Protein-Arginin-Methylierung: Eine aufkommende Modifikation in der Krebsimmunität und Immuntherapie Teil 1

In den letzten Jahren sind Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) als neue Mitglieder einer Familie von Genexpressionsregulatoren in Eukaryoten aufgetaucht und werden mit der Pathogenese und Progression von Krebs in Verbindung gebracht. Die Krebsimmuntherapie hat die Krebsbehandlung im Hinblick auf das Gesamtüberleben und die Lebensqualität erheblich verbessert. Die Protein-Arginin-Methylierung ist eine epigenetische Modifikationsfunktion nicht nur in Transkriptions-, RNA-Verarbeitungs- und Signaltransduktionskaskaden, sondern auch in vielen Prozessen des Krebs-Immunitätszyklus. Die Arginin-Methylierung ist an der Aktivierung der Anti-Krebs-Immunität und der Regulierung der Wirksamkeit der Immuntherapie beteiligt.

In dieser Übersicht fassen wir die aktuellsten Informationen zu regulatorischen molekularen Mechanismen und verschiedenen zugrunde liegenden Arginin-Methylierungssignalwegen bei angeborenen und adaptiven Immunantworten bei Krebs zusammen. Wir skizzieren auch das Potenzial von PRMT-Inhibitoren als wirksame kombinatorische Behandlungen mit Immuntherapie.

Schlüsselwörter: Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs), Krebsimmunität, Krebsimmuntherapie, posttranslationale - Modifikation, der molekulare Mechanismus

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1. EINLEITUNG

Posttranslationale Modifikation ist eine chemische Modifikation, die die funktionelle Vielfalt von Proteinen durch die kovalente Addition einer chemischen Gruppe erhöht. Der Prozess moduliert die Proteinfunktion und hat sich als entscheidender Regulator mehrerer zellulärer Prozesse bei Krebs herausgestellt.

Im Gegensatz zu Acetylierung, Ubiquitinierung und Phosphorylierung wurde der Argininmethylierung jedoch bis vor kurzem wenig Aufmerksamkeit geschenkt, hauptsächlich aufgrund der unregelmäßigen Substraterkennung und des Fehlens zuverlässiger Antikörper und wirksamer niedermolekularer Inhibitoren. Die Proteomik und die Entdeckung von Inhibitoren haben unser Verständnis von Autoren, Lesern und Regulatoren während der Arginin-Methylierung vertieft. Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) katalysieren die Arginin-Methylierung als „Writer“ und sind hauptsächlich an der Transkriptionsaktivierung und -repression, dem Prä-mRNA-Spleißen und DNA-Schadensreaktionen beteiligt (1). Arginin-Methylierung moduliert auch die Transkription von Zielorten und vermittelt dadurch Schlüsselzellprozesse, um die Gewebehomöostase und Krankheitsphänotypen aufrechtzuerhalten. Da die Arginin-Methylierung eine zielgerichtete Modifikation ist, haben PRMT-Inhibitoren in präklinischen Modellen und klinischen Studien ein großes Potenzial als Krebstherapien gezeigt, um das Überleben der Patienten effektiv zu verbessern (2).

Da die Funktionen des Immunsystems gut etabliert und für die Tumorüberwachung und Krebsbehandlung von entscheidender Bedeutung sind, gelten die sich schnell entwickelnden Krebsimmuntherapien heute als vierte Säule der Krebsbehandlung (neben Operation, Strahlentherapie und Chemotherapie) (3).

Die Krebsimmunität eliminiert typischerweise Tumorzellen oder begrenzt ihr Wachstum, fördert aber auch das Fortschreiten des Tumors, indem sie Tumormikroumgebungen (TMEs) etabliert, die sich an das Tumorwachstum anpassen (4). Trotz der Wirksamkeit der Immun-Checkpoint-Blockade (ICB)-Therapie zieht eine Minderheit von Patienten mit fortgeschrittenen malignen Erkrankungen klinische Vorteile aus diesen Behandlungen, wobei die Mehrheit eine angeborene oder erworbene Resistenz entwickelt (5).

Daher ist weitere Forschung zu immuntherapiebasierten Kombinationsmethoden erforderlich, um das Gesamtüberleben bei Patienten mit Krebs im fortgeschrittenen Stadium zu verbessern.

Angesichts der Tatsache, dass Krebsimmunantworten kontinuierliche, dynamische, streng regulierte und gut geplante Prozesse sind, können unterdrückende Reaktionen auf eine Immuntherapie auf mehrere Faktoren zurückgeführt werden, einschließlich des TME-Immunphänotyps und der molekularen Mechanismen, die der intrinsischen Tumorresistenz zugrunde liegen (6). Zu den Themen, die für optimale Reaktionen auf die Immuntherapie relevant sind, gehört jeder Schritt in einer Reihe von Kaskadenverstärkungsprozessen, die als Krebsimmunitätszyklus bezeichnet werden, das Zusammenspiel zwischen angeborener und adaptiver Immunität sowie die Aktivierung oder der Verlust von onkogenen Signalwegen. Der klassische Krebs-Immunitätszyklus umfasst Antigenexpression und -präsentation, T-Zell-Transport und Tumorinfiltration sowie das Abtöten von Zielzellen durch zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs). Die angeborene Immunität integriert, erhält und verstärkt diesen Zyklus vollständig. Während epigenetische Regulatoren an der Aktivierung und Translokation von Immunzellen zum TME sowie an nachfolgenden Immunantworten beteiligt sind, bleiben ihre spezifischen Rollen bei der Tumorimmunität und ihre kombinierten Wirkungen mit Immuntherapie unklar (7, 8).

Hier untersuchen wir die Arginin-Methylierungsfunktionen bei der Tumorimmunität aus drei Perspektiven: 1) Beteiligung des Krebs-Immunzyklus an Antitumorreaktionen, 2) Typ-I-Interferon (IFN)-Produktion und verwandte Signalwege und 3) intrinsische Tumorresistenzmechanismen. Unter Verwendung dieser Perspektiven liefern wir Beweise, die die neuen physiologischen Rollen von PRMTs bei der Krebsimmunität hervorheben, und wir fragen, ob PRMT-Inhibitoren mit einer Immuntherapie kombiniert werden können, um maximale und lang anhaltende therapeutische Wirkungen bei Krebs zu erzielen.

2 PRMTS

2.1 PRMT-Klassifizierung

Arginin-Methylierung bezieht sich hauptsächlich auf die Addition von Methylgruppen von S-Adenosylmethionin (SAM) an die Guanidinogruppen der Arginin-Seitenkette, die durch PRMTs katalysiert wird (9). Fünf potentielle Donoren von Wasserstoffbrücken befinden sich in der Guanidinogruppe, wobei die Argininrest-Methylierung einen potentiellen Wasserstoffbrückendonor entfernt, wodurch die Form des Argininrests verändert wird, ohne kationische Ladungen zu neutralisieren und in den meisten Zellen physiologische Wirkungen zu erzeugen (10, 11). 

Derzeit wurden neun PRMTs (PRMT 1–9) in Säugetierzellen identifiziert und in drei verschiedene Gruppen eingeteiltentsprechend der katalytischen Aktivität: 1) w-NG-Monomethylarginin (MMA) bezieht sich auf eine einzelne Methylgruppe, die an das endständige Stickstoffatom angefügt ist, 2) asymmetrisches w-NG-Dimethylarginin (aDMA) bezieht sich auf eine weitere Methylgruppe, die an demselben Guanidino platziert ist Gruppe basierend auf MMA, und wenn sie auf dem anderen endständigen Guanidino-Stickstoff platziert ist, bezieht sich dies auf 3) symmetrisches w-NG, N'Gdimethylarginin (CDMA). Typ-I-Enzyme (PRMT1, PRMT2, PRMT3, PRMT4 (CARM1), PRMT6 und PRMT8) katalysieren aDMA (12), während Typ-II-Enzyme (PRMT5 und PRMT9) CDMA katalysieren (13) und Typ-III-Enzyme (PRMT7) nur katalysieren MMA (Abbildung 1). PRMTs sind an vielen biologischen Prozessen beteiligt, einschließlich der Regulation der Genexpression, Reaktionen auf DNA-Schäden und Zellsignalisierung (Ergänzungstabelle 1). PRMTs sind vorherrschend und essentiell für menschliche Zellen, insbesondere PRMT1, das für 85 Prozent von aDMA verantwortlich ist und einen dramatischen Methylierungsverlust zeigt, wenn es ausgeschaltet ist (14).

