Seneszenz verkabelt die Mikroumgebungserkennung neu, um die Antitumor-Immunität zu erleichtern

ABSTRAKT

Bei der Zellalterung handelt es sich um einen stabilen Stillstand des Zellzyklus in Verbindung mit einem sekretorischen Programm, das in manchen Fällen die Immunabwehr alternder Zellen stimuliert. Anhand eines immunkompetenten Leberkrebsmodells, bei dem Seneszenz eine durch CD8-T-Zellen vermittelte Tumorabstoßung auslöst, zeigen wir, dass Seneszenz auch das Zelloberflächenproteom umgestaltet, um die Art und Weise zu verändern, wie Tumorzellen Umweltfaktoren wahrnehmen, wie am Beispiel von Typ-II-Interferon (IFN). Im Vergleich zu proliferierenden Zellen regulieren seneszierende Zellen den IFN-Rezeptor hoch, werden gegenüber IFN aus der Mikroumgebung hypersensibilisiert und induzieren stärker die antigenpräsentierenden Maschineneffekte, die auch in menschlichen Tumorzellen rekapituliert werden, die einer therapieinduzierten Seneszenz unterliegen. Eine Störung der IFN-Erkennung in seneszenten Zellen schwächt deren immunvermittelte Clearance, ohne den Seneszenzzustand oder sein charakteristisches sekretorisches Programm zu deaktivieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass seneszente Zellen über eine verbesserte Fähigkeit verfügen, Umweltsignale sowohl zu senden als auch zu empfangen, und implizieren, dass jeder Prozess für ihre wirksame Immunüberwachung erforderlich ist.

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BEDEUTUNG:

Unsere Arbeit deckt ein Zusammenspiel zwischen Gewebeumbau und Gewebeerkennungsprogrammen auf, das durch Seneszenz bei fortgeschrittenen Krebsarten aktiviert werden kann, um Tumorzellen für das adaptive Immunsystem sichtbarer zu machen. Diese neue Facette der Seneszenz etabliert reziproke heterotypische Signalinteraktionen, die therapeutisch induziert werden können, um die Antitumorimmunität zu stärken.

EINFÜHRUNG

Zelluläre Seneszenz ist ein Stressreaktionsprogramm, das durch einen stabilen Stillstand des Zellzyklus und ein sekretorisches Programm gekennzeichnet ist, das in der Lage ist, die Gewebeumgebung umzugestalten (1). In normalen Geweben trägt Seneszenz zur Gewebehomöostase während der Wundheilung bei; In gealtertem oder geschädigtem Gewebe kann die abnormale Ansammlung alternder Zellen jedoch zu chronischen Entzündungen und einer verminderten Regenerationsfähigkeit des Gewebes führen (2–4). Es wurde gezeigt, dass Seneszenz bei Krebs sowohl positive als auch schädliche Auswirkungen auf die Gewebebiologie hat. Einerseits stellt Seneszenz eine Barriere für die Onkogen-initiierte Tumorentstehung dar und trägt zur Antitumoraktivität einiger Krebstherapien bei (5, 6). Andererseits kann die Persistenz seneszenter Tumorzellen nach der Therapie eine Gewebeumgebung schaffen, die Rückfälle und Metastasen begünstigt (7, 8). Die molekularen Grundlagen dieser gegensätzlichen biologischen Ergebnisse sind nach wie vor kaum verstanden. Eine Facette des Seneszenzprogramms, die wahrscheinlich zu einer solch vielfältigen Biologie beiträgt, ist der seneszenzassoziierte sekretorische Phänotyp (SASP; Lit. 9). SASP wird durch einen globalen Chromatin-Remodellierungsprozess aktiviert, der sich entwickelt und von wichtigen epigenetischen Regulatoren wie BRD4 und proinflammatorischen Transkriptionsfaktoren wie NF-κB und C/EBP- gesteuert wird (10–12). Dies wiederum führt zur Induktion von Genen, die Gewebeumbauproteine ​​wie Matrixmetalloproteinasen, Wachstumsfaktoren und fibrinolytische Faktoren kodieren, von denen bekannt ist, dass sie eine entscheidende Rolle im Wundheilungsprozess spielen (3, 13, 14). Zu den weiteren SASP-Komponenten gehören Chemokine und Zytokine, die die Zusammensetzung und den Zustand von Immunzellen im Gewebe verändern können, was zu einer immunvermittelten Ansteuerung und Beseitigung der seneszenten Zellen selbst führt (15, 16). Dennoch impliziert die abnormale Anhäufung seneszierender Zellen in vielen pathologischen Kontexten, dass die immunvermittelte Clearance kein universelles Ergebnis der Seneszenz oder des SASP ist und erhöht die Möglichkeit, dass zusätzliche Mechanismen die paradoxerweise vorteilhaften und schädlichen Auswirkungen der Seneszenz auf die Gewebebiologie und die Immunüberwachung bestimmen (17–19).

Sicherlich kann die seneszenzassoziierte Immunüberwachung starke Antikrebseffekte haben, obwohl die genauen Effektormechanismen je nach Gewebe und Zelltyp variieren (10, 15, 16, 20). In Mausmodellen des hepatozellulären Karzinoms (HCC) werden Lebertumorzellen, deren Alterung ausgelöst wird, durch immunabhängige Mechanismen eliminiert, die durch Wildtyp (WT) p53 aktiviert werden (15). Übereinstimmend ist TP53 im humanen HCC häufig mutiert, insbesondere in Tumoren der „Proliferationsklasse“, die die schlechteste Prognose aufweisen (21, 22). Obwohl sich Immuntherapie und TP53--Targeting-Medikamente als vielversprechende Strategien zur Verbesserung des Krankheitsverlaufs herausstellen, ist die molekulare Grundlage für Reaktion und Resistenz noch unbekannt (23–25). Daher kann das Verständnis der Mechanismen, durch die alternde Lebertumorzellen für das Immunsystem sichtbar werden, Strategien zur Auslösung einer Antitumorimmunität bei TP53-mutiertem HCC erleichtern, die sich möglicherweise auf andere Tumortypen ausweitet.

Hier haben wir uns zum Ziel gesetzt, Prinzipien zu etablieren, die die Immunerkennung und -clearance seneszenter Zellen modulieren, um umsetzbare Seneszenzmechanismen zu identifizieren, die zur Verbesserung der Immunkontrolle von Krebs genutzt werden können. Zu diesem Zweck haben wir ein neuartiges „seneszenzinduzierbares“ Modell entwickelt, bei dem Leberkrebszellen durch genetische Modulation von endogenem p53 selektiv in einen seneszenten Zustand versetzt werden können. Wir gingen davon aus, dass dies die Auswirkungen von Therapien nachahmen würde, die Seneszenz auslösen (26, 27), und gleichzeitig die verwirrenden Auswirkungen seneszenzauslösender Therapien auf Immunzellen oder andere Komponenten der Gewebeumgebung vermeiden würden. Mithilfe dieses Modells und der anschließenden Ausweitung auf andere Systeme zeigen wir, dass die Seneszenz zusätzlich zum SASP eine umfassende Umgestaltung des Zelloberflächenproteoms und der Signalprogramme in einer Weise vorantreibt, die voraussichtlich die Art und Weise, wie Zellen die Umwelt wahrnehmen und auf sie reagieren, grundlegend verändert Signale, hier beispielhaft dargestellt durch Überempfindlichkeit gegen Mikroumgebungs-Typ-II-IFN (IFN). Dieser Prozess ermöglicht eine stärkere Hochregulierung der Antigenverarbeitungs- und Präsentationsmaschinerie in seneszenten Tumorzellen, die sie für die Immunüberwachung in vivo anfällig macht. Somit zeigen unsere Ergebnisse ein neu verdrahtetes Gewebeerkennungsprogramm in seneszenten Zellen, das zusammen mit SASP deren immunogenes Potenzial steigert und so die immunvermittelte Tumorabstoßung erleichtert.

