Quercetin dämpft oxidative Veränderungen im Gehirn, die durch Eisenoxid-Nanopartikel bei Ratten hervorgerufen werden

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Abstrakt: Die Therapie mit Eisenoxid-Nanopartikeln (IONP) hat verschiedene gesundheitliche Vorteile, aber hohe Dosen oder eine längere Therapie können oxidative Zellschäden hervorrufen, insbesondere im Gehirn. Daher haben wir die aktuelle Studie durchgeführt, um die Schutzfunktion von zu untersuchenQuercetinNahrungsergänzung gegen die oxidativen Veränderungen, die durch IONPs im Gehirn von Ratten induziert werden. Vierzig erwachsene männliche Albino-Ratten wurden in gleiche fünf Gruppen eingeteilt; die Kontrollgruppe erhielt eine normale Basisdiät, der IONP-Gruppe wurden 50 mg/kg Körpergewicht (KG) von IONPs intraperitoneal injiziert, und die mit Quercetin behandelten Gruppen erhielten IONPs plus Q25, IONPs plus Q50 und IONPs plus Q100, die oral durch Quercetin ersetzt wurden durch Dosen von 25, 50 bzw. 100 mg Quercetin/kg Körpergewicht täglich, verabreicht mit der gleichen Dosis von IONPs für 30 Tage. IONPs induzierten signifikante Anstiege von Malondialdehyd (MDA) und verringerten signifikant reduziertes Glutathion (GSH) und oxidiertes Glutathion (GSSG). Folglich induzierten IONPs aufgrund der Eisenablagerung signifikant schwere Verletzungen des Hirngewebes, was zu oxidativen Veränderungen mit signifikanten Anstiegen der Kreatinphosphokinase (CPK) und der Acetylcholinesterase (AChE) im Gehirn führte. Darüber hinaus induzierten IONPs signifikante Reduktionen von Epinephrin, Serotonin und Melatonin im Gehirn mit der Herunterregulierung von Peroxisom-Proliferator-aktiviertem Rezeptor-Gamma-Coaktivator 1-alpha (PGC-1a) und mitochondrialem Transkriptionsfaktor A (mtTFA) mRNA Ausdrücke. IONPs induzierten Apoptose im Gehirn, überwacht durch Erhöhungen der Caspase 3 und Abnahmen der B-Zell-Lymphom-2(Bcl2)-Expressionsniveaus. Die Quercetin-Supplementierung hat das Gehirn deutlich besiegtoxidative Schädendosisabhängig. Daher wird eine Quercetin-Supplementierung während IONPs dringend empfohlen, um die Vorteile von IONPs mit weniger Gesundheitsrisiken zu nutzen.

Schlüsselwörter: Eisenoxid-Nanopartikel; oxidativen Stress; Quercetin; Antioxidans

1. Einleitung

Eisenoxid-Nanopartikel (IONPs) werden für das Targeting von Medikamenten, die Genabgabe, die Zellmarkierung, ein Kontrastmittel in der Magnetresonanztomographie und die Hyperthermietherapie verwendet[1]. Es wird auch als Lebensmittelzusatzstoff in mit Eisen angereicherten Getränken und Cerealien für den menschlichen Verzehr [2] verwendet, neben zahlreichen industriellen Anwendungen in der Abwasserbehandlung, Gassensorik und Halbleiter-Sorptionsmitteln, Schmiermitteln, Pigmenten und Beschichtungen [3]. Die vielfältige Verwendung von IONPs induziert jedoch eine Eisenüberladung und die nachfolgende Initiierung von oxidativem Stress in verschiedenen Organen [4]. Verschlucken, Einatmen und Hautpenetration sind die Hauptwege für den Eintrag von IONPs[5]. Im Blutkreislauf werden IONPs an Plasmaproteine ​​gebunden und in verschiedene Körper verteilt

Organe wie Leber, Milz, Niere, Lunge und Herz und durchdringen die Blut-Hirn-Schranke (BBB), was zu oxidativen Verletzungen führt [6,7]. Aus IONPs freigesetztes Eisen, das die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) verursacht, führt zu schwerwiegenden oxidativen Veränderungen in Lipiden, Proteinen und DNA [8,9].