Darüber hinaus wird spekuliert, dass zwischen PRMTs (15) viel Nebensprechen existiert. Der Verlust von PRMT1 verursacht die Freisetzung verschiedener Substrate, da sie nicht länger durch eine aDMA-Modifikation blockiert werden, wodurch diese Substrate zu PRMT-Targets vom Typ II und III wechseln (15). PRMTs haben jedoch einander ausschließende Funktionen, selbst wenn sie in vitro auf eine Vielzahl identischer Substrate angewendet werden (16).

2.2 PRMT-Funktionen in der Krebsbiologie

Frühere Studien berichteten, dass die erhöhte Expression von PRMTs mit der Tumorentstehung und einer schlechten Prognose bei mehreren Krebsarten korrelierte (17–19) (Ergänzungstabelle 2). Bis heute sind die meisten PRMTs an der Regulierung von Zellprozessen im Zusammenhang mit der Krebserhaltung beteiligt, einschließlich epigenetisch vermittelter Genexpression, mRNA-Splicing und DNA-Schadensreaktionen (20). Unter diesen Signalwegen ist die epigenetische Regulation ein herausragender Mechanismus, der die Zellaktivität beeinflusst, hauptsächlich aufgrund von PRMT, das aktivierte (Histon H4R3me2a, H3R2me2s, H3R17me2a und H3R26me2a) oder repressive (H3R2me2a, H3R8me2a, H3R8me2s und H4R3me2s) Histonmarkierungen ablagert, die fördern oder unterdrücken (bzw.) Schlüsselgene im Zusammenhang mit Tumoren (21). Frühe Studien zur Nicht-Histon-Methylierung identifizierten Rollen für PRMTs bei der konstitutiven und alternativen Spleißregulation (22, 23). Tatsächlich unterdrückte die PRMT5- und Typ-I-PRMT-Hemmung die sDMA- und aDMA-Funktionen in RNA-bindenden Proteinen, die an der Spleißregulation beteiligt sind, was zu Tumorunterdrückungsreaktionen in Tierleukämiemodellen mit Spleißfaktormutationen führte (24). Die Herunterregulierung der DNA-Schadensreparatur ist seit langem als zunehmende Genominstabilität anerkannt, um eine unkontrollierte Krebsentwicklung zu erzeugen (25). Da die Arginin-Methylierung von Proteinen, die mit der Reparatur von DNA-Schäden in Verbindung stehen, einschließlich MRE11, 53BP1 und hnRNPUL1, für die DNA-Reparatur durch homologe Rekombinationsreparatur und nicht-homologe Endverbindung erforderlich ist, wurden PRMT-Inhibitoren mit Chemotherapie kombiniert, um die Resistenz gegen zytotoxische Behandlungen zu überwinden (26 –28).

Diese ermutigenden Ergebnisse legen nahe, dass PRMTs eine starke und aufregende Rolle in der Krebsbehandlung spielen. Ein weiterer unerwarteter Befund war der synergistische Effekt der PRMT-Hemmung in Kombination mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs) (19). Daher könnten Studien zur Klärung der molekularen Mechanismen, die der PRMT-Verarmung oder -Hemmung zugrunde liegen, dazu beitragen, neue „medikamentöse“ Ziele für die Immuntherapie zu identifizieren.

3 PRMTs BEI KREBSIMMUNITÄT

In letzter Zeit ist die Immunonkologie zu einem bedeutenden Bereich in der Krebsbehandlung geworden, wobei ICIs als vielversprechende Monotherapien oder Kombinationstherapien zur Behandlung verschiedener Krebsarten identifiziert wurden (29). Die schrittweisen Ereignisse, die an der Induktion und Ausführung von Antikrebs-Immunantworten beteiligt sind, der sogenannte Krebsimmunitätszyklus, liefern eine theoretische Grundlage für die Tumorimmuntherapie (30). In diesem Zusammenhang ist es wichtig, das Zusammenspiel zwischen PRMTs und Komponenten im Krebs-Immunitätszyklus zu verstehen, da die Ausrichtung auf einen oder mehrere Zyklusschritte laufende Antitumor-Immunantworten verstärken und/oder neue stimulieren könnte. Viele Studien haben nun gezeigt, dass Typ-I-Interferon (IFN) entscheidend für die Antikrebs-Immunantwort ist, da IFN ein wichtiger Regulator und Mediator bei jedem Schritt des Krebsimmunitätszyklus ist (31, 32).

Daher könnte die Entwicklung sicherer und effizienter Agonisten zur Stimulierung von Typ-I-IFN vielversprechende Strategien für die Krebsimmuntherapie darstellen. In der Tat tauchen intrinsische Tumordefekte als molekulare Schlüsselfaktoren auf, die den Immunkontext verschiedener Krebsarten diktieren, mit behindernder Rolle bei lokalen Anti-Tumor-Immunantworten (33). Die Nutzung von Beziehungen zwischen intrinsischen tumorgenetischen Ereignissen und PRMTs ist erforderlich, um die Wirksamkeit von Inhibitoren zu maximieren und personalisierte Immuninterventionsstrategien zu entwickeln. Insgesamt werden die Identifizierung von Methylierungsereignissen im Krebs-Immunitätszyklus, die Charakterisierung der Typ-I-IFN-Produktion und die Aufklärung onkogener Signalwege umfassende und tiefgreifende Einblicke in PRMTs in der Immunonkologie liefern und zur Identifizierung neuer Ziele beitragen.

3.1 Die Rolle von PRMTs im CancerImmunity Cycle

Erhebliche Beweise deuten darauf hin, dass die Tumorimmunität kein isolierter Prozess ist, sondern eine Reihe von schrittweisen Ereignissen erfordert, die als "Krebs-Immunitätszyklus" bezeichnet werden, oder ein sich selbst verstärkender Prozess, bei dem jeder Schritt die Tumorentwicklung und -prognose beeinflusst, indem er positive regulatorische Signale verstärkt oder negative hemmt Regulationssignale (30, 34, 35). Die vollständige Entfernung bösartiger Tumore ist theoretisch erreichbar (30). In diesem Modell wird das Entweichen von Tumorzellen erreicht, indem spezifische Schritte im Krebs-Immunzyklus unterbrochen werden. Der Tumor-Immunzyklus beginnt mit der Freisetzung tumorassoziierter Neoantigene aus Tumorzellen, die von Antigen-präsentierenden Zellen wie dendritischen Zellen (DCs), B-Zellen und Makrophagen erkannt werden, um antigene Peptid-Major-Histokompatibilität (MHC) zu bilden. Komplexe. Reife DCs wandern vom Tumor zu sekundären lymphatischen Organen (SLOs), um antigene Peptid-MHC-Komplexe an CD4 plus T- und CD8 plus T-Zellen abzugeben (36). T-Zell-Rezeptoren (TCRs) erkennen diese Komplexe und erzeugen ein erstes Signal, gefolgt von der Hochregulierung des Transmembranproteins CD40L auf der Oberfläche von Th-Zellen. Und dann bindet CD40L an CD40 auf der Oberfläche von DCs, was die B7-Expression stark erhöht, und bindet anschließend stärker an CD28 auf der Oberfläche von Th-Zellen. Dieses duale Signal initiiert die Kostimulation von T-Zellen und produziert Zytokine, was zur Aktivierung von Effektor-T-Zellen gegen krebsspezifische Antigene führt. Aktivierte Effektor-T-Zellen wandern dann über den Kreislauf zum Tumor und erzeugen tumorinfiltrierende Immunzellen.

Schließlich erkennen TCRs auf CD8 plus T-Zellen den antigenen Peptid-MHC-I-Komplex und töten Zielkrebszellen ab, wobei Antigene von toten Krebszellen in den nächsten Zyklus freigesetzt werden (30). Die potenziellen Veränderungen werden durch Arginin-Methylierung im Krebs-Immunitätszyklus reguliert angezeigt (Abbildung 2).

