Schützende Wirkungen des neuen Wenshen-Shengjing-Dekokts auf die durch Cyclosporin induzierte Beeinträchtigung der Testosteronsynthese und der spermatogenen Apoptose
Mar 03, 2022
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XIAOYAN PAN, XIYAN WANG, XUENAN WANG, WANSHENG ZHANG4, ZHANXUAN SUN1, XUAN XUAN LIANG, XUE ZHANG, WENJUN LI und ZHIXIN LI
Abstrakt
Die vorliegende Studie zielte darauf ab, die potenziellen Schutzwirkungen des neuen Wenshen Shengjing Decoction (neues WSSJD; einschließlich Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax Ginseng, Cynomorium Solarium,Cistanche Deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum und Angelica Sinensis) zur Cyclosporin-induzierten Beeinträchtigung der Testosteronsynthese und der spermatogenen Apoptose bei Mäusen. Insgesamt 90 erwachsene männliche Kunming-Mäuse wurden in die folgenden 6 Gruppen eingeteilt: Kontrolle (keine Intervention), Dimethylsulfoxid (DMSO; erhielt nur DMSO), Cyclosporin A (CSA), Clomifencitrat (CC; CsA plus CC, 15 mg/kg /Tag), WSSJD (CsA plus WSSJD, Rohdroge 12 g/kg/Tag) und neue WSSJD (CsA plus neue WSSJD, Rohdroge 12 g/kg/Tag). Alle Mäuse wurden 30 Tage lang per Schlundsonde behandelt. Die Hoden wurden anschließend fixiert und mit Hämatoxylin & Eosin gefärbt, um die Entwicklung von Samenepithelien zu beurteilen. Immunhistochemische Techniken wurden verwendet, um die Expression des luteinisierenden Hormonrezeptors (LHR) und die P450-Seitenkettenspaltung (P450scc) in testikulären Leydig-Zellen nachzuweisen. Darüber hinaus wurde die Apoptose von spermatogenen Zellen in den Hoden mit einem terminalen Desoxynukleotidyltransferase-vermittelten dUTP-Nick-End-Labeling-Assay nachgewiesen, und es wurde Durchflusszytometrie verwendet, um die Überlebensrate und frühe Apoptose von Spermien in den Nebenhoden zu analysieren. Im Vergleich zu den CsA- und CC-Gruppen erhöhte die neue WSSJD-Verabreichung signifikant die Serumtestosteronspiegel und die Expression von LHR und P450scc in testikulären Leydig-Zellen (P<0.05), while="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" seminiferous="" tubules="" and="" early="" apoptosis="" of="" mature="" sperm="" were="" significantly="" decreased=""><0.05). these="" results="" suggest="" that="" new="" wssjd="" may="" ameliorate="" csa-induced="" spermatogenic="" damage="" in="" male="" mice="" by="" enhancing="" testosterone="" synthesis="" and="" the="" secretion="" of="" testicular="" leydig="" cells,="" and="" by="" reducing="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="">
Einführung
Cyclosporin A (CSA) ist ein häufig verwendetes Immunsuppressivum, das spezifisch auf T-Zellen abzielt und die Sekretion von Interleukin -2 hemmt und die Erfolgsrate von Leber-, Nieren- und Hornhauttransplantationen sowie die Überlebensrate von dramatisch erhöht Empfänger (1-3). Allerdings erhöht die durch langfristige CsA-Einnahme induzierte Immunsuppression das Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Infektionen und bösartige Tumore signifikant (4). Eid et al. (5) berichteten, dass die Konzentration und Beweglichkeit der Spermien bei männlichen Empfängern einer Nierentransplantation negativ mit der Konzentration von CsA im Serum korrelierten, was darauf hindeutet, dass CsA bei männlichen Empfängern eine Funktionsstörung des Fortpflanzungssystems hervorrufen kann. Darüber hinaus wurde dokumentiert, dass CsA für eine beeinträchtigte Spermatogenese und eine Schädigung des männlichen Fortpflanzungssystems verantwortlich sein kann (6).
Frühere Studien haben gezeigt, dass CsA den Testosteronspiegel im Serum senkt, indem es die Testosteronbiosynthese und -sekretion in den Hoden beeinflusst. He et al. (7) beobachteten, dass Ratten, die mit 40 mg/kg/Tag CsA behandelt wurden, signifikant höhere Spiegel des luteinisierenden Hormons (LH) und signifikant niedrigere Testosteronspiegel im Serum aufwiesen, was zu einer Beeinträchtigung der Hodenentwicklung führte. Ali et al. (8) berichteten, dass die Behandlung mit CsA die Expression des LH-Rezeptors (LHR) auf der Membran von Leydig-Zellen verringerte, was anschließend die LH-vermittelte Testosteronsynthese und -sekretion aus Leydig-Zellen verringerte. Eine andere Studie von Seethalakshmi et al. (9) berichtete, dass CsA den Testosteronspiegel senkte, indem es die Aktivität der 17-alpha-Hydroxylase unkooperativ und die 17 --Hydroxysteroiddehydrogenase-Aktivität während der Testosteronbiosynthese hemmte, und der primäre Ort für die CsA-Hemmung war das unterbrochene zyklische Adenosin Monophosphat-Stimulation. Darüber hinaus wies dieser Bericht darauf hin, dass die durch CsA in Leydig-Zellen induzierte verringerte Testosteronsekretion die Entwicklung des männlichen Fortpflanzungssystems und die Aufrechterhaltung der Fortpflanzungsfähigkeit direkt beeinflusste. Seethalakshmi et al. (10) injizierten CsA-behandelten Ratten exogenes Testosteron, um die endogenen Testosteronspiegel zu erhöhen. Es wurde beobachtet, dass die erhöhten Dosen von exogenem Testosteron das Gewicht der Fortpflanzungsorgane, die Serumspiegel des follikelstimulierenden Hormons (FSH) signifikant wiederherstellten und die Keimzellzahl erhöhten, was darauf hindeutet, dass die CsA-induzierte Beeinträchtigung der Spermatogenese teilweise durch das exogene verhindert werden kann Verabreichung von Testosteron (10). Es wurde jedoch festgestellt, dass exogenes Testosteron nicht ausreicht, um beschädigtes Hodengewebe zu reparieren, da die Testosteronsekretion und Spermatogenese immer noch durch CsA beeinflusst wurden und hohe Apoptoseraten in Spermien und spermatogenen Zellen beobachtet wurden (10).
