Nierenschutzwirkung der Beluga-Linsen-Vorbehandlung bei Ischämie-Reperfusionsverletzung
Mar 24, 2022
Syng-ook Lee,1 Also junger Chun,2Eun Hye Lee,2Bomi Kim,2Bo Hyun Yoon,2 et al
Hintergrund und Ziel. Ischämie/Reperfusionsverletzung (I/R), verursacht durch akuteNiereSchaden, verursacht histopathologische Veränderungen, Apoptose der Tubuluszellen, Entzündung, Oxidation und den Verlust der Nierenfunktion. Wir bewerteten die Schutzwirkung gegen I/R-Verletzungen der Beluga-Linsen-Vorbehandlung. Materialen und Methoden. Die Mäuse wurden in vier Gruppen eingeteilt: normale, unbehandelte, niedrig dosierte (2 mg) und hoch dosierte (8 mg) Belugalinsen-Behandlungsgruppen. Beluga-Linse wurde 2 Wochen lang oral verabreicht, gefolgt von bilateraler renaler Ischämie für 20 Minuten und Reperfusion für 30 Minuten. Blutproben uNiereGewebe wurden gesammelt und analysiert, um die Nierenfunktion, Histopathologie, Epithel- und Endothelzellen zu untersuchenSchaden, Apoptose, oxidativer Stress und Entzündungsreaktionen. Ergebnisse. Die vorbehandelten Gruppen behielten die Nierenfunktion mit signifikant niedrigeren Harnstoff-Stickstoff- (BUN) und Kreatininspiegeln im Blut im Vergleich zu den anderen Gruppen. Die histopathologische Analyse zeigte eine verringerte Verletzung des proximalen Tubulus und verringerte verletzungsbedingte Moleküle (NiereVerletzungsmolekül 1 (KIM-1) und Neutrophilengelatinase-assoziiertes Lipocalin (NGAL)) in den vorbehandelten Gruppen im Vergleich zu den anderen Gruppen. Terminale Desoxynukleotidyl-Transferase dUTP Nick-End-Labeling- (TUNEL-) positive Zellen und die Sekretion von Apoptose-assoziierten Molekülen (Fas und Caspase 3) waren in den vorbehandelten Gruppen im Vergleich zu den anderen Gruppen signifikant reduziert. Die vorbehandelten Gruppen zeigten eine positive Expression des mikrogefäßassoziierten Gens (Differenzierungscluster (CD31)) und eine negative Expression des Adhäsionsmoleküls (intrazelluläres Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1)). In den Vorbehandlungsgruppen wurde eine antioxidative Wirkung mit reduzierter Expression von Malonaldehyd (MDA) und erhöhter Sekretion von antioxidativen Enzymen (Superoxiddismutase (SOD), Katalase (CAT), Glutathion (GSH) und Glutathionperoxidase (GPx)) beobachtet. In den vorbehandelten Gruppen war die Infiltration von F4/80 plus Makrophagen und CD4 plus T-Zellen gehemmt und die Spiegel proinflammatorischer Zytokine (Interleukin- (IL-) 1 , IL-6 und Tumornekrosefaktor- (TNF-) ) verringert; jedoch stiegen die Spiegel der entzündungshemmenden Zytokine (Transforming Growth Factor- (TGF-) , IL-10 und IL{-22) an. Schlussfolgerungen. Die Beluga-Linsen-Vorbehandlung zeigte Schutzwirkungen gegen I/R-induzierte Nierenschäden durch antiapoptotische, entzündungshemmende und antioxidative Aktivitäten.
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com
1. Einleitung
Eine Verletzung durch Ischämie/Reperfusion (I/R) während einer partiellen Nephrektomie oder einer Nierentransplantation verursacht eine akuteNieren-Verletzung [1, 2] und kann zu einer irreversiblen Verschlechterung der Nierenfunktion führen [3]. Ischämie löst Apoptose in tubulären Nierenepithelzellen aus, was die Entzündungsreaktionen interstitieller Zellen verstärkt. Reperfusion induziert durch die Expression von Adhäsionsfaktoren auf der Oberfläche von Endothelzellen mikrovaskuläre Schäden, die die Migration von Entzündungszellen fördern [4–8]. I/R-Verletzungen verursachen auch oxidativen Stress, erhöhen reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und verringern die antioxidative Enzymaktivität [9], was zu einer erhöhten Produktion von entzündungsfördernden Faktoren [10], einer Aktivierung des Caspase-Wegs und einem erhöhten apoptotischen Zelltod führt, was schließlich zum Verlust der Nierenfunktion führen [11]. Um eine I/R-induzierte Nierenschädigung zu verhindern, wurde die Verwendung von Antioxidantien mit entzündungshemmenden und antiapoptotischen Funktionen vorgeschlagen [10–14].