Quercetin(3,3',4',5,7-Pentahydroxyflavon) ist einFlavonoidin Obst (Äpfel, Beeren, Kirschen und rote Trauben) und Gemüse (Zwiebeln und Brokkoli) neben vielen Samen, Buchweizen, Nüssen, Blüten, Rinden, grünem Tee und Olivenöl enthalten[10]. Quercetin hat zahlreiche wertvolle Wirkungen, darunter entzündungshemmende, antioxidative, antimutagene, antiischämische, antivirale und Anti-Aging-Wirkungen [11-17]. Quercetin ist lipophil und kann die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​durchdringen[18]. Darüber hinaus zeigt Quercetin eine potenzielle antioxidative Rolle durch die Verstärkung von reduziertem Glutathion (GSH) und die Hochregulierung von Kupfer-Zink-Superoxid-Dismutase (SOD1)[17]. Quercetin kann Eisen chelatisieren, die Fenton-Reaktion hemmen und die ROS-Erzeugung hemmen [19]. Folglich ist Quercetin ein potenzielles Therapeutikum für mehrere neurodegenerative Erkrankungen und neuronale Verletzungen [20]. DasAntioxidansDas Potenzial von Quercetin ermutigte uns, die vorliegende Studie durchzuführen, um das Schutzpotenzial von Quercetin gegen die durch IONPs induzierten oxidativen Veränderungen im Gehirngewebe zu untersuchen.

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2. Ergebnisse

2.1.Größe und Ladung von IONPs

Ein SEM-Bild von IONPs, wie in Abbildung 1 gezeigt, zeigte eine sphärische Form mit einer durchschnittlichen Größe von 16,34-22,88 nm, während sie einen positiven Zetapotentialwert plus 22,8 mV besaß (Abbildung 2).

2.2. Oxidativer Stress im Gehirn und Antioxidansstatus

Die Spiegel des Lipidperoxidationsprodukts Malondialdehyd (MDA) waren in der IONPs-Gruppe signifikant erhöht (S<0.05) while="" they="" significantly="" decreased="" in="" ionps="" +="" q100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" (figure="" 3a).mda="" levels="" in="" ionps+="" q25=""><0.01), ionps+=""><0.01) and=""><0.01) were="" significantly="" decreased="" compared="" with="">

Die GSH-Spiegel im Gehirnhomogenat waren bei IONPs signifikant erniedrigt (S<0.001), ionps+=""><0.001),ionps+o50><0.001) and="" ionps+="" o100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.in="" ionps+q100,="" the="" gshlevels="" were="" significantly="" increased="" than=""><0.001) and="" ionps+="" q25(p=""><0.01), as="" represented="" in="" figure="">

Der Gehalt an oxidiertem Glutathion (GSSG) war bei IONPs signifikant erhöht (S<0.001), ionps+q25=""><0.001),><0.001) and=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="">

Basierend auf den Daten von GSH und GSSG waren die Werte des GSH/GSSG-Verhältnisses bei IONPs signifikant verringert (S<0.001), ionps+="" q25,ionps+="" q50="" and="" ionps+="" o100="" compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="" 3d).="" in="" ionps+="" q100,="" gsh/gssg="" ratio="" values="" were="" significantly="" increased="" in="" comparison="" with=""><0.01)and ionps+q25=""><>

2.3. Gehirnkreatinphosphokinase (CPK) und Acetylcholinesterase (AChE) Aktivitäten

CPK-Aktivitäten waren in IONPs signifikant erhöht (S<0.001), ionps="" +="" q25=""><0.001), ionps+="" q50=""><0.001) and="" ionps+="" q100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.="" in="" comparison="" with="" the="" ionp="" groups,="" cpk="" activities="" were="" significantly="" decreased="" in=""><0.01),><0.01) and="" ionps+q100=""><0.001)(figure>

In Abbildung 4B waren die AChE-Aktivitäten in IONPs signifikant erhöht (S<0.001), ionps=""><0.001), ionps+="" q50=""><0.001) and="" ionps+=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.="" they="" significantly="" decreased="" in="" ionps+q25=""><0.01), ionps+q50=""><0.001)and ionps+q100(p=""><0.001) than="" ionps.in="" addition,="" ache="" activities="" were="" significantly="" decreased=""><0.001) in="" ionps+="" q100="" compared="" with="" ionps+="">

