SLC37A2, ein mit Phosphor verwandtes Molekül, nimmt in glatten Muskelzellen in der verkalkten Aorma zu

Gefäßverkalkungist eine Hauptquelle vonHerzkreislauferkrankungbei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung.Hyperphosphatämieführt zu einem erhöhten intrazellulären Phosphoreinstrom, was zu einer Zunahme osteoblastenähnlicher Zellen in den glatten Gefäßmuskelzellen führt. PiT-1 transportiert Phosphat in glatten Gefäßmuskelzellen. Der Mechanismus der Gefäßverkalkung ist jedoch nicht vollständig geklärt. Diese Studie untersuchte mögliche andere phosphorverwandte Moleküle als PiT-1. Wir stellten die Hypothese auf, dass phosphorverwandte Moleküle dazu gehörenTräger gelöster Stoffe(SLC)-Superfamilie wäre an der Gefäßverkalkung beteiligt. Als Ergebnis der DNA-Microarray-Analyse konzentrierten wir uns auf SLC37A2 und zeigten, dass die mRNA-Expression dieser Zellen auf verkalkten glatten Muskelzellen der Aorta (AoSMC) zunahm. Es wurde berichtet, dass SLC37A2 sowohl den Glucose-6-phosphat/Phosphat- als auch den Phosphat/Phosphat-Austausch transportiert. In-vitro-Analysen zeigten, dass die SLC37A2-Expression nicht durch eine Entzündung auf AoSMC beeinflusst wurde. Die Expression von SLC37A2-mRNA und -Protein erhöhte sich in verkalktem AoSMC. In vivo-Analysen zeigten, dass die SLC37A2-mRNA-Expression in der Aorta vonchronisches NierenleidenRatten wurde mit osteogenen Markergenen korreliert. Darüber hinaus wurde SLC37A2 im Bereich der Gefäßverkalkung exprimiertRatten mit chronischer Nierenerkrankung. Als Ergebnis haben wir gezeigt, dass SLC37A2 eines der Moleküle ist, die mit wachsenGefäßverkalkungin vitro und in vivo.

Schlüsselwörter: SLC37A2,Gefäßverkalkung, glatte Muskelzellen der Aorta,chronisches Nierenleiden, Hyperphosphatämie

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Da die Anzahl der Patienten mitchronisches Nierenleiden(CKD) steigt die Zahl der Patientendialysepflichtig sindwird auch zunehmen. Die meisten Todesfälle bei Patienten, die sich einer Behandlung unterziehenDialyseliegen daranHerz-Kreislauf-Erkrankungenwie zum BeispielHerzversagen, zerebrovaskuläre Störungenoder Herzinfarkt. (,2) Eine Hauptquelle vonHerzkreislauferkrankungist eine ektopische Verkalkung (), eine Anomalie, die durch die Bildung und Ablagerung von Kalziumphosphatkristallen im Weichgewebe verursacht wird. (4 6) Verschiedene Faktoren wie Entzündungen. Oxidativer Stress und ein Anstieg der Plasmakalzium- (Ca) und Phosphorspiegel (P) sind am Fortschreiten der Gefäßverkalkung beteiligt. Unter diesen Faktoren ist Hyperphosphatämie am stärksten mit Gefäßverkalkung verbunden. (7.8) Hyperphosphatämie wird durch eine übermäßige P-Zufuhr bei gleichzeitig verminderter Nierenfunktion verursacht. Daher müssen Patienten, die sich einer Dialyse unterziehen, die Aufnahme von P. (79-12) begrenzen. Es wurde jedoch berichtet, dassGefäßverkalkungist bereits fortgeschritten, wenn mit der Dialyse begonnen wird; es wurde auch bei Patienten mit CKD im Frühstadium beobachtet, bei denen keine Hyperphosphatämie erkennbar war. (3) Folglich ist es wichtig, Gefäßverkalkungen bei Patienten mit CKD im Frühstadium zu verhindern, um die Lebensprognose zu verbessern.

