Sidt2 ist ein Schlüsselprotein im Autophagie-lysosomalen Abbauweg und ist für die Aufrechterhaltung der Nierenstruktur und der Filtrationsfunktion von wesentlicher Bedeutung Ⅱ
Nov 07, 2023
DISKUSSION
Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass LMPs an der Nierenfunktion oder der strukturellen Homöostase beteiligt sind [21–25]. Unsere vorherige Studie ergab, dass das LMP Sidt2 den Entzündungssignalweg beeinflusst und Schäden an den glomerulären Mesangialzellen der Maus verursacht [28]. In dieser Studie untersuchten wir zum ersten Mal die Auswirkungen des LMP Sidt2 auf die Struktur und Funktion von Mäusenieren. Es wurde festgestellt, dass die Deletion von Sidt2 zur Verschmelzung der Fußfortsätze der Mausniere, zu einer Verdickung der Basalmembran, einem Ödem der renalen tubulären Epithelzellen, einer Schädigung der Mikrovilli und einer erhöhten Proteinurie nach 24 Stunden führte, was darauf hindeutet, dass der Verlust von Sidt2 zu einer beeinträchtigten Filtrationsfunktion führt und Struktur der Mäuseniere, der detaillierte Mechanismus ist jedoch nicht klar.
Denn LMPs sind wichtige funktionelle Einheiten des Lysosoms [17] undlysosomale Dysfunktioneiner der häufigsten pathogenen Faktoren vieler chronischer Nierenerkrankungen (CDKs) ist (Ref. [4, 29]), haben wir entsprechende Untersuchungen an Lysosomen nach Sidt2-Deletion durchgeführt und festgestellt, dass die Anzahl der sauren Lysosomen abnahm und der pH-Wert der Lysosomen nahmen in vitro zu. Allerdings gab es bei der elektronenmikroskopischen Analyse keine offensichtlichen Veränderungen in der Anzahl der an Autophagosomen gebundenen primären Lysosomen und der Gesamtzahl der Lysosomen. Cathepsine stellen die größte Gruppe proteolytischer Enzyme in Lysosomen dar [30], unter denen CTSB eine der am häufigsten vorkommenden lysosomalen Proteasen ist [31].
Da Cathepsine zur Reifung (Aktivierung) angesäuert werden müssen, führt eine Änderung des pH-Werts letztendlich zu einer deutlichen Verringerung des Proteinabbaus [32]. In-vivo- und In-vitro-Spiegel zeigten eine verringerte Aktivität und einen verringerten Gehalt an lysosomaler Säurehydrolase, was weiter bestätigt, dass Sidt2 die lysosomale Funktion hemmt, indem es die Reifung von Proteasen in den Lysosomen beeinflusst.
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Unterdessen fungiert das Lysosom als Recyclingzentrum für den Abbau zellulärer Metaboliten und Abfallprodukte am Ende der Autophagie [1]. Eine normale lysosomale Abbaufunktion ist für die Autophagie, die Aufrechterhaltung der Zellhomöostase und das Überleben der Zellen in physiologischen Zuständen von wesentlicher Bedeutung [33–36]. Es wurde nachgewiesen, dass das Auftreten und die Entwicklung vieler Nierenerkrankungen mit einer abnormalen Autophagie zusammenhängen [37–39]. Aktuelle Studien haben ergeben, dass Sidt2 ein lysosomaler DNA/RNA-Transporter ist. Die unkonventionellen Arten der Autophagie durch RNautophagy und DNautophagy (RDA) sind wichtig für den selektiven RNA/DNA-Abbau [40]. Wir haben zuvor herausgefunden, dass die Deletion von Sidt2 die Fusion von Autophagosomen und Lysosomen schädigt, was dazu führt, dass beschädigte Mitochondrien nicht abgebaut werden können, was zu einer Schädigung der