2.4.Epinephrin-, Serotonin- und Melatonin-Hormone im Gehirn

Epinephrinspiegel in Gehirnhomogenaten waren bei IONPs signifikant erniedrigt (S<0.001), ionps+="" q25=""><0.001) and=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group(figure="" 4c).in="" the="" ionps+="" q25=""><0.05),ionps+><0.001)and ionps+q100=""><0.001)groups, the="" epinephrine="" levels="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" ionps.="" furthermore,="" the="" levels="" were="" significantly="" increased="" in="" ionps+=""><0.05)compared with="" ionps="" +="">

Wie in Abbildung 4D zu sehen ist, waren die Serotoninspiegel bei IONPs signifikant verringert (S<><0.001),><0.01) and=""><0.05)compared with="" the="" control="" group.="" in="" ionps+="" q100,="" the="" levels="" significantly="" increased=""><0.05) than="" ionps="" +="">

Die Melatoninspiegel in Gehirnhomogenaten waren bei IONPs signifikant verringert (S<0.001), ionps+=""><0.001) and="" ionps+="" q50=""><0.01) compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="" 4e).in="" comparison="" with="" ionps,="" the="" levels="" in="" the=""><0.01) and="" ionps="" +=""><0.001)groups were="" significantly="" increased.="" it="" significantly="" increased=""><0.001)in ionps="" +="" q100="" compared="" with="" ionps="" +="">

2.5. Hirn-PGC-1a- und mtTFA-mRNA-Expression

Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor-Gamma-Coaktivator 1-alpha(PGC-1a)-mRNA-Expressionsfaltenänderungen waren bei IONPs signifikant verringert (p<0.001) and="" ionps+q25=""><0.05) and="" significantly="" increased="" in="" ionps+="" q100=""><0.001)compared with="" the="" control="" group="" (figure="" 5a).in="" comparison="" with="" ionps,="" the="" pgc-1a="" expression="" levels="" were="" significantly="" increased="" in="" ionps+="" q50=""><0.05) and="" ionps+q100=""><0.001).in addition,="" pgc-1a="" expression="" levels="" in="" ionps+="" o100="" were="" significantly="" increased="" (p=""><0.001)compared with="" the="" ionps="" +="" q25="" and="" ionps="" +="" q50="">

In IONPs (S<0.001), ionps+="" q25="" (p=""><0.001)and ionps+=""><0.05), the="" mrna="" expression="" levels="" of="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a="" (mttfa)="" were="" significantly="" decreased="" than="" in="" the="" control="" group="" while="" they="" significantly="" increased="" in="" ionps+q50=""><0.01) and="" ionps+=""><0.05)compared with="" ionps+="" q25.mttfa="" expression="" levels="" were="" significantly="" increased=""><0.05) in="" ionps+o100="" in="" comparison="" with="" ionps+q50="" (figure="">

2.6.Hämatoxylin (H)- und Eosin(E)-Färbungsbewertung von Hirnschnitten

Histologische Auswertungen des Hirngewebes ergaben, dass die Kontrollgruppe eine normale histologische Struktur der Kleinhirnschichten aufwies (Abbildung 6A). In der IONP-Gruppe zeigte das Kleinhirn eine schwere Verarmung der Purkinje-Zellschicht (Abbildung 6B), während diese Verarmung der Purkinje-Zelle Schicht aufgrund von IONPs wurde in den Gruppen IONPs plus Q25 (Abbildung 6C), IONPs plus Q50 (Abbildung 6D) und IONPs plus Q100 (Abbildung 6E) dosisabhängig gelindert.

Ratten in der Kontrollgruppe zeigten eine normale histologische Struktur der Hirnhäute und Großhirnrinde (Schema 1A), während die Hirnhäute von Ratten, die mit IONPs behandelt wurden, eine Stauung submeningealer Blutgefäße zeigten (Schema 1B). die Ratten zeigten Satellitose, Neuronophagie (Schema 1C), Gliose (Schema 1D) und Spongiose (Schema 1E) neben einer Verstopfung des Plexus choroideus (Schema 1F).