3.1.1 PRMTs und Tumorantigenpräsentation

Viele Krebsarten entziehen sich der Immunabwehr, indem sie die Verarbeitung und Präsentation von MHC-Klasse-I-Antigenen (MHC-I) unterdrücken. MHC-I hat beträchtliche Aufmerksamkeit erregt, da es CD8 plus T-Zellen endogene Peptidantigene präsentiert, die Störung der Tumorerkennung hemmt und die Zytotoxizität von CD8 plus T-Zellen reduziert, die der primäre Effektor von Zelltypen für den ICB-Erfolg ist (4). Bei 40 bis 90 Prozent der menschlichen Tumoren wurde eine MHC-I-Herunterregulierung beobachtet, die die MHC:TCR-Interaktionen beeinflusst und die Erkennung von Krebszellen durch CD8 plus T-Zellen reduziert. IFN-regulatorische Faktoren (IRFs) und Nukleotid-bindende Domänen-Leucin-reiche Wiederholungs-enthaltende (NLR)-Familie CARD-Domäne mit 5 (NLRC5) werden häufig mit einer MHC-I-Herunterregulierung in Verbindung gebracht (37–40). Moleküle der MHC-Klasse II (MHC-II) werden hauptsächlich von spezialisierten Antigen-präsentierenden Zellen (APC) exprimiert und präsentieren exogene Peptid-Antigene hauptsächlich CD4 plus T-Zellen (41). Die Herunterregulierung von MHC-I oder MHC-II ist mit einer schlechten Krebsprognose, beeinträchtigten ICB-Antworten und reduzierten Tumorabstoßungsraten in Mausmodellen verbunden (42–44).

Eine kürzlich durchgeführte Studie berichtete, dass PRMT5 die MHC-I-Häufigkeit und die Antigenpräsentation kontrollierte, die die NLRC5-Transkription beeinflusste (19). Die Herunterregulierung von PRMT5 oder die pharmakologische Hemmung der PRMT5-Aktivität erhöhte die Expression von NLRC5 und seinen Zielgenen, die an der Antigenprozessierung und -präsentation beteiligt waren. NLRC5 ist ein Transkriptionsaktivator von MHC-I-Genen, wenn er mit Transkriptionsfaktoren gepaart wird, die mit regulatorischen Elementen des MHC-I-Promotors interagieren, wie dem SXY-Modul (39, 45). Der PRMT5-Knockdown erhöhte auch die NLRC5-Expression nach IFN-g-Behandlung und wurde von einer erhöhten MHC-I-Oberflächenexpression begleitet (19). Die NLRC5-Expression korrelierte umgekehrt mit der PRMT5-Expression in Krebszellen (46). Daher könnte das Targeting von PRMT5 eine vielversprechende Strategie sein, um die Häufigkeit von MHC-I zu erhöhen und die Antigenpräsentation zu fördern. Neben PRMT5 wurde gezeigt, dass mehrere andere PRMTs die MHC-I-Spiegel negativ regulieren.

In Monozyten verringerte die PRMT1-Hemmung die Anreicherung der zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Response-Element-Bindung (CREB) an der CRE-Stelle auf dem HLA-B (Major Histocompatibility Complex, Klasse I, B)-Promotor, um die MHC-I-Spiegel zu erhöhen (47). In PRMT7-Knockdown- oder PRMT7-Inhibitor-behandelten murinen Melanom-B16-Zellen werden MHC-I-Genregulatoren wie Nlrc5 und seine Zielgene ebenfalls hochreguliert, ähnlich wie in der MS023-Gruppe (PRMT1-Inhibitor) (48).

Es wurde gezeigt, dass PRMT1 den Klasse-II-Transaktivator (CIITA) methyliert, der ein Schlüsselregulator der MHC-II-Expression ist, und mit der Bindung des Transkriptionsfaktors an den MHC-II-Promotor assoziiert ist und mit dieser kooperiert (49). Die Arginin-Methylierung von CIITA führte zu seinem anschließenden Abbau und der Herunterregulierung der MHC-II-mRNA- und -Proteinspiegel (49). Eine kürzlich durchgeführte Studie berichtete, dass PRMT5 die MHC-II-Expression bei MYC-gesteuertem hepatozellulärem Karzinom negativ reguliert (50). MHC-II war auf tumorinfiltrierendem CD45.1 plus Leukozyten und DCs signifikant erhöht, wenn MYC-überexprimierende transgene Mäuse mit dem PRMT5-Inhibitor GSK3326595 behandelt wurden (50). PRMT5-Silencing in MYC-überexprimierenden hepatozellulären Karzinomzellen regulierte direkt die MHC-II-Expression, indem es die in vitro-H3R8me2s- und H4R3me2s-Anreicherung auf CIITA- und CD74-Promotoren verringerte (50).

Daher könnte das Targeting von PRMT5 mit kleinen molekularen Inhibitoren die Infiltration von Immunzellen in Lebertumore induzieren und die Antigenpräsentation durch MHC-II-Hochregulierung fördern. Eine andere Studie zeigte jedoch, dass die PRMT5--vermittelte Akkumulation von symmetrisch dimethyliertem Histon H3R2 (H3R2me2s) als Reaktion auf die IFN-g-Stimulation und von einer CIITA-Anreicherung am MHC-II-Promotor begleitet wurde; PRMT5 aktivierte die MHC-II-Transkription auf aktivitätsabhängige Weise (51). Diese unterschiedlichen Wirkungen von PRMT5 auf MHC-II-Transkriptionsprozesse könnten auf unterschiedliche Modelle zurückzuführen sein, daher sind weitere Studien erforderlich, um diese Fragen zu klären. CARM1 aktivierte auch die durch CIITA induzierte IFN-g-stimulierte MHC-II-Transkription in einer von der Arginin-Methyltransferase-Aktivität abhängigen Weise. Darüber hinaus methylierte CARM1 das CREB-Bindungsprotein an den Positionen R714, R742 und R768, wodurch eine Assoziation mit dem MHC-II-Promotor erleichtert und die MHC-II-Transkription durch CIITA synergistisch aktiviert wurde (52). Zusammen beeinflussten PRMTs die CIITA-vermittelte Induktion von MHC II durch IFN über verschiedene Mechanismen.

3.1.2 PRMTs vermitteln die Migration von Immunzellen, indem sie die Chemokine, CXCL10 und CXCL11 regulieren

Um Anti-Tumor-Aktionen auszuführen, wandern T-Zellen nach der Initiation in den Lymphknoten durch das Kreislaufsystem zum Tumor. Die CXCL9, -10, -11/CXCR3-Achse reguliert hauptsächlich die Migration, Differenzierung und Aktivierung von Immunzellen. CXCR3 ist ein oberflächenexprimierter Rezeptor für die Chemokine CXCL9, CXCL10 und CXCL11 auf Immun- und Krebszellen. Chemokine rekrutieren CTL, natürliche Killerzellen (NK), NK-T-Zellen und Makrophagen, erleichtern dann die Infiltration in Krebsgewebe über einen chemotaktischen Gradienten und lösen eine gerichtete Migration als Reaktion auf IFN-g aus, das synergistisch durch Tumornekrosefaktor-a verstärkt wird ( TNF-a) (53). Die subkutane Injektion letaler oder subletaler Dosen von Melanom-B16-Zellen in CXCR3-/-Mäuse begründet eine entscheidende Rolle für CXCR3 als Rezeptor für CXCL9, CXCL10 und CXCL11 während der CTL-Migration (54). Aus Tumoren stammende Chemokine sind auch für die Rekrutierung von Th2-Zellen, Tregs und myeloiden Suppressorzellen (MDSCs) verantwortlich (53). Daher spielen CXCL9, CXCL10 und CXCL11 entscheidende, nicht redundante, zellautonome Rollen, die die Infiltration von Immunzellen in Tumore vermitteln und eine wirksame Anti-Tumor-Immunität induzieren. Darüber hinaus unterdrückten die durch das Zeste-Homolog 2 (EZH2) vermittelte Histon-Lysin-Methylierung und die DNA-Methyltransferase -1 (DNMT-1)-vermittelte DNA-Methylierung die Produktion von CXCL9 bzw. CXCL10 und hemmten dann den T-Zell-Tumor Heimkehr.

Daher können Behandlungen mit epigenetischen Modulatoren diese Unterdrückung beseitigen und letztendlich die Krebsbehandlung verbessern (55). Diese Beobachtungen legen nahe, dass die epigenetische Reprogrammierung von Tumoren die T-Zell-Rekrutierung und die klinische Wirksamkeit der Tumorimmuntherapie regulieren kann, und dass die Arginin-Methylierung als weit verbreitete und kritische epigenetische Modalität diese Prozesse beeinflusst.