Dies führt zu einem erhöhten P-Einstrom in die glatten Gefäßmuskelzellen (VSMC). Der P-Einstrom erfolgt über PiT-1, einen Transporter auf der Zellmembranoberfläche von VSMC. PiT- ist ein Mitglied der Superfamilie der gelösten Träger (SLC), zu der ein durch SLC20A1.04 kodierter Natriumphosphattransporter gehört. PiT- transportiert Phosphat durch Na-abhängige Zellmembranen und führt anschließend aufgrund erhöhter p-Werte zur Matrixmineralisierung. s) Als intrazellulär Steigt der P-Spiegel, beginnt VSMC mit der Expression osteogener Transkriptionsfaktoren wie Runt-bezogener Transkriptionsfaktor 2 (Runx2)(16). Diesem Effekt folgt eine erhöhte Expression osteoblastenspezifischer Gene wie Osteopontin und Osteocalcin. Darüber hinaus wird die Expression glattmuskelspezifischer Proteine ​​reduziert. B. Glattmuskelprotein 22-0 (SM22-0), auftritt. Dadurch wird VSMC in osteoblastenähnliche Zellen umgewandelt. (1718)Neueste klinische Studien haben gezeigt, dass der Kalziumspiegel im Blut steigt. Proteinpartikel (CPP), die kolloidale Calciumphosphatpartikel darstellen, nehmen mit abnehmender Nierenfunktion zu. (19-21) Darüber hinaus wurden Korrelationen mit dem CPP- und P-Spiegel im Blut berichtet.2o2i) Es ist möglich, dass der CpP das Fortschreiten der Gefäßverkalkung auslösen kann.22-24)

Bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung im Frühstadium und normalen Plasma-P-Spiegeln wurde jedoch eine Gefäßverkalkung beobachtet. (13) Darüber hinaus wird PiT-1-mRNA ubiquitär in allen Geweben exprimiert. Somit könnte ein anderes Molekül vor allem im Bereich der Gefäßverkalkung wirken. Es gibt Berichte darüberEntzündungfördert die Gefäßverkalkung. Entzündungsfaktoren wie Interleukin (IL)-1B, IL-6 und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-a) induzierten die Differenzierung von VSMC in osteoblastenähnliche Zellen (2s26). TNF-a induziert eine Gefäßverkalkung über den cAMP-Weg, der eine Rolle bei der Differenzierung von Osteoblasten spielt.2728) IL-6 reguliert verschiedene Wege, die zur Gefäßverkalkung von VSMC führen2-31) Darüber hinaus. IllB, IL-6 und TNF-a sind ebenfalls Faktoren, die mit einer erhöhten Gefäßverkalkung verbunden sind, die durch hohe p-Spiegel hervorgerufen wird.3233) Allerdings. Aktuelle Daten erklären den Mechanismus der Gefäßerkrankung nicht vollständig

Verkalkung, die durch diese Faktoren hervorgerufen wird. Wir stellten die Hypothese auf, dass es möglicherweise andere P-verwandte Moleküle wie die der SLC-Superfamilie gibt, die an der Gefäßverkalkung beteiligt sind. Wir konzentrierten uns auf Membranproteine ​​in der SLC-Superfamilie und untersuchten potenzielle P-verwandte Moleküle außer PiT-1 auf ihre Beteiligung an der Gefäßverkalkung. Darüber hinaus haben wir den Zusammenhang zwischen Kandidatenmolekülen und Gefäßverkalkung im Video und in vivo untersucht.

Materialen und Methoden

Zellkultur. Normale humane Aorten-Glattmuskelzellen (AoSMC) wurden von Lonza (Basel, Schweiz) erhalten. AoSMC wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers kultiviert. AoSMC wurden in einem Wachstumsmedium gehalten (Basalmedium für glatte Muskelzellen, ergänzt mit 5 % fötalem Rinderserum (FBS), epidermalem Wachstumsfaktor, Insulin, Fibroblasten-Wachstumsfaktor B und Gentamicin/Amphotericin-B). Die Medien wurden jeden zweiten Tag gewechselt. AoSMC wurden in einem befeuchteten 5 % CO-Inkubator bei 37 Grad gezüchtet und bis zum Erreichen der Konfluenz gehalten und dann in Experimenten verwendet.

Verkalkte AoSMC. Die Verkalkung von AoSMC wurde wie zuvor beschrieben induziert.435) AOSMC wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt mit 15 % FBS und Penicillin-Streptomycin, kultiviert und mit 2,6 mM P für 3, 6, 9, 12 und 14 Tage kultiviert. Die P-Konzentration wurde durch den P-Puffer NaH, PO/Na und HPO angepasst. pH-Wert 7,2). Andere AoSMCs wurden nicht mit 2,6 mM P kultiviert.