Struktur und Funktion der Skelettmuskulatur führt [41]. Daher haben wir in dieser Studie die Autophagie untersucht, wenn Nierenschäden durch Sidt2-Deletion verursacht wurden. Wir beobachteten durch Elektronenmikroskopie, dass sich Autophagolysosomen in den Nieren von Sidt2−/− Mäusen ansammelten. Autophagie ist ein dynamischer Prozess, der die Bildung von Autophagosomen sowie die Bildung und den Abbau von Autophagolysosomen umfasst. Die Bildung früher Autophagosomen wird durch das Atg-Gen gesteuert, und die Bildung von LC3-II ist ein Zeichen der Autophagosomenbildung [42]. Wir fanden heraus, dass die Expression der Autophagie-bezogenen Proteine Atg und LC3-II beide nach der Sidt2-Deletion zunahmen, was darauf hinweist, dass die Autophagie-Aktivität möglicherweise verstärkt ist. Die Akkumulation von LC3-II kann jedoch auch durch eine Blockierung des Autophagolysosomen-Signalwegs am Ende der Autophagie verursacht werden
Um die Wirkung von Sidt2 auf den Zustand der renalen Autophagie weiter zu untersuchen, wurden die Expression und Bildung des P62-Frachtproteins gemessen und auch die Auswirkungen von Medikamenten untersucht, die auf die Autophagie abzielen (CQ und RAPA). P62 muss mit LC3B kombiniert und dann im Lysosom abgebaut werden. Ein Anstieg des P62-Proteinspiegels stellt häufig eine Blockade des Autophagieflusses dar [43]. Um die Ursache für den Anstieg der P62-Produktion zu beseitigen, haben wir den mRNA-Spiegel von P62 gemessen und festgestellt, dass die Produktion von P62 verringert war, sodass die Akkumulation von LC3-II wahrscheinlich auf einen behinderten Abbau zurückzuführen war. Um den Prozess der Autophagie weiter zu erforschen, führten wir ein Chloroquin-Flip-Experiment durch. Chloroquin kann die saure Umgebung des Lysosoms neutralisieren und anschließend die Funktion des Lysosoms zerstören und die Autophagie hemmen [44]. Der Anstieg des LC3-II-Proteins vor und nach der CQ-Behandlung spiegelt die Anzahl der durch Lysosomen abgebauten Autophagosomen wider, was die Aktivität der Autophagie widerspiegeln kann. Der gleiche CQ-Flip-Test kann auch verwendet werden, um das Ausmaß des P62-Abbaus über den Autophagolysosomenweg zu bestimmen. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen führte die Löschung von Sidt2 zu einer Verringerung des Autophagieflusses aufgrund des blockierten Endes der Autophagie. Gleichzeitig stiegen im RAPA-Experiment die LC3-II- und P62-Proteinspiegel in der Sidt2−/−-Gruppe signifikant an, was ein weiterer Beleg dafür sein kann, dass das Fehlen von Sidt2 die Endphase der Autophagie beeinträchtigt.
Die Endphase der Autophagie umfasst die Bildung und den Abbau von Autophagolysosomen. Wir verwendeten LAMP1- und LC3B-Immunfluoreszenz-Co-Lokalisierungsexperimente, um die Fusion von Autophagosomen und Lysosomen nachzuweisen [45, 46], und die Ergebnisse zeigten, dass die Fusion von Autophagosomen und Lysosomen nach der Sidt2-Deletion blockiert wurde. Das Ad-mCherry-GFP-LC3B-Doppelmarkierungsexperiment erkennt die Bildung und den Abbau von Autophagolysosomen [27]. Es bestätigte außerdem, dass die Blockierung der Bildung und des Abbaus von Autophagolysosomen der Hauptgrund für die Schädigung der Nierenstruktur und -funktion nach der Sidt2-Deletion ist.
