Quantifizierung der Neuritendegeneration mit erhöhter Genauigkeit und Effizienz in einem In-vitro-Modell der Parkinson-Krankheit, Teil 1

Abstrakt

Die Degeneration von Neuriten wird mit frühen Stadien neurodegenerativer Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit (PD) und der amyotrophen Lateralsklerose in Verbindung gebracht. Eine Methode, die üblicherweise zur Analyse der Neuritendegeneration verwendet wird, umfasst die Berechnung eines Degenerationsindex (DI) nach der Verwendung des Analyze Particles-Tools von ImageJ, um Neuritenfragmente in mikroskopischen Aufnahmen kultivierter Zellen zu erkennen. DI-Analysen sind jedoch anfällig für verschiedene Arten von Messfehlern, können zeitaufwändig in der Durchführung sein und sind in ihrer Anwendung begrenzt.

Neurodegeneration bezieht sich auf Veränderungen, die in oder um Neuronen auftreten und sich auf die kognitiven Funktionen, die Intelligenz, Emotionen, das Verhalten usw. des Menschen auswirken können. Viele Menschen denken, dass Neurodegeneration eng mit einer Verschlechterung des Gedächtnisses zusammenhängt, aber das ist möglicherweise nicht der Fall.

Erstens bedeutet Neurodegeneration nicht unbedingt, dass das Gedächtnis mit zunehmendem Alter nachlässt. Manche Menschen können ein gutes Gedächtnis behalten und sind sogar in der Lage, Gerechtigkeit zu verstehen. Dies liegt daran, dass das Gedächtnis einer Person durch eine Kombination von Faktoren wie Bewegung, Ernährung und Lebensstil beeinflusst wird.

Zweitens kann das menschliche Gehirn neue neuronale Verbindungen wiederherstellen und neue Erinnerungen bilden, was als Plastizität bezeichnet wird. Unabhängig vom Alter lernt das Gehirn ständig und bildet neue Erinnerungen. Daher ist Neurodegeneration einfach eine natürliche Veränderung im Gehirn und bedeutet nicht zwangsläufig, dass sich das Gedächtnis verschlechtert.

Schließlich kann die Aufrechterhaltung einer optimistischen Einstellung auch das Gedächtnis einer Person verbessern. Sorgen und Stress können negative Auswirkungen auf das Gehirn haben und zu Gedächtnisverlust führen. Eine positive Einstellung kann die Gesundheit des Gehirns fördern und das Gedächtnis und die kognitiven Fähigkeiten verbessern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Neurodegeneration nicht unbedingt zu Gedächtnisverlust führt und eine optimistische Lebenseinstellung uns dabei helfen kann, ein gutes Gedächtnis und eine gute kognitive Leistungsfähigkeit zu bewahren. Daher sollten wir eine optimistische Einstellung bewahren und das Training, die Ernährung und das Lebensstilmanagement stärken, um die Gesundheit des Gehirns und das Gedächtnis zu erhalten. Es ist ersichtlich, dass wir unser Gedächtnis verbessern müssen. Cistanche kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche auch das Gleichgewicht von Neurotransmittern regulieren kann, beispielsweise durch die Erhöhung des Acetylcholinspiegels und der Wachstumsfaktoren. Diese Stoffe sind sehr wichtig für das Gedächtnis und das Lernen. Darüber hinaus kann Fleisch auch die Durchblutung verbessern und die Sauerstoffversorgung fördern, wodurch sichergestellt werden kann, dass das Gehirn ausreichend Nährstoffe und Energie erhält, wodurch die Vitalität und Ausdauer des Gehirns verbessert wird.

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Hier beschreiben wir eine verbesserte Methode zur Durchführung von DI-Analysen. Die Genauigkeit der Messungen wurde durch die Änderung der Auswahlkriterien für die Erkennung von Neuritenfragmenten, die Entfernung von Bildartefakten und Nicht-Neuritenmaterialien aus Bildern sowie die Optimierung des Bildkontrasts verbessert. Solche Verbesserungen wurden in ein ImageJ-Makro implementiert, das eine schnelle und vollständig automatisierte DI-Analyse mehrerer Bilder ermöglicht. Das Makro umfasst Operationen zur automatisierten Entfernung von Zellkörpern aus mikroskopischen Aufnahmen und erweitert so die Anwendung von DI-Analysen auf den Einsatz in Experimenten mit dissoziierten Kulturen.

Wir präsentieren experimentelle Ergebnisse, die belegen, dass die verbesserte Analysemethode im Vergleich zur herkömmlichen Methode Messungen mit höherer Genauigkeit liefert und deutlich weniger Zeit für die Durchführung benötigt.

Darüber hinaus demonstrieren wir den Nutzen der Methode zur Untersuchung der Neuritendegeneration in einem Zellkulturmodell der Parkinson-Krankheit, indem wir ein Experiment durchführen, das die Auswirkungen der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK) auf die durch oxidativen Stress in menschlichen mesenzephalen Zellen induzierte Neuritendegeneration aufdeckt. Diese verbesserte Analysemethode kann verwendet werden, um neue Einblicke in die Faktoren zu gewinnen, die der Neuritendegeneration und dem Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen zugrunde liegen.