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ERGEBNISSE

Ein p53-Wiederherstellbares immunkompetentes Tumormodell zur Untersuchung der Seneszenzüberwachung

Um zu untersuchen, wie Seneszenz Zell- und Gewebezustände umprogrammiert, nutzten wir eine Technik der hydrodynamischen Schwanzveneninjektion (HTVI) (28), um ein Seneszenz-induzierbares Leberkrebsmodell zu erzeugen, das durch eine tumorspezifische, wiederherstellbare p53-Short-Hairpin-RNA (shRNA) gesteuert wird. Konkret wurden erwachsene Leberhepatozyten von immunkompetenten Bl/6-Mäusen in vivo mit einem Dornröschen-SB13-Transposasevektor und zwei Transposonkonstrukten (kodierend für NrasG12D-IRES-rtTA und TRE-tRFP-shp53 oder „NSP“) transfiziert, die in das Genom integrieren . In diesem Tet-On-System wird endogenes p53 in Gegenwart von Doxycyclin (Dox) durch die Aktivierung induzierbarer shRNA, die mit RFP verknüpft ist, unterdrückt (Abb. 1A), wodurch die genetische Kontrolle der Seneszenz in etablierten Tumoren ermöglicht wird. In Übereinstimmung mit dem gleichzeitigen Auftreten von Mutationen, die TP53 inaktivieren und Zellproliferationssignalwege (z. B. PI3K/AKT- und RAS/MAPK-Kaskaden) in menschlichen Lebertumoren aktivieren, führte die Zusammenarbeit zwischen onkogenem RAS und der Unterdrückung von p53 bei den meisten von ihnen zur Hepatozytentransformation Mäuse entwickelten 5 bis 8 Wochen nach HTVI Tumore mit schlecht differenzierten Merkmalen. Transkriptionsprofile ergaben, dass diese murinen Tumoren der „Proliferations“-Klasse des menschlichen HCC ähneln (ergänzende Abbildung S1A – S1F), der typischen Klasse des menschlichen HCC, die TP53-Mutationen beherbergt (21, 22, 29).

Basierend auf früheren Arbeiten (15) gingen wir davon aus, dass die Reaktivierung von p53 im oben genannten System Seneszenz auslösen und die Antitumorimmunität aktivieren würde. Dementsprechend löste der Dox-Entzug über mehrere Wochen dramatische Tumorrückgänge aus, was zu einem verlängerten Überleben der Tiere führte (Abb. 1B und C). Die Analyse der Tumoren 14 Tage nach Dox-Entzug ergab die erwartete Herunterregulierung der p53-shRNA (wie durch den verlinkten RFP-Reporter visualisiert) und die Akkumulation von seneszenzassoziierter -Galactosidase (SA- -gal) ohne nennenswerte Auswirkungen auf die Tumoren RAS-Effektor p-ERK (Abb. 1D). In ähnlicher Weise wurde 6 bis 8 Tage nach der p53-Wiederherstellung ein Anstieg der SA- -gal-Aktivität und der SASP-assoziierten Transkriptionsprofile zusammen mit einem damit einhergehenden proliferativen Stillstand in explantierten Tumorzellen beobachtet (ergänzende Abbildung S2A–S2H). Bemerkenswert ist, dass die Transplantation dieser Kulturen (auf Dox gehalten, um die p53-Stummschaltung aufrechtzuerhalten) in mit Dox gefütterte immunkompetente Mäuse zu synchronen und fokalen Sekundärtumoren führte, die sich nach Dox-Entzug mit einer ähnlichen Kinetik wie die Primärtumoren zurückbildeten (Abb. 1B; ergänzende Abb. S3A– S3E). Kontrollexperimente unter Verwendung eines Tet-Off-Systems oder unter Einbeziehung einer konstitutiven p53-shRNA schlossen die Möglichkeit aus, dass Dox selbst in unserem Modell irgendeinen Einfluss auf das Tumorverhalten hatte (ergänzende Abbildungen S3F und S3G). Daher ermöglicht dieses System die effiziente Induktion der Seneszenz in Tumorzellen, ohne auf Therapien zurückgreifen zu müssen, die auch das Immunsystem des Wirts verändern können. Aufgrund seiner zusätzlichen Flexibilität verwendeten wir für viele der unten beschriebenen mechanistischen Studien das orthotope Transplantationsmodell (im Folgenden als „NSP“ bezeichnet). Wie erwartet waren die oben erwähnten ausgeprägten Tumorrückgänge immunvermittelt. Daher zeigten NSP-Tumoren, die nach der Transplantation in immungeschwächte Nackt- und Rag2-/-Il2rg-/- (R2G2)-Mäuse auftraten, eine deutliche zytostatische Reaktion, bildeten sich jedoch nicht zurück, wobei R2G2-Tiere die schwerwiegendsten Defekte aufwiesen (Abb. 1E – G; Ergänzung). Abb. S3H und S3I). Da bei Nacktmäusen die adaptive Immunität mangelhaft ist und R2G2 auch in Bezug auf Aspekte der angeborenen Immunität beeinträchtigt ist, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das adaptive Immunsystem für eine effiziente Tumorregression im Modell von wesentlicher Bedeutung ist, und schaffen einen gut kontrollierten experimentellen Kontext zur Erforschung der mechanistischen Grundlagen dafür diese Effekte.

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Seneszenz löst einen Wechsel von der Immunumgehung des Tumors zur Immunerkennung aus

Um die tumorsuppressiven parakrinen Effekte der Seneszenz zu charakterisieren, haben wir als Nächstes die Immunmikroumgebungen von Tumoren charakterisiert, die p53-supprimiert (als „proliferierend“ bezeichnet) und p53-wiederhergestellt (als „seneszierend“ bezeichnet) beherbergen. ) Tumorzellen nach einer Woche Dox-Entzug, einem Zeitpunkt, an dem die Seneszenz etabliert ist, die Tumore sich jedoch noch nicht zurückgebildet haben (Ergänzende Abbildungen S2, S3 und S4A). Läsionen, die seneszente Tumorzellen beherbergen, zeigten im Vergleich zu proliferierenden Kontrollen einen etwa 1,{8}fachen Anstieg der gesamten CD45+-Immunzellen (Abb. 2A; Lit. 15, 16). Immunphänotypische und histologische Analysen (am Tag 9 nach dem Entzug von Dox) ergaben, dass dies einen deutlichen Anstieg des Prozentsatzes an Lymphozyten (B-Zellen, CD4-T-Zellen und CD8-T-Zellen) und einen Rückgang des Prozentsatzes an Gr1+ zur Folge hatte. Von Myeloiden abgeleitete Suppressorzellen/Neutrophile (CD11b+Gr1+Ly6Clo; Abb. 2B; Ergänzende Abbildungen S4B). Obwohl der Anteil der Makrophagen an der gesamten CD45-Population unverändert blieb, stiegen die absoluten Zahlen deutlich an (Abb. 2A und B; ergänzende Abb. S4C – S4E). Innerhalb der T-Zellpopulation zeigten sich akkumulierende CD8-T-Zellen Marker für die Antigenerfahrung (CD44+, CD69+) und beherbergten eine erhöhte Population von Effektorzellen (CD44+CD62L−; Abb . 2C; Ref. 30). Diese allgemeine Umgestaltung der Immunumgebung führte zu einem signifikanten Anstieg des CD3:Neutrophilen-Verhältnisses bei Tumoren, die seneszierende Zellen beherbergen (ergänzende Abbildung S4F). Diese Effekte stehen im Einklang mit ähnlichen Erhöhungen des CD3:Neutrophilen-Verhältnisses, die mit der Immunreaktivität beim Menschen in Verbindung gebracht wurden Lebertumoren (31). Der Umbau konnte mithilfe der 3D-Bildgebung nach der Gewebereinigung visualisiert werden (Abb. 2D; ergänzende Abb. S4G und S4H; ergänzendes Video S1; Ref. 32).

Abbildung 1. Ein p53-restaurierbares Tumormodell zur Untersuchung der Seneszenz-Immunüberwachung. A: Generierung des p53-wiederherstellbaren, NRAS-gesteuerten Mausleberkrebsmodells unter Verwendung des Dornröschen-Transposonsystems, das über HTVI bereitgestellt wird. (Erstellt mit BioRender.com.) B, Repräsentatives Ultraschallbild von Leberkrebsmodellen mit HTVI und orthotopischer Injektion zum angegebenen Zeitpunkt nach der Wiederherstellung von p53. C, Überlebensanalyse von Mäusen im HTVI-Modell. D, Repräsentative Hämatoxylin- und Eosin- (H&E), Immunfluoreszenz (IF) und Seneszenz-assoziierte -Galactosidase (SA- -gal)-Färbung von p53-supprimiert (p53 aus) und -restauriert (p53 ein für). 14 Tage) Tumorschnitte, die aus dem HTVI-Modell generiert wurden. Maßstabsbalken, 5{{30}} μm. E–G, Orthotopische Injektion von GFP-Luciferase-Vektor-transduzierten NSP-Tumorzellen in die Leber immunkompetenter und immundefizienter Mausstämme. E: Veränderung der Tumorgröße, gemessen durch Ultraschall nach p53-Wiederherstellung. R2G2, Rag2-Il2rg Double-Knockout-Maus. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. n Größer oder gleich 9 für jeden Stamm. F: Repräsentative makroskopische Bilder nach 21 Tagen von p53 auf oder Endpunkt p53 außerhalb des Tumors. G: Repräsentative IHC-Färbung von GFP-markierten Tumorzellen am Tag 21 nach der p53-Wiederherstellung. Maßstabsbalken, 100 μm. **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