Wenshen Shengjing Decoction (WSSJD) besteht aus 15 pflanzlichen Arzneimitteln, darunter hauptsächlich Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax Ginseng, Cynomorium Solarium,Cistanche Deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicorneum und Angelica Sinensis (11). Es wurde gezeigt, dass WSSJD die Cyclophosphamid-induzierte spermatogene Apoptose lindert (11). Um die therapeutische Wirkung von WSSJD weiter zu verbessern, entwickelte die vorliegende Studie ein neues WSSJD, das auf dem Mechanismus der CsA-induzierten Hodengewebeschädigung basiert, indem die Dosierung der WSSJD-Komponenten angepasst wurde. Moderne pharmakologische Studien haben gezeigt, dass Geweihsamt bei WSSJD als Sexualhormon fungieren kann (12); Radix Astragali kann die Proliferation und Nährstoffversorgung von testikulären Sertoli-Zellen verbessern (13), und Panax Ginseng kann testikuläre Hyperoxidspiegel senken und die spermatogene Apoptose hemmen (14). Die oben genannten Arzneimittel können auch die Nierenfunktion verbessern und die Entwicklung spermatogener Zellen fördern (12-14). In früheren klinischen Studien wurde gezeigt, dass Clomifencitrat (CC) eine therapeutische Wirkung auf die männliche Unfruchtbarkeit ausübt (15,16). Darüber hinaus wurde CC mit verbesserten Testosteron- und Samenparametern in Verbindung gebracht, und die Schutzmechanismen von CC können denen von WSSJD ähnlich sein (15,16). Darüber hinaus wurde CC in einer Studie von Wang et al. (17) als Behandlungskontrolle verwendet, um die Wirkung der chinesischen Medizin Shengjing auf Spermatogenesestörungen bei Mäusen zu untersuchen. Basierend darauf wurde CC in der vorliegenden Studie als positive Kontrolle verwendet.
In der vorliegenden Studie wurde der Mechanismus untersucht, der der Schutzwirkung von neuem WSSJD im Hodengewebe zugrunde liegt, um die therapeutische Wirksamkeit des modifizierten Medikaments zu bestimmen. Die Aufklärung des Schutzmechanismus kann eine Grundlage für die Verwendung von neuem WSSJD bei der Linderung von CsA-induzierten spermatogenen Schäden liefern.
Auswirkungen von Cistanche deserticola: VorbeugenSpermatogene Schäden
Materialen und Methoden
Tiere. Insgesamt 90 männliche Kunming-Mäuse (8- Wochen alt; 35-40 g) wurden vom Changchun Institute of Biological Products Co., Ltd. (Changchun, China) bereitgestellt. Die vorliegende Studie wurde mit Genehmigung der Ethikkommission der Jilin Medical University (Changchun, China) durchgeführt. Die Mäuse wurden bei 21 ± 3 °C und 55–65 % relativer Luftfeuchtigkeit in einem 12-Stunden-Dunkel-Licht-Zyklus gehalten. Den Mäusen wurde freier Zugang zu einer Standard-Labormausdiät und sterilem Wasser gegeben.
Vorbereitung von WSSJD. Die 15 Komponenten der chinesischen Medizin von WSSJD, einschließlich Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax Ginseng, Cynomorium Solarium,Cistanche Deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum und Angelica Sinensis (11) wurden von Tongrentang (Peking, China) bezogen. Diese Materialien wurden nach der traditionellen Methode der chinesischen medizinischen Abkochung (18) abgekocht. Kurz gesagt, die Zutaten wurden gemäß dem Rezept abgewogen und insgesamt 250 ml destilliertes Wasser wurden hinzugefügt, um die Kräuter zu übergießen. Die Kräuter wurden 30 min eingeweicht und anschließend erhitzt. Die Kräuter wurden zuerst für 10 min gekocht und dann wurde die Hitze für 20 min auf ein Köcheln reduziert. Nach 30-minütigem Erhitzen wurde der flüssige Sud von den Kräutern getrennt, die mit 200 ml destilliertem Wasser bei 80 °C weitere 30 min lang weiter dekocht wurden. Dieser Vorgang wurde wiederholt und das Endvolumen der Abkochflüssigkeit wurde durch 4-5 Lagen Gaze filtriert. Die Flüssigkeit wurde auch aus den Kräutern in den gefilterten Sud gepresst. Der Sud wurde anschließend bei 80 °C in einem Wasserbad für 6-7 h erhitzt, bis die Konzentration 2 g Rohdroge/ml erreichte, und der Sud wurde vor Gebrauch bei 4 °C gelagert. Das neue WSSJD wurde basierend auf der Formulierung von WSSJD mit geringfügigen Anpassungen der Dosierungen von Panax Ginseng, Cynomorium Solarium, Radix Astragali und Epimedium brevicornum hergestellt. Die Abkochmethode war die gleiche wie bei WSSJD. neues WSSJD bestehend aus: Panax Ginseng, 6 g; Cynomorium-Solarium, 9 g; Radix Astragali, 12 g; Epimedium brevicornum, 6 g; Cornu Cervi Nippon Parvum, 1 g;Cistanche Deserticola, 9 g; Angelica sinensis, 6 g; Flatstem Milkvetch-Samen, 9 g; Rhizoma dioscoreae, 15 g; Atractylodes-Rhizom mit großem Kopf, 6 g; Ligusticum wallichii, 3 g; Radix Paeoniae Alba, 6 g; Cinnamomum Cassia, 1 g; Costustoot, 1,5 g, und Fructus Foeniculi, 3 g.