Wie in Schema iF zu sehen ist, zeigte das Gehirn von Ratten in der IONPs plus Q25-Gruppe Spongiose (kurze Pfeile) und Verstopfung der submeningealen Blutgefäße. Darüber hinaus zeigte das Großhirn von Ratten in der Gruppe mit IONPs plus Q50 eine leichte Spongiose und Blutgefäßverstopfung (Schema 1H). Das Gehirn von Ratten in der IONPs plus Q100-Gruppe zeigte eine relativ normale histologische Struktur der Meningen und Großhirnrinde (Schema 1I).

2.7. Beurteilung der Preußisch-Blau-Färbung von Gehirnschnitten

Gehirnschnitte der Kontrollgruppe zeigten eine negative Preußisch-Blau-Färbung (Fig. 7A). In der IONPs-Gruppe wurden Preußisch-Blau-Färbungsflecken in Gehirnschnitten erkannt (Abbildung 7B). Im Gegensatz dazu wurde die Intensität der Preußisch-Blau-Färbungsflecken der Schnitte der IONPs-Gruppe durch Quercetin in den Gruppen IONPs plus Q25 (Abbildung 7C), IONPs plus Q50 (Abbildung 7D) und IONPs plus Q100 (Abbildung 7E) in a abgeschwächt dosisabhängig.

2.8. Caspase 3- und Bcl2-Proteinspiegel in Gehirnschnitten

Die Kontrollgruppe zeigte eine negative Expression der Caspase-3-Proteinspiegel (Abbildung 8A), während sie in IONPs stark exprimiert wurden (Abbildung 8B).Mit Quercetin behandeltGruppen (Abbildung 8C-E) zeigten eine geringe Expression von Caspase 3 im Vergleich zu IONPs. Im Gegensatz dazu wurde Bcl2 signifikant in IONPs plus Q25 (Abbildung 9C), IONPs plus Q50 (Abbildung 9D) und IONPs plus Q100 (Abbildung 9E) im Vergleich zu IONPs (Abbildung 9B) und der Kontrollgruppe (Abbildung 9A) exprimiert.

3. Diskussion

Die Exposition gegenüber IONPs führte zu Eisen und dessen Ablagerung in Weichteilen, insbesondere im Gehirn [21]. In der vorliegenden Studie erkannten wir eine Eisenablagerung im Gehirn, die durch Preußisch-Blau-Färbung und morphologische Veränderungen nachgewiesen wurde, die durch die Bewertung der H- und E-Färbung überwacht wurden. Dhakshinamoorthyet al. [22] zeigten, dass der Eisengehalt im Gehirngewebe von IONP-behandelten Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht war. Dies wurde durch Preußisch-Blau-Färbung der Hirnregionen beurteilt und durch blaue Flecken im frontalen Kortex, Hippocampus und Kleinhirn nachgewiesen. El-Sayed et al. [23] stellten ebenfalls signifikante Anstiege der Eisenspiegel im Gehirngewebe aufgrund der IONP-Gabe bei Ratten fest.

IONPs könnten mehr Fähigkeit haben, die BHS zu durchdringen und Gehirnzellverletzungen zu induzieren als andere Organzellen [24,25]. Eine andere Erklärung könnte ein erhöhter Eisenspiegel sein

im Gehirn aufgrund der Bindung von Eisen an Transferrin löst die Hochregulierung von Eisenrezeptoren im Gehirn aus und transportiert folglich Eisen über die BHS [26].