Linsensorten (grün, rot, französisch oder Beluga) enthalten verschiedene bioaktive Verbindungen, insbesondere Antioxidantien [15]. Ihr Gesamtpolyphenol- und Flavonoidgehalt reicht von 27,30–30,30 mg (Gerbsäureäquivalent)/g bis 13,14–16,29 mg (Quercetinäquivalent)/g [16]. Für Beluga-Linsen wurden signifikant hohe Polyphenolgehalte und ROS-Abfangwirkungen nachgewiesen [16]. Unser Team berichtete über die antioxidativen Wirkungen von Linsen anhand eines In-vitro-Experiments mit Leberzelllinien [16]. Beluga-Linsen zeigten im Vergleich zu anderen Linsensorten signifikante Schutzwirkungen gegen alkoholinduzierte Zytotoxizität in AML-12-Zellen. Die entzündungshemmenden Wirkungen von Beluga-Linsen wurden auch in Lipopolysaccharid-behandelten RAW264.7-Zellen beobachtet [17]. Die Behandlung mit Beluga-Linsen verringerte die Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) und die Expression der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) durch die Hochregulierung des durch den Kernfaktor E 2- verwandten Faktors 2- (Nrf2-) vermittelten Häms signifikant Oxygenase-1 (HO-1)-Weg. Diese In-vitro-Experimente deuteten auf die antioxidative und entzündungshemmende Wirkung von Beluga-Linsen hin.
Um die Anwendungen von Beluga-Linsen zu erweitern, haben wir sie auf ein Mausmodell mit Nieren-I/R-Verletzung angewendet und die Nierenschutzwirkung bewertet. Für dieses Experiment wurden Belugalinsen 2 Wochen lang als Vorbehandlung verabreicht, gefolgt von 20-minütiger Ischämie und 30-minütiger Reperfusion. Die Nierenschutzwirkung der Belugalinsen-Vorbehandlung wurde durch Analyse der Nierenfunktion, der Histopathologie, der Epithel- und Endothelzellschädigung, der Apoptose, des oxidativen Stresses und der Entzündungsreaktionen verifiziert. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine Vorbehandlung mit Beluga-Linsen eine I/R-induzierte Nierenschädigung durch antioxidative, entzündungshemmende und antiapoptotische Aktivitäten verhindern würde.
2. Materialien und Methoden
2.1. Tiergruppen und Behandlungsbedingungen.
Alle Verfahren wurden unter Verwendung eines Tierprotokolls durchgeführt, das vom Yeungnam University Institutional Animal Care and Use Committee (AEC2019-003) genehmigt wurde. Mäuse (ICR, 8 Wochen alt, männlich, 23–25 g, Orient, Seongnam, Korea) wurden zufällig in die folgenden 4 Gruppen eingeteilt (n =7 pro Gruppe): (1) Normal, normale Kontrollgruppe; (2) unbehandelte, mit Kochsalzlösung behandelte Gruppe; (3) Gruppe mit niedriger, niedriger Dosis (2 mg/100 μl Kochsalzlösung/-BioMed Research International Maus), 14- Tag oral verabreichter Belugalinsen-Vorbehandlungsgruppe; und (4) Hohe, hochdosierte (8 mg/100 μl Kochsalzlösung/Maus), 14- Tag oral verabreichte Beluga-Linse, Vorbehandlungsgruppe. Beluga-Linsen wurden von Prof. Syng-Ook Lee (Keimyung University, Daegu, Korea) zur Verfügung gestellt, und die Extraktzubereitung und die Analyse bioaktiver Verbindungen wurden in einer früheren Studie beschrieben [16]. Nach der Behandlung wurden die Tiere unter Narkose in Bauchlage gebracht und ein dorsaler Einschnitt vorgenommen [1]. Die Nierenarterie und -venen beider Nieren wurden mit einer Gefäßklemme für 20 Minuten verschlossen, gefolgt von einer 30-minütigen Reperfusion gemäß einem zuvor beschriebenen Protokoll [18, 19]. Blut wurde durch Herzpunktion gesammelt und die Nieren wurden extrahiert. Die Nieren wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen; Eine Niere wurde für die RNA- und Proteinextraktion verwendet, während die andere Niere für die histologische Analyse verwendet wurde.