Die Konzentrationen von Drogen-Rohextrakten wurden wie folgt bestimmt: Gewicht des Rohmaterials/Endvolumen. Diese Berechnungsmethode wird im Studium der traditionellen chinesischen Medizin (19-21) häufig verwendet. Arzneimittelverabreichung. Die Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in 6 Gruppen (15 Mäuse pro Gruppe) eingeteilt und es wurde intragastrisch ein Medikament verabreicht. Die Gruppen waren wie folgt: Kontrolle (normale Kochsalzlösung); Dimethylsulfoxid (DMSO); CsA; CC; WSSJD; und neue WSSJD. Mäusen in den CsA-, CC-, WSSJD- und neuen WSSJD-Gruppen wurden 30 Tage lang intraperitoneal (ip) 15 mg/kg/Tag CsA (Shanxi Powerdone Pharmaceutics Co., Ltd., Datong, China) injiziert, wie zuvor beschrieben (8 ). Mäuse in den Kontroll- und DMSO-Gruppen wurden während der 30--tägigen Versuchsdauer einer täglichen ip-Injektion mit einem gleichen Volumen normaler Kochsalzlösung bzw. DMSO-Lösungsmittel unterzogen. Die Konzentration von in normaler Kochsalzlösung verdünntem DMSO betrug 3,25 Prozent (v/v). Der CC-Gruppe wurden 21,6 mg/kg/Tag CC (GKH Pharmaceutical, Ltd., Guangzhou, China) verabreicht, wie zuvor beschrieben (13), das ebenfalls in 3,25 Prozent (v/v) DMSO (pH {{14}) }.2). Mäusen in den WSSJD- und neuen WSSJD-Gruppen wurden 12 g Roharzneimittel/kg/Tag von WSSJD bzw. neuem WSSJD verabreicht.Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (H&E). Mäusehoden wurden geerntet und sofort in 4 % Paraformaldehyd (pH =7,2) bei Raumtemperatur für 24 h fixiert, gefolgt von Ethanoldehydratisierung, Xylolbehandlung zur Entfernung des Ethanols, Einbettung in Wachs und Schneiden. Unter Verwendung eines Rotationsmikrotoms wurden histologische Schnitte (5 &mgr;m) erhalten. Diese wurden für die H&E-Färbung auf Glasobjektträgern fixiert. Hodenschnitte wurden unter Verwendung von histopathologischer Highlight-Mikroskopie beobachtet, um die Entwicklung von Hodenkanälchen zu bewerten und histometrische Daten zu erhalten. Die Entwicklung der Hodenkanälchen wurde mit dem Johnsen-Scoring-System (22) bewertet.
ELISA. Am Tag 3 0 der Behandlung wurden die Mäuse mit 10 % Chloralhydrat (Shanghai Guoyao Chemical Reagent Co., Ltd) mit 0,004 ml/g Körpergewicht ip vor der Euthanasie mit CO2 anästhesiert. Stammblut wurde entnommen und das Serum abgetrennt und bei –20 °C gelagert. Kurz gesagt, Blut wurde in 1,5-ml-Röhrchen gesammelt und über Nacht bei 4 °C gelagert. Das Röhrchen wurde dann bei 1.300 xg bei 4°C für 6 min zentrifugiert und das Serum gesammelt. ELISA-Kits (Shanghai Elisa Biotech Co., Ltd., Shanghai, China) wurden verwendet, um den Serumgehalt von Testosteron (Kat.-Nr. EIA-2380) und LH (Kat.-Nr. EIA-2385) zu bestimmen. ) nach Herstellerprotokoll. Die optische Dichte (OD) wurde unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts Modell 680 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) bestimmt, und die Konzentrationen von Testosteron und LH wurden basierend auf der Standardkurve bestimmt.
Immunhistochemie. Hodengewebe wurden in 4-prozentigem Formaldehyd bei Raumtemperatur für 24 h fixiert und in Paraffin eingebettet. Paraffinschnitte wurden in 5 &mgr;m-Schnitte geschnitten und anschließend entparaffiniert. Die Antigengewinnung erfolgte durch Inkubation der Schnitte in 0.01 M Citratpuffer (pH=6.0) bei 95-98˚C für 5 min. Die Schnitte wurden anschließend mit 5 % Rinderserumalbumin (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland; A3675) bei Raumtemperatur für 1 h blockiert. Nach dem Blockieren wurden die Schnitte mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern gegen LHR (Kat.-Nr. L6792; Sigma-Aldrich; Merck KGaA; 1:200) oder P450-Seitenkettenspaltung (P450scc; Kat.-Nr. ab75497; Abcam, Cambridge, UK) inkubiert ; 1:200) bei 4˚C über Nacht im Dunkeln. Das Streptavidin-Biotin-Komplex (SABC)-Verfahren wurde verwendet, um die Expression von LHR und P450scc unter Verwendung eines SABC-Kits (SA2010; Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, USA) nach dem Protokoll des Herstellers nachzuweisen. Für die aus negativen Kontrollmäusen isolierten Gewebe wurde der primäre Antikörper durch PBS ersetzt. Leydig-Zellen mit gelber oder brauner Färbung auf der Membran oder im Plasma wurden als LHR-positive Zellen angesehen. Fünf Objektträger wurden von jeder Probe erhalten und fünf Felder in den Leydig-Gewebebereichen wurden zufällig ausgewählt und unter einem Fluoreszenzmikroskop (Vergrößerung x400) bewertet. Die mittlere OD positiver Zellen in den Leydig-Gewebebereichen wurde unter Verwendung der Software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA) erhalten. Die Expression von LHR und P450scc war proportional zu den OD-Werten, wobei höhere OD-Werte höhere Proteinexpressionen darstellen.