Die katalytische Strukturdomäne von CARM1 interagiert direkt mit p65, das sich in der Rel-Homologiedomäne des Kernfaktors kappa-B (NF-kB) befindet, und dient als wesentliches Dimerisierungsmotiv (56). In TNF-a-stimulierten CARM1-Knockdown-Zellen war die Rekrutierung von p65 zum CXCL10-Promotor signifikant fehlerhaft und die H3R17-Methylierung auf dem Promotor nicht nachweisbar, während die Wiedereinführung von CARM1 diese Reaktionen vollständig rettete, was darauf hindeutet, dass CARM1 für die Rekrutierung von p65 zum CXCL10-Promotor erforderlich war und H3R17-Methylierung (56). PRMT5 regulierte auch die p65-Assoziation mit dem CXCL10-Promotor, weil PRMT5 die Dimethylierung von R30- und R35-Stellen auf p65 und die DNA-Bindung und Kerntranslokation von p65 auslöste (57). Die TNF-a-Induktion von CXCL10 in Endothelzellen erforderte eine PRMT5--vermittelte p65-Arginin-Methylierung. Gemäß anderen Untersuchungen dieses Teams induzierte PRMT5 die R174-Dimethylierung auf p65, um die Bindung an den CXCL11-Promotor zu modifizieren (58).

Konsequenterweise erhöhte die PRMT5-symmetrische Dimethylierung von p65 an R30 seine Affinität für DNA und löste eine NF-kB-induzierte Genexpression aus (59). Im Gegensatz dazu erhöhte die Abschwächung der PRMT5-Aktivität durch kurze Haarnadel-RNA oder den niedermolekularen Inhibitor EPZ015666 in Melanom-B16-Zellen die CCL5- und CXCL10-Expression nach der Stimulation (19). PRMT5 methylierte auch IFI16, schwächte seine Bindung an intrazelluläre doppelsträngige DNA (dsDNA) ab und induzierte daher die CCL5- und CXCL10-Expression (19). Obwohl Wechselwirkungen zwischen PRMT1 und CXCL10 oder CXCL11 nicht beschrieben wurden, dimethylierte PRMT1 den konservierten R30-Rest von p65 asymmetrisch (60). Die PRMT1-Methylierungsstelle befindet sich im RxxRxRxxC-Motiv der p65-DNA-bindenden L1-Schleife (60). Methyliertes p65 hat eine geringe Affinität zu NF-kB-geteilten Oligonukleotiden; es regulierte die p65-DNA-Bindung und Transkriptionsaktivität negativ und verhinderte dadurch die NF-kB-Rekrutierung zu Zielgen-Promotoren (60).

Daher nehmen wir an, dass PRMT1 Chemokine auf Transkriptionsebene regulieren könnte. PRMT1, CARM1 und PRMT5 banden alle direkt an die Rel-Homologiedomäne von p65 aufgrund der Tatsache, dass die Wechselwirkung durch eine zentrale Region vermittelt wurde, die die Methyltransferase-Strukturdomäne enthielt, die evolutionär konserviert war (61). Insgesamt sind PRMT-Chemokin-Wechselwirkungen dynamisch und kontextabhängig, so dass symmetrische und asymmetrische Dimethylierung ausgleichen und in verschiedenen Stadien von NF-kB-Reaktionen auftreten können, wodurch unterschiedliche Effektormoleküle rekrutiert und verschiedene biologische Wirkungen erzeugt werden. Die Chemokinproduktion sollte gefördert werden, um die Rekrutierung tumorinfiltrierender Lymphozyten durch selektives Targeting unterschiedlicher PRMTs zu erleichtern.

3.1.3 Überwindung hemmender Netzwerke im TME

Das TME wird heute eher als komplexes Tumorökosystem denn als tumorzellzentriertes Wachstumsmuster angesehen (62). Um besser zu verstehen, wie das TME funktioniert, müssen wir seine extrazelluläre Matrix und die Zusammensetzung der Stromazellen verstehen. Stromazellen werden wie folgt kategorisiert; infiltrierende Immunzellen (IIC), angiogene Gefäßzellen und krebsassoziierte Fibroblasten (63). Antigen-spezifische infiltrierende Immunzellen umfassen angeborene Immunzelltypen (Makrophagen (Mjs), dendritische Zellen (DCs), MDSCs, NKs, Mastzellen, Neutrophile und adaptive Immunzellen (T- und B-Lymphozyten), die auf eine Vielzahl von Reizen reagieren) (64). Während diese Zellen zunächst aus umgebendem Gewebe oder Knochenmark rekrutiert werden, um Tumorgewebe zu umhüllen, werden sie schließlich „umerzogen“, um zu anderen Zelltypen zu werden, die chronische Entzündungen und Angiogenese erzeugen.

In dieser Umgebung kommunizieren Krebszellen und das umgebende Stroma miteinander, indem sie immunologisch nützliche Gene unterdrücken und eine anormale Signalübertragung induzieren, wodurch letztendlich starke Zytokine und Chemokine produziert werden, die die Immunüberwachung des Wirts beeinflussen, um das Wachstum, die Progression und die Metastasierung von Krebszellen aufrechtzuerhalten. Viele klinische Beweise zeigen nun, dass die TME die Wirksamkeit der Immuntherapie und die klinischen Ergebnisse erheblich beeinflusst und dass PRMTs neue therapeutische Ziele für die Tumorimmuntherapie bieten können, indem sie die TME in Richtung einer hohen Lymphozyteninfiltration modulieren.

3.1.3.1 Zielgerichtete T-Zell-Proliferation und -Differenzierung

Da CD8--wirksame T-Zellen die potentesten tumortötenden Zellen sind, sind T-Zell-Populationen hochaktuelle Forschungsthemen. CD8 plus zytotoxische T-Zellen und CD4 plus T-Helferzellen bilden T-Zell-Subpopulationen in der TME. Naive CD4-Plus-Zellen differenzieren sich hauptsächlich in vier unterschiedliche Populationen: T-Helfer-1 (Th1), Th2, Th17 und regulatorische T (Treg)-Zellen. Ihre Differenzierung wird durch Signalmuster bestimmt, die sie während ihrer anfänglichen Wechselwirkungen mit Antigenen erhalten (65). T-Zellen im TME üben nicht nur Anti-Tumor-Effektorfunktionen aus, sondern einige fördern das Tumorwachstum. Unter diesen spielen CD8 plus zytotoxische T-Zellen und Th1-Zellen, allgemein bekannt als CTLs, tumortötende Rollen. Letztere Zellen sind durch die Produktion von IFN-g, TNF-a und Interleukin (IL)-2 gekennzeichnet, die den ersteren Zelltyp unterstützen oder als zytotoxische T-Zellen wirken, um Tumorzellen direkt zu entfernen (66). Th2-Zellen unterstützen B-Zellen, indem sie IL-4, IL-5 und IL-13 freisetzen, während Th17-Zellen das Tumorwachstum fördern, indem sie IL-17, IL-21 produzieren und IL22 (65, 67). Darüber hinaus schwächen Tregs T-Zell-vermittelte Antitumor-Immunantworten ab, indem sie die T-Zell-Funktion und Zytokinproduktion direkt hemmen oder indirekt die Antigenpräsentation hemmen, um die T-Zell-Aktivierung zu verhindern (68, 69). Ein hohes Verhältnis von Tregs zu CD8 plus T-Zellen weist normalerweise auf eine schlechte Krebsprognose hin (70). CD8 plus zytotoxische T-Zellen können häufig die Tumorbildung während der Tumorentstehung aufgrund der T-Zell-Erschöpfung nicht hemmen, die als anhaltende Expression von T-Zell-inhibitorischen Rezeptoren und dem fortschreitenden Verlust der IFN-g-Produktion und Degranulationsfunktionen als Reaktion auf langfristige Faktoren definiert ist wie chronische Entzündung oder Krebsstimulation (71). IL-12 und IFN-g polarisieren naive CD4-plus-T-Zellen in Richtung Th1-Zellen durch Wirkungen des Signalwandlers und Aktivators des T-Box-Transkriptionsfaktors T-bet. Die Th2-Zelldifferenzierung erfordert GATA3, das IL-4 nachgeschaltet ist. Die Th17-Zelldifferenzierung erfordert den Retinoid-Related-Orphan-Rezeptor (ROR)gt, einen Transkriptionsfaktor, der durch den transformierenden Wachstumsfaktor (TGF-b) in Kombination mit IL-6, IL-21 und IL{{55} induziert wird }}. Die Treg-Zelldifferenzierung erfordert auch Forkhead Box P3 (FOXP3) als Transkriptionsfaktor.

