Qualitätsmarker von Cistanches Herba basierend auf der Beziehung zwischen antioxidativem Spektrum und Wirkung

Abstrakt

Ziel: Etablierung einer Forschungsmethode für die Qualitätsmarker (Q-Marker) vonCistanches Herba(CH)basierend auf derBeziehung zwischen antioxidativem Spektrum und Wirkung, Bereitstellung einer Grundlage für die Untersuchung seiner pharmakologischen Substanzen undQualitätskontrolle. Methoden: Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UPLC) wurde verwendet, um Fingerabdruckprofile für 10 CH-Chargen zu erstellen. Unter Verwendung von H2O2 wurde ein Modell für oxidative Zellschäden erstellt und die antioxidative Kapazität von CH wurde basierend auf der halbmaximalen Hemmkonzentration reaktiver Sauerstoffspezies sowie den Spiegeln von Superoxiddismutase und Katalase als pharmakologische Indikatoren bestimmt. Die Spektrum-Effekt-Beziehung wurde durch Hauptkomponentenanalyse, Pearson-Korrelationsanalyse und partielle Regressionsanalyse der kleinsten Quadrate konstruiert. Die Wirkstoffe wurden einer pharmakologischen Validierung unterzogen. Ergebnisse: Fingerabdruckprofile für CH wurden mittels UPLC erstellt und 17 häufige Peaks identifiziert. Basierend auf einer Spektrum-Effekt-Korrelationsanalyse wurden neun Komponenten ausgewählt. Die pharmakologischen Validierungsergebnisse zeigten, dass Geniposidsäure, 8-Epilogansäure,Echinacosid, Akteosid,Isoacteosid, UndTubulosid Azeigte eine konzentrationsabhängige antioxidative Aktivität. Schlussfolgerung: Diese Studie untersuchte Q-Marker für CH auf der Grundlage der Spektrum-Wirkungs-Beziehung und lieferte Referenzinformationen für die pharmakologische Substanzgrundlage und die Verbesserung des Qualitätsstandards.

Schlüsselwörter:Cistanches Herba; Q-Marker;Spektrum-Wirkungs-Beziehung; Antioxidans

BIO-CISTANCHE-EXTRAKT MIT 30 % ECHINACOSID UND 12 % ACTEOSID FÜR DIE NIERENFUNKTION

Cistancheist der getrocknete, fleischige Stängel mit schuppigen Blättern von Cistanche deserticola YCMa oder Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, einer Pflanze der Gattung Cistanche aus der Familie der Orobanchiaceae. Es wurde erstmals in der „Materia Medica von Shen Nong“ erwähnt und wird als Bestnote aufgeführt [1]. Es ist von warmer Natur, süß und salzig im Geschmack; es kehrt zu den Nieren- und Dickdarmmeridianen zurück; Es hat die Wirkung, das Nieren-Yang zu nähren, die Essenz und das Blut wieder aufzufüllen, den Darm zu befeuchten und abzuführen, und ist ein wichtiges Arzneimittel zur Tonisierung der Niere und zur Wiederauffüllung der Essenz [2-3]. Die Nieren speichern Essenz, und Essenz und Blut stammen aus derselben Quelle. Wenn es an Essenz und Blut mangelt, wirkt sich dies auf die gesamten Lebensaktivitäten des menschlichen Körpers aus; Das essenzproduzierende Mark wird in den Knochen gespeichert und das Gehirn ist das Markmeer. Wenn die Nierenessenz nicht ausreicht, verlieren die Knochen ihre Nährstoffe und das Gehirn leidet, was zu degenerativen Knochenveränderungen wie lockerer Textur, Zahnverlust, Gedächtnisverlust, Demenz und verminderter Immunfunktion führt [4-6]. Cistanche deserticola enthält Phenylethanolglycoside, Iridoide, Lignane und andere Strukturkomponenten, einschließlich Echinaceaside, Verbascosid, Isorbascosid, Genipinsäure und 8-Epistryansäure. , Tubulin A usw. [7]. Die aktuelle Qualitätskontrolle von Cistanche deserticola in der Ausgabe 2020 des „Arzneibuchs der Volksrepublik China“ schreibt lediglich den Gehalt an Echinaceaside und Verbascosid vor, was die Mehrkomponenten- und Multizielwirkungsmerkmale der traditionellen chinesischen Medizin nicht vollständig widerspiegeln kann. , was seiner Qualitätskontrolle und Bewertung nicht förderlich ist.