Terminal-Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT)-vermittelter dUTP-Nick-End-Labeling (TUNEL)-Assay. Mäusehoden wurden präpariert, in Wachs eingebettet und geschnitten. Die Schnitte (5- µm dick) wurden dann unter Verwendung des TUNEL-Testkits (MK1024; Boster Biological Technology) gemäß dem Protokoll des Herstellers gefärbt. Kurz gesagt, Hodengewebe von Kontrollgruppen (normale Kochsalzlösung), DMSO-, CsA-, CC-, WSSJD- und neuen WSSJD-Gruppen wurden mit einer 1:100-Verdünnung von Biotin-markiertem Digoxin-Antikörper für 30 Minuten bei 37 °C gefärbt. Gefärbtes interstitielles Epithelgewebe von Ratten (im Kit enthalten) wurde als Positivkontrolle verwendet, und Proben, die mit PBS anstelle von Biotin-markiertem Digoxin-Antikörper inkubiert wurden, wurden als Negativkontrolle verwendet. Die Häufigkeit von TUNEL-positiven Zellen, die eine grüne Kernfärbung zeigten, wurde unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops bewertet. Insgesamt 10 Zufallsfelder wurden unter starker Vergrößerung (x400) bewertet und positive Zellen wurden gezählt. Die mittlere Anzahl positiver Zellen pro Feld wurde berechnet.
Propidiumiodid (PI)- oder Annexin V‑Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Färbung und durchflusszytometrische Analyse. Die Cauda Epididymis wurde nach der folgenden Tötung geerntet und die Epidermis wurde mit einer Klinge geschnitten, um das Sperma aus der Epididymis in 2 ml PBS bei 37°C freizusetzen, um Nebenhodensuspensionen zu erhalten. Die Suspensionen wurden anschließend 10 min lang bei 37 °C inkubiert, damit die Spermien herausschwimmen konnten. Ansammlungen von Spermien wurden verworfen und die verbleibenden Spermienproben wurden isoliert und in PBS resuspendiert, um eine Konzentration von 106 Zellen/ml zu ergeben. Die Spermien-Apoptose wurde unter Verwendung eines Annexin V-FITC-Apoptose-Erkennungskits (Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, China) gemäß dem Protokoll des Herstellers analysiert. Kurz gesagt wurde 1 ml Spermiensuspension mit 10 &mgr;l PI oder mit 500 &mgr;l Bindungspuffer und 5 &mgr;l Annexin V-FITC im Dunkeln für 10 min bei Raumtemperatur gefärbt. Die Zellen wurden sofort durch Epics XL-Durchflusszytometrie (Beckman Coulter, Inc.) und unter Verwendung eines TetraONE TM -Systems (6915050; Beckman Coulter, Inc.) analysiert. Zellen in den frühen Stadien der Apoptose wurden durch Annexin-V-positive Färbung identifiziert und nekrotische Zellen wurden durch PI-positive Färbung identifiziert.
Statistische Analyse. Die Datenanalyse wurde unter Verwendung der Software SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) durchgeführt und wie angegeben als Mittelwert plus oder ± Standardabweichung ausgedrückt. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde anhand einer Einweg-Varianzanalyse gefolgt von Tukeys Post-Hoc-Test bewertet. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche Deserticola
Ergebnisse
Auswirkungen der neuen WSSJD auf die Entwicklung der Hodenkanälchen. Um die potenzielle Schutzwirkung von neuem WSSJD auf die Entwicklung der Hodenkanälchen der Maus zu untersuchen, wurde die Morphologie von H&E-gefärbten Maushoden unter Lichtmikroskopie verglichen. Die Hodenkanälchen von Mäusen aus den CsA- und CC-Gruppen zeigten im Vergleich zur Kontrolle eine Schrumpfung der Tubulusränder, verringerte Tubulusdurchmesser und reduzierte Schichten von testikulärem Hodenepithel. Außerdem zeigten die Spermatogenesezellen eine ungeordnete Anordnung, die Anzahl der Spermatogenesezellen war reduziert und im Lumen waren nur wenige reife Spermien sichtbar (Abb. 1). Bei Mäusen aus den DMSO-, WSSJD- und neuen WSSJD-Gruppen waren mehr Schichten von testikulärem Samenepithel sichtbar und der Saum der Samenkanälchen war ohne Schrumpfung oder Kollaps integriert (Abb. 1). Die Johnsen-Scores unterschieden sich nicht signifikant zwischen der DMSO-Gruppe und den Kontrollgruppen oder zwischen der CC- und der DMSO-Gruppe. Allerdings war der Johnsen-Score in der CsA-Gruppe und der WSSJD-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant verringert, und die Werte der WSSJD- und der neuen WSSJD-Gruppe waren im Vergleich zur CC- oder CsA-Gruppe signifikant erhöht (P<0.05; table="" i).="" these="" results="" indicated="" that="" new="" wssjd="" and="" wssjd="" promoted="" the="" development="" of="" seminiferous="" epithelium="" following="" csa="">
Wirkungen neuer WSSJD auf Serumtestosteron und LH. Anschließend wurden die Testosteron- und LH-Spiegel im Serum gemessen. Die Serumspiegel von Testosteron und LH waren nach der DMSO-Verabreichung unbeeinflusst. Im Gegensatz dazu war das Serum-Testosteron bei mit CsA behandelten Mäusen im Vergleich zu Kontrollen signifikant herunterreguliert und LH signifikant hochreguliert (P<0.05; fig.="" 2),="" and="" new="" wssjd="" administration="" significantly="" restored="" testosterone="" to="" near="" control="" levels=""><0.05; fig.="" 2).="" for="" serum="" lh,="" the="" protective="" effects="" of="" wssjd="" were="" similar="" to="" that="" of="" cc;="" however,="" new="" wssjd="" decreased="" serum="" testosterone="" to="" a="" significantly="" lower="" level="" than="" that="" observed="" with="" cc="" and="" wssjd=""><0.05; fig.="" 2),="" suggesting="" a="" superior="" protective="" effect="" of="" new="" wssjd="" over="" cc="" or="">
