Soziale Immunität bei Honigbienen: Gelée Royale als Vehikel zur Übertragung bakterieller Krankheitserregerfragmente zwischen Nestkameraden

ABSTRAKT

Soziale Immunität ist eine Reihe von Verhaltens- und physiologischen Merkmalen, die es Koloniemitgliedern ermöglichen, sich gegenseitig vor Krankheitserregern zu schützen, und umfasst die orale Übertragung immunologischer Verbindungen zwischen Nestkameraden. Bei Honigbienen ist Gelée Royale ein Drüsensekret, das von einer Untergruppe von Arbeiterinnen produziert wird, an die Königin und die jungen Larven verfüttert wird und viele antimikrobielle Verbindungen enthält. Eine verwandte Form der sozialen Immunität, das transgenerationale Immunpriming (TGIP), ermöglicht es Königinnen, Krankheitserregerfragmente in ihre sich entwickelnden Eier zu übertragen, wo sie vom Immunsystem des Embryos erkannt werden und beim neuen Nachwuchs eine höhere Krankheitserregerresistenz auslösen. Der Transport dieser Erregerfragmente erfolgt durch Vitellogenin (Vg), ein Eigelb-Vorläuferprotein, das auch von Krankenschwestern zur Synthese von Gelée Royale verwendet wird.

Daher kann Gelée Royale als Vehikel für den Transport von Krankheitserregerfragmenten von Arbeitern zu anderen Nestkameraden dienen. Um dies zu untersuchen, haben wir kürzlich gezeigt, dass aufgenommene Bakterien zu den Ammengelee-produzierenden Drüsen transportiert werden, und hier zeigen wir, dass Erregerfragmente in das Gelée Royale eingebaut werden. Darüber hinaus zeigen wir, dass der Verzehr von Krankheitserregerzellen höhere Spiegel eines antimikrobiellen Peptids induziert, das in Gelee Royale vorkommt, Defensin-1.

Die orale Verabreichung von Immunverbindungen kann die menschliche Immunfunktion erheblich beeinträchtigen. Diese Verbindungen können die Immunität verbessern, indem sie das Immunsystem des Körpers stärken oder modulieren. Immunität ist die Widerstandskraft des Körpers gegen Krankheiten, einschließlich Abwehrmechanismen wie Immunzellen und Antikörper. Orale Immunisierungspräparate können die Aktivität von Immunzellen aktivieren, die Produktion von Antikörpern im Körper steigern und die Vermehrung pathogener Bakterien und Viren hemmen, wodurch die Immunität verbessert und das Infektionsrisiko verringert wird. Darüber hinaus kann die orale Verabreichung von Immunverbindungen Entzündungen reduzieren und die mit der Krankheit verbundenen Schmerzen und Beschwerden lindern, wodurch die Lebensqualität verbessert wird. Somit besteht ein enger Zusammenhang zwischen der oralen Verabreichung von Immunverbindungen und der Immunität. Daraus können wir erkennen, dass wir auf die Verbesserung unserer Immunität achten müssen. Cistanche kann die Immunität stärken. Die Polysaccharide im Fleisch können die Immunantwort des menschlichen Immunsystems regulieren, die Stressfähigkeit von Immunzellen verbessern und den Sterilisationseffekt von Immunzellen verstärken.

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SCHLÜSSELWÖRTER:

Honigbienen, soziale Immunität, Gelée Royale, Amerikanische Faulbrut.

EINFÜHRUNG

Gelée Royale fasziniert Biologen seit langem, da es eine Schlüsselrolle bei der Kastenentwicklung von Honigbienen spielt. Dieses Drüsensekret wird von einer Untergruppe der Arbeiterkaste produziert, die als Krankenschwestern bekannt ist, und wird während ihrer Entwicklung und ihres Erwachsenenlebens an die Königin verfüttert, während Larven, die für Arbeiterinnen bestimmt sind, in den ersten drei Tagen ihres Lebens mit Gelée Royale gefüttert werden, bevor sie auf eine andere umgestellt werden pollenbasierte Ernährung (Johansson, 1955; Haydak, 1970; Townsend und Lucas, 1940). Als sich die Methoden der analytischen Chemie weiterentwickelten, begannen Wissenschaftler, die Nährstoffbestandteile von Gelée Royale zu untersuchen und fanden heraus, dass es viele pathogentötende Verbindungen enthielt, die die Königin und junge Larven vor Krankheiten schützen (Blum et al., 1959; Fontana et al., 2004; Fujiwara). et al., 1990; Okamoto et al., 2003; Romanelli et al., 2011; Sugiyama et al., 2012; Vucevic et al., 2007). Die Übertragung antipathogener Verbindungen zwischen Nestkameraden ist eine Form der sozialen Immunität, eine Reihe von Verhaltens- und physiologischen Merkmalen, die den Koloniemitgliedern helfen, sich gegenseitig vor Krankheitserregern zu schützen (Cremer et al., 2007).