Freie Fe-Ionen reagieren mit H2O2, um ROS im Fenton-Reaktionsprozess zu erzeugen [27]. Die erhöhte ROS erhöhte die Permeabilität der äußeren Mitochondrienmembran, die Lipidperoxidation, den Proteinschaden und den Bruch der DNA-Kette [28]. Dasoxidativen Stressder ROS führte zu einem Anstieg der Hirnspiegel des Lipidperoxidationsprodukts MDA, wie in der aktuellen Studie an mit IONP behandelten Ratten festgestellt wurde. In ähnlicher Weise berichteten Dhakshinamoorthy et al. [22] über einen signifikanten Anstieg der MDA-Spiegel im Gehirngewebe von mit IONP behandelten Mäusen. Reddy et al.[26] stellten auch fest, dass die MDA-Spiegel im Gehirngewebe bei einer hohen Dosis signifikant erhöht waren, aber eine nicht signifikante Erhöhung bei einer niedrigen Dosis bei mit IONP behandelten Ratten. Gaharwar und Paulraj [5] zeigten, dass die MDA-Spiegel bei mit IONP behandelten Ratten signifikant erhöht waren. In ähnlicher Weise induzierten IONPs die oxidative Schädigung von Kardiomyozyten, was durch eine hohe MDA-Produktion und verringerte GSH-Konzentrationen überwacht wurde [29].

Autoren haben in mehreren Studien die schützende Wirkung von Naturprodukten oder ihren Extrakten gegen die mit IONPs verbundenen Nebenwirkungen untersucht, darunter Echinacea purpurea [30] und Antriscus sulvestris [31]-Extrakte. In der aktuellen Studie untersuchten wir die Schutzfunktion von Quercetin gegen die Toxizität von IONPs im Gehirn von Ratten. Eine Quercetin-Ergänzung bei mit IONP behandelten Ratten senkte die MDA-Spiegel im Gehirngewebe, und unsere Ergebnisse stimmten mit denen von Dong et al. überein. [32], die feststellten, dass Quercetin die Lipidperoxidation verringerte, indem es die MDA-Spiegel im Gehirngewebe von Ratten senkte. Dies kann durch die Fähigkeit von Quercetin erklärt werden, die ROS zu reduzieren und somit die Lipidperoxidation zu hemmen und die Bildung von MDA zu verhindern [33]. Dies wurde der Brenzcatechingruppe (B-Ring) und der OH-Gruppe an Position 3 des A- und C-Rings zugeschrieben, die eine optimale Radikalfängerfunktion besitzen [17].

GSH ist ein wesentlicher Bestandteil der zellulären antioxidativen Abwehr, die direkt mit ROS und anderen reaktiven Spezies reagiert [34]. In der vorliegenden Studie waren die GSH-Spiegel im Gehirn bei mit IONP behandelten Ratten signifikant erniedrigt, aber die GSSG-Spiegel waren signifikant erhöht. Reddy et al.[26] stellten die Verringerung der GSH-Spiegel im Gehirngewebe von mit IONP behandelten Ratten fest und schlugen vor, dass dies auf eine erhöhte Verwendung von GSH in Konjugationsreaktionen als Teil eines Entgiftungsmechanismus zurückzuführen sein könnte, wodurch reduziertes GSH verringert und GSSG oxidiert wird erhöht. Die gleichzeitige Verabreichung von IONP-behandelten Ratten mit Quercetin stellte dies wieder her, indem die GSH- und GSSG-Spiegel im Gehirngewebe erhöht wurden. Diese Ergebnisse standen im Einklang mit Singh et al. [35], die über die Erhöhung des GSH-Spiegels im Gehirngewebe berichteten, was auf das antioxidative Potenzial von Quercetin hinweist. Donget al. [32] zeigten auch, dass Quercetin die Genexpression des Kernfaktors Erythroid 2--bezogener Faktor 2 (Nrf2) veränderte. Nrf2 stimulierte folglich die antioxidative Enzymproduktion im Gehirngewebe.

In der vorliegenden Studie war CPK im Gehirngewebe von mit IONP behandelten Ratten signifikant erhöht. Bei der zellulären Energiepufferung und Energieübertragung spielt CPK/Phosphokreatin eine große Rolle, insbesondere in Zellen mit hohem und schwankendem Energiebedarf wie Neuronen [36]. Daher können die Aktivierung des CPK/Phosphokreatin-Systems und Änderungen der CPK-Expression ein früherer Indikator für oxidativen und bioenergetischen Stress in der Zelle sein [37] als Kompensation für die abnehmende Energieproduktion aufgrund von oxidativem Stress. Die gleichzeitige Verabreichung von IONP-behandelten Ratten mit Quercetin senkte die CPK im Gehirngewebe, Lemmens et al. [38]zeigte eine Abnahme der CPK-Aktivität aufgrund einer Quercetin-Supplementierung.