Auswirkungen der neuen WSSJD auf die Expression von LHR und P450scc. Die Expression von P450scc und LHR wurde in testikulären Leydig-Zellen durch Immunhistochemie bewertet (Fig. 3 und 4). In der Kontrollgruppe wurde LHR auf den äußeren Membranen von Leydig-Zellen zwischen den Hodenkanälchen exprimiert (Fig. 3A), und P450cc wurde im Cytoplasma von testikulären Leydig-Zellen exprimiert (Fig. 4A). Die Behandlung mit DMSO hatte keine signifikante Wirkung auf die Expression von LHR und P450scc. Im Gegensatz dazu senkte die CsA-Behandlung die Expression von LHR und P450scc im Vergleich zu Kontrollmäusen (P<0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" turn,="" the="" expressions="" of="" lhr="" and="" p450scc="" were="" significantly="" increased="" by="" treatment="" with="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" compared="" with="" the="" csa="" group=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" addition,="" levels="" of="" lhr="" and="" p450scc="" in="" testicular="" leydig="" cells="" were="" significantly="" higher="" in="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" mice="" compared="" with="" cc="" mice=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b),="" and="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" upregulation="" than="" wssjd=""><0.05; figs.="" 3b="" and="">
Wirkung neuer WSSJD auf die Apoptose spermatogener Zellen. Die Apoptose spermatogener Zellen in den Hoden der Maus wurde mit einem TUNEL-Assay analysiert. Die Kerne von apoptotischen Zellen wurden hauptsächlich in den Spermatogonien und primären Spermatozyten beobachtet (Fig. 5A). Spermatogonien sind größer als Spermatozyten und liegen näher an der Basalmembran (23). Die DMSO-Behandlung hatte keine signifikante Wirkung auf die Anzahl der apoptotischen spermatogenen Zellen in den Hoden. Im Gegensatz dazu erhöhte die Behandlung mit CsA signifikant die Anzahl der apoptotischen spermatogenen Zellen im Vergleich zu den Kontroll- und DMSO-Gruppen (P<0.05; fig.="" 5b).="" in="" turn,="" administration="" of="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" significantly="" reduced="" csa-induced="" apoptosis=""><0.05; fig.="" 5b).="" furthermore,="" the="" number="" of="" apoptotic="" testicular="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" groups="" was="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05), and="" new="" wssjd="" was="" significantly="" more="" effective="" than="" wssjd=""><0.05; fig.="">
Auswirkungen neuer WSSJD auf das Überleben und die frühe Apoptose von Spermien. Um die Schutzwirkung von neuem WSSJD gegen CsA-induzierte Spermien-Apoptose zu verifizieren, wurden das Überleben und die frühe Apoptose von Spermien in den Nebenhoden bestimmt. Epididymale Spermien wurden mit PI oder Annexin V gefärbt und durch Durchflusszytometrie analysiert ( 6 und 7 ). Nach den oben genannten Ergebnissen reduzierte die CsA-Behandlung signifikant den Prozentsatz an lebenden Spermien und erhöhte signifikant den Prozentsatz an früh apoptotischen Spermien (P<0.05; figs.="" 6b="" and="" 7b),="" while="" dmso="" treatment="" had="" no="" effect.="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" significantly="" increased="" the="" percentage="" of="" live="" sperm=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" reduced="" the="" percentage="" of="" early="" apoptosis="" sperm=""><0.05; fig.="" 7b)="" compared="" with="" csa="" treatment.="" the="" percentages="" of="" live="" and="" early="" apoptotic="" sperm="" in="" wssjd="" and="" cc="" mice="" did="" not="" differ="" significantly,="" while="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" increase="" in="" live="" sperm="" percentage="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" significantly="" decreased="" the="" percentage="" of="" early="" apoptotic="" sperm="" compared="" with="" the="" cc="" and="" wssjd="" groups=""><0.05; fig.="">
Diskussion
Es wurde bereits früher dokumentiert, dass die Langzeitanwendung von CsA als Immunsuppressivum die Fortpflanzungsfähigkeit beeinträchtigt (6). Xu (24) berichtete, dass die Morphologie und Vitalität der Spermien bei mit CsA behandelten Patienten signifikant niedriger waren als in einer unbehandelten Gruppe, wie in den Samenproben von 26 Nierentransplantatempfängern, die mit verschiedenen CsA-Dosen behandelt wurden, und 12 gesunden Freiwilligen beobachtet wurde. Es wurde auch beobachtet, dass die Kopfdeformitätsraten der Spermien bei CsA-behandelten Empfängern signifikant höher waren(24). Diese Ergebnisse legten nahe, dass CsA eine dosisabhängige Wirkung auf die Samenparameter hatte. Daher sind Studien gerechtfertigt, um neue pharmakologische Wirkstoffe zu identifizieren, die in der Lage sind, CsA-induzierte Hodenschäden zu lindern und die männliche Fortpflanzungsfähigkeit nach einer Organtransplantation zu verbessern.