Um die spezifischen Immunzelltypen zu bestimmen, die für die Immunüberwachung alternder Tumorzellen verantwortlich sind, haben wir parallele Kohorten von Mäusen mit orthotopen NSP-Tumoren erstellt und die Auswirkungen der Dezimierung verschiedener Immunzellpopulationen auf die Tumorregression nach Dox-Entzug untersucht. Während die Blockierung von Antikörpern gegen Neutrophile/Monozyten (Gr1), natürliche Killerzellen (NK) (NK1.1) und CD4-T-Zellen (GK1.5) keine Wirkung hatte, war die Depletion von CD8-T-Zellen (2,43) und Makrophagen (unter Verwendung von liposomalem Clodronat) nicht wirksam , das selektiv auf Makrophagen (CD11b+F4/80+), aber nicht auf klassische dendritische Zellen (CD11b−CD11c+MHC−II+CD103+; Lit. 33, 34) abzielt, beeinträchtigte die Tumorregression deutlich (Abb. 2E; ergänzende Abb. S4I). Um zu charakterisieren, wie p53--gesteuerte Tumorseneszenz zu einer produktiven Antitumorimmunität führt, führten wir eine Einzelzell-RNA-seq-Analyse (scRNA-seq) von frisch isolierten CD45-Zellen aus proliferierenden und seneszierenden NSP durch Tumoren früh nach Dox-Entzug (8 Tage; ergänzende Abb. S5A und S5B) und verwendeten den Differenzialhäufigkeitstestalgorithmus Milo (35), um Zellzustandsverschiebungen innerhalb der Immunzelltypen zu erfassen, die diesen Prozess vermitteln (ergänzende Abb. S5C – S5F). Entsprechend ihrem Beitrag zur Tumorregression zeigten die CD8-T-Zell- und Makrophagen-Subpopulationen deutliche Veränderungen in Menge und Zustand. Was T-Zellen betrifft, so waren proliferierende (p53-supprimierte) Tumoren signifikant in CD8-T-Zuständen angereichert und zeigten eine hohe Expression sowohl von Dysfunktionsmarkern (Tox, Tigit, Lag3, Ctla4, Pdcd1/PD1 und Cd160) als auch von Aktivierungsmarkern (Prf1). ; Abb. 2F und G; Ergänzende Abb. S5G; Ergänzende Tabelle S1). Diese CD8-T-Zellen zeigten auch hohe Mengen an Tnfrsf9, einem Marker, der bekanntermaßen T-Zell-Untergruppen abgrenzt, die die Fähigkeit haben, sich bei menschlichem HCC und anderen Krebsarten wiederzubeleben (36, 37). Im krassen Gegensatz dazu schienen CD8 T-Populationen in seneszenten (p53-reaktivierten) Läsionen stark aktiviert zu sein und zeigten niedrige Werte an Dysfunktionsmarkern und eine hohe Expression von Effektorzytokinen (z. B. Ifng, Tnf; Ergänzungstabelle S1). Dementsprechend zeigte das Transkriptionsprofil von Tumorgeweben immunaktive und zytotoxische Signaturen bei seneszenten Tumoren, die sich in einer Regression befanden (ergänzende Abbildung S5H; Lit. 38).

Abbildung 2. Seneszenz löst einen Tumorwechsel von Immunevasion zu Immunerkennung aus. A: Repräsentative Bilder von CD45- und GFP-Färbungen, die Immunzellen bzw. Tumorzellen in p53-supprimierten und p53-wiederhergestellten Tumoren markieren (7 Tage nach der Wiederherstellung von p53). Rechts wurde die Quantifizierung der Fläche der CD45+-Färbung aus 3 Zufallsfeldern pro Maus berechnet. Jeder Punkt repräsentiert eine Maus. B: Durchflusszytometrie-Analyse der globalen Immunlandschaft in einem orthotopen NSP-Lebertumormodell. Die Immunphänotypisierung seneszenter Tumoren wird 9 Tage nach dem Entzug von Dox durchgeführt, ein Zeitpunkt, an dem der seneszente Zustand vollständig etabliert ist, der jedoch der massiven Tumorregression vorausgeht. G-MDSC, granulozytäre myeloische Suppressorzellen; M-MDSC, monozytäre myeloische Suppressorzellen. Die Daten werden aus zwei unabhängigen Experimenten gepoolt, mit n=7 in der proliferierenden Gruppe und n=9 in der seneszenten Gruppe. Beachten Sie, dass mit zunehmender absoluter Anzahl von CD45+-Zellen in seneszenten NSP-Tumorläsionen (A) auch die Gesamtzahl der angegebenen Zelltypen zunimmt. C, Durchflusszytometrie-Analyse von CD8-T-Zellen. Die Daten werden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst, wobei n=11 in den proliferierenden und n=10 in den seneszenten Gruppen enthalten sind. Die Experimente wurden 9 Tage nach dem Dox-Entzug durchgeführt. D: Repräsentative Gewebereinigungsbilder der orthotopen NSP-Lebertumoren. T-Zellen, Neutrophile und Gefäße werden durch CD3-, MPO- bzw. CD31-Färbung markiert. Die Proben wurden 9 Tage nach Dox-Entzug entnommen. E: Mit Ultraschall gemessene Veränderung der Tumorgröße bei der p53-Wiederherstellung bei Mäusen nach der Dezimierung spezifischer Immunzelltypen mithilfe von Antikörpern oder Medikamenten. F, links, UMAP-Diagramm (Uniform Manifold Approximation and Projection) von CD8-T-Zellen, die aus p53-supprimierten proliferierenden (PRO) und p{{30}}reaktivierten seneszenten (SEN) Tumoren isoliert wurden. Rechts, Gen-Set-Anreicherungsanalyse von T-Zell-Erschöpfungsmarkergenen in CD8+-T-Zellen aus proliferierenden (p53-supprimierten) versus seneszenten (p53-reaktivierten) Tumoren. NES, normalisierter Anreicherungsscore; Pval, P-Wert. G, UMAP-Diagramm der Expression ausgewählter Gene (Cd8a, Cd44, Tnfrsf9, Cd69, Tox und Fasl) zwischen CD8-T-Zellen, die aus seneszenten (p{{40}}reaktivierten) und proliferierenden (p{ {41}}unterdrückte) Tumoren. H: Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von CD8-T-Zellen und F4/80-positiver Makrophagenfärbung im orthotopen NSP-Lebertumor. Tumorproben wurden 9 Tage nach Dox-Entzug entnommen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Alle Maßstabsbalken, 100 μm. Es wurde ein zweiseitiger Student-t-Test verwendet. *, P < 0,05; **, P < 0,01.

Veränderungen im Makrophagen-Kompartiment lieferten einen weiteren Beweis dafür, dass die Alterung der Tumorzellen einen Wechsel von der Immunumgehung zur Überwachung auslöste. Daher deuteten scRNA-seq, Immunphänotypisierung und Histologie darauf hin, dass tumorassoziierte Makrophagen-Phänotypen von F4/80lo; CD11chi-Zustände (Cluster 8), einschließlich immunsuppressiver PD-L1+-Populationen (charakteristisch für menschliche HCC-Tumoren mit schlechter Prognose; Lit. 39, 40) bis F4/80hi; CD11c−-Zustände (Cluster 0), definiert durch hohe Expression einer Antigenpräsentationsgensignatur (Ergänzungsabbildungen S5E – S5J und S6A und S6B; Ergänzungstabelle S1). Bemerkenswert sind diese seneszenzassoziierten F4/80hi; CD11c−-Makrophagen reagierten besonders empfindlich auf die Behandlung mit liposomalem Clodronat (ergänzende Abbildung S6C – S6E), was auch zu einer signifikanten Verringerung des Anteils aktiver CD8-, aber nicht CD4-T-Zellen führte (ergänzende Abbildungen S6F und S6G), was auf ein CD8 hinweist T-abhängige Immunantwort mit Kooperativität mit Makrophagen. Dementsprechend bestätigten histologische Analysen, dass sich akkumulierende CD8-T-Zellen und F4/80+-Makrophagen nach der Seneszenzinduktion in Tumoren häufig gleichzeitig anreicherten (Abb. 2H; ergänzende Abb. S4D). Insgesamt stützen diese biologischen und molekularen Analysen ein Modell, bei dem die Seneszenz von Tumorzellen einen abrupten Wechsel von der Immunumgehung zur Immunüberwachung induziert, der durch Veränderungen in Makrophagen und CD8-T-Zellzuständen vermittelt wird, was zu einer produktiven Antitumorimmunität und letztendlich zur Tumorabstoßung führt.