Schlüsselwörter:

Axonale Degeneration; Degenerationsindex; Neuritendegeneration; Neurodegeneration; oxidativen Stress; Parkinson-Krankheit.

Bedeutungserklärung

Neuritendegeneration ist ein zelluläres Ereignis, das mit den frühen Stadien mehrerer Arten neurodegenerativer Erkrankungen verbunden ist. Molekulare Faktoren, die die Neuritendegeneration regulieren, sind nach wie vor kaum verstanden, und bestehende Methoden zur Untersuchung der Neuritendegeneration sind nur begrenzt anwendbar und effizient. Hier identifizieren wir Modifikationen eines weit verbreiteten Verfahrens zur Analyse der Neuritendegeneration, die Messfehler reduzieren.

Solche methodischen Verbesserungen wurden in ein ImageJ-Makro integriert und ermöglichten so eine schnelle und vollständig automatisierte Analyse der Neuriten-Degeneration anhand großer Mengen mikroskopischer Aufnahmen. Anhand eines Zellkulturmodells der Parkinson-Krankheit (PD) zeigen wir, dass das Makro genauere und effizientere Messungen der Neuritendegeneration ermöglicht und gleichzeitig die Eignung der Analysemethode für Experimente mit dissoziierten Kulturen erweitert.

Einführung

Die Neuritendegeneration ist ein zellulärer Prozess, bei dem Axone oder Dendriten fortschreitende Funktionsstörungen und morphologische Veränderungen erfahren, was zu einem Verlust der Neuritenintegrität führt. Die Neuritendegeneration ist ein evolutionär konservierter Prozess, der für den ordnungsgemäßen Aufbau neuronaler Netzwerke während der Entwicklung des Zentralnervensystems von entscheidender Bedeutung ist (Neukomm und Freeman, 2014).

Der Prozess wird jedoch auch als Reaktion auf verschiedene Formen von Verletzungen ausgelöst, wie etwa mechanische Schäden oder die Exposition gegenüber Medikamenten, die zur Chemotherapie eingesetzt werden (Salvadores et al., 2017). Darüber hinaus ist die Neuritendegeneration mit dem Fortschreiten verschiedener altersbedingter neurodegenerativer Erkrankungen verbunden, darunter Alzheimer, Parkinson, Huntington und amyotrophe Lateralsklerose.

Interessanterweise gibt es bei allen solchen neurodegenerativen Erkrankungen zunehmend Hinweise darauf, dass die Neuritendegeneration ein wichtiges Ereignis im Frühstadium ist, das dem Absterben von Neuronen oder dem Auftreten klinischer Symptome vorausgeht (Serrano-Pozo et al., 2011; Adalbert und Coleman, 2013; Marangoni et al ., 2014; Suzuki et al., 2020). Daher könnten Studien zur Erforschung von Faktoren, die diesen zellulären Prozess regulieren, neue Angriffspunkte für die Behandlung verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen aufzeigen.

Die Untersuchung der Neuritendegeneration ist besonders wichtig für das Verständnis der Parkinson-Krankheit, einer Krankheit, die durch die Ansammlung von Proteinaggregaten, die a-Synuclein enthalten, den fortschreitenden Verlust dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra pars compacta (SNpc) und die Entwicklung einer Vielzahl motorischer und kognitiver Symptome gekennzeichnet ist (Aarsland et al., 2017).

Hinweise aus postmortalen und bildgebenden Untersuchungen am Menschen deuten darauf hin, dass a-Synuclein-Aggregate in neuronalen Fasern häufiger vorkommen als in den Zellkörpern und dass der Abbau dopaminerger Axone im SNpc in der Zeit bis zum klinischen Ausbruch in größerem Ausmaß erfolgt als der Verlust dopaminerger Neuronen (Tagliaferro und Burke, 2016).

Während die molekularen Wechselwirkungen, die zur fortschreitenden Verschlechterung dopaminerger Neuriten beitragen, noch unvollständig verstanden sind, deuten neuere Erkenntnisse darauf hin, dass die Neuritendegeneration durch Ereignisse vermittelt werden kann, die unabhängig von Signalkaskaden sind, die dem neuronalen Tod zugrunde liegen (Fukui, 2016; Geden und Deshmukh, 2016). Daher sind Studien, die die physiologischen Grundlagen der Neuritendegeneration direkt bewerten, von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von Therapien, die das frühe Fortschreiten der Parkinson-Krankheit verhindern.

Als Reaktion auf die Hinweise auf eine zentrale Rolle der Neuritendegeneration beim Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die Neuritendegeneration mithilfe von mikroskopischen Aufnahmen kultivierter Neuronen zu messen. Beispielsweise wurden mehrere verschiedene Methoden zur Messung der Neuritendegeneration mithilfe von Software zur Erkennung einer verringerten Neuritenanzahl oder -länge etabliert (Ofengeim et al., 2012; Johnstone et al., 2018).