Die spezifische Mikroumgebung des Hodens fördert die Spermatogenese, und daher kann eine Beeinträchtigung der Hodenstruktur und -funktion zu einem Stopp der Spermatogenese führen(25). Monteiro et al. (26) behandelten Wistar-Ratten 56 Tage lang mit CsA in einer Dosis von 15 mg/kg pro Tag und beobachteten bei CsA-behandelten Ratten einen erhöhten volumetrischen Anteil an Bindegewebe und einen verringerten volumetrischen Anteil an Leydig-Zellen. Es wurde auch beobachtet, dass CsA eine Degeneration des seminiferen Epithels verursachte, was zu einer Vakuolisierung der Sertoli-Zellen, abnormalen runden und verlängerten Spermatiden und der Ansammlung von restlichem Zytoplasma an der Epithelgrenze neben dem Lumen führte (26). In der vorliegenden Studie wurden Kunming-Mäuse 30 Tage lang täglich mit 15 mg/kg CsA behandelt, was zu einer Schrumpfung und einem verringerten Durchmesser der Samenkanälchen, einer Verringerung der Samenepithelschichten, einer ungeordneten Anordnung der Samenzellen und einer Abnahme der Reife führte Spermien im Lumen und ein deutlich erniedrigter Johnsen-Score.
Darüber hinaus hat die Behandlung mit CsA die Hodenstruktur stark geschädigt. Die vorliegende Studie untersuchte auch die Schutzwirkung des neuen WSSJD als neuartige chinesische Medizin auf die Hoden von mit CsA behandelten Mäusen. Es wurde beobachtet, dass die testikulären Samenepithelschichten und die Anordnung der Samenzellen nach der Behandlung mit neuem WSSJD wiederhergestellt wurden. Darüber hinaus zeigten Mäuse in der neuen WSSJD-Gruppe integrierte Hodenkanälchen ohne Schrumpfung oder Kollaps und hatten einen signifikant höheren Johnsen-Score im Vergleich zu CsA‑behandelten Mäusen. Diese Ergebnisse legten nahe, dass WSSJD CsA-induzierte Hodenschäden signifikant reparierte, was darauf hindeutet, dass diese pflanzliche Arzneimittelverbindung eine wirksame Behandlung zur Vorbeugung von CsA-induzierten Hodenschäden sein könnte. Ob diese Zellreparatur von der Nische innerhalb des Epithels abhängt oder nicht, ist ebenfalls eine wichtige Frage, die in zukünftigen Studien untersucht werden sollte.
Die Hypothalamus-Hypophysen-Hoden-Achse spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genitalaktivität (27). Die Entwicklung und Funktionsfähigkeit der männlichen Geschlechtsorgane wird durch Hormone aus dem Hypothalamus und der Hypophyse reguliert (28). Krueger et al. (29) behandelten Sprague-Dawley-Ratten 6 Tage lang mit 25 mg/kg/Tag CsA oder 40 mg/kg/Tag CsA und beobachteten, dass die Serumspiegel von LH und FSH um das 2-4-Fache anstiegen, während P450scc-Expression auf 30 Prozent derjenigen in der Kontrollgruppe verringert. Darüber hinaus waren die Testosteronspiegel im Serum bei mit CsA behandelten Mäusen signifikant erniedrigt, was zu einer beeinträchtigten Spermatogenese führte (29). In der vorliegenden Studie wurde gezeigt, dass die CsA-Behandlung die Expression von LHR in Leydig-Zellen signifikant verringerte. Obwohl das Serum-LH erhöht war, kann eine verringerte Expression von LHR die LH-vermittelte Wiederherstellung der Testosteronbiosynthese beeinträchtigt und die Expression von P450scc als geschwindigkeitsbegrenzendem Enzym der Testosteronbiosynthese verringert haben (30), wodurch die Testosteronbiosynthese durch Leydig-Zellen beeinträchtigt wird. Die neuartigen Inhaltsstoffe in neuen WSSJD, wie z. B. Langhaargeweih, zeigen ähnliche Wirkungen wie Sexualhormone (12), die den Serumtestosteronspiegel verbessern und den Serum-LH-Spiegel senken können, wodurch die LHR- und p450scc-Expression in Leydig-Zellen erhöht wird. Bemerkenswerterweise weisen die vorliegenden Ergebnisse darauf hin, dass das neue WSSJD die Testosteronbiosynthese und -sekretion in Leydig-Zellen stimuliert, um die Spermatogenese zu fördern.