Eine verwandte Form der sozialen Immunität, das Transgenerational Immune Priming (TGIP), hat in den letzten Jahren ebenfalls viel Aufmerksamkeit erregt (Sadd et al., 2005; Moret, 2006; Freitak et al., 2009, 2014; Zanchi et al., 2011; (López et al., 2014; Knorr et al., 2015; Salmela et al., 2015). Hier können weibliche Insekten, die einen Krankheitserregerangriff überleben, Krankheitserregerfragmente auf ihre Eier übertragen und so krankheitsresistentere Nachkommen hervorbringen. Diese Erregerfragmente enthalten erregerassoziierte molekulare Muster, Strukturbestandteile, die in den Zellwänden mikrobieller Zellen vorkommen und bei den sich entwickelnden Nachkommen eine Immunantwort auslösen. Während TGIP bei Honigbienen nachgewiesen wurde, beruhten die Studien auf der Injektion eines Inokulums an Königinnen, was ein Problem darstellte: Wie würde eine Königin unter natürlichen Bedingungen mit Krankheitserregern geimpft, wenn sie sich ausschließlich von Gelée Royale ernährt und keine Möglichkeit hat, potenziell zu konsumieren? Kontaminierter Nektar und Pollen, die von ihren Sammlern gesammelt wurden? Eine wichtige Entdeckung unserer Gruppe deutete auf einen neuen möglichen Weg hin. Königinnen übertragen Krankheitserregerfragmente mithilfe von Vitellogenin (Vg) in ihre Eier (Salmela et al., 2015), einem Eigelb-Vorläuferprotein, das auch von Krankenschwestern zur Synthese von Gelée Royale verwendet wird (Amdam et al., 2003).

So können Honigbienen Gelée Royale als Vehikel für die Übertragung von Krankheitserregerfragmenten zwischen Ammen und Königinnen sowie zwischen Larven als Teil eines Immunwegs auf Kolonieebene verwenden. In einem ersten Schritt zur Aufklärung dieses Signalwegs zeigten wir, dass Krankenschwestern, die Bakterien aufgenommen hatten, diese von ihrem Mitteldarm auf ihre Gelee-produzierenden Drüsen übertragen konnten und dass die Unterdrückung der vg-Expression diesen Prozess behinderte (Harwood et al., 2019). Nun wollen wir herausfinden, ob Pflegekräfte, die bakterielle Krankheitserreger einnehmen, diese in ihr Gelée Royale einbauen können und ob die Einnahme von Krankheitserregern auch die Konzentration anderer antimikrobieller Komponenten im Gelée Royale erhöht.

Das Verständnis der Immunpfade bei Honigbienen ist nicht nur für die Organismenbiologie wichtig, sondern auch für die menschliche Ernährungssicherheit. Honigbienen sind die wichtigsten Bestäuberinsekten in der Landwirtschaft und steigern allein in den USA jährlich den Wert der Nutzpflanzen um mindestens 15 Milliarden US-Dollar (Pressemitteilung des USDA vom 6. April 2020).

Amerikanische Imker leiden jedoch weiterhin unter hohen jährlichen Völkerverlusten (United States Department of Agriculture, 2019), was auf mehrere Stressfaktoren wie Pestizidexposition und schlechte Ernährung zurückzuführen ist. Aber auch Bienenschädlinge und Krankheitserreger tragen wesentlich dazu bei und werden häufig in ausgestorbenen Völkern nachgewiesen (United States Department of Agriculture, 2019). Zu diesen Krankheitserregern gehört eine Vielzahl von Bakterien, Pilzen und Viren, für die es für viele keine pharmakologische Behandlung gibt. Das Verständnis, wie soziale Immunität Krankheitserregerinfektionen vermittelt, könnte umfassendere Behandlungsschemata ermöglichen und dazu beitragen, die Krankheitslast zu verringern, die zum Verlust von Kolonien beiträgt.

Es ist wichtig zu verstehen, wie die Mechanismen der sozialen Immunität funktionieren. Eingegangen am 12. Juni 2020; Akzeptiert am 17. Februar 2021 ergänzen die immunologischen Abwehrkräfte einzelner Bienen.