Da solche Methoden die Neuritenfragmentierung jedoch nicht direkt bewerten, kann die Interpretation der Ergebnisse zur Bestimmung des Einflusses einer Variablen auf die Neuritendegeneration durch die möglichen Auswirkungen der Variablen auf das Neuritenwachstum verfälscht werden. Bestimmte Forschungsgruppen haben auch die Degeneration von Neuriten gemessen, indem sie Bilder von Neuriten anhand morphologischer Merkmale und des Grades der offensichtlichen Fragmentierung subjektiv bewertet haben (Zhai et al., 2003; Nakamura et al., 2016; Krishtal et al., 2017). Diese alternative Methode ist jedoch zeitaufwändig und kann zu Fehlern des Untersuchers führen.

Eine Methode, die eine objektive und direkte Messung der Neuritenfragmentierung ermöglicht, beinhaltet die Verwendung des Analyze Particles-Algorithmus von ImageJ, um die Fläche von Neuritenfragmenten in mikroskopischen Aufnahmen kultivierter Zellen zu messen. Die Messungen werden zur Berechnung eines Degenerationsindex (DI) verwendet, einer Skala zwischen {{0}}.0 und 1,0, die den Grad der Neuritendegeneration widerspiegelt (Sasaki et al., 2009).

Während DI-Analysen verwendet werden können, um unterschiedliche Grade der Neuritenfragmentierung zu erkennen, wird die Genauigkeit der Messungen häufig durch mehrere Fehlerquellen eingeschränkt, und die Anwendung der Methode war in erster Linie auf Explantatkulturen oder Zellen beschränkt, die in kompartimentierten Mikrofluidikgeräten gezüchtet wurden. Darüber hinaus sind DI-Analysen zeitaufwändig, wenn sie auf große Bildmengen extrapoliert werden. Daher haben wir versucht, diese Einschränkungen zu überwinden, indem wir das DI-Analyseverfahren modifiziert haben, um eine höhere Genauigkeit und Effizienz zu ermöglichen und gleichzeitig die Anwendbarkeit zu erweitern.

In der vorliegenden Studie identifizieren wir mehrere Fehlerquellen, die häufig mit DI-Analysen verbunden sind, und berichten über methodische Überarbeitungen, die die verschiedenen Fehlerformen reduzieren. Wir integrieren die Verfahrensverbesserungen in ein ImageJ-Makro namens Automated Neurite Degeneration Index (ANDI), um DI-Analysen aus großen Bildsätzen vollständig zu automatisieren. Für den Betrieb des ANDI-Makros sind ausschließlich Software und Dateien erforderlich, die Open Source und frei verfügbar sind. Mithilfe von ANDI erhaltene Messungen profitieren von einer höheren Genauigkeit und reduzieren gleichzeitig den Zeitaufwand für die Durchführung der Analysen erheblich.

Darüber hinaus zeigen wir, wie die neue Analysemethode angewendet werden kann, um eine genaue und schnelle Messung der Neuritendegeneration in einem Zellkulturmodell der Parkinson-Krankheit durchzuführen, an dem dissoziierte Zellen beteiligt sind, die ohne Kompartimentierung gezüchtet wurden. Zusammengenommen können diese methodischen Verbesserungen zu neuen Erkenntnissen über die Faktoren führen, die einem wichtigen zellulären Prozess im Zusammenhang mit der Neurodegeneration zugrunde liegen.

Materialen und Methoden

Zellkultur

Kulturen menschlicher mesenzephaler Lund-Zellen (LUHMES) wurden in Lab Tek II-Kammerobjektträgern mit acht Vertiefungen angelegt, die mit Poly-L-Ornithin (PLO) und Fibronektin, Poly-D-Lysin (PDL) und Laminin, allen vier Substraten oder nicht, beschichtet waren Untergründe, wie angegeben. Zur Beschichtung mit PLO und Fibronektin wurden die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur mit einer Lösung inkubiert, die 200 mg/ml PLO enthielt (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P3655).

Nach dem Waschen mit sterilem Wasser (Avantor) wurden die Objektträger mit 2 mg/ml Fibronektin (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. F0895) 3 Stunden lang bei 37 Grad inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger mit sterilem PBS (Corning Life Sciences, Katalog-Nr. 21-040-CV) gewaschen und an der Luft trocknen gelassen. Zur Beschichtung mit PDL und Laminin wurden die Objektträger bei Raumtemperatur mit einer Lösung inkubiert, die 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P7280) und 10 mg/ml Laminin (Corning, Katalog-Nr. 354232) enthielt.

Nach einer Inkubation über Nacht wurden die Objektträger mit sterilem PBS gewaschen und an der Luft trocknen gelassen. Um alle vier Substrate zu beschichten, wurden die oben genannten Verfahren nacheinander durchgeführt. LUHMES-Zellen (ATCC, RRID: CVCL_B056) wurden in den beschichteten Kammerobjektträgern mit den angegebenen Dichten in Differenzierungsmedium bestehend aus DMEM/F12 (Invitrogen, Katalog-Nr. 11330057), ergänzt mit 2 mM Glutamin (VWR), ausplattiert. 1 % (v/v) N-2-Ergänzung, 1 mg/ml Tetracyclin (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. 87128-25G), 1 mM N6, 29-Odibutyryladenosin cAMP (db-cAMP). ; Enzo Life Sciences, Katalog #BML-CN125-0100) und 2 ng/ml aus Gliazelllinien abgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF; R&D Systems, Katalog #212-GD-010).