Seneszenz verändert Gewebeerkennungsprogramme und Zelloberflächen-Landschaft

Als nächstes wollten wir das obige Modell nutzen, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die dafür verantwortlich sind, seneszierende Tumorzellen für das Immunsystem sichtbar zu machen. Die Senes-Zenz-Induktion beinhaltet ein Chromatin-Remodellierungsprogramm, das proliferative Gene zum Schweigen bringt und viele Gene aktiviert, die für SASP-Faktoren kodieren, wobei letzteres Programm weitgehend vom Enhancer-Reader BRD4 abhängt (10). Wir führten daher Transkriptionsprofilierungsexperimente an NSP-Zellen unter proliferierenden (p53-unterdrückten) versus seneszenten (p53- wiederhergestellten) Bedingungen in Abwesenheit und Gegenwart von JQ1 durch, einem Medikament, das die BRD4-Funktion hemmt (Ergänzungstabelle S2). ). In Übereinstimmung mit den Erwartungen reduzierte die Wiederherstellung von p53 die Expression proliferativer Gene drastisch und induzierte die Expression bekannter SASP-Faktoren (Abb. 3A; ergänzende Abb. S7A; Lit. 7), einschließlich mehrerer Zytokine, von denen bekannt ist, dass sie T-Zellen stimulieren (Cxcl16, Il18). ) oder Makrophagenaktivierung und -rekrutierung (Csf2, kodierendes Protein GM-CSF) oder zuvor mit Seneszenz verbunden (Igfbp7, Igfbp3, Pdgfa). Wie aus früheren Arbeiten (10) erwartet, waren viele der hochregulierten SASP-Codierungstranskripte (~65 %) BRD4--abhängig (ergänzende Abbildung S7B). In ähnlicher Weise wurde eine Reihe von Wachstumsfaktoren und Immunmodulatoren aus den seneszenten Zellen sezerniert, wie durch Multiplex-Zytokin-Assays beurteilt wurde, darunter die T-Zell- und Makrophagen-Lockstoffe CCL5, CXCL9 und GMCSF sowie der Gefäßumbaufaktor VEGF (ergänzende Abb . S7C). Daher ist die Seneszenz in p53-wiederhergestellten NSP-Tumorzellen mit einem robusten SASP verbunden, was mit der oben beschriebenen deutlichen Umgestaltung des Immunökosystems übereinstimmt.

Bemerkenswerterweise ergab die Untersuchung der subzellulären Lokalisierung differentiell exprimierter Gene (DEG), dass seneszente Tumorzellen nicht nur die Expression sezernierter („extrazellulärer“ EC) SASP-Faktoren erhöhten, sondern auch erhebliche Veränderungen in den Expressionsniveaus von Transkripten zeigten, die Oberflächenproteine ​​kodieren („Plasmamembran“, PM; Abb. 3B). Tatsächlich kodierten 25 % der gesamten hochregulierten DEGs PM-Proteine, eine signifikante Anreicherung, die von der Zufallsverteilung abwich (15 %; Abb. 3B). Dynamische PM-DEGs wurden mit der Protein-Tyrosinkinase-Signaltransduktion (Nrp1, Egfr), der Zytokinrezeptoraktivität (Ifngr1), extrazellulären Matrixrezeptoren (Itgb3, Cd44) und Ionentransportern (Slc12a1, Slc24a3) verknüpft und erfassten bekannte Seneszenz-assoziierte Moleküle ( Cd44, Vcam1 und Itgb3), was darauf hindeutet, dass seneszierende Zellen möglicherweise eine verbesserte Fähigkeit haben, mit ihrer Umgebung zu interagieren und diese zu erfassen (Abb. 3C; ergänzende Abb. S7D; Lit. 41–43). Interessanterweise wurde der mit der Seneszenz verbundene Anstieg der Expression vieler dieser PM-Proteine ​​durch JQ1 abgeschwächt, was darauf hindeutet, dass ihre Induktion Teil des umfassenderen Chromatin-Remodellierungsprogramms sein könnte, das an SASP gekoppelt ist (Abb. 3D; Lit. 10). Bemerkenswert ist, dass tiefgreifende Veränderungen in der Transkription von Genen, die für PM-Proteine ​​kodieren, auch in p53--defizienten NSP-Tumorzellen auftraten, die mit der seneszenzinduzierenden Arzneimittelkombination Trametinib und Palbociclib behandelt wurden (Ergänzungsabbildung S7E, oberes Feld; Ergänzungstabelle S2; Ref. 20) und in einer Reihe von 13 genetisch unterschiedlichen TP53 WT- und TP53--mutierten menschlichen Krebslinien, die aus Leber-, Brust-, Lungen- und Dickdarmkrebs stammen und durch verschiedene Auslöser zum Altern gebracht werden (Abb. 3E; ergänzende Abb. S7F; Lit. 44). Dies war besonders robust für hochregulierte (aber nicht herunterregulierte) PM-DEGs, was an die für EC-SASP-Faktoren beobachteten Effekte erinnert (Abb. 3E; ergänzende Abb. S7E, unteres Feld). Daher geht die deutlich veränderte Expression von Zelloberflächenproteinen, die wir in unserem Modell beobachtet haben, über die p53-induzierte Seneszenz hinaus und könnte ein Kennzeichen des Seneszenzzustands sein.

Abbildung 3. Seneszenz verändert Gewebeerkennungsprogramme und die Zelloberflächenlandschaft. A: Gen-Set-Anreicherungsanalyse (Reaktom) von RNA-seq-Daten aus proliferierenden (PRO, p53 aus) versus seneszenten (SEN, p53 an für 8 Tage) NSP-Lebertumorzellen in vitro. NES, normalisierter Anreicherungsscore. B, Subzelluläre Lokalisierung von DEGs (P < 0.05; Fold Change > 2) in allen erkannten Genen [Transkripte pro Kilobase Million (TPM) > 1] aus RNA-seq. C, Genontologie (GO)-Analyse von DEGs, die für PM-Proteine ​​kodieren, die in seneszenten Zellen hochreguliert sind. TM, Transmembran. D, Transkriptomanalyse aller DEGs (proliferierend vs. seneszent) in Gegenwart oder Abwesenheit einer JQ1-Behandlung. Der C1-Cluster (in Rot) enthält die seneszenzspezifischen Gene, die gegenüber JQ1 empfindlich sind, und der C4-Cluster (in Blau) enthält die proliferationsspezifischen Gene, die gegenüber JQ1 empfindlich sind. E: Metaanalyse des RNA-seq-Datensatzes von SENESCopedia durch Durchführung einer subzellulären Lokalisierung von DEGs (wie in Abb. 2D) und genauer Fisher-Test zur Untersuchung der relativen Anreicherung von hochregulierten und herunterregulierten EC/PM-DEGs, die von der Zufallsverteilung abweichen. Siehe auch ergänzende Abbildungen S7E und S7F. F, Massenspektrometrie (MS)-Analyse von PM-angereichertem Proteom in proliferierenden und seneszenten Zellen. Der Proteingehalt wird auf die mittlere Expression des Proteins aller Proben normalisiert. Bei den Kontrollen handelt es sich um Proben ohne Biotin-Markierung, die als Hintergrund dienen. Rote und blaue Kästchen stellen Proteine ​​dar, die in seneszenten bzw. proliferierenden Zellen angereichert sind. n=6 sowohl für die seneszenten als auch proliferierenden Versuchsgruppen und n=3 bzw. 4 für ihre Kontrolle. G, Verteilung hochregulierter und herunterregulierter GeneCards-annotierter PM-Proteine, profiliert durch MS. NC, keine Änderung. H, Vulkandiagramm von GeneCards-annotierten PM-Proteinen, profiliert durch MS.

Um die globale Umgestaltung von PM-Faktoren im Alter auf Proteinebene zu validieren, führten wir Oberflächenproteomik an isogen proliferierenden und seneszierenden NSP-Tumorzellen durch, wobei wir eine Biotin-Markierungsanreicherungsmethode verwendeten, bei der Zelloberflächenproteine ​​mit membranundurchlässigem Biotin markiert wurden. gereinigt und einer Massenspektrometrie unterzogen (Abb. 3F; ergänzende Abb. S7G; Lit. 45). Es wurde eine starke Korrelation zwischen biologischen Replikaten unter jeder Bedingung beobachtet (ergänzende Abbildung S7H), wobei die detektierten Proteine ​​nach Induktion der p53--induzierten Seneszenz um 60 % an annotierten PM-Proteinen angereichert wurden. Von 887 Proteinen, die reproduzierbar nachgewiesen wurden, wurden mehr als 50 % unterschiedlich exprimiert. Die meisten unterschiedlich exprimierten Proteine ​​korrelierten gut mit der in unseren Transkriptionsprofilierungsdaten beobachteten Direktionalität, obwohl einige unterschiedlich exprimiert wurden, ohne dass sich die Transkriptmengen entsprechend änderten (ergänzende Abbildung S7I).