CSA-induzierter oxidativer Stress und Hodenschädigung induzieren die Dysplasie von Spermien und spermatogenen Zellen (31). Es wurde berichtet, dass eine Langzeitbehandlung mit CsA das antioxidative System in tierischen Hodengeweben schädigt, was zu verringerten Konzentrationen von Glutathion, Glutathionperoxidase und Wasserstoffperoxid und erhöhten Konzentrationen von Malondialdehyd in den Hoden führt (31). Daher können übermäßige Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies im Hodengewebe nicht eliminiert werden, was zur Peroxidation von Lipiden der Spermienmembran, DNA-Schäden und verminderter Vitalität der Spermien führt. In der vorliegenden Studie wurde beobachtet, dass die CsA-Behandlung den DNA-Bruch und die Apoptoserate spermatogener Zellen in Samenkanälchen signifikant erhöhte. Die Überlebensrate der Spermien in den Nebenhoden nahm ebenfalls ab, während der Anteil früh apoptotischer Spermien erhöht war, was darauf hindeutet, dass die spermatogene Aktivität der Hoden erheblich geschädigt war. Türk et al. (32) dokumentierten, dass die schützende Wirkung von Ellagsäure auf CsA-induzierte Hodenschäden mit oxidativem Stress bei männlichen Ratten assoziiert war. Das neue WSSJD, das in der vorliegenden Studie verwendet wird, enthält verschiedene antioxidative Komponenten, einschließlich des pflanzlichen Arzneimittels Ginseng, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es den Hyperoxidspiegel in den Hoden signifikant senkt (14).
In der vorliegenden Studie wurden die Wirkungen von neuem WSSJD auf die CsA-induzierte Beeinträchtigung der Testosteronsynthese und der spermatogenen Apoptose untersucht, und es wurde beobachtet, dass neues WSSJD die Apoptoseraten von spermatogenen Zellen und Spermien signifikant senkte und somit Schäden an den Samenleitern der Hoden reparierte Epithel. Die Morphologie der Hodenkanälchen und die Apoptose spermatogener Zellen und Spermien wurden histochemisch und durchflusszytometrisch untersucht. Obwohl die Zellzyklusverteilung und die tägliche Spermienproduktion nicht untersucht wurden, werden sie im Mittelpunkt zukünftiger Studien unserer Gruppe stehen.
WSSJD erhöhte den Testosteronspiegel in den Hoden signifikant und verringerte die Apoptose spermatogener Zellen und Spermien, wodurch CsA-induzierte Hodenschäden wirksam repariert wurden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das neue WSSJD ein nützliches pharmakologisches Mittel bei der Behandlung und Vorbeugung von CsA-induzierten Hodenschäden sein kann.
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Verweise
1. Pedersen M und Seetharam A: Infektionen nach orthotoper Lebertransplantation. J Clin Exp Hepatol 4: 347-360, 2014.
2. Vora GK und Ciolino JB: Hornhauttransplantatreaktion in Verbindung mit nichtokularer Entzündung. Ziffer J Ophthalmol 20: 29-31, 2014.
3. De Pasquale C, Veroux M, Indelicato L, Sinagra N, Giaquinta A, Fornaro M, Veroux P und Pistorio ML: Psychopathologische Aspekte der Nierentransplantation: Wirksamkeit eines multidisziplinären Teams. World J Transplant 4: 267-275, 2014.
4. El-Gowelli HM und El-Mas MM: Zentrale Modulation von Cyclosporin-induzierter Hypertonie. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 388: 351-361, 2015.
5. EidMM, Abdel-Hamid IA, SobhMA und el-SaiedMA: Bewertung der Spermienbewegungseigenschaften bei unfruchtbaren Nierentransplantatempfängern mittels computergestützter Analyse. Int J Androl 19: 338-344, 1996.
6. Zahra A., Gholamreza N., Farokhi F. und Shalizar Jalali A.: Dämpfung der durch Cyclosporin induzierten Spermienschädigung und Embryotoxizität durch wässrigen Extrakt aus Crataegus-monogyna-Früchten. Zelle J 15: 198-205, 2013.
7. He Z, Qiu J, LiJ, Zhao D, Chen G und Chen L: Langzeiteffekte der Umstellung von Cyclosporin auf Rapamycin auf Hodenfunktion und -morphologie in einem Rattentransplantationsmodell. Transplantationsprozess 45: 763-769, 2013.
8. AliRB, KlouzA, Boubaker S, LakhalM und BelkahiaC: Ein Tiermodell der testikulären Toxizität durch Cyclosporin: Bewertung und Schutz. Fundam Clin Pharmacol 23: 241-246, 2009.
9. L. Seethalakshmi, C. Flores, RK Malhotra, JD Pallas, D. Tharakan, RB Khauli und M. Menon: Der Wirkungsmechanismus von Cyclosporin bei der Hemmung der Testosteronbiosynthese durch Ratten-Leydig-Zellen in vitro. Transplantation 53: 190-195, 1992.
10. SeethalakshmiL, FloresC, CarboniAA und Menon M: Quantitative Aufrechterhaltung der Spermatogenese bei mit Cyclosporin behandelten Ratten durch exogene Verabreichung von Testosteronpropionat. J Androl 11: 491-497, 1990.
11. Pan XY, Wang XY, Wang XN, Sun ZX, Wang D, Wang X, Yang YY und Li ZX: Wirkungen von „Wenshen Shengjing Decoction“ auf Cyclophosphamid-induzierte spermatogene Zellapoptose und Histon-H3K9-Dimethylierung. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi 48: 82-86, 2014 (auf Chinesisch).
12. Xu ZH, Li SF, Wang JY, Zhou R und Tian SJ: Extraktion von Sexualhormonen aus Geweihsamt mit überkritischem CO2. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 32: 2000-2003, 2007 (auf Chinesisch).
13. Zhao LP, Xu Z, Zhang M, Sun HC und Tang F: Wirkungen von Fructus Lycii und Radix astragali auf die Funktion von Sertoli-Zellen in Rattenhoden. Zhonghua Nan Ke Xue 13: 82-86, 2007 (auf Chinesisch).