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Kulturen mit einer Dichte von 115 000 Zellen pro Vertiefung ausplattiert. Bis zur Behandlung wurde alle 48 Stunden ein 50-prozentiger Medienaustausch durchgeführt. Um eine genetische Drift zu verhindern, wurden für alle Experimente Zellbestände verwendet, die sechs oder weniger Mal passagiert wurden.

Experimente mit Primärkulturen sympathischer Neuronen wurden vom Animal Care and Use Committee der Eastern Kentucky University oder der University of Virginia genehmigt. Obere Halsganglien wurden von postnatalen C56Bl/6-Mäusen vom Tag 0–6 präpariert, bei 37 Grad in einem enzymatischen Dissoziationspuffer inkubiert und mit Wachstumsmedium gewaschen, um proteolytische Enzyme zu entfernen, und verrieben.

Zellsuspensionen wurden mit einer Dichte von 7000 Zellen pro Vertiefung in Lab Tek II-Kammerobjektträgern mit acht Vertiefungen ausplattiert. Die Medien wurden am Tag in vitro (DIV) 1 gewechselt, gefolgt von einem Medienaustausch jeden zweiten Tag. Die Medien wurden mit Cytosin-Arabinofuranosid (Ara-C, Millipore-Sigma) auf DIV1–DIV3 ergänzt, um das Wachstum nicht-neuronaler Zellen zu verhindern, gefolgt von der Entfernung von Ara-C aus den Medien für mindestens 24 Stunden vor der angegebenen Behandlung. Für an der Eastern Kentucky University durchgeführte Experimente zur Behandlung mit Wasserstoffperoxid wurden die Kammerobjektträger mit 200 mg/ml PLO (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P3655), 2 mg/ml Fibronektin und 100 ng/ml PDL (Sigma-Aldrich, Katalog) beschichtet #P7280) und 10 mg/ml Laminin (Corning, Katalog-Nr. 354232) vor der Verwendung, und die Dissoziation wurde durch 30-minütige Inkubation in Puffer bestehend aus DMEM (ThermoFisher, Katalog-Nr.11960- 044) mit 0,025 % durchgeführt. Trypsin (Corning Life Sciences, Katalog-Nr.25-053-CI) und 0,3 % Kollagenase (Worthington Biochemical, Katalog-Nr. LS004176).

Wachstumsmedien für solche Experimente bestanden aus DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Invitrogen, Katalog-Nr.26140-079), 2 mM L-Glutamin (Corning, Katalog-Nr.25-005-CI) und 40 ng/ml Nervenwachstumsfaktor (Fisher Scientific, Katalog #13-257-019); 5 mM Ara-C (Sigma-Aldrich) wurde zur Entfernung nichtneuronaler Zellen verwendet.

Für an der University of Virginia durchgeführte Experimente mit NGF-Entzug wurden die Zellen auf Kammerobjektträgern ausplattiert, die mit 100 ng/ml PDL (Millipore Sigma) und 10 mg/ml Laminin (Invitrogen) beschichtet waren, und die Dissoziation erfolgte über 20-min Inkubation in Puffer bestehend aus DMEM/F12, der BSA (10 mg/ml, Sigma-Aldrich), Kollagenase Typ 2 (4 mg/ml, Worthington Biochemical), Desoxyribonuklease 1 (Millipore Sigma) und Hyaluronidase (Sigma-Aldrich) enthält. Wachstumsmedien für solche Experimente bestanden aus DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Invitrogen), 1 U/ml Penicillin/Streptomycin (Invitrogen) und 45 ng/ml NGF (gereinigt aus Speicheldrüsen); 10 mM Ara-C wurden zur Entfernung nicht-neuronaler Zellen verwendet.

Zellbehandlungen

Differenzierte LUHMES-Zellen wurden am fünften Tag im Differenzierungsmedium den angegebenen Konzentrationen von {{0}}Hydroxydopamin (6-OHDA; Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. 162957) oder Vehikellösung ausgesetzt. Vorräte an 6- OHDA wurden in gekühltem PBS mit 0,02 % Ascorbat (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. A5960) hergestellt und Aliquots wurden in lichtgeschützten Fläschchen unter Inertgas bei 80 Grad gelagert. Nach 24-stündiger Behandlung wurden die Zellen durch 25-minütige Inkubation in PBS mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei Raumtemperatur fixiert.

Um die Rolle der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK) bei der durch oxidativen Stress induzierten Neuritendegeneration zu bestimmen, wurden Kulturen 1 Stunde lang mit 10 mM SP600125 (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. S5567) oder Vehikellösung vorbehandelt vor dem vollständigen Austausch der Medien durch Medien mit 7,5 mM 6-OHDA, 7,5 mM 6-OHDA und 10 mM SP600125 oder Vehikellösungen. Vorräte an SP600125 wurden durch Auflösen des Inhibitors in sterilem Dimethylsulfoxid (DMSO) hergestellt und gefrorene Aliquots wurden in lichtgeschützten Fläschchen, die mit Inertgas gefüllt waren, bei 20 Grad gelagert. Die Behandlungen wurden so durchgeführt, dass die Zellen nicht mehr als 0,1 % DMSO ausgesetzt wurden.