2.2. Histopathologische und immunhistochemische (IHC) Analysen.
Histopathologische Untersuchungen wurden unter Verwendung von Hämatoxylin und Eosin (H&E)-Färbung durchgeführt, und Verletzungen wurden basierend auf den folgenden Faktoren bewertet: das Vorhandensein von Tubuluszellen, die in das Lumen fallen, Kernverlust in abgeblätterten Zellen, Lumentrümmer, kollabierter Lumenraum und Infiltration von Immunzellen . Die Wertung erfolgte durch einen Facharzt für Pathologie: Wertung 0, keine tubuläre Verletzung; Punktzahl 1,<10% of="" tubules="" injured;="" score="" 2,="" 10–25%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 3,="" 25–50%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 4,="" 50–74%="" of="" tubules="" injured;="" and="" score="" 5,="">75 Prozent der Tubuli verletzt. Für die IHC-Analyse wurde die Niere mit 4 Prozent Paraformaldehyd fixiert, und in Paraffin eingebettete Proben wurden in 5-μm-Schnitte geschnitten. H&E- und IHC-Färbungen wurden nach Routineverfahren durchgeführt. Auf die Schnitte wurden primäre Antikörper gegen Marker von Immunzellen (F4/80 und Differenzierungscluster 8 (CD8), Abcam, Cambridge, UK) und Endothelzellen (CD31 und intrazelluläres Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1), Abcam) aufgetragen , für 24 Stunden bei 4 Grad (Verdünnung 1:200), gefolgt vom Sekundärantikörper (Alexa Fluor 594, Life Technology, Waltham, MA, USA), für 1 Stunde bei Raumtemperatur und 4′,6-diamidino{ {19}}Phenylindol (DAPI) wurde verwendet, um Kerne zu färben.
2.3. Protein-Assay.
Für die Nierenfunktionsanalyse wurde das Serum ohne Antikoagulans abgetrennt, und die Konzentrationen von Serumkreatinin und Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) wurden mit einem Creatinine Colorimetric Assay Kit und einem Quanti-Chrom Urea Assay Kit (BioAssay Systems LLC, Hayward, CA, USA) nachgewiesen ), beziehungsweise. Um Nierentubulus-/Gefäßverletzung, oxidativen Stress, antioxidative Enzyme und Apoptose zu beurteilen, wurde Nierengewebe mit jedem entsprechenden Puffer homogenisiert. Zur Analyse der Schädigung der Nierentubuli-Epithelzellen wurden die Konzentrationen von Nierenschädigungsmolekül-1 (KIM-1) und neutrophiler Gelatinase-assoziiertem Lipocalin (NGAL) unter Verwendung eines enzymgebundenen Immunadsorptionstests (ELISA) (USCN Life Science Inc ., Wuhan, China). Um die Apoptose zu analysieren, wurden die Konzentrationen von Fas und Caspase 3 unter Verwendung entsprechender ELISA-Kits (Abcam) gemessen. Um oxidativen Stress zu bewerten, wurden Malonaldehyd (MDA)-Spiegel unter Verwendung eines MDA-Assay-Kits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute, Nanjing, China) gemessen. Antioxidative Enzyme, einschließlich Superoxiddismutase (SOD), Katalase (CAT), Glutathion (GSH) und Glutathionperoxidase (GPx), wurden unter Verwendung eines Gesamt-SOD-Testkits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute), eines CAT-Testkits ( Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute), ein fluorometrisches GSH-Assay-Kit bzw. ein GPx-Assay-Kit (BioVision Inc.). Alle Kits wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.
2.4. Genexpressionsanalyse.
Gesamt-RNA wurde mit dem TRIzol-Reagenz extrahiert, und cDNA wurde aus 20 ug Gesamt-RNA unter Verwendung eines cDNA-Synthesekits (Invitrogen, Waltham, MA, USA) synthetisiert. Die Echtzeit-PCR-Bedingungen waren wie folgt: 95 Grad für 10 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen von 95 Grad für 10 Sekunden, 60 Grad für 50 Sekunden und 72 Grad für 20 Sekunden. Die Genamplifikation wurde mit SYBR green nachgewiesen, und die 2-ΔΔCt-Methode wurde zur Analyse der Expression verwendet. Die Experimente wurden dreifach unter Verwendung der folgenden Primersequenzen durchgeführt: Interleukin- (IL-) 1 , 5'-gcccatcctctgagactcat-3' und 5'-aggccacagg- tatttttgtcg-3'; IL-6, 5′-agttgccttcttgggactga-3′ und 5′ -tccacgatttcccagagaac-3′; Tumornekrosefaktor- (TNF-), 5′-agcccccagtctgtatcctt-3′ und 5′-ctccctttgcagaactcagg-3′; Transforming Growth Factor- (TGF-) , 5′-tggttgtagaggg- caaggac-3′ und 5′-ttgcttcagctccacagaga-3′; IL-10, 5′ -acctggtagaagtgatgccc-3′ und 5′-agggtcttcagcttctcacc-3′; IL- 22, 5′-tccaacttccagcagccata-3′ und 5′-tagcactgactcctcggaac- 3′; und Glycerinaldehyd-3′-phosphatdehydrogenase (GAPDH), 5′-tgtgtccgtcgtggatctga-3′ und 5′-cctgcttcac-caccttcttga-3′ .