14. Xu L, Liu XH und Zhang L: Wirkungen von Gesamt-Ginsenosiden auf die NO-, NOS- und Gesamt-Antisauerstoff-Kapazität in den Hoden der Maus. Acta Academiae Medicinae CPAPF 5: 507-508, 2006 (auf Chinesisch).
15. Patel DP, Brant WO, Myers JB, Presson AP, Johnstone EB, Dorais JA, Aston KI, Carrell DT und Hotaling JM: Die Sicherheit und Wirksamkeit von Clomifencitrat bei hyperandrogenen und subfertilen Männern. Int J Impot Res 27: 221-224, 2015.
16. ElSheikh MG, Hosny MB, Elshenoufy A, Elghamrawi H, Fayad A und Abdelrahman S: Kombination von Vitamin E und Clomifencitrat bei der Behandlung von Patienten mit idiopathischer Oligo wie der Azoospermie: Eine prospektive, randomisierte Studie. Andrologie 3: 864-867, 2015.
17. Wang R, Xu L, Zhang WX, Wu YF, Shi JH und Zhang YX: Shengjing Granulat: Eine wirksame chinesische Medizin für spermatogene Störungen bei Mäusen. Zhonghua Nan Ke Xue 14: 1046-1049, 2008 (auf Chinesisch).
18. Fan BT: Chinese Medicine Pharmacy, Shanghai Science and Technology Press 12: 62-68, 1997 (auf Chinesisch).
19. Zhang J, Li H, Lu L, Yan L, Yang X, Shi Z und LiD: Die Yiqi- und Yangyin-Formel verbessert die durch Ganzkörperbestrahlung induzierte Verletzung des hämatopoetischen Systems. J Radiat Res 58: 1-7, 2017.
20. M. Minami, T. Konishi, T. Jiang, T. Arai und T. Makino: Wirkung von Shin'iseihaito auf die durch nasale Sensibilisierung induzierte allergische Reaktion von Mäusen. J Tradit Complement Med 6: 252-256, 2015.
21. Rong R, Li RR, Hou YB, Li J, Ding JX, Zhang CB und Yang Y: Mahuang-Xixin-Fuzi-Abkochung reduziert die Infektion mit dem Influenza-A-Virus bei Mäusen mit Nieren-Yang-Mangel-Syndrom. J Ethnopharmacol 192: 217-224, 2016.
22. Johnsen SG: Testicular Biopsy Score Count – eine Methode zur Registrierung der Spermatogenese in menschlichen Hoden: Normalwerte und Ergebnisse bei 335 hypogonadalen Männern. Hormone 1: 2-25, 1970.
23. Mays-Hoopes LL, Bolen J, Riggs AD und Singer-Sam J: Vorbereitung von Spermatogonien, Spermatozyten und runden Spermatiden zur Analyse der Genexpression mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung. Biol Reprod 53: 1003-1011, 1995.
24. Xu LG: Einfluss von Cyclosporin A auf die Samenparameter der Patienten nach Nierentransplantation. J Clin Urol 20: 603-605, 2005.
25. Pintus E, Ros-Santaella JL und Garde JJ: Jenseits der Hodengröße: Verbindungen zwischen Spermatogenese und Spermienmerkmalen bei einem saisonalen Zuchtsäugetier. PLoS One 10: e0139240, 2015.
26. Monteiro JC, Predes FS, Matta SL und Dolder H: Die Infusion von Heteropterys aphrodisiaca reduziert die Nebenwirkungen von Cyclosporin A auf die Hoden. Anat Rec (Hoboken) 291: 809-817, 2008.
27. Oseko F, Note S, Morikawa K, Endo J, Taniguchi A und Imura H: Einfluss der durch Sulpirid induzierten chronischen Hyperprolaktinämie auf die Hypothalamus-Hypophysen-Hoden-Achse bei normalen Männern. Fertil Steril 44: 106-111, 1985.
28. Wisniewski P, Romano RM, Kizys MM, Oliveira KC, Kasamatsu T, Giannocco G, Chiamolera MI, Dias-da-Silva MR und Romano MA: Die Exposition von Erwachsenen gegenüber Bisphenol A (BPA) bei Wistar-Ratten reduziert die Spermienqualität mit Unterbrechung der Hypothalamus-Hypophysen-Hoden-Achse. Toxikologie 329: 1-9, 2015.
29. Krueger BA, Trakshel GM, Sluss PM und Maines MD: Cyclosporin-vermittelte Depression von luteinisierenden Hormonrezeptoren und Häm-Biosynthese in Rattentestes: Ein möglicher Mechanismus für die Abnahme des Serum-Testosterons. Endokrinologie 129: 2647-2654, 1991.
30. Nolan CJ und Payne AH: Der Genotyp am P450scc-Locus bestimmt Unterschiede in der Menge an P450scc-Protein und der maximalen Testosteronproduktion in Maus-Leydig-Zellen. Mol Endocrinol 4: 1459-1464, 1990.
31. Türk G, Ateşşahin A, Sönmez M, Yüce A und Ceribaşi AO: Lycopin schützt vor durch Cyclosporin A induzierter Hodentoxizität bei Ratten. Theriogenology 67: 778-785, 2007. 32. Türk G, Sönmez M, Ceribaşi AO, Yüce A und Ateşşahin A: Attenuation of cyclosporine A-induced testicular and spermatozoal damage related with oxidative stress by ellagic acid. Int Immunopharmacol 10: 177-182, 2010.