Die umfassende Charakterisierung der Arginin-Methylierung in primären T-Zellen identifizierte die regulatorische Rolle von PRMTs bei Entscheidungen über das Schicksal von T-Zellen. Mittels Massenspektrometrie konnten Geoghegan et al. identifizierten 2.502 Arginin-Methylierungsstellen in 1.257 Proteinen in menschlichen T-Zellen (72). Auf der Liste standen Komponenten der T-Zell-Antigenrezeptor-Signalmaschinerie und wichtige Transkriptionsfaktoren, die die Schicksalsbestimmung von T-Zellen regulieren. Darüber hinaus quantifizierten diese Autoren Änderungen in der Arginin-Methylierungsbelegung während der primären T-Zell-Differenzierung und zeigten Änderungen in der Arginin-Methylierungs-Stöchiometrie während der Zellstimulation in einer Untergruppe von Proteinen, die für die T-Zell-Differenzierung entscheidend sind (72).

Drei unabhängige Studien mit T-Zell-spezifischen PRMT5--defizienten Mäusen bestätigten die Schlüsselrolle von PRMT5 bei der Aufrechterhaltung peripherer T-Zellen und der Lenkung des Übergangs von naiven T-Zellen zu einem Effektor/Gedächtnis-Phänotyp (73–75). Inoueet al. berichteten, dass im Vergleich zu Kontrollmäusen PRMT5-T-Zell-spezifische homozygote defiziente Mäuse niedrigere invariante NK (iNK) T-, CD4 plus T- und CD8 plus T-Zellzahlen aufwiesen. Außerdem war PRMT5 für das Überleben und die Proliferation von T-Zellen erforderlich (74). Tanakaet al. zeigten, dass PRMT5 entscheidend für den T-Zell-Übergang von einem naiven zu einem aktivierten Phänotyp und auch für die Aufrechterhaltung bereits reifer T-Zellen war (73). Lindsayet al. bestätigten auch, dass PRMT5 erforderlich war, um normale iNKT-, CD4 plus T- und CD8 plus periphere T-Zellpopulationen aufrechtzuerhalten (75). Sowohl die Aktivität der symmetrischen Arginindimethylierung als auch die PRMT5-Expressionsniveaus wurden in aktivierten T-Zellen signifikant induziert.

Darüber hinaus haben Inoue et al. berichteten auch, dass PRMT5 das Prä-mRNA-Spleißen von Il2rg und Jak3 erleichterte, um ihre Expressionsniveaus zu erhöhen und T-Zell-Populationen aufrechtzuerhalten. Il2rg codiert gc, eine Rezeptoruntereinheit, die von Zytokinen geteilt wird, einschließlich IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 und IL-21 (76). Die gc-Zytokinfamilie reguliert die Lymphozytenentwicklung streng und funktioniert über die Tyrosinkinasen JAK1 und JAK3 (77). Eine fehlerhafte Lymphozytenentwicklung, einschließlich T-, B-, NK- und iNKT-Zellen, wird bei Mäusen beobachtet, denen entweder gc oder JAK3 fehlt. Diese Autoren zeigten auch, dass die symmetrische Dimethylierung von Argininresten in Sm-Proteinen durch PRMT5 möglicherweise für durch PRMT5-Mangel verursachte Spleißveränderungen verantwortlich ist (74).

CD8 mit hoher Dichte plus zytotoxische T-Zellen sind bei vielen Krebsarten mit einer besseren Prognose assoziiert (78). Daher wurden in zahlreichen Studien Korrelationen zwischen PRMTs, CD8 plus T-Zell-Proliferation und der Fähigkeit zur Zytokinproduktion untersucht. Kumaret al. zeigten, dass die CARM1-Hemmung die Anzahl tumorinfiltrierender CD8-plus-T-Zellen erhöhte, die Granzym-B- und IFN-g-Expression und die Ki-67-Markerproliferation förderte, was eine stärkere Fähigkeit zur Tumorabtötung in CD8-plus-T-Zellen ermöglichte, was auf eine CARM1-Hemmung hindeutet verstärkte CD8 plus T-Proliferation und Zytokinproduktion (79). Kumaret al. zeigten auch, dass Carm1--Knockout-T-Zellen höhere Konzentrationen von Gedächtnis-CD8 plus T-Zell-assoziierten Transkriptionsfaktoren wie Tcf7 und Myb exprimierten (79). Myb förderte die Bildung von Gedächtnis-CD8 plus T-Zellen über die transkriptionelle Aktivierung von Tcf7 und Zeb2-Repression (80). Bemerkenswerterweise koexprimierten Carm1--Knockout-T-Zellen geringe Mengen der inhibitorischen Rezeptoren PD-1 und TIM3, die Erschöpfungsmarker von T-Zellen sind (79). Im Unterschied zu CARM1 unterdrückte die PRMT5-Hemmung die Induktion von tumorantigenspezifischen CD8 plus T-Zellen in vitro (81). PRMT-Methylierungsreaktionen wandelten SAM als methylspendenden Cofaktor in Sadenosyl-l-homocystein (SAH) um, während SAM auch in Methylthioadenosin (MTA) umgewandelt wurde. Sowohl SAH als auch MTA hemmten PRMTs in Rückkopplungsschleifen, während MTA die PRMT5-Aktivität wirksam hemmte (82). MTA reduzierte die Proliferation und Lebensfähigkeit von CD8-plus-T-Zellen, da es Effektorfunktionen in humanen Antigen-spezifischen CD8-plus-zytotoxischen T-Zellen hemmte, indem es die Degranulationskapazität von CD8-plus-T-Zellen verringerte und die IFN-g- und IL-2-Sekretion inhibierte dosisabhängig (81). Stroblet al. berichteten, dass der PRMT5--spezifische Methyltransferase-Inhibitor EPZ015666 die Proliferation, Lebensfähigkeit und Funktionalität von CD8 plus T-Zellen unterdrückte (83).

Zusätzlich assoziierten diese Autoren PRMT5 mit dem selektiven MDM4-Spleißen, das die Transduktion der p53-Signalkaskade induzierte, um den Zellzyklusarrest und die Apoptose in CD8-plus-T-Zellen zu vermitteln. Die PRMT5-Hemmung reduzierte auch die Signalübertragung von Proteinkinase B (AKT)/Säugerziel von Rapamycin (mTOR), was die Proliferation und das Überleben von CD8 plus T-Zellen beeinträchtigte (83).

CD28 band an B7 auf APCs und Co-Stimulation mit TCR verringerte die Aktivierungsschwelle von T-Zellen, wodurch CD4 plus T-Zell-Differenzierung und Zytokin-Expression vom Th2--Typ gefördert wurden (84). Blanchet al. berichteten, dass co-stimulierende CD28-Signale die Arginin-Methylierung in T-Zellen induzierten (85). Angesichts der Tatsache, dass SAH schnell durch S-Adenosyl-L-homocystein-Hydrolase (SAHase) eliminiert wurde und SAH die PRMT-Aktivitäten hemmte, dient SAHase als PRMTs-Aktivator. Pharmakologische SAHase-Blocker hemmten stark die Aktivierung mehrerer Schlüsselproteine, die durch TCR-Signale stimuliert wurden, darunter AKT, extrazellulär regulierte Proteinkinasen (ERK)1/2 und NF-kB. führt zu einer beeinträchtigten Aktivierung von CD4 plus T-Zellen (86).

Daher können PRMTs eine wichtige Rolle bei der Aktivierung und Differenzierung von CD4 plus T-Zellen spielen. Selektive Inhibitoren für PRMT5 könnten die Proliferation von Th2-Zellen unterdrücken (87). Webbet al. beobachteten, dass bei PRMT5-T-Zell-spezifischen homozygoten defizienten Mäusen der Anteil von IFN-g plus T-bet plus , IFN-g plus und T-bet plus T-Zellen während der Differenzierung von Th1-Zellen zunahm, die Gesamtzahl der differenzierten Th1-Zellen jedoch zunahm reduziert, mehr als wahrscheinlich aufgrund einer reduzierten Proliferation von Th1 (75). Zusätzlich beobachteten diese Autoren, dass der Prozentsatz von GATA-3 plus IL-4 plus und IL-4 plus T-Zellen während der Th2-Differenzierung zunahm (75). Die PRMT5-Hemmung verstärkte also die Differenzierung von CD4 plus T-Zellen, unterdrückte aber die Proliferation. Mechanistisch wurde gezeigt, dass SAHase-Inhibitoren die Arginin-Methylierung von Vav Guanine Nucleotide Exchange Factor 1 (Vav1), einem essentiellen Molekül, reduzieren, was zu einer eingeschränkten Aktivierung von CD4 plus T-Zellen führt (86, 88). Konsequenterweise sammelte sich Arginin-methyliertes Vav1 im Zellkern an und aktivierte den Transkriptionskomplex-Nuklearfaktor aktivierter T-Zellen (NFAT) und NF-kB, um die IL-2-Produktion und die T-Zell-Proliferation zu fördern (85). PRMT5 regulierte auch die IL-2-Transkription durch Methylierung bestimmter sDMA-haltiger Proteine ​​(89).