2.5. TUNEL-Assay.
Um die Apoptose zu beurteilen, wurde ein TdT-vermittelter dUTP-Nick-End-Labeling(TUNEL)-Assay unter Verwendung eines Apoptose-Nachweiskits (Chemicon, Bedford, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz, entparaffinierte und rehydrierte Objektträger wurden mit 2 0 ug/ml Proteinase K bei 37 Grad für 15 Stunden verdaut, um Proteine zu entfernen, und mit 3,0 Prozent Wasserstoffperoxid behandelt, um endogene Peroxidase zu quenchen. Die Objektträger wurden in 1 × TdT-Äquilibrierungspuffer eingetaucht, und eine Arbeitskonzentration des TdT-Enzyms wurde für 1 Stunde bei 37 Grad zugegeben. Ein Anti-Digoxigenin-Konjugat wurde 30 Minuten lang auf den 3'-OH-DNA-Terminus aufgetragen, und die Farbe wurde unter Verwendung eines Peroxidase-Substrats 3 Minuten lang entwickelt. Nach der DAPI-Behandlung wurden die Objektträger montiert. TUNEL-positive Kerne wurden in allen Gesichtsfeldern in jeder Gewebeprobe unter 200-facher Vergrößerung gezählt.
2.6. Statistische Analyse.
Alle Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Signifikante Unterschiede für die Gruppe mit I/R-Nierenverletzung und die Beluga-Linsen-I/R-Vorbehandlungsgruppen wurden unter Verwendung einer Varianzanalyse, gefolgt von Tukey's Post-hoc-Test, in SPSS (Statistical Package for the Social Sciences v. 9) bewertet.{{ 2}}; Chicago, IL, USA). p-Werte < 0,05="" wurden="" als="" signifikant="">
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3. Ergebnisse
3.1. Auswirkungen der Beluga-Linsen-Vorbehandlung auf die Nierenfunktion.
Die vorbehandelten Gruppen zeigten beide signifikante Schutzwirkungen gegen I/R-Verletzungen (Abbildung 1). Die mittleren BUN- und Serumkreatininkonzentrationen in der unbehandelten Gruppe betrugen 89:92 ± 7:29 mg/dL bzw. 0:48 ± 0:16 mg/dL. Die vorbehandelten Gruppen zeigten signifikant reduzierte BUN (niedrig: 22:6 ± 3:67 mg/dL; hoch: 21:6 ± 3:17 mg/dL) und Serum-Kreatinin (niedrig: 0:25 ± {{19} }:04mg/dL; hoch: 0:23 ± 0:04mg/dL) Konzentrationen im Vergleich zu denen in der unbehandelten Gruppe (S<0:01), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" two="" pretreatment="" groups.="" these="" results="" indicated="" that="" pretreatment="" with="" beluga="" lentils="" can="" protect="" against="" acute="" renal="" functional="">
3.2. Wirkungen der Beluga-Linsen-Vorbehandlung auf Tubular-Epithelzellen-Verletzung und Apoptose.
Tubuläre Verletzungen, insbesondere die Atrophie von Epithelzellen, wurden häufig im äußeren Nierenmark beobachtet, und in den Nieren der Nieren wurden gelegentlich exfolierte Zellkernverluste, luminale Trümmer am Nierentubulus, kollabierter luminaler Raum und interstitielle neutrophile Infiltrate identifiziert unbehandelte Gruppe (Abbildung 2(a)). Im Gegensatz dazu zeigten die Nieren der vorbehandelten Gruppen nahezu normale Zellmorphologien, und Tubulusverletzungen wurden in der Hochdosisgruppe seltener beobachtet als in der Niedrigdosisgruppe. Wenn die Verletzung als Prozentsatz pro Flächeneinheit ausgedrückt wurde, war der Verletzungswert in den vorbehandelten Gruppen reduziert (niedrig: 2:0±0:93; hoch: 1:5± {{ 11}}:53) verglichen mit der unbehandelten Gruppe (2:87 ± 1:25) (Abbildung 2(b)). Bei der Untersuchung der KIM-1- und NGAL-Sekretion (Abbildung 2(c)) zeigten die ELISA-Ergebnisse, dass die KIM-1-Gehalte in den vorbehandelten Gruppen abnahmen (niedrig: 1, 922:83 ± 199:42 pg/ mg; hoch: 1.827:83 ± 278:26 pg/mg) im Vergleich zur unbehandelten Gruppe (1.977:83 ± 184:49 pg/mg). Die NGAL-Expression war in der Hochdosis-Gruppe (489:34 ± 19:95 pg/mg) im Vergleich zu denen in der Niedrigdosis-Gruppe (527:36 ± 15:19 pg/ml) und unbehandelt (537:05 ± 15:95:00) signifikant reduziert. 70pg/mg) Gruppen (S<>