Aus den obigen Ergebnissen können wir schließen, dass das Fehlen von Sidt2 zu einer Verringerung der Anzahl saurer Lysosomen führt und dass die Ansäuerungsstörung der Lysosomen die Reifung hydrolysierter Enzyme beeinflusst. Dies könnte neben Autophagosomen- und Lysosomenfusionsstörungen die wichtigste Ursache für Schäden am Autophagie-Lysosomen-Abbauweg sein. Unterdessen könnte der beeinträchtigte Autophagieprozess eng mit der beschädigten Nierenstruktur und Filterfunktion nach der Sidt2-Deletion zusammenhängen (Abb. 8). Unsere Studie befasst sich nur mit einem Teil der Auswirkungen von Sidt2 auf die Nierenstruktur und -funktion. Interessant ist jedoch, dass die Anhäufung wichtiger Autophagieproteine und die durch die Deletion von Sidt2 verursachte Beeinträchtigung der Nierenstruktur und -funktion den Veränderungen der wichtigsten Autophagieproteine ähnlich sind signifikant erhöhte Proteinurie bei diabetischer Nephropathie [37, 47]. Die Reparatur der Lysosomenfunktion könnte eine potenzielle neue Strategie zur Behandlung der diabetischen Nephropathie sein [37]. Wir gehen davon aus, dass Sidt2 in Zukunft eine Möglichkeit bieten wird, die Pathogenese und Behandlung von Nierenerkrankungen zu erforschen.
Urinproteintest bei Mäusen Zufällig ausgewählte 12- Wochen alte WT-Mäuse und männliche Sidt2-/-Mäuse wurden in Stoffwechselkäfige gesetzt und nüchtern, aber mit Wasser versorgt. 24-Stunden-Urinproben wurden gesammelt und dann auf Urinprotein getestet (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, CHN, C035-2-1) (ausführliche Methoden finden Sie in den ergänzenden Materialien). Zellen MPC5 glomeruläre Podozyten der Maus wurden von der BeNa Culture Collection erworben und mit 10 % FBS (Excell Bio, Südamerika, FSP500) und DMEM mit niedrigem Glucosegehalt (Sigma-Aldrich, 6046) kultiviert. SV40 MES 13 glomeruläre Mesangialzellen der Maus wurden von der Zellbank des typischen Kulturkonservierungsausschusses der Chinesischen Akademie der Wissenschaften erworben und mit 10 % FBS (Excell Bio, Südamerika, FSP500) und DMEM mit hohem Glucosegehalt (Sigma-Aldrich, 6429) kultiviert. . Die CO2-Konzentration der Zellkulturbox wurde bei 5 % und die Temperatur bei 37 Grad gehalten. Chloroquin (CQ) und Rapamycin (RAPA) wurden von Sigma-Aldrich (C6628, V900930) bezogen. 10 mM CQ und 25 mg/ml Rapamycin wurden beide in hochreinem Wasser gelöst. CQ wurde in die Petrischale gegeben, so dass die Endkonzentration 50 μM betrug, und 16 Stunden lang als Autophagie-Inhibitor inkubiert. Rapamycin wurde in einer Endkonzentration von 15 μM in die Petrischale gegeben und 2 Stunden lang als Autophagie-Aktivator inkubiert. Zur Entfernung des Sidt2-Gens wurde das geneditierende Lentivirus-Vektorsystem CRISPR/Cas9 verwendet. Lenticrispr-v2-Plasmide (AddgenePlasmid49535, Feng Zhang) wurden gekauft und das sgRNA-Online-Designtool (http://crispr.mit.edu/) verwendet Entwerfen Sie sgRNA, die auf Sidt2 abzielt.