Primärkulturen sympathischer Neuronen wurden auf DIV5 behandelt. Für Experimente mit durch Wasserstoffperoxid induzierter Neuritendegeneration wurden die Kulturen 500 mM Wasserstoffperoxid (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. H1009-100ML) oder einer Vehikellösung bestehend aus sterilem Wasser (Cytiva, Katalog-Nr. SH30529.02) ausgesetzt. für 24 Std.

Bei Experimenten mit NGF-Entzug erhielten die SCG-Kulturen entweder einen Medienersatz durch Wachstumsmedien oder wurden einem NGF-Entzug unterzogen. SCG-Kulturen, denen NGF entzogen werden sollte, wurden dreimal mit NGF-freiem Wachstumsmedium gespült und dann 80 Stunden lang ohne Medienwechsel in NGF-freiem Wachstumsmedium inkubiert. Nach der Behandlung wurden die Zellen durch 30-minütige Inkubation in 4 % PFA in PBS fixiert, gefolgt von der Entfernung des PFA durch Spülen mit PBS.

Färbe- und Fluoreszenzmikroskopie

Für Experimente mit LUHMES-Zellen sowie für Experimente mit mit Wasserstoffperoxid behandelten sympathischen Neuronen wurden Kammerobjektträger mit acht Vertiefungen, die fixierte Zellen enthielten, mit 0,1 % Triton X-100 in PBS permeabilisiert und blockiert 1 Stunde mit 10 % normalem Ziegenserum in PBS mit 0,1 % Triton X-100. Die Objektträger wurden dann mit einem für b I-Tubulin spezifischen Primärantikörper (Covance; 1:1000, RRID: AB_2313773) in einer Blockierungslösung bei 4 Grad über Nacht inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger mit PBS gewaschen, mit einem an Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_142495) gekoppelten Sekundärantikörper 90 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und weiteren Waschvorgängen unterzogen.

Für Experimente mit Tyrosinhydroxylase (TH)-Färbung wurden die Objektträger einer zusätzlichen Inkubation in PBS unterzogen, das 10 % normales Ziegenserum und 0,1 % Triton X-100 enthielt, einen für TH spezifischen Antikörper (Sigma- Aldrich, 1:400, AB152) bei 4 Grad über Nacht. Die Objektträger wurden dann mit PBS gewaschen, mit einem sekundären Antikörper, der an Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_1500889) gekoppelt war, inkubiert und weiteren PBS-Waschvorgängen unterzogen.

Nach Abschluss der Immunmarkierung für b III-Tubulin oder TH wurden die Objektträger 5 Minuten lang mit 5 mg/ml 49,69-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; Katalog-Nr. D9542) in PBS inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger mit PBS gewaschen und die Deckgläser mit dem Eindeckmedium Fluoromount G (Southern Biotech, Katalog-Nr. 0100-01) montiert.

Für Experimente mit sympathischen Neuronen, die einem NGF-Entzug ausgesetzt waren, wurden die Objektträger 1 Stunde lang durch Inkubation bei Raumtemperatur in einem Puffer blockiert, der aus 5 % normalem Ziegenserum (Life Technologies) und 0.0005 % bestand. Triton Anschließend wurden die Objektträger mit PBS gespült, 1 Stunde lang in Ziegen-Anti-Maus-IgG Alexa Fluor 488 (1:800, Invitrogen) und 0,1 mg/ml Hoechst 33342 (Invitrogen) in Blockierungspuffer inkubiert, weiteren PBS-Spülungen unterzogen und zugelassen trocknen. Die Objektträger wurden mit Fluoromount-G (Southern Biotech, Katalog-Nr. 0100-01) montiert und bei Raumtemperatur gelagert.

Objektträger, die LUHMES-Zellen enthielten, wurden mit einem 20-Objektiv eines invertierten Nikon Eclipse II Ti-U-Mikroskopsystems mit einer 4-Kanal-LED-Lichtquelle von Lumencor Mira sichtbar gemacht. 1280 1024-Pixelbilder wurden mit einer Nikon DSQi1Mc 5 MP CCD-Kamera und NIS Elements 3.22.15 (Build 738) aufgenommen. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Phasenkontrastbilder mit Lichtintensitäts- und Belichtungszeiteinstellungen aufgenommen, die eine durchschnittliche Hintergrundintensität von 165 in 8--Bit-Bildern ergaben.

Um Hintergrundschattierungen oder andere Inkonsistenzen zu reduzieren, wurde vor jeder Mikroskopiesitzung ein Bild einer leeren Vertiefung aufgenommen und zur Hintergrundkorrektur während der LUHMES-Zellbildgebung verwendet. Objektträger mit sympathischen Neuronen, die an der Eastern Kentucky University oder der University of Virginia kultiviert wurden, wurden mit einem Zeiss LSM 800-Mikroskopsystem bzw. einem Zeiss LSM 980-Mikroskopsystem abgebildet. Die Bilder wurden mit der Zen-Software (Carl Zeiss Microscopy) bei 20-facher Vergrößerung und 1024 1024-Auflösung aufgenommen.