Die AChE-Aktivität im Nervengewebe ist für die Hydrolyse von Acetylcholin (Ach) zu Cholin an den Synapsen und der neuromuskulären Synapse verantwortlich [39]. In der vorliegenden Studie war AChE bei mit IONP behandelten Ratten signifikant erhöht, und dieses Ergebnis stand im Einklang mit Dhakshinamoorthy et al. [22], die einen signifikanten Anstieg der AChE-Aktivitäten im Gehirngewebe von mit IONP behandelten Ratten feststellten, bei denen die Eisenakkumulation durch IONPs das cholinerge System veränderte.

Neurotransmitter sind endogene chemische Substanzen, die es Neuronen ermöglichen, im ganzen Körper zu kommunizieren; sie ermöglichen dem Gehirn, verschiedene Funktionen in der chemischen synaptischen Übertragung auszuführen [40]. In der aktuellen Studie waren die Epinephrin-, Serotonin- und Melatoninkonzentrationen im Gehirngewebe bei mit IONP behandelten Ratten signifikant verringert.

Yousef et al. [41] berichteten, dass die Serotonin- und Dopaminspiegel im Gehirngewebe von mit IONP behandelten Ratten signifikant verringert waren. Im Gegensatz dazu erhöhte Quercetin im Vergleich zu IONPs die Epinephrin-, Serotonin- und Melatoninkonzentrationen im Gehirngewebe. Singhet al. [35] stellte fest, dass Quercetin Serotonin, Norepinephrin und Dopamin erhöhte.

Die mitochondriale Biogenese übernimmt eine Hauptrolle bei der Aufrechterhaltung der mitochondrialen Homöostase, um die zellphysiologischen Bedürfnisse neuraler Zellen zu erfüllen [42]. PGC-1a ist ein co-transkriptioneller Regulationsfaktor, der die mitochondriale Biogenese induziert und die Expression von mtTFA fördert [43]. In der vorliegenden Studie waren die Expressionsniveaus von PGC-1a und mtTFA im Gehirngewebe von mit IONP behandelten Ratten signifikant verringert. Unsere Ergebnisse stimmten mit denen von Yousef et al. [44]. Sie veranschaulichten, dass die durch PGC-la und mtTFA repräsentierte mitochondriale Biogenese ihre Expression im Gehirngewebe von IONP-exponierten Ratten signifikant verringerte, was auf eine verringerte mitochondriale Biogenese und mtDNA-Replikation und -Transkription hinweist, die zu einer mitochondrialen Dysfunktion führen könnte. Die gleichzeitige Verabreichung von IONP-behandelten Ratten mit Quercetin stellte diese Abnahme wieder her, indem sowohl die PGC-1a- als auch die mtTFA-Expression im Gehirngewebe erhöht wurden, und unsere Ergebnisse stimmten mit denen von Sharma et al. überein.[45] die berichteten, dass Quercetin die Expression von PGC-1a, NRF-1, NRF-2 und mtTFA erhöhte }}eine Erhöhung, dies führte zur Aktivierung von NRF-1 und NRF-2-stimulierter Expression von mtTFA.

Quercetin schwächte die apoptotische Wirkung von IONPs durch eine signifikante Verringerung der Caspase 3 und eine Erhöhung der Bcl2-Expressionsniveaus in immunhistochemischen Schnitten des Gehirns ab. Dieser Befund stützt dieAntioxidansPotenzial von Quercetin. In ähnlicher Weise schwächte die Behandlung mit Quercetin den Anstieg von Caspase 3 bei ischämischen Hirnverletzungen bei Ratten [46,47] und von Bcl2 bei mit Lipopolysaccharid behandelten Mäusen [48].