Ob eine Verletzung der tubulären Epithelzellen Apoptose verursachte, wurde dann analysiert. Die zelluläre Apoptose wurde durch den Nachweis fragmentierter chromosomaler DNA unter Verwendung des TUNEL-Assays bewertet (Abbildung 2(d)). TUNEL-positive Zellen wurden in den vorbehandelten Gruppen selten beobachtet (niedrig: 5:00 ± 1:22; hoch: 2:25 ± 1:09). Im Gegensatz dazu zeigte die unbehandelte Gruppe eine relativ erhöhte Anzahl von TUNEL-positiven Zellen in der äußeren Markregion (47:50 ± 16:77) (S<0:01), showing="" apoptotic="" bodies="" that="" extruded="" into="" the="" tubular="" lumen="" (figure="" 2(e)).="" when="" the="" secretion="" of="" apoptosis-related="" molecules="" (fas="" and="" caspase="" 3)="" was="" analyzed="" by="" elisa="" (figure="" 2(f)),="" fas="" expression="" was="" high:="" 3:96="" ±="" 0:55ng/mg)="" compared="" with="" that="" in="" the="" untreated="" group="" (7:10="" ±="" 0:87ng/mg),="" and="" caspase="" 3="" expression="" showed="" similar="" results="" (low:="" 8:44="" ±="" 2:05ng/mg;="" high:="" 8:25="" ±="" 1:28ng/="" mg;="" and="" untreated:="" 11:99="" ±="" 0:63ng/mg)="" (p=""><0:05). these="" results="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="">
tubuläre Epithelzell-Apoptose, induziert durch I/R.
3.3. Auswirkungen der Beluga-Linsen-Vorbehandlung auf Endothelzellverletzung.
Die Auswirkungen der Belugalinsen-Vorbehandlung auf Endothelzellen wurden vom IHC unter Verwendung eines CD31-Antikörpers verifiziert (Abbildung 3(a)). In der normalen Gruppe wurden CD31--positive Blutgefäße identifiziert, aber CD31--positive Zellen wurden in der unbehandelten Gruppe nicht identifiziert, was auf eine I/R-induzierte Gefäßstörung hinweist. Die hochdosierte Vorbehandlungsgruppe zeigte CD31--positive Zellen in den peritubulären Kapillaren, was auf eine gefäßschützende Wirkung der hochdosierten Belugalinsen-Vorbehandlung hinweist. Endothelzellen wurden durch den Nachweis von ICAM- 1, einem Adhäsionsmolekül, untersucht, und positive Zellen wurden häufiger in der tubulären Region der unbehandelten Gruppe (46:4±41:7 Zellen/Objektträger) im Vergleich zu den vorbehandelten Gruppen identifiziert ( niedrig: 5:77 ± 1:01 Zellen/Objektträger, hoch: 3:72 ± 1:05 Zellen/Objektträger) (Abbildung 3(b)). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Beluga-Linsen-Vorbehandlung die Kapillaren bewahrte und die Aktivierung von Adhäsionsmolekülen auf der Endothelzelloberfläche hemmte.
3.4. Auswirkungen der Beluga-Linsen-Vorbehandlung auf oxidativen Stress.
To evaluate the antioxidant effects of beluga lentil pretreat- ment, MDA, SOD, CAT, GSH, and GPx levels were detected by ELISA (Figure 4). MDA levels decreased in the pretreated groups (low: 0:85 ± 0:23nmol/mg; high: 0:81 ± 0:22nmol/ mg) compared with that in the untreated group (0:96 ± 0:11nmol/mg) (p >0:05) (Figure 4(a)). However, the antioxidant enzyme activities increased in the pretreated groups (Figure 4(b)) compared with those in the untreated group (p >{{{{20}}}}:05), für SOD (niedrig: 360:21 ± 56:42 U/ml; hoch: 362:7{{ 36}} ± 70:32 U/ml und unbehandelt: 333:52 ± 41:58 U/ml), CAT (niedrig: 3:64 ± 1:09 nmol/g; hoch: 3:21 ± 0:76 nmol/g; und unbehandelt: 3:18 ± 0:40 nmol/g), GSH (niedrig: 4:13 ± 0:53 nmol/mg; hoch: 4:56 ± 0:69 nmol/mg; und unbehandelt: 3:59 ± 0 : 53 nmol/mg) und GPx (niedrig: 198:89 ± 48:43 U/ug; hoch: 219:61 ± 138:08 U/ug; und unbehandelt: 165:14 ± 34:73 U/ug). Obwohl diese Unterschiede statistisch nicht signifikant waren, deuteten diese Ergebnisse darauf hin, dass eine Vorbehandlung mit Beluga-Linsen I/R-induzierten oxidativen Stress in den Nieren verhinderte, indem sie die antioxidative Potenz in den Nieren verstärkte.