DNA-Mikroarray. Es wurde Gesamt-RNA von AoSMC-Proben verwendet, die mit 2,6 mM P kultiviert und nicht kultiviert wurden. Gesamt-RNA 5,0 ug wurde unter Verwendung eines DNA-Microarrays (Agilent Technologies, Tokio, Japan) analysiert. SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray wurde verwendet, um etwa 26000 Gene zu untersuchen. Das Verhältnis wurde berechnet, indem das Expressionsniveau von AoSMC, das 12 Tage lang mit 2,6 mM kultiviert wurde, durch das Expressionsniveau von AoSMC, das nicht mit 2,6 mM P kultiviert wurde, dividiert wurde

DNA-Mikroarray

Es wurde Gesamt-RNA von AoSMC-Proben verwendet, die mit 2,6 mM P kultiviert und nicht kultiviert wurden. Gesamt-RNA 5,0 ug wurde unter Verwendung eines DNA-Microarrays (Agilent Technologies, Tokio, Japan) analysiert. SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray wurde verwendet, um etwa 26000 Gene zu untersuchen. Das Verhältnis wurde berechnet, indem das Expressionsniveau auf AoSMC, das 12 Tage lang mit 2,6 mM kultiviert wurde, durch das Expressionsniveau auf AoSMC, das nicht mit 2,6 mM P kultiviert wurde, dividiert wurde. Expression von SLC37A2 bei Gefäßentzündungen. Um eine Entzündungsreaktion bei AoSMC auszulösen, wurden die Zellen mit Wachstumsmedium kultiviert, bis sie Konfluenz erreichten, und dann 24 und 72 Jahre lang mit 1 μgml Lipopolysacchariden (LPS) (LPS aus Escherichia coli O111:B4; Sigma, St. Louis, MO) behandelt 2,6 mM P. Andere AoSMC wurden nicht mit Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsanalyse (PCR) kultiviert. Die Gesamt-RNA wurde aus AoSMC extrahiert, die 24 und 72 Stunden lang mit LPS behandelt wurden, und aus Zellen, die nicht mit LPS behandelt wurden. Die auf SYBR Green basierende quantitative Echtzeit-PCR wurde unter Verwendung synthetisierter cDNA und eines geeigneten Primersatzes für jedes Zielgen mit einem StepOnePlus-Echtzeit-PCR-System (Applied Biosystems, FosterCity, CA) durchgeführt. Die Primersequenzen waren wie folgt: menschliches IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' und 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; menschliches SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' und 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- und 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3.IL-6 und SLC37A2-mRNA-Expressionsniveaus wurden nach Normalisierung mit GAPDH berechnet. Expression von SLC37A2 in verkalktem Zustand AoSMC. Insgesamt wurden AoSMC-Zellen, die nicht mit 2,6 mM P kultiviert wurden, und AoSMC-Zellen, die mit 2,6 mM P für 3, 6, 9, 12 und 14 Tage kultiviert wurden, extrahiert. Eine Echtzeit-PCR wurde unter Verwendung der synthetisierten cDNA durchgeführt. Die Primersequenzen waren wie folgt folgt: menschliches Runx2, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3' und 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. Die Runx2- und SLC37A2-mRNA-Expressionsniveaus wurden nach Normalisierung mit APPH berechnet.

Western-Blot-Analyse.

Das Gesamtprotein wurde aus AoSMC-Proben gesammelt, die unter den gleichen Bedingungen kultiviert wurden, die für die Echtzeit-PCR-Analyse verwendet wurden. Diese Proben wurden mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (pH 75), ergänzt mit 5 % NP-40 und einem 1 % Proteaseinhibitor-Cocktail, lysiert. Die Proteinkonzentrationsproben wurden mit dem BCA Protein Assay Kit (Thermo FisherScientific, Waltham, MA) gemessen. und die Konzentration wurde durch Western Blot angepasst, 10 ug Protein wurden in einem 10 %igen Polyacrylamidgel mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Membran wurde mit SLC37A2-Antikörper (Novus Biologicals, Centennial, CO) oder GAPDH-Antikörper (GeneTex, Irvine, CA) als Primärantikörper behandelt und mit Kaninchen-lgG-Meerrettichperoxidase-konjugiertem Antikörper (R&D Systems, Minneapolis, MN) als Sekundärantikörper inkubiert und visualisiert mit Amersham ECL Select (GE Healthcare, Buckinghamshire, England) und einem Lumineszenzbildanalysator (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokio, Japan). Die Bande wurde mit lmagel quantifiziert.

Experimental

Alle Studienprotokolle wurden von der Ethikkommission der University of Hyogo, School of Human Science and Environment, genehmigt. Zwölf Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden von Japan SLC (Shizuoka, Japan) gekauft. Die Ratten wurden in einem 12-hellen, 12-stündigen Dunkelzyklus (09:00-21:00) gehalten und hatten freien Zugang zu Futter und reinstem Wasser.