Vorteile von Cistanche für Männer: Stärkung des Immunsystems

Zu den annotierten Zelloberflächenproteinen, die durch Massenspektrometrie bei Seneszenzinduktion nachgewiesen wurden, gehörten mehrere zuvor mit Seneszenz in Zusammenhang stehende Proteine ​​(z. B. CD44 und VCAM1), verschiedene Wachstumsfaktor- und Zytokinrezeptoren (z. B. EGFR, ICAM1 und IFNGR1) und andere weniger charakterisierte Faktoren (Abb . 3F–H; Ergänzende Abb. S7J und S7K). Bemerkenswert ist, dass die in unserem Modell identifizierten an der Zelloberfläche angereicherten Proteine ​​nur begrenzte Überlappungen mit denen aufwiesen, die in menschlichen Fibroblasten identifiziert wurden, die einer Onkogen-induzierten Seneszenz unterzogen wurden (46), was auf Heterogenität zwischen Zelltypen oder Seneszenzauslösern hindeutet. Unabhängig davon zeigen diese Ergebnisse, dass seneszente Zellen zusätzlich zur Neuverdrahtung ihres Sekretionsprogramms tiefgreifende Veränderungen im Gehalt und in der Häufigkeit von Zelloberflächenproteinen erfahren und implizieren, dass seneszierende Zellen charakteristische Merkmale zur Wahrnehmung der Mikroumgebung erwerben, die ihren Zustand und ihr Schicksal in vivo beeinflussen können .

Seneszente Zellen werden darauf vorbereitet, IFNg zu erkennen und die IFNg-Signalübertragung zu verstärken

Um Wege zu identifizieren, die funktionell beeinflussen könnten, wie seneszierende Zellen ihre Umgebung wahrnehmen, haben wir transkriptionelle und proteomische Datensätze auf seneszenzbedingte Veränderungen im Zusammenhang mit der Antitumorimmunität untersucht. Interessanterweise ergab die Analyse der Genontologie (GO), dass die Typ-II-Interferon-Gamma (IFN)-Reaktion (47) zu den fünf wichtigsten annotierten Signalwegen gehörte, die während der Seneszenz angereichert wurden und von zellzustandsspezifischen Enhancer-Programmen (d. h. JQ1-sensitiv) abhängig waren ; dh „C1“ von Abb. 3D; ergänzende Abb. S8A). Unter den veränderten Transkripten haben wir mehrere positive Regulatoren der IFN-Signalübertragung festgestellt, darunter die IFN-Rezeptor-Untereinheit IFNGR1 (eines der am stärksten hochregulierten Proteine ​​aus unseren proteomischen Daten) und mehrere Interferon-Effektoren (Irf1, Irf7 und Irf9; Lit. 47, 48). ; Abb. 4A–C; Ergänzende Abb. S8B und S8C). Neben diesen Brd4--sensitiven-hochregulierten Genen waren auch Transkripte, die für negative Regulatoren der IFN-Signalisierung (Ptpn2, Socs1 und Socs3) kodieren, signifikant verringert (Abb. 4C; Lit. 49, 50). Ähnliche Veränderungen wurden bei NSP-Tumorzellen festgestellt, die mit verschiedenen Seneszenzinduktoren behandelt wurden (Abb. 4C; ergänzende Abb. S8D–S8G) und allgemeiner bei einer Gruppe von 13 menschlichen Brust-, Lungen-, Leber- und Dickdarmkrebsarten Zelllinien werden zur Seneszenz angeregt (Abb. 4D; Ref. 44). Daher sind Veränderungen in der Expression von Typ-II-IFN-Signalkomponenten ein allgemeines Merkmal seneszenter Zellen, unabhängig vom Zelltyp, Zellgenotyp, der Spezies und der Art des Seneszenzinduktors. Der gleichzeitige Anstieg der IFN-Signaleffektoren und der Rückgang der negativen Regulatoren führten uns zu der Hypothese, dass seneszente Zellen darauf vorbereitet werden, IFN in ihrer Umgebung wahrzunehmen. Um diese Hypothese direkt zu testen, behandelten wir proliferierende und seneszente NSP-Zellen mit rekombinantem IFN und führten Immunoblot-Analysen der JAK-STAT-Signalaktivierung durch. Obwohl IFN die Ausgangswerte von STAT1 in beiden Zuständen dramatisch erhöhte, sammelten seneszierende Zellen unabhängig vom Seneszenzauslöser mehr phosphoryliertes STAT1 an (Abb. 4E; ergänzende Abb. S8H). Darüber hinaus fanden wir auch einen erhöhten Spiegel an phosphoryliertem JAK1 in p53- wiederhergestellten seneszenten Zellen, was unsere Feststellung eines aktiveren JAK-STAT-Signalwegs in seneszenten Zellen, die IFN erkennen, weiter untermauert (ergänzende Abbildung S8I). Wie aus Transkriptionsanalysen vorhergesagt, löste die Seneszenz auch eine Abnahme des PTPN2-Proteins aus (51), unabhängig vom Vorhandensein von exogenem IFN (Abb. 4E). Somit aktivieren seneszente Zellen die IFN-Signalübertragung effizienter als Reaktion auf eine begrenzende IFN-Konzentration in der Umgebung.

Seneszenz und EC-IFNg regulieren gemeinsam die Antigenverarbeitungs- und Präsentationsmaschinerie

Um den funktionellen Beitrag der IFN-Erkennung zum Seneszenzprogramm besser zu verstehen, verglichen wir als nächstes die phänotypischen und transkriptionellen Zustände proliferierender und p53-wiederhergestellter seneszenter NSP-Tumorzellen, die mit rekombinantem IFN in einer niedrigen Dosierung (50 pg/ml) behandelt wurden höhere (1 ng/ml) Dosis. Obwohl die Zugabe von exogenem IFN zu proliferierenden oder seneszierenden Tumorzellen bei den getesteten Dosen einen vernachlässigbaren Einfluss auf die Lebensfähigkeit, Proliferation oder SASP-Genexpression beider Zelltypen hatte (Abb. 5A; ergänzende Abb. S9A–S9D), zeigten sich deutliche Veränderungen in Es wurde eine Genexpression des IFN-Signalwegs im Zusammenhang mit dem Seneszenzzustand beobachtet. Insbesondere ergab die überwachte Clusterung der Hallmark-„IFN-Antwortsignatur“ über proliferierende und seneszente Zellen hinweg drei DEG-Module: (i) Gene, die während der Seneszenz unabhängig von IFN herunterreguliert werden (einschließlich der oben genannten negativen Regulatoren); (ii) Gene, die während der Seneszenz unabhängig von IFN hochreguliert werden; und interessanterweise (iii) eine beträchtliche Menge an DEGs, die durch die Kombination von Seneszenz und IFN kooperativ induziert werden (Abb. 5B). Daher löst Seneszenz quantitative und qualitative Veränderungen in der Transkriptionsreaktion auf IFN aus. Ein gut etabliertes Ergebnis der IFN-Signalübertragung, die die Anfälligkeit von Zellen für die adaptive Immunüberwachung reguliert, ist eine erhöhte Fähigkeit zur Antigenpräsentation, die durch MHC-Klasse-I-Moleküle (MHC-I; Lit. 47, 52) vermittelt wird. Tatsächlich umfassten viele der Gene, die in seneszenten Zellen hochreguliert wurden (Klasse-II-Gene) oder in Gegenwart von exogenem IFN superinduziert wurden (Klasse-III-Gene), Komponenten der Antigenpräsentationsmaschinerie. Zu den während der Seneszenz induzierten Genen (Gene der Klasse II) gehörten Tap1, Transporter, die mit der Antigenverarbeitung verbunden sind, und Psme1, ein Proteasomfaktor, der mit der Antigenverarbeitung verbunden ist (53). Zu den Personen, die überempfindlich auf exogenes IFN (Gene der Klasse III) reagieren, gehörten Nlrc5, ein Transkriptionskoaktivator von MHC-I-Genen (54); der MHC-I-Assemblierungsfaktor Tapbp; und die MHC-I-Untereinheit B2m. Zwei weitere Klasse-III-Gene waren Komponenten des Immunoproteasoms (Psmb8 und Psmb9), deren Wirkungen bei Überexpression das Repertoire der präsentierten Peptide verändern können und mit einer verbesserten Tumorreaktion auf Immun-Checkpoint-Blockade verbunden sind (55). Dieser verstärkte IFN-Ausstoß in seneszenten Zellen wurde durch RT-qPCR bestätigt und blieb bei noch höheren Mengen an exogenem IFN erhalten (Abb. 5C; Ergänzungstabelle S3). In Übereinstimmung mit dem oben beschriebenen multifaktoriellen Prozess wurde dieser Effekt bei proliferierenden Tumorzellen nicht beobachtet, selbst bei solchen, die eine IFNGR1-cDNA überexprimierten und/oder mit IFN behandelt wurden (Ergänzende Abbildung S10A – S10D).