4. Materialien und Methoden

4.1. Reagenzien und Chemikalien

Eisen(ⅡI)-Oxid-Nanopartikelpulver wurde von Sigma-Aldrich (Louis, MO, USA) erhalten, das vor der Verwendung in entionisiertem Wasser solubilisiert wurde. Quercetin in Pulverform wurde ebenfalls von Sigma-Aldrich erhalten, das vor der Verwendung in Dimethylsulfoxid (DMSO) bzw. destilliertem Wasser in einem Verhältnis von 1:20 gelöst wurde. DMSO größer oder gleich 99,6 Prozent wurde von Sigma-Aldrich bezogen. Andere Chemikalien und entionisiertes Wasser wurden vom Center for Graduate Studies and Research der Alexandria University gekauft.

4.2. Ethik-Erklärung

Die Studie wurde als Reaktion auf die Richtlinien des "NIH-Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren" von der Ethikkommission der Fakultät für Veterinärmedizin der Universität Alexandria, Ägypten, genehmigt.

4.3. Charakterisierung von IONPs

Die Morphologie und die Teilchengröße von IONPs wurden durch ein Rasterelektronenmikroskop (SEM) untersucht. Die Ladung des Teilchens wurde auch durch das Zeta-Potential unter Verwendung eines ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) bestimmt.

4.4.Tiere, Unterbringung und experimentelles Design

Vierzig gesunde erwachsene männliche Albino-Ratten mit einem Körpergewicht (BW) von 150 ± 20 wurden von der Animal Breeding Unit, Medical Research Institute der Alexandria University, Ägypten, gekauft. Die Tiere wurden in Metallkäfigen unter kontrollierten Umgebungsbedingungen mit optimaler Temperatur (23 ± 2), Feuchtigkeit (55 ± 5) und einem Dunkel-/Hell-Zyklus (12 h) und freiem Zugang zu einer Grundnahrung gehalten (Tabelle 1). und Trinkwasser. Alle Tiere wurden zwei Wochen vor dem Versuch zur Akklimatisierung untergebracht. Die Ratten wurden zufällig fünf Gruppen (jeweils acht Ratten) zugeordnet; die Kontrollgruppe erhielt eine normale Grunddiät und Wasser ad libitum, die IONPs-Gruppe erhielt intraperitoneal 50 mg/kg KG IONPs dreimal pro Woche injiziert[49], die IONPs plus Q25 mg-Gruppe erhielt dieselbe Dosis

von IONPs und mit 25 mg Quercetin/kg KG täglich per Magensonde verabreicht, wurde der IONPs plus Q50-Gruppe die gleiche Dosis an IONPs verabreicht und mit 50 mg Quercetin/kg KG täglich per Magensonde und der IONPs plus Q100-Gruppe wurde die gleiche Dosis an IONPs und per Magensonde verabreicht mit 100 mg Quercetin/kg KG täglich [17]. Alle Behandlungen wurden für 30 Tage aufrechterhalten.

4.5. Probenahme

Am Ende des Experiments wurden die Ratten 12 Stunden lang fasten gelassen und unter Verwendung einer intraperitonealen Injektion von Ketamin/Xylazin (100 mg/kg/10 mg/kg) anästhesiert, dann eingeschläfert und das Gehirn wurde sofort präpariert, mit gekühlter normaler Kochsalzlösung 0,9 Prozent gespült und in drei Teile geteilt; der erste wurde für biochemische Analysen verwendet. Der zweite Teil wurde für die mRNA-Extraktion und RT-PCR-Beurteilung bei -80 Grad gehalten, während der letzte Teil mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) gespült und in 4 % Paraformaldehyd, gelöst in PBS, für 48 h fixiert wurde Probenfixierung.

4.6. Biochemische Analysen

Teile jedes Rattenhirns wurden in kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) homogenisiert und 10 min bei 4 Grad bei 1435 × g zentrifugiert. Malondialdehyd (MDA), GSH, oxidiertes Glutathion (GSSG) und Kreatin-Phosphokinase (CPK) wurden mit den kommerziellen Kits von Biodiagnostic Co. (Gizeh, Ägypten) bestimmt. Acetylcholinesterase (AChE)-Enzymaktivitäten in Hirnhomogenaten wurden mit einem kolorimetrischen Assay-Kit (BioVision Co., Milpitas, CA, USA) bestimmt. Epinephrin-, Serotonin- und Melatoninspiegel in Gehirnhomogenaten wurden auch unter Verwendung von ELISA-Kits (BioVision Co., Milpitas, CA, USA) bestimmt.