Honigbienen verfügen über mehrere Verteidigungsschichten, beginnend mit strukturellen Barrieren wie einer wasserdichten Nagelhaut, die das Eindringen von Krankheitserregern blockiert (Moret und Moreau, 2012). Verschluckte Krankheitserreger landen im Mitteldarm, dem Organ, das für die Verdauung und Absorption verantwortlich ist, und treffen dort auf eine weitere physikalische Barriere, die peritrophe Matrix (Brandt et al., 1978; Lehane, 1997; Hegedus et al., 2009). Hierbei handelt es sich um eine chitinhaltige Substanz, die von den Epithelzellen des Mitteldarms abgesondert wird und als Sieb fungiert, um die Aufnahme großer Partikel wie Krankheitserregerzellen zu verhindern.

Wenn Krankheitserreger diese physischen Barrieren durchbrechen, werden sie von Rezeptoren zur Erkennung von Krankheitserregern erkannt, die verschiedene zelluläre und humorale Immunantworten aktivieren. Zur zellulären Abwehr kann die Phagozytose durch Hämozyten gehören (Evans und Spivak, 2010; Marringa et al., 2014; Lavine und Strand, 2002), während humorale Reaktionen die Produktion von Melanin umfassen können, um Fremdpartikel einzukapseln (González-Santoyo und Córdoba-Aguilar, 2012) und die Produktion antimikrobieller Peptide (AMPs), die Krankheitserreger direkt abtöten (Bulet und Stöcklin, 2005; Bulet et al., 1999; Evans et al., 2006). Die Melanisierungsreaktion wird induziert, wenn Bienengift-Serinprotease (Bi-VSP) die Phenoloxidase-Kaskade aktiviert, die zur Produktion von Melanin führt (Choo et al., 2010). AMPs wie Lysozym und Defensin -1 werden nach Aktivierung der Toll- oder Immundefizienz-Signalwege (IMD) induziert (De Gregorio et al., 2002).

Trotz eines robusten Arsenals gegen Krankheitserreger besitzen Honigbienen weniger immunbezogene Gene als Solitärbienenarten (Evans et al., 2006; Claudianos et al., 2006), was vor allem der Entwicklung der sozialen Immunität zu verdanken ist. Gelée Royale enthält viele der gerade besprochenen Enzyme und Peptide, darunter Bi-VSP, Lysozym und Defensin-1, sowie Glucoseoxidase, die Wasserstoffperoxid produziert, das auch Krankheitserreger abtötet (Fontana et al., 2004; Fujiwara et al., 1990; Romanelli et al., 2011; Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Fujita et al., 2012). Dieses angereicherte Futter ist besonders wichtig für die am stärksten gefährdeten Koloniemitglieder, die jungen Larven, deren Immunabwehr sich noch in der Entwicklung befindet. Beispielsweise haben junge Larven geringere Mengen an Prophenoloxidase (Chan und Foster, 2008; Chan et al., 2009) (wichtig in der Melanisierungskaskade) und AMPs (Chan und Foster, 2008) und ihr noch reifendes Mitteldarm- und Die peritrophe Matrix macht ihr Mitteldarmepithel anfällig für Brüche (Yue et al., 2008; Garcia-Gonzalez und Genersch, 2013; Riessberger-Gallé et al., 2016).

Infolgedessen sind Larven anfällig für einige Krankheiten, die für Erwachsene relativ harmlos sind. Dazu gehört auch Amerikanische Faulbrut, die durch das sporenbildende grampositive Bakterium Paenibacillus larvae verursacht wird (Genersch, 2010; Hansen und Brødsgaard, 1999). Eine Infektion mit Amerikanischer Faulbrut ist nicht nur tödlich für Völker, sondern auch kostspielig für Imker, da die Sporen widerstandsfähig sind und jahrelang lebensfähig bleiben, was bedeutet, dass Imker gezwungen sind, infizierte Bienenstöcke zu zerstören. Daher profitieren Larven von Nahrung, die mit Verbindungen angereichert ist, die Krankheitserreger abtöten, oder mit Krankheitserregerpartikeln, die eine Immunaktivierung auslösen können.