Abbildung 4. Seneszente Zellen werden darauf vorbereitet, die IFN-Signalübertragung zu erkennen und zu verstärken. A und B, IFNGR1-Spiegel auf proliferierenden und seneszenten Zellen, profiliert durch Massenspektrometrie (A) und validiert durch Durchflusszytometrie (B). AU ist eine beliebige Einheit. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. n=6 sowohl für die proliferierende als auch für die seneszierende Gruppe. C: Transkriptomanalyse ausgewählter Gene, die die IFN-Signalübertragung regulieren, aus RNA-seq-Daten von drei unabhängigen p53--wiederherstellbaren Zelllinien (NSP, NSM2 und NSP5), die p53 wiederherstellen, zusammen mit NSP-Zellen, die mit zwei anderen Seneszenzauslösern behandelt wurden. SEN/PRO, seneszierend/proliferierend; T + P, Trametinib plus Palbociclib. D: Die mRNA-Expression ausgewählter Gene, die an der IFN-Signalübertragung in menschlichen Zelllinien beteiligt sind, löste die Seneszenz aus. Behandlung: Ali, Alisertib; Eto, Etoposid; Die Zahl gibt die Behandlungsdauer (Tage) an. Die Daten stammen aus dem öffentlichen Datensatz SENESCopedia (44). E, oben, Immunoblot-Analyse von NSP-Zellen unter verschiedenen seneszenten Auslösern in Gegenwart oder Abwesenheit von IFN (1 ng/ml). Unten: Quantifizierung der Intensität des Signals vom Immunoblot. p-STAT1, Phospho-STAT1 (Tyr701).

Ebenfalls im Einklang mit den oben beschriebenen Genexpressionsänderungen regulierten seneszierende Tumorzellen MHC-I als Reaktion auf niedrige exogene IFN-Spiegel im Vergleich zu proliferierenden Gegenstücken stärker hoch. Während die MHC-I-Spiegel auf der Zelloberfläche sowohl proliferierender als auch seneszenter Zellen zu Beginn niedrig waren und durch exogenes IFN induziert wurden, zeigten seneszierende Zellen einen signifikanten Anstieg der MHC-I-Proteinexpression (Abb. 5D). Ähnliche Synergien wurden für die HLA-Expression auf der Zelloberfläche (identisch mit MHC-I bei Mäusen) in menschlichen Krebszellen aus der Leber und anderen Krebsarten beobachtet, die mit Butlin, das ein ap53-abhängiges Seneszenzprogramm aktiviert, Seneszenz auslösen (56). oder Trametinib/Palbociclib, das bevorzugt auf Tumorzellen mit einem aktivierten MAPK-Signalweg abzielt (Ergänzende Abb. S11A – S11D; Lit. 20). Bemerkenswert ist, dass die kombinatorischen Wirkungen von medikamentöser Behandlung und IFN auf die HLA-Expression eine Seneszenzinduktion erforderten und nicht in Lebertumorzellen auftraten, die aufgrund einer spontanen oder manipulierten p53-Mutation (nicht auf die Skizze reagierend) oder eines nicht hyperaktivierten MAPK-Signalwegs (nicht reagierend) nicht altern konnten zu Trametinib/Palbociclib). Auch wenn die IFN-Reaktionswege vom Typ I und II überlappende Komponenten umfassen, konnte eine exogene IFN-Behandlung IFN nicht ersetzen, indem sie in unserem p53-Restaurierungsmodell eine robuste MHC-I-Induktion in seneszenten Zellen oder eine stark unterschiedliche Induktion zwischen proliferierenden und seneszenten Zellen hervorrief ( Ergänzende Abbildungen S11E und S11F). Diese Daten deuten darauf hin, dass murinen und menschlichen Zellen, die zur Seneszenz gebracht werden, in Gegenwart begrenzter Mengen an IFN eine erhöhte Fähigkeit zur Antigenverarbeitung und -präsentation aneignen.

Seneszente Tumorzellen hyperaktivieren den IFNg-Signalweg in vivo

Um die In-vivo-Konsequenzen der in seneszenten Zellen identifizierten Neuverdrahtung der IFN-Signalübertragung zu bestimmen, haben wir als Nächstes ein IFN-Sensing-Reportersystem (IGS) angepasst, um die intrazelluläre IFN-Signalaktivierung direkt in Echtzeit zu visualisieren (57). Dieser Reporter besteht aus einer Reihe von Konsensus-IFN-aktivierten Sequenzen, die gegenüber anderen Signalen spezifisch für Typ-II-IFN sind (57), gefolgt von einer cDNA-Sequenz, die das fluoreszierende Protein ZsGreen1 kodiert, und ist mit einem konstitutiv exprimierten RFP-Transgen verknüpft, um transduzierte Zellen sichtbar zu machen ( Abb. 6A). NSP-Tumorzellen, die dieses Konstrukt exprimierten, waren RFP-positiv und zeigten bei Behandlung mit IFN in vitro einen dosisabhängigen Anstieg des ZsGreen1-Signals, der nach p53-Induktion oder nach Behandlung mit seneszenzinduzierenden Arzneimitteln zunahm (Abb. 6B; ergänzende Abb. S12A und S12B). .

Als nächstes verwendeten wir dieses System, um die Signalaktivität nach der Seneszenzinduktion in Tumoren zu überwachen. Reportertransduzierte Tumorzellen (auf Dox), die konstitutives RFP exprimieren, wurden in die Leber von mit Dox gefütterten syngenen Empfängern injiziert, und bei der Tumormanifestation wurde Dox entfernt, um die p53-Expression zu induzieren und Seneszenz wie oben auszulösen (siehe Abb. 1 und 2). Rückbildende Tumoren wurden 9 Tage nach Dox-Entzug isoliert, um eine 3D-Bildgebung der Reporteraktivität und eine parallele Beurteilung der IFN-Signalisierung im Vergleich zu proliferierenden Kontrollen (von Mäusen, die mit Dox behandelt wurden) durchzuführen. Wie in Abb. 6C dargestellt, zeigten proliferierende Tumorzellen, wenn überhaupt, nur eine geringe Reporterexpression, wohingegen Tumorzellen, die in vivo zum Altern gebracht wurden, ein deutlicheres ZsGreen1-Signal zeigten (Abb. 6C und D; Zusatzvideo S2). Dieser Effekt fiel mit einem spezifischen Anstieg der IFN-Proteinspiegel (jedoch nicht des Typ-I-IFN) in Tumorgewebeextrakten zusammen (Abb. 6E; ergänzende Abb. S12C).

Um zu testen, ob die veränderte Zusammensetzung von Immunzellen in seneszenten Tumoren (Abb. 2; ergänzende Abbildungen S5–S6) zum verstärkten Signal des IGS-Reporters beitrug, führten wir In-vitro-Kokulturtests durch, die es ermöglichten, seneszente oder proliferierende Tumorzellen einem Virus auszusetzen gleiche Anzahl aktivierter CD8 T-Zellen, die wir anhand von scRNA-seq-Daten als die vorherrschende zelluläre Quelle von IFN in vivo identifizierten (Abb. 6F – H). Seneszente Zellen zeigten im Vergleich zu proliferierenden Kontrollen immer noch einen signifikanten Anstieg des ZsGreen1-Signals (Abb. 6I). Im Einklang mit einer nicht zellautonomen Signalaktivierung wurde IFN in konditionierten Medien von NSP-Tumorzellen unter proliferativen oder seneszenten Bedingungen nicht nachgewiesen (ergänzende Abbildung S12D), IFN konnte jedoch bei Kokultur mit CD8-T-Zellen leicht nachgewiesen werden, ein Effekt, der vorhanden war weiter verstärkt durch die Zugabe von Makrophagen und verbunden mit einer erhöhten MHC-Klasse I auf seneszenten Zellen sowie einer erhöhten Aktivierung von CD8-T-Zellen (Ergänzende Abb. S12E – S12J). Insgesamt stützen diese Daten ein Modell, bei dem heterotypische Interaktionen zwischen seneszenten Tumorzellen und Immunzellen den Tumor für exogenes IFN sensibilisieren, was zu einer verbesserten Antigenpräsentation und einer effizienten Immunüberwachung führt.

Abbildung 5. Seneszenz und EC IFN arbeiten zusammen, um die Antigenverarbeitungs- und Präsentationsmaschinerie hochzuregulieren. A und B: mRNA-Expression von Genen in proliferierenden und seneszenten NSP-Zellen in vitro in Gegenwart oder Abwesenheit einer IFN-Behandlung (50 pg/ml). Der mRNA-Spiegel wird auf die mittlere Expression des Gens in allen Proben normalisiert. A: DEG-kodierende SASP-Faktoren in unserem Modell. B, IFN-Antwortgene aus der Hallmark-Signaturdatenbank. C, RT-qPCR ausgewählter Gene des Antigenpräsentationswegs in proliferierenden und seneszenten Zellen, behandelt mit niedriger (50 pg/ml) oder hoher (1 ng/ml) IFN-Konzentration. Die Proben stammen aus zwei biologischen Replikaten. D, MHC-I-Spiegel proliferierender und seneszierender Zellen, die 24 Stunden lang mit IFN behandelt wurden, gemessen mittels Durchflusszytometrie. MFI, mittlere Fluoreszenzintensität. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt.