Analyse der Zelllebensfähigkeit

Differenzierte LUHMES-Zellkulturen wurden auf Lab Tek II-Kammerobjektträgern mit acht Vertiefungen angelegt, die wie angegeben mit verschiedenen Substraten beschichtet wurden. Alle 48 Stunden wurde ein Medienwechsel von 50 % durchgeführt und die Zellen wurden am sechsten Tag der Differenzierung mit 4 % PFA in PBS fixiert. Objektträger mit fixierten Zellen wurden einer Färbung mit DAPI unterzogen und Bilder der Kernfärbung wurden mit einem invertierten Mikroskopsystem Nikon Eclipse II Ti-U und einer Nikon DS-Fi1 5 MP CCD-Kamera aufgenommen.

Die Zellen wurden von einem verblindeten Untersucher anhand des Aussehens der Zellkerne als gesund oder ungesund eingestuft. Zellen mit verringerter Kernfläche oder Kernfragmentierung wurden als ungesund bewertet. Die Anzahl gesunder Zellen pro Bild wurde in jedem Experiment für mindestens fünf Sichtfelder pro Bedingung bewertet.

DI-Messungen

Herkömmliche DI-Messungen wurden mit einem Fiji Is Just ImageJ (FIJI)-Paket durchgeführt, das ImageJ 1.52p enthielt, und zwar über eine Methode, die häufig zitierte Parameter für die DI-Analyse einbezog (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al., 2020; Shin und Cho, 2020). Acht-Bit-Bilder differenzierter LUHMES-Zellen mit gut getrennten Axonbahnen wurden einer Binarisierung unter Verwendung des Standard-Binarisierungsalgorithmus unterzogen, wobei binäre Optionen so konfiguriert waren, dass ein Bild mit schwarzen Zellen im Vordergrund und einem weißen Hintergrund erzeugt wurde.

Mit dem Freihand-Zeichenwerkzeug wurden alle Bildbereiche mit Zellkörpern manuell nachgezeichnet, und alle schwarzen Pixel wurden in den nachgezeichneten Bereichen in weiße umgewandelt. Das Messwerkzeug von ImageJ wurde verwendet, um den gesamten schwarzen Bereich der binarisierten Bilder zu messen, die ausschließlich Neuriten enthielten. Anschließend wurde das Werkzeug „Partikel analysieren“ mit einer Größeneinstellung von 20–10,000 Pixeln und einer Zirkularitätseinstellung von 0,2–1,0 angewendet, um Neuritenfragmente zu erkennen. Die summierte Fläche aller Neuritenfragmente wurde dann durch die gesamte schwarze Fläche dividiert, um den DI des Bildes zu berechnen.

Für Experimente im Zusammenhang mit der Optimierung von Größenparametern zur Identifizierung von Neuritenfragmenten wurden für alle Partikelmessungen Zirkularitätskriterien von {{0}}.2–1.00 verwendet. Das von Wayne Rasband entwickelte Particle Remover-Plugin (Version 20{{10}}4/02/09 wurde von https://imagej.nih.gov/ bezogen. Wo angegeben, wurde die Anwendung des Partikelentferner-Plugins mit Größenparametern von 0–9 Pixeln und Zirkularitätsparametern von 0,0–1,0 durchgeführt, um kleine, nicht-neuritische Objekte aus binarisierten Bildern zu entfernen, die aus Phasenkontrast-Mikrofotografien erhalten wurden.

In ähnlicher Weise wurden Größenparameter von {{0}}–4 Pixel und Zirkularitätsparameter von 0–1,0 verwendet, um kleine Objekte aus binarisierten Bildern zu entfernen, die aus Fluoreszenzmikroskopaufnahmen erhalten wurden, die die b III-Tubulin-Immunfärbung darstellen. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Phasenkontrastbilder vor der DI-Analyse einer Kontrastverstärkung unterzogen, indem ImageJ verwendet wurde, um eine Lookup-Tabelle (LUT) mit einem Minimum von 90 und einem Maximum von 205 anzuwenden.

Messung der künstlichen Fragmentierung

Kulturen, die gesunde LUHMES-Zellen enthielten, wurden am sechsten Tag der Differenzierung mit 4 % PFA fixiert und für b III-Tubulin immunmarkiert. Mit einem 20-Objektiv wurden 1280 1024-Pixel-Phasenkontrast-Mikroaufnahmen und Fluoreszenz-Mikroaufnahmen, die jeweils identische Sichtfelder darstellten, aus zufällig ausgewählten Regionen aufgenommen. Insgesamt wurden zehn Bildersätze aus neun verschiedenen Kulturen aufgenommen.

ImageJ wurde verwendet, um binarisierte Kopien der ursprünglichen Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopaufnahmen sowie Kopien von Phasenkontrastmikroskopaufnahmen zu erstellen, die nach der Kontrastverstärkung durch Anwendung einer LUT mit einem Minimum von 90 und einem Maximum von 205 binarisiert wurden. Für jeden Satz Anhand der Bilder identifizierte ein verblindeter Forscher einen kleinen, 150 150- Pixel großen Bereich der ursprünglichen Phasenkontrastmikroskopaufnahme, der ausschließlich gesunde und intakte Neuriten enthielt.