Um das Qualitätskontrollniveau der traditionellen chinesischen Medizin zu verbessern und die Qualitätsbewertung der traditionellen chinesischen Medizin zu optimieren, schlug der Akademiemitglied Liu Changxiao das neue Konzept des Qualitätsmarkers (Q-Marker) der traditionellen chinesischen Medizin vor [8]. Unter ihnen ist „Wirksamkeit“ das Kernelement der „Fünf Prinzipien“ des Q-Markers [9] und auch der Kern der Qualitätsbewertung traditioneller chinesischer Arzneimittel.

Angesichts des aktuellen Forschungsstands einer schlechten Korrelation zwischen Qualitätsstandards und Arzneimittelwirksamkeit ist die Erforschung von Q-Markern traditioneller chinesischer Arzneimittel und die Festlegung wissenschaftlicherer und angemessenerer Qualitätsstandards von großer Bedeutung für die Verbesserung der Qualität traditioneller chinesischer Arzneimittel. Die Spektrum-Wirkungs-Beziehung besteht darin, die Fingerabdruck-Chromatographie-Peaks der traditionellen chinesischen Medizin mit spezifischen pharmakodynamischen Daten zu verknüpfen, um die wirksamen Substanzen der traditionellen chinesischen Medizin zu finden und so die inhärente Qualität der traditionellen chinesischen Medizin widerzuspiegeln [10]. Die Erstellung eines mathematischen Modells der spektralen Effizienz kann den QMarker der traditionellen chinesischen Medizin aus einer „ganzheitlichen Sicht“ verdeutlichen und mehr Referenz für die spätere Qualitätskontrolle der traditionellen chinesischen Medizin, die Formulierung von Qualitätsstandards und das Screening von Wirkstoffen liefern. Diese Studie verwendet Fingerabdrücke in Kombination mit der Halbhemmungsrate reaktiver Sauerstoffspezies (ROS IC50), den Gehalten an Superoxiddismutase (SOD) und Katalase (CAT), um die Spektrum-Wirkungs-Beziehung der traditionellen chinesischen Medizin zu untersuchen, und verwendet eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) ), Pearson-Korrelationsanalyse (PCC) und partielle Regressionsanalyse der kleinsten Quadrate (PLS), um den Q-Marker von Cistanche deserticola umfassend zu analysieren und eine Grundlage für seine Qualitätskontrolle zu schaffen.

1 Material

1.1 Beispiel

Cistanche deserticolawurde im Yutian County, Xinjiang und der Cistanche deserticola Good Agricultural Practice (GAP)-Anbaubasis in der Inneren Mongolei geerntet. Es wurde vom Forscher Zhang Tiejun vom Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. als Cistanche tubulosa (Schenk) Wight und Cistanche deserticola identifiziert.

YC Ma, detaillierte Informationen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

1.2 Arzneimittel testen

Echinaceaside (Chargennummer: 111670-201907, Reinheit: 91,8 %) und Verbascosid (Chargennummer: 111530-201914, Reinheit: 95,2 %) wurden beide vom China Institute of Food and Drug Control gekauft; Isorescoside (Chargennummer: 61303-13 -7), Salidrosid (Chargennummer: 10338-51-9), 8-Epistrychonsäure (Chargennummer: 82509-41-9), Genipinsäure (Chargennummer: Z24A10X95926) , Tuberosin B (Chargennummer: 112516-04-08), 2-Acetyleugenolglycosid (Chargennummer: 94492-24-7) wurden von Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. gekauft, Reinheit größer oder gleich 98 %; Cistanche-Glykosid A (Chargennummer: MUST -20062806, Reinheit: 98,51 %) und Vasculin A (Chargennummer: MUST19110102, Reinheit: 98,57 %) wurden von Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd. gekauft; chromatographisch reines Acetonitril und Ameisensäure wurden von der Tianjin Concord Technology Co., Ltd. Company bezogen; Gereinigtes Wasser (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). Vitamin E (VE, V8010, Beijing Solarbio Company);

Dimethylsulfoxid (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company, USA); CellTiter 96® AQueous Einzellösungs-Zellproliferations-Nachweiskit (G3580, Promega Company, USA); Das CAT-Nachweiskit (S0051), das SOD-Aktivitätsnachweiskit (S0101M) und das ROS-Nachweiskit (S0033S) wurden von Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. erworben.