Die Primersequenzen waren wie folgt: F: 5′-ACCACACCGTGACCC CAC-3′, R: 5′-GTTGCGGGTCACTGGTGT-3′, synthetisiert von einem Biotechnologieunternehmen (Sangon Biotech, Shanghai, CHN). Unter Verwendung des CRISPR/Cas9-Lentivirus-Systems wurde das Lenticrispr-v2-Plasmid linearisiert und mit dem annealten sgRNA-Duplex verknüpft, um das rekombinante Lenticrispr-v{{1{{18{181}}}}}} Sidt2-Plasmid zu konstruieren. Das Transfektionsreagenz Vigofect (Vigorous Biotechnology, Beijing, CHN) wurde zur Transfektion des Lenticrispr-v2-Plasmids und des rekombinanten Lenticrispr-v2-Sidt2-Plasmids verwendet, um das Lentivirus zu konstruieren. Das erhaltene Lentivirus wurde in die MPC5-Zellen und SV40 MES 13-Zellen transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen zur Selektion 72 Stunden lang mit Purinomycin inkubiert. Bei den überlebenden Zellen handelte es sich um die Sidt2+/+-Gruppe und die Sidt2−/−-Gruppe, die erfolgreich transfiziert worden waren. RNA-Isolierung und Echtzeit-PCR-Assay Trizol (Invitrogen) wurde verwendet, um RNA aus Mäusenierenzellen zu extrahieren, und die spezifische RT-PCR-Methode war wie zuvor beschrieben [21]. Die Primersequenzen der RT-PCR waren wie folgt: Actin (Sinn: F: 5′- GGACTCC TATGTGGGTGACG-3′, R:5′-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3′), P62 (Sinn: F:5 ′- GGACCCATCTACAGAGGCT G-3′, R: 5′-ATCACAATGGTGGAGGGTGC-3′, Sidt2(sense: F:5′-TAGTGCCTGTTACCACGTCTGC-3′, R:5'-GGATGCAGTCTGTG TAGAGCACA{ {48}}′). Western Blot Die spezifische Methode ist wie zuvor erwähnt [28]. In dieser Studie umfassten die primären Antikörper Kaninchen-Anti-LC3B (1:1000; Sigma-Aldrich L7543), Kaninchen-Anti-P62 (1:1000; Abcam ab205719) und Maus-Anti-- -Actin (1:1000; Sigma Aldrich). A5316), Kaninchen-Anti-Sidt2 (1:1000; Invitrogen PA5-69064), Kaninchen-Anti-Atg5 (1:1000; Cell Signaling Technology 9980S), Kaninchen-Anti-Atg7 (1:1000; Cell Signaling Technology 8558S) , Kaninchen-Anti-Atg12 (1:1000; Cell Signaling Technology 2011S), Maus-Anti-LAMP1 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology H4A3), Kaninchen-Anti-Cathepsin B (1:1000; Cell Signaling Technology 31718S). Ad-mCherry-GFP-LC3B Die Zellen wurden auf Nunc-Petrischalen mit Glasboden inokuliert. Nach dem Wachstum auf eine geeignete Dichte wurde Ad-mCherry-GFP-LC3B hinzugefügt (Beyo Time, Shanghai, CHN, C3011-10 ml), was zu einer Endkonzentration von 10 −11 vp/ml führte. Nach 48-stündiger Stimulation wurde die Anzahl der mCherry- und GFP-Fluoreszenzpunkte direkt unter dem konfokalen Lasermikroskop (Leica SP8, Deutschland) beobachtet. Immunfluoreszenz: Die Zellen wurden auf Petrischalen mit Glasboden inokuliert und mit Paraformaldehyd fixiert. Nach der Blockierung wurden die Zellen über Nacht mit primärem Antikörper und dann 90 Minuten lang im Dunkeln mit sekundärem Antikörper inkubiert. Die Zellen wurden mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Leica SP8, Deutschland) fotografiert, nachdem die Kerne mit DAPI (1 ug/ml) gefärbt wurden. Zu den Primärantikörpern gehörten P62 (1:200; Abcam ab205719), LAMP1 (1:200; Santa Cruz Biotechnology H4A3), LC3B (1:200; Sigma-Aldrich L7543); Zu den sekundären Antikörpern gehörten Anti-Maus-sekundäres Anti-Cy3-konjugiertes Affinipure-Ziegen-Anti-Maus-IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00009-1) und CoraLite488-konjugiertes Affinipure-Ziegen-IgG Anti-Maus-IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00013-1), CoraLite594- konjugiertes