3.5. Auswirkungen der Beluga-Linsen-Vorbehandlung auf die Infiltration von Immunzellen, Zytokine und Entzündungen. Die Infiltration von Makrophagen (F4/80 plus) und T-Zellen (CD4 plus) und die Freisetzung von entzündungsfördernden Zytokinen (IL-1, IL-6 und TNF-) wurden analysiert, um die Apoptose-induzierte Entzündung zu bewerten. Weniger F4/80 plus und CD4 plus infiltrierende Immunzellen wurden in den vorbehandelten Gruppen beobachtet als in der unbehandelten Gruppe, wie durch IHC-Analyse festgestellt wurde (Abbildung 5(a)). Die Echtzeit-PCR-Analyse zeigte, dass die renalen mRNA-Spiegel von entzündungsfördernden Zytokinen (IL-1 , TNF- und IL 6) in der vorbehandelten Gruppe im Vergleich zu denen in der unbehandelten Gruppe abnahmen (Abbildung 5(b )). Die mRNA-Spiegel von entzündungshemmenden Zytokinen (TGF- und IL-22) stiegen jedoch in den vorbehandelten Gruppen im Vergleich zu der unbehandelten Gruppe an, mit Ausnahme von IL-10 (Abbildung 5(c)). Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass I/R-induzierte entzündliche Verletzungen in den Nieren durch Belugalinsen-Vorbehandlung aufgrund entzündungshemmender Wirkungen verhindert werden können, obwohl IL-10 nicht betroffen war.
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4. Diskussion
Eine durch I/R induzierte Nierenschädigung ist traditionell durch eine schnell abnehmende Nierenfunktion gekennzeichnet [20]. Die Nierenfunktion kann anhand der BUN- und Serum-Kreatinin-Werte abgeschätzt werden, die stickstoffhaltige Stoffwechselendprodukte sind, die auf die glomeruläre Filterfunktion hinweisen [21]. Die unbehandelte Gruppe zeigte signifikant erhöhte Werte von BUN (89:92 ± 7:29 mg/dL) und Kreatinin (0:48 ± {{20}}:16 mg/dL), was auf ein funktionelles Nierenversagen hinweist durch I/R induziert. Die mit Belugalinsen vorbehandelten Gruppen zeigten jedoch signifikant reduzierte BUN (niedrig: 22:6 ± 3:67 mg/dL; hoch: 21:6 ± 3:17 mg/dL) und Serum-Kreatinin (niedrig: 0: 25 ± 0:04mg/dL; hoch: 0:23 ± 0:04mg/dL) Werte (S<0:01) compared="" with="" those="" in="" the="" untreated="" group.="" these="" values="" are="" similar="" to="" those="" observed="" in="" normal="" mice="" (male,="" 6wks;="" bun:="" 22:68="" ±="" 3:05mg/dl;="" creatinine:="" 0:25="" ±="" 0:06mg/dl)="" [22].="" the="" significantly="" decreased="" bun="" and="" serum="" creatinine="" values="" observed="" in="" the="" pretreated="" groups="" relative="" to="" the="" untreated="" group="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="" exerted="" protective="" effects="" on="" renal="" function="" against="" i/r-induced="" renal="">
Die verminderte Nierenfunktion weist auf glomeruläre Filtrationsprobleme hin, die durch das Zurücklecken des glomerulären Filtrats über das tubuläre Epithel verursacht werden, das die am stärksten durch I/R geschädigte Region darstellt [23]. I/R führte zu Zellkernverlust durch abgeblätterte Zellen, Lumentrümmer auf dem Nierentubulus und kollabierten Lumenräumen in tubulären Epithelzellen. Die vorbehandelten Gruppen zeigten dosisabhängig eine reduzierte histopathologische tubuläre Verletzung. Die beobachtete histopathologische Tubulusverletzung wurde durch die Beurteilung der molekularen Marker KIM-1 und NGAL bestätigt [24]. KIM-1 ist ein Phosphatidylserinrezeptor, der als apoptotisches Zellerkennungsmolekül fungiert und eine verletzte Zelle zur apoptotischen/nekrotischen Zellphagozytose, zur Beseitigung apoptotischer Trümmer und zur Begrenzung der proinflammatorischen Reaktion in das Lysosom überträgt [25]. NGAL ist ein kleines Siderophorprotein, das an Gelatinasen bindet, die von menschlichen Neutrophilen stammen. NGAL wird selten in normalen Nieren exprimiert, aber akute, ischämische oder toxische Nierenschäden führen zu einer NGAL-Sekretion durch die Epithelzellen in den proximalen/distalen Tubuli, was die NGAL-Konzentrationen in Urin und Blut erhöht; somit kann NGAL als neuer früher Biomarker für I/R-induziertes akutes Nierenversagen verwendet werden[26]. Die vorbehandelten Gruppen zeigten eine reduzierte KIM-1- und NGAL-Sekretion, und die hochdosierte Vorbehandlungsgruppe zeigte eine signifikante Reduktion der NGAL-Sekretion im Vergleich zur unbehandelten Gruppe. Die beobachtete Verringerung der Tubulusverletzung und der KIM-1- und NGAL-Proteinsekretion deutete darauf hin, dass die Beluga-Linsen-Vorbehandlung eine schützende Wirkung gegen eine durch I/R induzierte Schädigung tubulärer Epithelzellen ausübte.