Darüber hinaus half die reduzierte IL-2-Sekretion durch PRMT5-Inhibitoren, die Proliferation und Differenzierung von Th1-Zellen zu unterdrücken (87). PRMT1 methylierte auch das NFAT-interagierende Protein NIP45, das eine Assoziation mit NFAT erleichterte, eine notwendige Modifikation für die NIP45--induzierte starke Steigerung der NFAT-Transaktivierung und PRMT1-Co-Aktivierung des IL-4-Promotors (90, 91). Zusammengenommen kontrollierten SAHase-Inhibitoren teilweise Proteine, die durch TCR-Signale durch reduzierte Vav1-Methylierung stimuliert wurden, wodurch die Aktivierung von CD4 plus T-Zellen gehemmt wurde. PRMT5 förderte auch die IL-2-Produktion durch Methylierung von Vav1 oder NF-45 und NF-90. Angesichts der Tatsache, dass IL-2 eine entscheidende Rolle bei der Polarisierung von naiven CD4-plus-T-Zellen zum Th2-Phänotyp und bei der T-Zell-Proliferation spielt, trugen die durch PRMT5 induzierten hohen IL-2-Expressionsniveaus zu CD4-plus-T-Zellen bei Differenzierung und Proliferation (92, 93).

Jüngste Studien zeigten, dass eine Arginin-Methylierungs-Dysregulation zur Th17-Differenzierung beitrug. Einerseits verhinderte die pharmakologische Hemmung von PRMT1 die Bildung von Th17-Zellen (94). Mechanistisch interagierte PRMT1 als Reaktion auf IL-6 und den transformierenden Wachstumsfaktor-b (TGF-b) mit einem Schlüsseltranskriptionsfaktor bei der Th17-Zelldifferenzierung, RORgt, und induzierte die IL-17-Transkription und -Expression, was charakterisierten den Th17-Phänotyp (94). Nach Kombination mit RORgt wurde PRMT1 an den IL-17-Promotor und asymmetrisch dimethyliertes Histon 4 Arginin 3 (H4R3) rekrutiert. Die Methylierung von H4R3 stabilisierte durch IL-6 aktiviertes STAT3 und entfernte durch IL-2 aktiviertes STAT5, wodurch die hemmende Wirkung von STAT5 auf den IL-17-Promotor abgeschwächt und die Th17-Differenzierung gefördert wurde (95).

Andererseits war die Th17-Differenzierung jedoch in einem T-Zell-spezifischen PRMT5-defizienten Modell stark behindert, wobei die Anzahl von RORgt-plus-IL17-plus-, IL-17-plus- und RORgt-plus-Th17-Zellen in diesem Modell sehr gering war (96). Diese Situation kann aus folgenden Gründen entstanden sein: PRMT5 dimethylierte SREBP1 an R321 symmetrisch, was seine Phosphorylierung an S430 hemmte und den Abbau von SREBP1 über den Ubiquitin-Proteasom-Weg verhinderte (96). Diese Veränderung förderte die Stabilität und transkriptionelle Aktivität von SREBP1, einem Gentransaktivator, der die Cholesterinbiosynthese fördert, was zur Akkumulation eines potenten endogenen RORg-Agonisten, Desmosterol (75, 97), führte.

Neben seinen Wirkungen auf die Cholesterinbiosynthese verstärkte PRMT5 auch die glykolytische Maschinerie zur Regulierung der Th17-Differenzierung. Die PRMT5-Hemmung unterdrückte die Expression des Glykolyse-regulierenden Faktors, des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1-a (HIF-1a), um die Th17-Differenzierung über die direkte transkriptionelle Aktivierung von RORgt und die Förderung des glykolytischen Signalwegs zu fördern ( 75, 83, 98). Insgesamt förderten PRMTs durch die Methylierung von Histonen zur Aktivierung des IL-17-Promotors und zur Regulierung der metabolischen Reprogrammierung, einschließlich der Glykolyse und des Lipidstoffwechsels nach der T-Zell-Aktivierung, die Th17-Differenzierung.

Für Treg-Zellen wurde FOXP3 als der schicksalbestimmende Transkriptionsregulator beschrieben, wobei hohe FOXP3-Spiegel und Stabilität für die immunsuppressive Aktivität von Treg-Zellen erforderlich sind (99, 100). PRMTs regulierten aktiv die Differenzierungs- und Unterdrückungsaktivität von Tregs, indem sie FOXP3 regulierten. Die PRMT1--katalysierte direkte Methylierung von FOXP3 an R48 und R51 verstärkte die unterdrückende Funktion von Treg-Zellen (101). In ähnlicher Weise könnte PRMT1 auch die Treg-Aktivität beeinflusst haben, indem es andere Proteine ​​reguliert, die mit FOXP3 interagieren, wie das Forkhead-Box-Protein O1 (FOXO1) und den Transkriptionsfaktor Runt-related Transcription Factor 1 (Runx1) (102, 103). PRMT1 methylierte FOXO1 an R248 und R250, um das Protein zu stabilisieren, und methylierte auch Runx1 an R206 und R21, um seine Transkriptionsaktivität zu potenzieren (104, 105).

Außerdem verstärkte die Behandlung mit dem PRMT1-Inhibitor AMI-1 die Empfindlichkeit von Treg gegenüber der TGF-b-induzierten FOXP3-Expression und erhöhte die Frequenz und die unterdrückende Wirkung von Tregs durch eine direkte Verstärkung der FOXP3-Expression (106, 107). Abgesehen von PRMT1 regulierte PRMT5 auch die FOXP3-Expression in naiven T-Zellen durch Beeinflussung der DNMT1-Expression, die die CpG-Methylierung im FOXP3-Promotor kontrollierte und daher die transkriptionelle Zugänglichkeit zu regulatorischen Regionen von FOXP3 verbesserte (108, 109). Zusätzlich beeinflusste die PRMT5-Hemmung die H3K27me3-Modifikation im FOXP3-Promotor und erleichterte die FOXP3-Expression (106). Da PRMT5 mit EZH2 interagierte, was in einer erhöhten H3K27me3-Ablagerung gipfelte, könnten H3K27me3-Veränderungen in PRMT5-defizienten Zellen durch PRMT5-EZH2-Wechselwirkungen induziert worden sein (110).

Im Gegensatz dazu beobachteten Yasuhiro et al. in einem Treg-Zell-spezifischen PRMT5--Mangelmodell, dass die unterdrückende Aktivität und der Wirkungs-/Gedächtnis-Phänotyp von Tregs reduziert waren, was aus dem verringerten symmetrischen Dimethylierungsmarker des FOXP3-R51-Locus (111 ). Diese Autoren entdeckten jedoch später, dass ein PRMT5-Mangel möglicherweise mit einer fehlerhaften Aufrechterhaltung, Aktivierung und Proliferation von Treg-Zellen über eine gestörte gc-Signalübertragung und nicht über methyliertes FOXP3 verbunden war (73).

3.1.3.2 Zielgerichtete Aktivierung und Differenzierung von B-Zellen

Während T-Zellen seit langem im Mittelpunkt der Tumorimmunitätsforschung stehen, sind andere Untergruppen von Immunzellen für dieses Gebiet relevant, insbesondere im Hinblick auf das Konzept der tertiären lymphoiden Struktur (TLS). Anstatt dass DCs von der Tumorstelle zu SLOs wandern müssen, postuliert die TLS-Hypothese, dass dieses Phänomen direkt in ektopischen lymphoiden Organen auftritt, erzeugt durch nicht-lymphoides Gewebe, das Tumorränder und Stroma infiltriert (112). Solche Strukturen bestehen aus einer CD3-plus-T-Zell-Zone und einer CD20-plus-B-Zell-Zone, wobei die erstere DCs enthält, die für DC-Lysosom-assoziiertes Membranglykoprotein und Fibroblasten-Retikulozyten positiv sind, und die letztere Keimzentren, Plasmazellen, follikuläre DCs und enthält Antigen-Antikörper-Komplexe (113). Beim TLS lösen tumorassoziierte Antigene eine B-Zell-Transformation in einen Effektor-/Gedächtnis-Phänotyp aus, der Antikörper produziert und Tumorantigene für T-Zellen präsentiert, wodurch die prognostische Funktion von CD8 plus T-Zellen verstärkt und das T-Zell-Wachstum gefördert wird (113). Erhöhte CD8-plus- und CD4-plus-T-Zellspiegel, die zusammen mit einer beträchtlichen Infiltration von CD20-plus-B-Zellen lokalisiert waren, waren mit einem langfristigen klinischen Überleben verbunden (114).