Die experimentellen Diäten umfassen eine Kontroll-P-Diät (1,0 % P, 0,6Ca, 20 % Protein) und eine Adenin-Diät (0,75 % Adenin , 1.0% P, 0.6%Ca, 2.5% Protein), eine Diät mit niedrigem P-Gehalt (LP) (0.2% P,0 0,6 % Ca, 10 % Protein) und eine Diät mit hohem P-Gehalt (HP) (1,0 % P, 0,6 % Ca, 10 % Protein) basierend auf der AIN93-G-Diät (orientalisch). Hefe, Tokio, Japan) mit Kasein als Proteinquelle.3637) Es wurde berichtet, dass eine proteinarme Diät die Gefäßverkalkung bei Ratten mit Adenin-induziertem Nierenversagen fördert, daher wurde eine Proteinrestriktion durchgeführt.3738) Vor der Gruppierung wurden alle Ratten (n=23) wurden zur Akklimatisierung eine Woche lang mit einer Standard-MF-Diät (Oriental Yeast) gefüttert. Im Alter von 13 Wochen wurden die Ratten in zwei Gruppen eingeteilt: die Kontrollgruppe (n=5) und die Adenin-induzierte CNE-Gruppe (n=18). Die Kontrollgruppe erhielt 6 Wochen lang die Kontroll-P-Diät . Die Adenin-induzierte CKD-Gruppe erhielt etwa drei Wochen lang die Adenin-Diät und wurde dann weiter in zwei Untergruppen unterteilt: die CKD-LP-Gruppe (n=8) oder die CKDHP-Gruppe (n=10). Ratten der CKD-LP-Gruppe und der CKD-HP-Gruppe erhielten jeweils 3 Wochen lang die LP-Diät und die HP-Diät. Während des Versuchszeitraums wurde die Nahrungsaufnahme täglich aufgezeichnet. Während der Adenin-Diät wurden einmal pro Woche bis zur zweiten Woche und danach alle zwei Tage zwischen 10:{46} Uhr und 11:{48} Uhr Blutproben aus der Schwanzvene entnommen, um die Plasmaspiegel zu überwachen. Während der LP-Diät bzw. HP-Diät wurden einmal pro Woche Blutproben entnommen. Einmal pro Woche wurden Urinproben gesammelt und das Urinvolumen aufgezeichnet. Die Ratten wurden unter Anästhesie mit Isofluran (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) und Laparotomien getötet. Zur Analyse wurden Blutproben aus der unteren Hohlvene und der thorakoabdominalen Aorta entnommen.

SLC37A2-Expression auf der Aorta.

Ungefähr ein Drittel der gesammelten thorakoabdominalen Aorta wurde zur Visualisierung der Verkalkung und zur Durchführung einer Immunfärbung verwendet. Die Aorta wurde in Paraffin eingebettet und es wurden 4-um-Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden unter Verwendung eines Von Kossa Method for Calcium Kit (Polysciences, Warrington, PA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt. Die Immunfärbungsanalyse wurde mit Serienschnitten durchgeführt. Die Schnitte wurden über Nacht bei 4 Grad mit SLC37A2-Antikörper inkubiert und dann 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI (Nichirei Biosciences, Tokio, Japan) behandelt. Anschließend wurden die Schnitte mit einem DABsubstrate-Kit (Nichirei) behandelt.

Die Gesamt-RNA wurde aus dem Rest der gefrorenen thorakoabdominalen Aorta extrahiert. Mit der synthetisierten cDNA wurde eine Echtzeit-PCR durchgeführt. Die Primersequenzen waren wie folgt: Ratte Osteo-Pontin,5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' und 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' und; Ratten-SLC37A2, 5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' und 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. Die Osteopontin-mRNA- und SLC37A2-mRNA-Expressionsniveaus wurden nach Normalisierung mit GAPDH berechnet

Statistische Analyse.

Die Daten werden als Mittelwert + SE dargestellt. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mithilfe des T-Tests analysiert. In phosphatinduzierten verkalkten AoSMC-Experimenten wurden Unterschiede mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse gefolgt von der Dunnett-Methode analysiert. In den CKD-Modellversuchen wurden Unterschiede mithilfe des Kruskal-Wallis-Tests und anschließend der Steel-Dwass-Methode analysiert. Korrelationskoeffizienten (rs) wurden mithilfe des Korrelationskoeffizienten-Rangtests nach Spearman bestimmt. Für alle Tests. zweiseitige p-Werte<0.05 were considered statistically significant.