Wenn die I/R-Verletzung schwerwiegend ist, werden beschädigte Zellen durch den apoptotischen Weg beseitigt, der ein pathophysiologischer Zelltodmechanismus ist [27]. Apoptose-spezifische DNA-Schäden können durch den TUNEL-Assay nachgewiesen werden.
TUNEL-positive Zellen wurden häufig in der unbehandelten Gruppe beobachtet, wohingegen die mit Belugalinsen vorbehandelten Gruppen dosisabhängig signifikant reduzierte TUNEL-positive Zellzahlen zeigten. Dieser histologische Nachweis von Apoptose wurde durch Untersuchung von Fas- und Caspase-3-Expressionen bestätigt. Fas ist ein Ligand, der an den Zelltodrezeptor bindet und zunächst während des programmierten Zelltods beobachtet wird [28]. Caspase 3 ist ein intrazelluläres Exekutionsenzym des apoptotischen Zelltodwegs, der zur apoptotischen Körperbildung führt [29]. Fas- und Caspase-3-Proteinsynthesen waren in der vorbehandelten Gruppe im Vergleich zu denen in der unbehandelten Gruppe signifikant verringert, was bestätigt, dass eine Vorbehandlung mit Beluga-Linsen die apoptotische Signaltransduktion nach einer I/R-Verletzung hemmen kann.
Eine I/R-Verletzung induziert auch den Verlust von Nierenmikrogefäßen [30], was zu pathohistologischen Veränderungen in Endothelzellen führt [20]. Eine Schädigung der Nierenmikrogefäße wurde mit einem Antikörper gegen CD31, einem Endothelzellmarker, nachgewiesen [30]. In der unbehandelten Gruppe wurde keine CD31-Expression nachgewiesen, was auf den Verlust von Nierenmikrogefäßen hinweist. Die mit hoher Dosis vorbehandelte Gruppe zeigte jedoch eine positive CD31-Expression mit einer ähnlichen Gefäßdichte wie in der normalen Gruppe beobachtet, was darauf hinwies, dass die Vorbehandlung mit Beluga-Linsen bei hohen Dosen eine schützende Wirkung auf die Erhaltung der Endothelzellen ausübte. Beschädigte Endothelzellen exprimieren Endothel-Leukozyten-Adhäsionsmoleküle wie ICAM-1 [31]. Erhöhte Adhäsionsmoleküle können zu Leukozytenaktivierung, Kapillarobstruktion, Zytokinproduktion und entzündungsfördernden Reaktionen führen [32]. Die unbehandelte Gruppe zeigte eine positive ICAM-1-Expression, was auf eine verstärkte Adhäsionsmolekülexpression hinweist, die durch Endothelzellschädigung induziert wird. Die mit hoher Dosis vorbehandelte Gruppe zeigte jedoch eine negative ICAM-1-Expression, was auf die schützenden Wirkungen der Belugalinsen-Vorbehandlung für den Erhalt von Endothelzellen hinweist, sowohl funktionell als auch physiologisch. Die erhaltenen Gefäßstrukturen können für einen gleichmäßigen Blutfluss sorgen, Sauerstoff und Nährstoffe an Gewebe und Zellen liefern, die durch I/R geschädigt wurden, und die funktionelle und histologische Wiederherstellung der Niere unterstützen.
Die Reperfusion stellt die Sauerstoffversorgung geschädigter Zellen wieder her, was die Expression von Enzymen auslösen kann, die mit oxidativem Stress in Verbindung stehen und Sauerstoff in ROS umwandeln [33]. ROS sind instabile und hochreaktive Produkte, die freie Radikale erzeugen, die durch die Veränderung von zellulären Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren DNA-Schäden, Apoptose und Nekrose verursachen. Freie Radikale schädigen ungesättigte Fettsäuren in der Zellmembran, was zu einer Lipidperoxidation führt [34]. Lipidperoxid wird dann zu MDA abgebaut, das die antioxidativen Enzymaktivitäten wie SOD, GPx, GSH und CAT reduziert [35]. SOD katalysiert die Dismutation von Superoxid in Sauerstoff und Wasserstoffperoxid, das durch CAT weiter abgebaut wird. GPx ist ein wichtiges antioxidatives Enzym, das Peroxid mithilfe von GSH eliminiert. GSH kann in Kombination mit GPx verschiedene oxidative Produkte entgiften. MDA- und antioxidative Enzymspiegel zeigten in der ELISA-Analyse eine umgekehrte Beziehung. In den vorbehandelten Gruppen war die MDA-Expression relativ niedrig, aber die antioxidativen Enzyme wurden im Vergleich zu ihren jeweiligen Niveaus in der unbehandelten Gruppe stark exprimiert.