Darüber hinaus wurden mehrere Chemokine von B-Zellen sezerniert, um DCs, T-Zellen und NK-Zellen zu rekrutieren (113). Sowohl klinische Kohorten- als auch analytische Studien der TME identifizierten positive Korrelationen zwischen Patientenreaktionen auf die ICB-Therapie und B-Zell-Infiltration und TLS-Bildung. Diese Studien unterstrichen die bisher nicht gewürdigte Rolle von B-Zellen bei der menschlichen Anti-Tumor-Immunität, weshalb ICB-unempfindliche Tumore möglicherweise besser auf neue Therapien ansprechen, die auf die B-Zell-Aktivität abzielen (115–117).

PRMT1, PRMT5 und PRMT7 regulieren die Proliferation und Differenzierung von Prä-B-Zellen, die Keimzentrumsbildung und Antikörperreaktionen. Bei B-Zell-spezifischen PRMT1--defizienten Mäusen war die Anzahl der B-Zellen im Knochenmark und anderen peripheren lymphatischen Organen signifikant reduziert (118), während die B-Zell-Entwicklung im Prä-B-Zell-Stadium stark eingeschränkt war (119 ). Aktivierte B-Zellen zeigten erhöhte Spiegel von PRMT1 und Arginin-methyliertem Protein. Durch Herunterregulieren der rekombinationsaktivierenden Gene Rag1 und Rag2 blockierte FOXO1 das Fortschreiten der B-Zell-Differenzierung über das Pro-B-Zell-Stadium hinaus (120). Yamagataet al. zeigten, dass PRMT1 FOXO1 direkt methylierte, um die Phosphorylierung durch AKT und den anschließenden proteasomalen Abbau zu hemmen (105). Darüber hinaus methylierte PRMT1 auch die Iga-Untereinheit des B-Zell-Rezeptors (BCR), um die BCR-induzierte Syk-Aktivierung und die Phosphoinositid-3--Kinase (PI3K)-Signalübertragung zu hemmen, den FOXO-Proteinabbau zu blockieren und die Prä-B-Zell-Differenzierung zu fördern Proliferation (121, 122).

Somit regulierte PRMT1 B-Zell-Signalisierungsereignisse wie Klassenwechsel-Rekombination und Antigenauswahl über PI3K-FOXO1-Signalisierung negativ und erleichterte so die Entwicklung von Prä-B-Zellen zu unreifen B-Zellen. Zusätzlich vermittelte PRMT1 die Arginin-Methylierung von CDK4, destabilisierte den CDK4-Cyclin-D3-Komplex, induzierte den Zellzyklusarrest und förderte die Prä-B-Zell-Differenzierung (119). In einem PRMT1--defizienten Mausmodell mit peripherem B-Zell-Kompartiment war die Proliferation und Differenzierung reifer B-Zellen nach der Stimulation stark behindert, die Generierung von Keimzentrum-B-Zellen (GC-B) und die Aktivierung und Proliferation von Gedächtnis-B-Zellen waren defekt erheblich reduziert (121). PRMT1 behielt auch die Zahl der follikulären B (FO-B)-Zellen bei und förderte die Bildung des Keimzentrums (GC) nach Aktivierung der FO-B-Zellen (118). PRMT1 schützte aktivierte B-Zellen vor Apoptose, indem es die Expression von Überlebensproteinen der BCL2-Familie, MCL1, BCL2, A1 und BCLX regulierte (121).

Litzleret al. berichteten, dass sowohl das PRMT5-Protein als auch die sDMA-Spiegel in proliferierenden B-Zellstadien hochreguliert waren und dass PRMT5 das Überleben aktivierter B-Zellen förderte (123). PRMT5 war für die B-Zell-Entwicklung in Pro-B- und Prä-B-Zellen notwendig. PRMT5 schützte reife B-Zellen vor Apoptose und förderte die Proliferation und GC-Bildung, indem es die B-Zell-Transkription und die Spleißtreue regulierte (123). Darüber hinaus interagierte PRMT5 direkt mit BCL6 und methylierte es, um die BCL6--vermittelte Transkriptionsrepression zu erleichtern und so die GC-Bildung zu regulieren (124). Die BCL6-Zielgene Irf4 und Prdm1, die die Plasmazelldifferenzierung vermittelten, wurden ebenfalls durch PRMT5 herunterreguliert (123).

Unter Verwendung eines B-Zell-spezifischen PRMT7-Knockout-Mausmodells haben Ying et al. zeigten, dass der Verlust von PRMT7 die Entwicklung von B-Zellen beeinträchtigte, die Marginalzone B (MZ-B)-Zellen verringerte, die FO-B-Zellen erhöhte und die GC-Bildung nach der Immunisierung förderte (125). PRMT7-Depletion erhöhte die Bcl6-Expression durch Rekrutierung von H4R3me1 und symmetrischem H4R3me2 zum Bcl6-Promotor. Die Differenzierung von IgA- und IgG1--sekretierenden Plasmazell-Subtypen war auch bei PRMT7--defizienten Mäusen verringert, wahrscheinlich weil der PRMT7-Verlust eine Bcl6-Hochregulierung induzierte und Irf4 und Prdm1 in GC-B-Zellen hemmte (125 ).

3.1.3.3 Zielgerichtete Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM)-Differenzierung und die Expression anderer Immunzellen

Zunehmende Beweise deuten nun darauf hin, dass das TME Immunzellen verändert, um die Immunüberwachung und immunologische Reaktionen zu unterdrücken (126). Klassisch aktivierte M1-Makrophagen neigen dazu, Tumorzellen zu phagozytieren, indem sie eine entzündungsfördernde Umgebung schaffen und Th1- und CTL-Antworten erleichtern.

Alternativ aktivierte M2-Makrophagen wie TAMs fördern jedoch Tumorwachstum und -invasion, indem sie die Th2-Polarisation, die Tumorangiogenese und die Hemmung der Antitumor-Immunantworten fördern (127). DCs sind auf die Verarbeitung und Präsentation von Antigenen spezialisiert, während NKs Tumorzellen effizient identifizieren und Perforin/Granzym-vermittelte Zytotoxizität nutzen, um das Tumorwachstum zu begrenzen, während akkumulierte MDSCs eher herausragende immunsuppressive Wirkungen ausüben als sich in reife myeloide Zellen zu differenzieren (128).

Unter Verwendung eines myeloidspezifischen PRMT1-Knockout-Mausmodells haben Tikhanovich et al. zeigten, dass PRMT1 für die Differenzierung von M2-Makrophagen erforderlich war. PRMT1-Induktion wurde während der Monozyten-zu-Makrophagen-Differenzierung beobachtet, was zu einer H4R3me2a-Ablagerung auf dem Promotor des Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptors g (PPARg) führte, der die PPARg-Expression verstärkte (ein wichtiger Transkriptionsfaktor, der für die Differenzierung des M2-Phänotyps erforderlich ist). Die makrophagenspezifische Deletion von PPARg beeinträchtigte die Reifung von alternativ aktivierten M2-Makrophagen (129, 130). In Übereinstimmung mit dieser Studie induzierte PRMT1 die Makrophagenpolarisation zu M2-Typen und erhöhte die IL-6- und nachgeschaltete STAT3-Expression, indem es die PPARg-abhängige Makrophagen-Efferozytose förderte, um apoptotische Körper in einem Mausmodell des alkoholabhängigen hepatozellulären Karzinoms zu verbrauchen (131).

Außerdem verringerte der PRMT1-Mangel die M2-Typen über den c-Myc-vermittelten PPARg-Weg, der den Transport, die Efferozytose, die Phagozytose und die alternative Aktivierung von Makrophagen beeinflusste (132–134). PRMT1 methylierte auch c-Myc an R299 und R346, um seine Fähigkeit zur Bindung an p300 anstelle von HDAC1 hochzuregulieren. Diese verstärkte Rekrutierung des c-Myc-p300-Komplexes zu Genen löste die nachfolgende M2-Transkription aus, wie z. B. PPARg- und Mannose-Rezeptor-C-Typ-1(MRC1)-Promotoren (129).