Affinipure-Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA{{144 }}). Für LysoTracker (Beyotime, Shanghai, CHN, C1046) haben wir die Zellen auch auf Petrischalen mit Glasboden inokuliert. Nachdem sie eine geeignete Dichte erreicht hatten, wurde Zellkulturflüssigkeit mit einer LysoTracker-Endkonzentration von 75 nM zu den Zellen gegeben, die nach 45 m Stimulation fotografiert wurden. Verwenden Sie ImageJ, um die Anzahl der fluoreszierenden Punkte und den Pearson-Korrelationskoeffizienten zu zählen. Transmissionselektronenmikroskopische Beobachtungen Aus jeder Gruppe wurden 3–5 12- Wochen alte männliche Sidt2–/−- und WT-Mäuse zufällig ausgewählt, um elektronenmikroskopische Proben des Nierengewebes herzustellen, und die spezifische Methode ist wie zuvor beschrieben [48] , fotografieren Sie die Schnitte nach dem Zufallsprinzip mit einem Elektronenmikroskop, es werden mehr als 10 Bilder von Nierenschnitten für jede Maus gemacht, wählen Sie zufällig 3–5 Bilder mit 8000-facher Vergrößerung aus den elektronenmikroskopischen Bildern jeder Maus aus, berechnen Sie die Anzahl der Autophagolysosomen im Bild und vergleichen Sie die Sidt2−/−-Gruppe mit der WT-Gruppe. Für die Vorbereitung von Zellelektronenmikroskop-Proben kratzen Sie nicht weniger als 105 Zellen mit einem Zellschaber ab und sammeln Sie sie in einem EP-Röhrchen, zentrifugieren Sie dann 5 m lang bei 800 U/min/min, verwerfen Sie den Überstand und füllen Sie ihn mit dem Fixiermittel für das Elektronenmikroskop. Nach einer Lagerung im 4-Grad-Kühlschrank für mehr als 1 Stunde kann es zur Prüfung eingereicht werden. Die Elektronenmikroskopaufnahme wurde von KingMed Diagnostics (Guangzhou, China) aufgenommen. LysoSensor Die Zellen wurden auf einer 96-Well-Platte inokuliert. Nach dem Wachstum bis zu einer geeigneten Dichte wurde ein vorgewärmtes (37 Grad) Medium mit 1 µM LysoSensorDND-160® (Thermo Fisher L7545) hinzugefügt. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 37 Grad inkubiert, dann wurde das Medium entfernt und nach dreimaligem Waschen der Zellen mit PBS ersetzt. Der WellScan-Modus wurde zum Lesen der Platte in BioTek Citation 5 (BioTek, Winooski, VT, USA) verwendet. Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung der Anregungs-/Emissionswellenlängen Ex360 nm/Em450 nm und Ex380 nm/Em540 nm gemessen und der pH-Wert des Lysosoms wurde aus dem Verhältnis von Em540 zu Em450 bestimmt. Statistische Analyse Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Der statistische Vergleich zwischen zwei Gruppen wurde mithilfe ungepaarter T-Tests durchgeführt. Wenn die Software Graphics 8.0 für die statistische Analyse verwendet wurde, wurde P < 0,05 als statistisch signifikant angesehen. Jede Gruppe von Experimenten in dieser Studie wurde mindestens dreimal unabhängig voneinander wiederholt. DATENVERFÜGBARKEIT Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.
VERWEISE
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3. Ballabio A. Das fantastische Lysosom. EMBO Mol Med. 2016;8:73–76.
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5. Nonclercq D, Wrona S, Toubeau G, Zanen J, Heuson-Stiennon JA, Schaudies RP, et al. Tubularverletzung und Regeneration in der Rattenniere nach akuter Gentamicin-Exposition: eine Zeitverlaufsstudie. Ren scheitert. 1992;14:507–21.
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