1.3 Instrumente

Waters H-Klasse-PDA-Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatograph (Waters Company, USA); Elektronische Waage Sartorius BT25S (Firma Sartorius, Deutschland); Hochgeschwindigkeits-Desktopzentrifuge H1650 (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

Mikroplatten-Lesegerät (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); WYS-41XDY biologisches Mikroskop (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 Zellen

In diesem Experiment wurden menschliche embryonale Nierenzellen HEK 293-Zellen verwendet, die von der Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften erworben wurden.

2 Methoden

2.1 Erstellung einer Fingerabdruckkarte

2.1.1 Vorbereitung der Testlösung: 2 g medizinisches Material aus Cistanche deserticola abwiegen, die 10-fache Menge Wasser hinzufügen, 3-mal erhitzen und unter Rückfluss halten, jeweils 1 Stunde, bei 1 zentrifugieren.0 ×105r·min-1 für 15 Minuten (Zentrifugalradius beträgt 300 mm), Überstände kombinieren und konzentrieren, um eine Stammlösung mit einer Massenkonzentration von 100 mg·mL-1 herzustellen, diese 10-fach verdünnen, und filtern Sie es durch eine 0,22 µm mikroporöse Filtermembran, um es zu erhalten.

2.1.2 Herstellung einer gemischten Referenzlösung

Nehmen Sie 8-Epistrrychninsäure, Salidrosid, Echinaceaside, Cistancheglycosid A, Genipinsäure, Verbascosid, Anthocyanosid A, Isorbascosid und 2'-Acetyleugenol. Glykosid und Angiosid B-Referenzsubstanz wurden in geeigneten Mengen abgemessen und genau abgewogen. Fügen Sie zum Auflösen eine 50 %ige Methanollösung hinzu und bereiten Sie eine gemischte Referenzsubstanzlösung mit einer Massenkonzentration von 20 µg·mL–1 vor.

2.1.3 Chromatographische Bedingungen

ACQUITY UPLC®BEH C18-Säule (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm); Die mobile Phase ist Acetonitril (A) ~ 0,1 % Ameisensäurelösung (B), Gradientenelutionsprogramm (0 ~ 6 Min., 5 % ~ 8 % A; 6 ~ 10 Min., 8 % ~ 15 % A ; 10–13 Min., 15–19 % A, 13–20 Min., 19–25 % A); Detektionswellenlänge beträgt 237 nm; Die Flussrate beträgt 0,4 ml·min –1; Die Säulentemperatur beträgt 40 Grad. Das Injektionsvolumen beträgt 3 µL.

2.1.4 Auswahl des Referenzpeaks

Im Ultra-Performance Liquid Chromatography (UPLC)-Chromatogramm von Cistanche deserticola wurde der Peak mit dem größten Peakflächenverhältnis, mäßiger Retentionszeit und guter Trennung als Referenzpeak des Fingerabdruckspektrums ausgewählt.

2.1.5 Methodische Überprüfung

Präzisionstest: Nehmen Sie die T1-Probe und bereiten Sie die Testlösung gemäß der Methode unter 2.1.1 vor. Injizieren Sie die Probe 6 Mal hintereinander und zeichnen Sie den Fingerabdruck auf. Die Ergebnisse zeigen, dass die relative Peakfläche RSD jedes Peaks 0,10 % ~ 4,61 % und die relative Retentionszeit RSD 0,08 % ~ 1,32 % beträgt, was darauf hinweist, dass das Instrument gut ist Präzision.