Darüber hinaus beeinflussten PRMTs die c-MYC-Expression und -Funktion in anderen Zelllinien wie folgt: 1) PRMT1 und CARM1 hinterlegten H4R3me2a-Marker auf dem cMYC-Genpromotor, die von der Tudor-Domäne enthaltenden Protein 3 (TDRD3)-Topoisomerase IIIB (TOP3B )-Komplex und erleichterte c-MYC-Transkription (135). 2) PRMT5 methylierte die R218- und R225-Stellen im heterogenen nukleären Ribonukleoprotein A1 (hnRNP A1), um die von der internen Ribosomeneintrittsstelle (IRES) abhängige Translation von c-MYC zu regulieren (136). 3) Die enzymabhängige Hemmung der c-MYC-Polyubiquitinierung durch PRMT3 beseitigte den Ubiquitin-vermittelten C-MYC-Abbau (137), und 4) die PRMT5--vermittelte H4R3me2-Markierung war reich an c-Myc-Bindung an CANNTG E- Box-Elemente sowie geregelte MYC-Funktion (138).

PRMT6 förderte auch die Tumorprogression, indem es die Differenzierung der Makrophagen zum M2-Phänotyp statt zum M1-Phänotyp erleichterte und die Neoangiogenese des Tumors unterstützte. PRMT6 interagierte mit ILF2 beim Lungenadenokarzinom, um die Synthese von Hemmfaktoren für die Migration von Makrophagen zu regulieren, um eine alternative TAM-Aktivierung zu induzieren (139, 140).

Arginin-Methylierung wirkte sich außer auf Makrophagen auch auf andere Immunzellen aus. Mit dem niedermolekularen CARM1-Inhibitor EZM2302 behandelte Tumore wurden von einer großen Anzahl dendritischer Zellen, kreuzpräsentierender cDC1-Zellen und NK-Zellen infiltriert. Konsequenterweise wurde in einem PRMT5--Knockdown-Tumormodell eine höhere Häufigkeit von NKs, DCs und MDSCs im Vergleich zum Kontroll-Knockdown-Modell beobachtet (19, 79).

In Kombination spielen PRMTs eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der Makrophagendifferenzierung und der NK-, DC- und MDSC-Zellproliferation. Diese Funktionen bieten nicht nur neue Perspektiven für die alternative Aktivierung von Makrophagen, sondern könnten auch neue therapeutische Angriffspunkte für Krebs identifizieren.

3.2 PRMTs und IFN-Signalisierung vom Typ I

Typ-I-IFNs erleichtern die Krebs-Immunüberwachung, die Antitumor-Immunität und die Wirksamkeit der Immuntherapie auf verschiedene Weise, insbesondere durch die Stimulierung der DC-Reifung und die Verbesserung ihrer Fähigkeit, Antigene im krebseigenen Immunitätszyklus zu verarbeiten und zu präsentieren (141). Typ IFNs erhöhen auch die Expression von zytotoxischen Mediatoren in CTLs und hindern NK-Zellen daran, aktiviertes CD8 plus CTLs zu beseitigen, während sie gleichzeitig den Gedächtnisphänotyp aufrechterhalten und Treg-unterdrückende Funktionen beeinflussen (142). Wenn verschiedene Klassen von Mustererkennungsrezeptoren (PRR), einschließlich Toll-like-Rezeptoren (TLRs), RNA-sensierende Retinsäure-induzierbare Gene (RIG)-I-like-Rezeptoren (RLRs) und zytosolische DNA-Sensoren, Pathogen-assoziierte molekulare Muster erkennen oder schädigungsassoziierten molekularen Mustern wird die Rekrutierung von TBK1 zusammen mit der sukzessiven Aktivierung von IRF3/7 und NF-kB induziert, was herkömmlicherweise die Expression des IFN-stimulierten Gens (ISG) und die Typ-I-IFN-Erzeugung erhöht (143). Es ist denkbar, dass die geeignete Stimulation von Typ-I-IFNs und verwandten Signalwegen als wirksame Antitumor-Immuntherapien entwickelt werden könnten.

3.2.1 PRMT- und TLR-Signalwege

Pathogen-assoziierte molekulare Mustererkennung durch TLRs trägt zur transkriptionellen Hochregulierung verschiedener Gene bei. Tumornekrosefaktorrezeptor (TNFR)-assoziierter Faktor 6 (TRAF6) wurde als Schlüssel für den myeloiden Differenzierungsprimärantwort-88 (MyD88)-abhängigen Signalweg mit immunregulatorischen Funktionen identifiziert, der TLRs nachgeschaltet war (143). PRMT1 methyliert und deaktiviert TRAF6, um den TRAF6--abhängigen TLR-Weg zu unterdrücken. Diese Unterdrückung wurde durch die Jumonji-Domäne, die 6 (JMJD6) enthielt, umgekehrt, wobei TRAF6 durch JMJD6 demethyliert wurde. Das PRMT1/JMJD6-Verhältnis bestimmte die Aktivierung des MyD88--abhängigen TLR-Signalwegs. Die Arginin-Methylierung von TRAF6 war mit einer niedrigeren TRAF6- und nachgeschalteten NF-kB-Aktivität verbunden, während die Exposition gegenüber dem TLR-Liganden PRMT1 vorübergehend reduzierte, was zu einer TRAF6-Demethylierung durch JMJD6 und einer NF-kB-Aktivierung führte, dann, sobald das Signal beendet wurde, PRMT1 re- blockierte den TRAF6--abhängigen Signalweg (144) (Abbildung 3).

3.2.2 PRMTs und der RIG-I-Pfad

Im RIG-I-Weg wurde eine wichtige Rolle für PRMT5 bei der IFI16/IFI204-Methylierung identifiziert; IFI16/IFI204-Methylierung aktivierte dsRNA-induzierte RIG-I/TLR3--vermittelte Typ-I-Interferon-Antworten, obwohl IFI16/IFI204 normalerweise einem DNA-Sensorprotein diente (19, 145). PRMT7 bildete Aggregate, um das mitochondriale antivirale Signalprotein (MAVS) an R52 zu monomethylieren, wodurch dessen Wechselwirkung mit RIG-I und TRIM31--ausgelöster MAVS-K63--verknüpfter Polyubiquitinierung auf katalytisch abhängige Weise gehemmt wurde. Die MAVS-Aktivierung und nachgelagerte virusinduzierte molekulare Ereignisse (IRF3-, IkB- und STAT1-Phosphorylierung) wurden durch PRMT7 gehemmt, aber durch den PRMT7-Inhibitor SGC3027 gerettet (146). MAVS rekrutierte sowohl TRAF3 als auch TRAF6, um den MAVS/TRAF3/TRAF6-Komplex zu bilden, der mit TBK1 und IKK interagierte, um die IRF3- und Typ-I-IFN-Produktion zu aktivieren (147). In frühen Stadien der Virusinfektion wurde PRMT7 bei R32 automethyliert, wodurch seine enzymatische Aktivität und Aggregation deaktiviert wurde. SMURF1 wurde dann auf MAVS-abhängige Weise an PRMT7 rekrutiert, um die K48--verknüpfte Polyubiquitinierung von PRMT7 zu katalysieren, um seinen rechtzeitigen proteasomalen Abbau und die anschließende RIG-I-MAVS-Aktivierung sicherzustellen, während SMURF1 MAVS, TRAF3, TRAF6 oder USP25 in späteren Virusinfektionsstadien, um eine übermäßige RLR-Signalaktivierung zu vermeiden (146).

In Zebrafischen schwächten PRMT2, PRMT3 und PRMT7 die antivirale Reaktion ab, indem sie den RIG-IMAVS-Signalweg unterdrückten. Die Lys63--verknüpfte Autoubiquitinierung von TRAF6 wurde durch PRMT2--vermittelte asymmetrische Dimethylierung von R100 an TRAF6 verhindert, wodurch die nemoabhängige TBK1/IKKϵ-Signalgebung inaktiviert wurde (148). PRMT2 konkurrierte auch mit MAVS um die TRAF6-Bindung und verhinderte die Rekrutierung von TBK1/IKKϵ an MAVS (148). Durch die beiden zuvor erwähnten Mechanismen kontrollierte PRMT2 die IRF3/IRF7-Phosphorylierung und die Expression von Downstream-Typ-I-IFN-Genen (148). Diese Autoren schlugen auch vor, dass sowohl PRMT3 als auch PRMT7 die IRF3-Phosphorylierung beeinflussten und die IFN-Produktion unterdrückten, indem sie mit RIG-I interagierten (149, 150) (Abbildung 4).