Diese Ergebnisse zeigten, dass die Beluga-Linsen-Vorbehandlung I/R-induzierte Nierenschäden reduzieren kann, indem sie den Weg des oxidativen Stresses durch die Hemmung der Membranlipidperoxidation und die Aktivierung antioxidativer Enzyme blockiert.
Die Reperfusion löst auch die Aktivierung von vaskulären Endothelzellen aus, was zu einer ICAM-1-Expression auf der Zelloberfläche führt. Das exprimierte ICAM-1 verbindet sich mit Neutrophilen durch Lymphozytenfunktions-assoziiertes Antigen-1 (LFA-1), was zur Anheftung von Neutrophilen an Endothelzellen, Infiltration von Neutrophilen und zur Sekretion von Entzündungen führt Zytokine durch Neutrophile [36]. Nachdem Neutrophile in einer geschädigten Region erscheinen, erfolgt die Infiltration von F4/80 plus Makrophagen. Makrophagen unterscheiden sich je nach Zeit und Umgebung in entzündungsfördernde M1- und entzündungshemmende M2-Phänotypen. M1-Makrophagen sezernieren entzündungsfördernde Zytokine (IL-1 , TNF- und IL- 6), die mit I/R-induzierten Nierenschäden assoziiert sind, während M2-Makrophagen entzündungshemmende Zytokine (TGF- , IL{ {19}} und IL-22) [37, 38]. Makrophagen stimulieren auch die Aktivierung von CD4 plus T-Zellen. Aktivierte T-Zellen synthetisieren Interferon-(IFN-) , das die Immunantwort durch M1-Makrophagenaktivierung verstärkt [39]. In dieser Studie zeigten die mit Belugalinsen vorbehandelten Gruppen hemmende Wirkungen gegen die Infiltration von F4/80 plus Makrophagen und CD4 plus T-Zellen in die Nierenrindenregion, was zu einer verringerten Expression von IL-1, IL-6, und TNF-mRNA und die verstärkte Expression von TGF-, IL-10- und IL-22-mRNA. Diese Ergebnisse zeigten, dass eine Beluga-Linsen-Vorbehandlung die Entzündungsreaktion reduzieren kann, indem sie die Infiltration von Immunzellen hemmt und die entzündliche Zytokinexpression reduziert.
5. Schlussfolgerungen
Zusammenfassend zeigten die Beluga-Linsen-Vorbehandlungsgruppen eine verringerte proximale Tubulusverletzung, eine verringerte verletzungsbedingte Molekülsekretion, verringerte TUNEL-positive Zellen, eine verringerte Apoptose-bezogene Molekülsekretion, eine positive Mikrogefäßexpression, eine negative Adhäsionsmarkerexpression, eine antioxidative Wirkung und eine gehemmte Entzündung Antworten. Daher übte die Vorbehandlung mit Belugalinsen über antiapoptotische, entzündungshemmende und antioxidative Aktivitäten Schutzwirkungen gegen I/R-induzierte Nierenschäden aus. Basierend auf den Ergebnissen dieser Studie kann die Nierenfunktion durch die Anwendung von Beluga-Linsen-Behandlungen in klinischen Situationen im Zusammenhang mit I/R-Verletzungen, wie z. B. einer partiellen Nephrektomie, erhalten werden.
Flavonoidergänzungen in der Niere
Datenverfügbarkeit
Daten sind auf Anfrage erhältlich.
Offenlegung
Die Zusammenfassung des Manuskripts wurde auf der 72. Jahrestagung der Korean Urological Association vorgestellt.
Interessenskonflikte
Es bestehen keine Interessenkonflikte.
Autorenbeiträge
Syng-ook Lee und So Young Chun haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Biomedical Research Institute des Kyungpook National University Hospital (2019) unterstützt.
1Abteilung für Lebensmittelwissenschaft und -technologie, Keimyung-Universität, Daegu 42601, Republik Korea
2BioMedical Research Institute, Kyungpook National University Hospital, Daegu 41940, Republik Korea
3Department of Laboratory Animal Research Support Team, Yeungnam University Hospital, Daegu 42415, Republik Korea
4Abteilung für Innere Medizin, Yeungnam University College of Medicine, Daegu 42415, Republik Korea
5Department of Urology, School of Medicine, Kyungpook National University, Daegu 41566, Republik Korea
6Department of Pathology, School of Medicine, Kyungpook National University, Daegu 41566, Republik Korea
7Abteilung für Urologie, Yeungnam University College of Medicine, Daegu 42415, Republik Korea
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