Abbildung 6. Seneszenz verstärkt die IFN-vermittelte heterotypische Signalübertragung von aktivierten Immunzellen zu Tumorzellen. Eine grafische Illustration des IGS-Reporters. (Erstellt mit BioRender.com.) B, links, repräsentative Durchflusszytometriediagramme zur Messung von ZsGreen1-Signalen in proliferierenden und seneszenten NSP-Zellen, die mit 1 ng/ml IFN behandelt wurden. Rechts: Quantifizierung des Prozentsatzes ZsGreen1-positiver Zellen nach IFN-Behandlung. MFI, mittlere Fluoreszenzintensität. C und D: Repräsentative 3D-Bildgebung von gewebegereinigten Tumoren aus der orthotopisch injizierten Leber-NSP-Zelllinie, die den IGS-Reporter exprimiert (C). Quantifizierung von 3 zufällig ausgewählten Feldern aus dem Lebertumor jeder Maus (D). n=5 und n=3 für die proliferierende bzw. seneszierende Gruppe (9 Tage nach der Wiederherstellung von p53). Maßstabsbalken, 100 μm. E, oben, zytometrischer Bead-Array-Assay für den IFN-Spiegel aus In-vivo-Tumorgewebe-Lysatproben (7 Tage nach der p53-Wiederherstellung). Unten: Transkripte der angegebenen Gene aus der RNA-Sequenz von In-vivo-Massenproben von Tumoren, die durch HTVI erzeugt wurden (PRO, p53 aus; SEN, p53-Wiederherstellung für 12 Tage). TPM, Transkripte pro Kilobase Million. Der bekannte Ifna/b-Cluster enthält 14 Ifna-Subtypen und 1 Ifnb-Gen. F und G: Expression von Ifng in tumorinfiltrierenden Immunzellen, profiliert durch scRNA-seq im NSP-Transplantationsmodell (wie in Abb. 2, eine Probe, die am Tag 8 nach der p53-Wiederherstellung entnommen wurde). H: Einheitliche Mannigfaltigkeitsnäherung und Projektionsdiagramm der Expression von Havcr2 (kodierend für TIM3) und Ifng in CD8-T-Zellen, die aus proliferierenden (P) und seneszenten (S) Tumorläsionen entnommen wurden. Das obere Feld ist aus Abb. 2F (links) repliziert, um die Zellen anzuzeigen, die jeder Bedingung entsprechen. I, Quantifizierung der ZsGreen1-Intensität von NSP-Tumorzellen im Kokulturexperiment mit OT-I-T-Zellen und SIINFEKL-exprimierenden Tumorzellen (Effektor-zu-Ziel-Verhältnis, 5:1) nach 2{47} Stunden Kokultur. Mittels Durchflusszytometrie gemessenes Signal. T + P, Trametinib plus Palbociclib. Siehe experimentelle Details in der ergänzenden Abbildung S12E. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Es wurde ein zweiseitiger Student-T-Test verwendet. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

Die IFNg-Signalübertragung in seneszenten Tumorzellen ist für die Immunüberwachung notwendig

Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die immunvermittelte Clearance seneszenter NSP-Tumorzellen die kombinierten Wirkungen von SASP beinhaltet, von dem bekannt ist, dass es die Rekrutierung von Immunzellen stimuliert (10, 20, 58), zusammen mit einer bisher unterschätzten Fähigkeit seneszenter Zellen, die Wahrnehmung und Reaktion darauf zu verbessern EC-Signale, wie hier mit IFN gezeigt. Um den Beitrag des Seneszenz-assoziierten IFN-Erkennungsprogramms zur Immunüberwachung seneszierender Tumorzellen zu testen, untersuchten wir, wie sich eine Störung des IFNGR in den Tumorzellen oder eine IFN-Depletion im Wirt auf die Clearance von NSP-Tumorzellen bei Seneszenzinduktion auswirkt . Tatsächlich wurde die Tumorregression (jedoch nicht die Seneszenz an sich; ergänzende Abb. S13A – S13D) durch Knockout (KO) von IFNGR1 beeinträchtigt (Abb. 7A und B; ergänzende Abb. S14A – S14C), ein Effekt, der noch ausgeprägter war IFNGR-intakte Tumoren, die in Ifng-/−-Mäuse transplantiert wurden (Abb. 7C und D) und mit dem erwarteten Verlust von Oberflächen-MHC-I in Tumorzellen verbunden sind (Ergänzende Abb. S14D und S14E).

In Übereinstimmung mit dem bekannten Beitrag der IFN-Signalübertragung und des Tumorzell-MHC-I zur CD8+-Interaktion (59) enthielten Tumore, denen IFNGR1 fehlte oder die sich bei Ifng-/--Empfängern entwickelten, in beiden Fällen weniger CD8-T-Zellen als ihre WT-Gegenstücke proliferierende und seneszierende Zustände (ergänzende Abb. S14F), während dennoch ein robustes Immuninfiltrat einschließlich reichlich vorhandener Makrophagen induziert wird (Abb. 7E und F; ergänzende Abb. S14G). Unabhängig davon war der beeinträchtigte Phänotyp der Seneszenzüberwachung nicht einfach eine Folge dieser Abnahme der CD8-T-Zellen. Kokulturtests, die eine gleichmäßige Exposition von IFNGR1-KO- und WT-Tumorzellen gegenüber CD8-T-Zellen und Makrophagen ermöglichten, zeigten immer noch eine IFNGR1--abhängige Abtötung seneszierender Tumorzellen (ergänzende Abbildung S15A–S15E) – eine Abhängigkeit, die das Vorhandensein beider T Zellen und Makrophagen und das nicht wurde in proliferierenden Tumorzellen unter den gleichen Bedingungen beobachtet. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die verbesserte Fähigkeit seneszierender Zellen, IFN aus der Mikroumgebung zu erkennen, zusammen mit der SASP-stimulierten Rekrutierung von Immunzellen wirkt, um sich gegenseitig verstärkende heterotypische Interaktionen zwischen Tumorzellen, Makrophagen und aktivierten T-Zellen zu ermöglichen, die die Antigenpräsentation und Immunüberwachung verbessern , was zu starken Tumorrückgängen führt.

DISKUSSION

Anhand eines murinen Tumormodells, bei dem die Krebsimmunevasion gegenüber der Seneszenzüberwachung einer strengen genetischen Kontrolle unterliegt, zeigen wir, wie seneszente Zellen ihre Fähigkeit, Umweltsignale sowohl zu senden als auch zu empfangen, dramatisch verändern (ergänzende Abbildung S16). In Übereinstimmung mit bekannten Seneszenzprogrammen führte die p53--gesteuerte Seneszenzinduktion zur Stummschaltung proliferativer Gene und induzierte das SASP. Allerdings beobachteten wir auch einen tiefgreifenden Effekt auf die Genexpression für PM-Proteine, einschließlich einer Reihe von Wachstumsfaktorrezeptoren und Zytokinrezeptoren, von denen vorhergesagt wird, dass sie die Reaktion seneszierender Zellen auf Umweltsignale drastisch verändern. Obwohl wir ein Leberkrebsmodell als primäres experimentelles System verwendeten, wurde eine ähnliche Neuverdrahtung in der Expression von Zelloberflächensensoren und Genprogrammen, die auf Umweltsignale reagieren, in einem breiten Spektrum von murinen und menschlichen Tumorzellen beobachtet, die mit seneszenzinduzierenden Mitteln behandelt wurden Agenten, was impliziert, dass das veränderte Wahrnehmungsprogramm ein allgemeines Kennzeichen des seneszenten Zustands ist.

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Einer der wichtigsten in seneszenten Zellen veränderten Wahrnehmungswege ist die IFN-Signalübertragung vom Typ II. In unserem Leberkrebsmodell und in allen von uns untersuchten Seneszenzstadien geht die Seneszenz mit zellinternen Transkriptions- und Proteinexpressionsänderungen einher, von denen vorhergesagt wird, dass sie die Signalübertragung durch exogenes IFN verstärken. Tatsächlich aktivieren seneszierende Zellen IFN-Effektoren als Reaktion auf IFN in vitro und in vivo stärker, und für eine effiziente CD8-T-Zell-vermittelte Clearance seneszierender Tumorzellen sind sowohl ein intakter IFN-Effektorweg als auch IFN in der Umgebung erforderlich. Obwohl die Signalweganalyse seneszierender Zelltranskriptome die IFN-Signalübertragung vom Typ II ausnahmslos als angereichertes Merkmal identifiziert, haben Überschneidungen zwischen Signalkomponenten vom Typ I und II und die Tatsache, dass IFN normalerweise nicht als SASP-Faktor erkannt wird, mechanistische Fragen zur IFN-Signalübertragung vom Typ II in der Seneszenz aufgeworfen weitgehend unerforscht. Unsere Studien zeigen, dass eine solche Anreicherung der IFN-Signalsignaturen seneszierender Zellen eine verbesserte Fähigkeit zur IFN-Erkennung widerspiegelt, deren Ausgabe in vivo am stärksten ausgeprägt ist.