Die Größe und Koordinaten der Region wurden dann im Region of Interest (ROI)-Manager von ImageJ gespeichert und zur Durchführung von DI-Messungen in analogen Regionen binärisierter Bilder aus demselben Bildsatz verwendet. Die DI-Messungen wurden mit der traditionellen Methode mit Fragmentgrößenparametern von 20 -10,000 Pixeln durchgeführt. Da alle gemessenen Regionen ausschließlich intakte Neuronen enthielten, wurden alle entdeckten Fragmente als künstliche Fragmente betrachtet.

ANDI-Makro

Das ANDI-Makro wurde mit der ImageJ-Makrosprache geschrieben. Das Makro verfügt über eine Reihe von Operationen, die es dem Benutzer ermöglichen, Pfade für drei Verzeichnisse auszuwählen: ein Verzeichnis enthält Bilder von Neuronen, die für einen neuronalen Marker wie b III-Tubulin immunmarkiert sind, ein zweites Verzeichnis enthält entsprechende Bilder, die die Kernfärbung darstellen, und ein drittes Verzeichnis zum Speichern von Ergebnisdateien vorgesehen. Die Fragmentflächen und gesamten Neuritenflächen der Bilder in den ausgewählten Verzeichnissen werden dann über eine Reihe von ImageJ-Operationen berechnet. Kurz gesagt, ein Bild, das die Kernmarkierung darstellt, wird geöffnet, einer Kontrastverstärkung unterzogen und binarisiert. Das Partikelentfernungs-Plugin wird verwendet, um kleine, nicht-nukleare Artefakte aus dem binarisierten Bild zu entfernen, und das binarisierte Bild wird einer Reihe von Dilatationen und Erosionen unterzogen.

Ein entsprechendes Bild von Zellen, die für b III-Tubulin (oder einen anderen neuronalen Marker) immunmarkiert sind, wird geöffnet und einer Kontrastverstärkung unterzogen. Das binärisierte Bild, das vergrößerte Zellkerne darstellt, wird dann von dem Bild mit für b III-Tubulin immunmarkierten Zellen subtrahiert, wodurch ein Bild entsteht, das ausschließlich Neuriten enthält. Das Neuritenbild wird dann binarisiert und der Entfernung von Partikeln zwischen 0 und 4 Pixeln unterzogen. Die Neurite-Fragmentfläche wird durch Anwendung des Algorithmus „Partikel analysieren“ berechnet, um Partikel mit einer Zirkularität zwischen 0,2 und 1,0 und einer Größe zwischen 5 und 10,0000 Pixeln zu messen. Die gesamte Neuritenfläche wird berechnet, indem das Messwerkzeug zur Berechnung der gesamten schwarzen Fläche angewendet wird. Ein Bild, das den binarisierten Neuritenbereich mit hervorgehobenen Fragmenten darstellt, wird zusammen mit CSV-Dateien, die den fragmentierten Neuritenbereich und die gesamten Neuritenbereichsmessungen melden, in einem vom Benutzer angegebenen Verzeichnis gespeichert.

Zusätzlich zu den oben genannten Vorgängen sind mehrere zusätzliche Vorgänge im Makro enthalten, um die Benutzerfreundlichkeit zu erhöhen und Benutzerfehler zu begrenzen. Dazu gehören Funktionen, die Maßstabsinformationen aus Bildern entfernen und sicherstellen, dass Messungen in Pixeleinheiten erfolgen; Konfigurieren Sie die ImageJ-Farbeinstellungen und Binäroptionen für eine geeignete Bildsubtraktion und Binärisierung. Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Verzeichnisse für Bilder der b III-Tubulin-Färbung und der DAPI-Färbung eine gleiche Anzahl von Bildern enthalten. Schließen Sie zuvor verwendete Bilder, um die Verarbeitungszeit zu verlängern. klare Ergebnisse früherer Analysen vor der Durchführung neuer Analysen; und verhindern Sie Fehler im Zusammenhang mit der Erstellung von .ini-Dateien durch Windows 10.

Für Experimente mit Analysen sympathischer Neuronen wurde das ANDI-Makro dahingehend überarbeitet, dass es eine Operation enthält, die ein Dialogfeld anzeigt, mit dem der Benutzer steuern kann, wie oft binarisierte Bilder von Kernen erweitert werden. Die Version von ANDI mit dieser Revision wurde ANDI v1.1 genannt. Wenn Sie den Wert im Dialogfeld auf eine höhere Zahl ändern, erhöht sich die Größe der Soma-Entfernung, während eine Änderung des Werts auf eine niedrigere Zahl die Größe der Soma-Entfernung verringert. Der Standardwert ist 12. Dies ist die Anzahl der Dilatationen, die für alle Experimente mit LUHMES-Zellen verwendet werden. Bei Analysen sympathischer Neuronen wurde ein Wert von 16 verwendet, um größere Zellkörperregionen zu entfernen.