4.7. mRNA-Extraktion und RT-PCR

Die Gesamt-RNA wurde aus den Proben unter Verwendung der easy-RED-Gesamt-RNA-Extraktionskits des Herstellers (iNtRON Biotechnology, Inc., Gyeonggi-do, Südkorea) extrahiert. Die Erststrang-cDNA wurde unter Verwendung des Pakets HiSen Script cDNA (iNtRON Biotechnology, Inc.) erhalten. Spezifische Primer wurden verwendet, um ausgewählte Gene mit Glyceraldehyd-3--Phosphatdehydrogenase (GAPDH) als stabiles Haushaltsgen (Tabelle 2) zu amplifizieren. CA, USA) und einem TOP real TM PreMIX SYBR Green qPCR Masterblend (Kat. RT 500, Enzynomics, Daejeon, Südkorea) nach Herstellerangaben. Die relativen Genexpressionskonzentrationen wurden mit der von Pfaffl [50] beschriebenen 2-AAct-Methode ausgewertet.

4.8. Histopathologische Untersuchung

Unter Verwendung der traditionellen Paraffin-Inkorporationstechnik wurden die fixierten Proben durch aufsteigende Ethanolgrade dehydriert, in drei Xylol-Schichten geklärt und durch Einbetten in Paraffin bei 65 °C fertiggestellt. Schnitte mit einer Dicke von 4 um wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H und E) gefärbt. [51].

Gehirnschnitte wurden durch eine Reihe abnehmender Alkoholkonzentrationen hydratisiert und für 30 Minuten in eine 20-prozentige Kaliumferrocyanidlösung mit einer 20-prozentigen HCl-Lösung gegeben. Die Objektträger wurden gewaschen, dehydriert, mit Xylol gereinigt und unter dem Mikroskop auf Blaufärbung oder Eisengehalt untersucht [52].

4.9.Immunhistochemische Untersuchung

Die Standard-Meerrettich-Peroxidase (HRP)-Immunhistochemie-Technik wurde auf die positiv geladenen Objektträger der Paraffingewebeschnitte angewendet. Gemäß den Richtlinien des Herstellers wurden Kaninchen-Antiratten-Caspase 3 (Lab Vision, Fremont, CA, USA) und Bcl2 (DAKO, Glostrup, Dänemark) verwendet. Fünf um dicke Abschnitte des Großhirns, des Kleinhirns, des Rückenmarks und des Ischiasnervs wurden entwachst, rehydriert und mit 3-prozentigem Wasserstoffperoxid (H2O2) vorbehandelt, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Die Antigenwiedergewinnung wurde erreicht, indem die Objektträger 1 0 min lang in einem 10 mM Natriumcitratpuffer (pH 6,0) in eine Mikrowelle gestellt wurden. Die Objektträger wurden mit dem primären Antikörper inkubiert und dann mit Tris-Puffer-Kochsalzlösung und dem sekundären Antikörper gespült. Objektträger wurden mit einer 3,3/-Diaminobenzidin (DAB)-Substratchromogenlösung inkubiert und dann mit Mayer's Hämatoxylin gegengefärbt. Bilder von 10 verschiedenen Feldern wurden bei einer Vergrößerung von ×400 abgebildet.

4.10. Statistische Analyse

Für die Datenanalyse wurde eine einfache ANOVA mit Post-Hoc-Multiple-Range-Tests von Tukey unter Verwendung eines GraphPad Prism v.5https://www.graphpad.com/ verwendet, abgerufen am 10. März 2021 (GraphPad, San Diego, CA, USA). . Alle Erklärungen von Bedeutung hingen von p ab<0.05. 5.="">

Eisenoxid-Nanopartikel (IONPs), die intraperitoneal in einer Dosis von 50 mg/kg KG injiziert wurden, induzierten oxidative Veränderungen im Gehirn, während Quercetin in Dosen von 25, 50 und 100 mg/kg KG durch IONPs induzierte oxidative Hirnverletzungen linderte. Daher ist Quercetin neben der IONP-Therapie ein vielversprechendes Nahrungsergänzungsmittel.

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