Wiederholbarkeitstest: Nehmen Sie die T1-Probe und bereiten Sie parallel 6 Proben der Testlösung gemäß der Methode unter 2.1.1 vor und injizieren Sie die Probe kontinuierlich. Die Ergebnisse zeigen, dass die relative Peakfläche RSD jedes chromatographischen Peaks 1,35 % bis 4,8 0 % beträgt und die relative Retentionszeit RSD 0,10 % bis 1,80 % beträgt, was den Anforderungen des Fingerabdrucks entspricht und die Wiederholbarkeit zeigt des Instruments ist gut.

Stabilitätstest: Nehmen Sie die T1-Probe und bereiten Sie die Testlösung gemäß der Methode unter 2.1.1 vor, injizieren Sie Proben zum Testen nach 0, 2, 4, 8 und 12 Stunden und zeichnen Sie den Fingerabdruck auf. Der berechnete RSD der relativen Peakfläche jedes chromatographischen Peaks beträgt 0,53 % bis 4,82 %, und der RSD der relativen Retentionszeit beträgt 0,09 % bis 2,17 %, was den Anforderungen entspricht des Fingerabdrucks und zeigt an, dass das Testprodukt innerhalb von 12 Stunden stabil ist.

2.2 Forschung zur antioxidativen Wirkung von Cistanche deserticola

2.2.1 Zubereitung der Mutterlauge aus Cistanche deserticola

Nehmen Sie die Mutterlauge gemäß Punkt 2.1.1, filtrieren und sterilisieren Sie sie und verdünnen Sie sie vor der Verwendung mit Kulturmedium auf die erforderliche Konzentration.

2.2.2 Cistanche deserticola und Positivkontrolle

Die Wirkung von VE auf die Lebensfähigkeit von HEK 293-Zellen wurde als normale Gruppe (Zellsuspension), Cistanche deserticola-Verabreichungsgruppe (25, 50, 100, 200, 400 µg·ml–1) und VE-Gruppe (20, 40, 60) festgelegt , 80, 100 µmol·L–1), 6 doppelte Vertiefungen für jede Konzentration anlegen, 24 Stunden kultivieren, 20 µL CellTiter 96® AQueous Einzellösungsreagenz in jede Vertiefung geben, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu ermitteln, 2 Stunden weiter kultivieren, und verwenden Sie ein Mikroplatten-Lesegerät, um die Lebensfähigkeit der Zellen bei 490 nm zu ermitteln. Der Absorptionswert (OD) jeder Vertiefung wurde zur Berechnung der Zellüberlebensrate gemäß Formel (1) verwendet. Überlebensrate (%)=(OD-Versuchsgruppe/OD-Leergruppe) × 100 % (1)

2.2.3 Cistanche deserticola auf H2O2-Induktion

Wirkung von ROS auf HEK 293-Zellen. Die Zellen wurden in eine normale Gruppe (Zellsuspension) und eine Cistanche deserticola-Verabreichungsgruppe (6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg·mL–1 Cistanche deserticola und 60 µm·L–1 H2O2) unterteilt und 24 Stunden lang kultiviert. Befolgen Sie die Schritte des ROS-Erkennungskits für nachfolgende Vorgänge, beobachten Sie die Zellfärbung direkt durch ein Mikroskop und verwenden Sie ein Mikroplattenlesegerät, um die Fluoreszenzintensität jeder Gruppe zu erkennen. Die Parametereinstellungen verwendeten eine Anregungswellenlänge von 488 nm und eine Emissionswellenlänge von 525 nm. Das Experiment wurde dreimal wiederholt.

2.2.4 Cistanche deserticola-Paar

Wirkung von H2O2 auf SOD in HEK 293-Zellen. Die Zellen wurden in eine normale Gruppe (Zellsuspension), eine Modellgruppe (60 µm·L–1 H2O2), eine VE-Gruppe (60 µm·L–1 VE und 60 µm·L–1 H2O2) und eine Cistanche deserticola-Verabreichungsgruppe (100) eingeteilt µg·mL–1 Cistanche deserticola und 60 µm·L–1 H2O2), sammeln Sie die Zellen nach 24-stündiger Kultur, geben Sie SOD-Probenvorbereitungslösung hinzu, um die Zellen zu lysieren, und zentrifugieren Sie bei 4 Grad und 12.000 U/min{{22} } min (Zentrifugationsradius beträgt 300 mm), nehmen Sie den Überstand als zu testende Probe und befolgen Sie die Schritte des SOD-Nachweiskits für nachfolgende Vorgänge. Der Versuch wurde dreimal wiederholt.