Abbildung 7. Die IFN-Signalübertragung in seneszenten Tumorzellen ist für die Immunüberwachung notwendig. A: Ifngr1-KO sowohl proliferierender als auch seneszierender NSP-Zellen, validiert durch Durchflusszytometrie. B: Tumorregressionsphänotyp von Ifngr1-KO oder Kontroll-sgRNA-transfizierten Tumorzellen, die nach p53-Wiederherstellung orthotop in Bl/6N-Mäuse injiziert wurden. Als Kontrolle dient eine Kontroll-sgRNA, die auf eine Genwüste auf Chr8 (Strg KO) abzielt. C: Tumorregressionsphänotyp von parentalen NSP-Tumorzellen, die nach p53-Wiederherstellung orthotop in WT- oder Ifng-KO-Mäuse injiziert wurden. D, Repräsentative makroskopische Bilder des Tumors, gesammelt am Tag 21 nach der Wiederherstellung von p53 aus C. E, Durchflusszytometrie-Analyse der CD45-Häufigkeit im Tumor aus den angegebenen Gruppen. F: Repräsentative Immunfluoreszenz in p{{10}}supprimiertem (proliferierendem) und p53-wiederhergestelltem (seneszierendem, 7 Tage nach p53-Wiederherstellung) Tumor des angegebenen Wirts. NSP-Tumorzellen wurden zur Visualisierung mit einem GFP-exprimierenden Vektor transduziert. Maßstabsbalken, 50 μm. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Es wurde ein zweiseitiger Student-T-Test verwendet. **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

Der vielleicht am besten etablierte Effekt der IFN-Signalübertragung vom Typ II ist ihre Fähigkeit, die Antigen-Präsentationsmaschinerie zu induzieren. Tatsächlich induzierte IFN in unserem Modell sowohl unter Proliferations- als auch unter Seneszenzbedingungen die Zelloberflächenexpression von MHC-I (oder HLA in menschlichen Zellen). Allerdings war die IFN-induzierte MHC-I-Hochregulation in seneszenten Zellen stärker ausgeprägt, ein Effekt, der mit einer erhöhten Expression des Transporters korrelierte, der mit der Antigenverarbeitung, anderen Antigenverarbeitungsfaktoren und strukturellen Komponenten von MHC-I verbunden ist. Eine ähnliche Überempfindlichkeit gegen IFN bei der Induktion von MHC-I/HLA wurde bei menschlichen Leber- und Lungenkrebszelllinien beobachtet, die zur Alterung gebracht wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Seneszenzprogramm die Antigenpräsentation in nichtimmunen Zellen verbessern und dadurch die Immunüberwachung von Tumoren erleichtern kann. Unsere Ergebnisse stützen ein Modell, bei dem der letztendliche Einfluss seneszierender Zellen auf die Gewebebiologie durch die kombinierten Auswirkungen der Art und Weise bestimmt wird, wie sie Umweltsignale senden und empfangen. Seneszente Zellen induzieren nicht nur das SASP, das den Gewebeumbau auslöst und den Zellzustand und die Zusammensetzung von Immunzellen in der Umgebung verändert, sondern sie verändern auch dramatisch ihr Oberflächengewebe, was zu einer unterschiedlichen Fähigkeit führt, Umweltfaktoren zu erkennen, hier am Beispiel von IFN. Wichtig ist, dass die Störung der IFN-Signalübertragung keinen Einfluss auf die Seneszenzinduktion oder das SASP in unserem System hatte, jedoch nachfolgende Tumorregressionen beeinträchtigte, was darauf hindeutet, dass eine veränderte Umweltwahrnehmung zusammen mit dem SASP die endgültige Ausgabe des Seneszenzprogramms bestimmt – in diesem Fall Immunüberwachung. Diese Effekte scheinen Teil eines koordinierten epigenetischen Programms zu sein, da sowohl das SASP- als auch das Sensing-Programm eine deutliche Abhängigkeit vom Chromatin-Remodelling-Faktor BRD4 aufweisen.

Obwohl der Mechanismus der Immunüberwachung in unserem Modell von den kooperativen Wirkungen von CD8-T-Zell- und Makrophagenpopulationen abhängt, die einen Übergang von einer „immunen Kälte“ zu einer „immunen heißen“ Tumormikroumgebung widerspiegeln, können andere angeborene oder adaptive Immunzelltypen dies erkennen und klare seneszierende Zellen in verschiedenen Kontexten, oder alternativ findet möglicherweise überhaupt keine Immunüberwachung statt (18, 19). Zweifellos spiegeln einige dieser Unterschiede die Heterogenität in der Sekretion des SASP-Faktors wider (13, 14), obwohl unsere Ergebnisse die Möglichkeit nahelegen, dass das Ausmaß und die Art der veränderten Umweltwahrnehmung auch Einfluss darauf haben, wie seneszente Zellen die Gewebebiologie beeinflussen. Obwohl die Ausschaltung der IFN-Erkennung (über Ifngr1 KO) und die Deletion von MHC-I (B2M KO) in seneszenten Tumorzellen deren Immunüberwachung in vivo beeinträchtigten, wurde die Tumorregression nach Seneszenzinduktion nicht vollständig aufgehoben, was darauf hindeutet, dass die IFN-Erkennung in seneszenten Zellen der Fall ist nicht der einzige Weg, der zur Tumorregression beiträgt. Unabhängig davon impliziert die Tatsache, dass seneszierende Zellen unterschiedlich auf Umweltsignale reagieren können, dass ihr endgültiger molekularer Zustand im Gewebe anders sein wird als in Zellkulturen, was die Notwendigkeit einer besseren Charakterisierung des Prozesses in vivo unterstreicht.

Unsere Ergebnisse können dazu beitragen, die paradoxen Auswirkungen der Seneszenzbiologie auf Physiologie und Krankheit zu erklären und Auswirkungen auf den wirksamen Einsatz seneszenzmodulierender Therapeutika zu haben. Beispielsweise wurde in unserem Modell der Unterschied zwischen der Clearance und Persistenz seneszierender Tumorzellen zumindest teilweise durch das Vorhandensein von IFN in der Umgebung und die Integrität der Typ-II-IFN-Signalisierung in den seneszenten Zellen bestimmt. Dies deutet darauf hin, dass eine Variation in der Fähigkeit seneszierender Zellen, IFN-sekretierende Immunzellen oder andere Immunzelltypen zu rekrutieren und zu erkennen, die Clearance seneszierender Zellen tiefgreifend beeinflussen könnte, sodass eine verminderte IFN-Signalisierung in der Umgebung oder eine verminderte Typ-II-IFN-Signalisierung die Persistenz seneszierender Zellen im Gewebe ermöglichen könnte. Im Zusammenhang mit Krebs können Therapien, die die Seneszenz von Tumorzellen induzieren – ein zytostatisches Programm –, eine immunvermittelte Tumorregression auslösen oder Tumore für eine Blockade des Immun-Checkpoints resensibilisieren. Dies sind jedoch keine universellen Ergebnisse. Daher kann die Heterogenität im SASP (die je nach Tumorzelltyp und Seneszenzinduktor variieren kann) oder die IFN-Erkennung und -Ausgabe [möglicherweise beeinflusst durch die Deletion oder Mutation des IFN-Signalwegs oder der HLA-Komponenten (60) oder die hier aufgedeckten reversiblen Transkriptionsmechanismen] einen Einfluss haben die Wirksamkeit solcher Therapien bei Patienten. In Übereinstimmung mit dieser Annahme sagt die therapiegesteuerte Induktion spezifischer SASP-Profile die Patientenergebnisse bei einer Untergruppe von Patientinnen mit Eierstockkrebs voraus (61). Im Gegensatz dazu können Strategien zur Verbesserung der Immunüberwachung seneszenter Zellen durch Erhöhung ihrer Empfindlichkeit gegenüber IFN (z. B. mit PTPN2-Inhibitoren) dazu beitragen, die Programmausgabe in Richtung einer Abstoßung von Tumorzellen zu beeinflussen. Wir gehen davon aus, dass die Untersuchung dieses und anderer Programme zur Gewebeumgestaltung und -erkennung in Tumorbiopsien vor und nach der Behandlung (z. B. durch transkriptomische oder proteomische Profile) neue Reaktionsbiomarker und/oder Kombinationsstrategien zur Verbesserung des klinischen Managements von Krebs aufdecken könnte.

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