Das ANDI-Makro ist Open Source und kann über die folgende URL kostenlos verwendet oder geändert werden: https://github. com/kraemerb/kraemerlab. Der genaue Betrieb von ANDI wurde anhand mehrerer PCs mit dem Betriebssystem Windows 10 überprüft. Ein Bildsatz mit LUHMES-Zellkulturen, die verschiedene Grade der Neuritendegeneration aufweisen, ist ebenfalls unter der oben genannten Webadresse verfügbar und kann verwendet werden, um die genaue Ausführung des Makros durch andere Computertypen zu untersuchen. Die Webadresse bietet auch Zugriff auf ein Protokoll, das die Verwendung des Makros beschreibt.

Zeitschätzungen

Um die für die manuelle Durchführung von DI-Messungen erforderliche Zeit zu bewerten, wurden Phasenkontrast-Mikroaufnahmen von LUHMES-Zellen erstellt, die mit Vehikellösung, 2,5 mM 6-OHDA, 5,{5}} mM 6-OHDA oder behandelt wurden 7,5 mM 6-OHDA wurden einer DI-Bewertung unter Verwendung zuvor etablierter Methoden unterzogen (Kraemer et al., 2014). Jedes Bild wurde einer Kontrastverstärkung und Binärisierung unterzogen. Anschließend wurde das Freihand-Tool von ImageJ verwendet, um alle dargestellten Zellkörper digital aus den binarisierten Bildern zu entfernen. Das Werkzeug „Partikel analysieren“ wurde verwendet, um Fragmente mit einer Zirkularität zwischen 0,2 und 1,0 und einer Größe zwischen 20 und 10,000 Pixel zu messen, und das Werkzeug „Messen“ wurde verwendet, um die gesamte Neuritenfläche zu bestimmen.

Werte über die fragmentierte Neuritenfläche und die gesamte Neuritenfläche wurden in eine Tabellenkalkulation in Microsoft Excel übertragen und eine mathematische Operation in Excel wurde zur Berechnung der DI-Werte verwendet. Nachdem ein Bild mit ImageJ geöffnet wurde, wurde die Zeit gemessen, die für die manuelle Durchführung jedes dieser Vorgänge erforderlich war. Die durchschnittlichen Analysezeiten wurden aus insgesamt 36 Bildern berechnet. Die Bilder wurden von neun unabhängigen Zellkulturpräparaten erhalten und die Analysen wurden unter Verwendung eines Bildes pro Behandlungsbedingung von jedem Zellkulturpräparat durchgeführt. Um die Geschwindigkeit von DI-Messungen zu bestimmen, die mit dem ANDI-Makro durchgeführt wurden, wurden dieselben Bildsätze verwendet, um die Zeit zu bestimmen, die zum Öffnen des Makros in ImageJ, zum Ausführen der Makrooperationen, zum Übertragen der Daten in eine Excel-Tabelle und zum Berechnen des DI erforderlich ist.

Statistiken

Quantitative Vergleiche werden als Box- und Whisker-Plots dargestellt, wobei die Mittellinie den Median darstellt, die Boxen bis zum 25. und 75. Perzentil reichen und Whisker das 5. und 95. Perzentil darstellen. Die Mittelwerte wurden in GraphPad Prism 9.1.2 durch ANOVA mit wiederholten Messungen und Post-hoc-Vergleichen unter Verwendung einer Sidák-Korrektur statistisch verglichen. Die Normalität quantitativer Daten wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test in IBM SPSS 26 getestet.

Wenn die Normalitätsannahme verletzt wurde (Abb. 1C, 3D), wurden Gruppenvergleiche über den nichtparametrischen Friedman-Test durchgeführt, wobei für Post-hoc-Vergleiche der Dunn-Test durchgeführt wurde. Korrelationsanalysen werden als Streudiagramme dargestellt und umfassen Linien mit der besten Anpassung. Solche Beziehungen wurden mithilfe von Pearson-Produkt-Moment-Korrelationen oder Spearmans r analysiert, wenn die Normalitätsannahme verletzt wurde. Die Normalität der Residuen für die Korrelationsanalyse wurde durch visuelle Inspektion der entsprechenden QQ-Diagramme beurteilt.

Die Produkt-Moment-Korrelationskoeffizienten von Pearson wurden unter Verwendung des asymptotischen Z-Tests von Steiger miteinander verglichen (Steiger, 1980; Lee und Preacher, 2013). Es wurden keine Ausreißer ausgeschlossen. Die statistische Signifikanz wurde bei p=0,05 angenommen. P-Werte werden auf vier Dezimalstellen gerundet und im gesamten Haupttext angegeben. Für parametrische Analysen werden auch Effektgrößen und 95 %-Konfidenzintervalle angegeben, wobei die Effektgrößen im gesamten Haupttext beschrieben und die Konfidenzintervalle in Tabelle 1 aufgeführt sind.

Datenverfügbarkeit

Weitere Daten zum vorliegenden Artikel werden auf begründete Anfrage mitgeteilt.

Zugänglichkeit des Codes

Der im Artikel beschriebene Code/die Software ist online unter https://github.com/kraemerb/kraemerlab frei verfügbar. Der Code ist als Extended Data 1 verfügbar.

For more information:1950477648nn@gmail.com