2.2.5 Cistanche deserticola auf H2O2-Induktion

Die Auswirkungen von CAT auf HEK 293-Zellen wurden gemäß der Methode in 2.2.4 behandelt und in Gruppen eingeteilt. Nach der Behandlung Lyselösung hinzufügen, 10 Minuten lang bei 4 Grad und 12.000 U/min-1 zentrifugieren (der Zentrifugalradius beträgt 300 mm), den Überstand entnehmen und die Schritte des CAT-Nachweiskits für nachfolgende Vorgänge befolgen . Der Versuch wurde dreimal wiederholt.

2.2.6 Statistische Analyse

Für die statistische Analyse wurde die Software SPSS 26.0 verwendet. Jede Datengruppe wurde durch (±±() dargestellt. Eine einfache Varianzanalyse wurde für die Daten durchgeführt, die der Normalverteilung entsprachen. Wenn die Varianzen gleich waren, wurde die Methode der niedrigstsignifikanten Differenz verwendet. Wenn die Varianzen gleich waren ungleichmäßig, wurde die T3-Methode von Dunnett für die grafische Darstellung verwendet, und P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Spektrum-Wirkungs-Korrelationsanalyse des Antioxidans Cistanche deserticola

2.3.1 PCA Die Peakflächen der gemeinsamen Peaks von 10 Chargen Cistanche deserticola, die Fingerabdrücke festgestellt haben, wurden durch den Z-Wert normalisiert und in eine Datenmatrix der Ordnung 10×17 umgewandelt, die in die Software SPSS 26.0 importiert wurde für PCA.

2.3.2 PCC

SPSS 26.0 wurde zur Durchführung einer bivariaten Analyse verwendet, um die spektrale Effizienzbeziehung zwischen Fingerabdrücken von Cistanche deserticola und Antioxidantien zu untersuchen. Der Signifikanztest wurde mit einem zweiseitigen Test (T) durchgeführt, wobei P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 Bitte

Importieren Sie die experimentellen Ergebnisse der standardisierten Peakfläche und des Antioxidans von Cistanche deserticola in die Software SIMCA-P 14.1, legen Sie die Peakfläche als X-Variable und den pharmakodynamischen Index als Y-Variable fest, um PLS durchzuführen.

2.4 Überprüfung der antioxidativen Aktivität des Cistanche deserticola Q-Markers

2.4.1 Herstellung der Mutterwirkstofflösung. Wiegen Sie die entsprechenden Mengen an Genipinsäure, 8-Epistrichnsäure, Echinaceaside, Verbascosid, Isorebascosid und Anthocyanosid A genau ab und fügen Sie DMSO hinzu, um sie in 10 mmol·L-1 Referenzlösung aufzulösen.

2.4.2 Einfluss von Wirkstoffen auf die Zytotoxizität von HEK 293.

Geben Sie nach 24-stündiger Inkubation der HEK 293-Zellen unterschiedliche Konzentrationen der Wirkstofflösungen unter 2.4.1 in jede Vertiefung (0.781, 1.563, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 µmol·L–1 ) 100 µL, kontinuierliche Stimulation

Nachdem die Zellen 24 Stunden lang inkubiert wurden, wurde das Einzellösungsreagens CellTiter 96® AQueous zugegeben, um die Lebensfähigkeit der Zellen festzustellen.

2.4.3 Die antioxidative Schädigungswirkung von Wirkstoffen auf H2O2-induzierte HEK 293-Zellen.

Die Zellen sind wie folgt gruppiert: Normalgruppe, Modellgruppe und VE-Gruppe werden gemäß 2.2.4 gruppiert. Versuchsgruppe (0.781, 1.563, 3.125 µm·L–1 Aktivitätszusammensetzung und 60 µm·L–1 H2O2), 24 Stunden lang kultiviert. Bestimmen Sie die intrazellulären ROS-Spiegel, SOD- und CAT-Enzymgehalte gemäß den Methoden unter 2.2.3, 2.2.4 bzw. 2.2.5.

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