In dieser Studie verfolgten wir ein zweifaches Ziel: erstens herauszufinden, ob Ammen, die vegetative Zellen der amerikanischen Faulbrut verzehren, Krankheitserregerfragmente in ihr Gelée Royale einbauen können, und zweitens herauszufinden, ob dies zu höheren Mengen an Immunproteinen führt, die in Gelée Royale vorkommen. Zu diesem Zweck fütterten wir Krankenschwestern mit fluoreszierend markierten und durch Hitze abgetöteten P.-Larvenzellen und untersuchten anschließend das von ihnen produzierte Gelée Royale. Wir verwendeten Fluoreszenzmikroskopie, um das Vorhandensein von Bakterienzellfragmenten im Gelée Royale zu bestätigen, und Massenspektrometrie, um das proteomische Profil von Gelée Royale aus Provokations- und Kontrollkolonien zu vergleichen. Insbesondere haben wir die Hypothese getestet, dass Gelée Royale aus infizierten Kolonien einen höheren Gehalt an den Immunproteinen Glucoseoxidase, Bi-VSP, Lysozym und Defensin aufweisen würde-1.

MATERIALEN UND METHODEN

Kultivierung pathogener Bakterien

Vegetative Zellen von P.-Larven wurden aus der Kultursammlung der Universität Göteburg gewonnen und unter normalen Bakterienwachstumsbedingungen kultiviert. Kurz gesagt, die Zellen wurden in MYPG-Brühe suspendiert und über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 37 Grad gehalten, bevor sie auf MYPG-Agar ausplattiert und eine Woche lang bei 37 Grad inkubiert wurden. Danach wurden vegetative Zellen geerntet und in 1× phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendiert, bevor sie in einem Autoklaven durch Hitze abgetötet wurden. Die resultierenden nicht lebensfähigen Bakterienzellen wurden dann unter Verwendung des pHrodo™ Red Phagocytosis Particle Labeling Kit (Invitrogen #a10026) gemäß den Anweisungen des Herstellers an einen Fluoreszenzfarbstoff konjugiert. Nach dem Färben wurden die P. larvae-Zellen in 1× PBS bis zu einer Konzentration von 10 mg ml–1 suspendiert und bis zur Verwendung bei 4 Grad gelagert.

Bienen- und Fütterungsexperiment

Natürlich gepaarte europäische Honigbienen, Apis mellifera Linnaeus 1758, wurden in Standard-Langstroth-Bienenstöcken an der Universität Helsinki auf dem Vikki-Campus in Finnland gehalten. Diese Standard-Langstroth-Bienenstöcke dienten als Spender für kleinere Kolonien ohne Königin, die in Mini-Paarungs-Bienenstöcken untergebracht waren. Um diese kleineren Kolonien ohne Königinnen zu etablieren, wurde ein Abschnitt der Brutwabe, der 1- Tage alte Larven mit den Maßen 12 cm×12 cm enthielt, aus dem Spenderstock herausgeschnitten und in eine Mini-Paarungs-Nuc-Box überführt. Etwa 100–200 Ammen wurden ebenfalls aus demselben Spenderstock übertragen und in die Mini-Paarungs-Nuc-Box gesetzt. Als Ammen wurden die Individuen identifiziert, die beobachtet wurden, wie sie in Brutzellen eindrangen und Larven im Spenderstock fraßen.

Insgesamt wurden N{{0}} kleine Kolonien ohne Königinnen gegründet, jede aus einem separaten Spenderstock. Die Kolonien wurden königinlos gemacht, um die Ammen dazu anzuregen, mehr Gelée Royale zu produzieren, um eine neue Königin zu zeugen (Sahinler und Kaftanoglu, 1997). Die Ammen und jungen Larven wurden drei Tage lang in den Mini-Paarungs-Nuc-Boxen eingeschlossen und mit einer 30-prozentigen Saccharoselösung in einer an der Decke hängenden Spritze versorgt. N=3-Kolonien erhielten eine Kontrolldiät, während N=3 fluoreszierend markierte P.-Larven zu ihrer Saccharose hinzugefügt hatte, bis eine endgültige Pathogenkonzentration von 0,6 mg ml−1 erreicht war. Kontroll- und pathogenhaltige Diäten wurden täglich mit frischen Lebensmitteln ergänzt. Nach den drei Tagen wurde neu abgelagertes Gelée Royale aus den Arbeiterbrutwaben jeder Kolonie geerntet und in einen von zwei Arbeitsabläufen aufgeteilt: Fluoreszenzmikroskopie oder Proteomikanalyse.

Fluoreszenzmikroskopie

Gelée Royale von jedem Kamm wurde in 200-µl-Reaktionsröhrchen überführt. Um das aus jedem Bienenstock gewonnene Geleevolumen abzuschätzen, haben wir 30 Reaktionsröhrchen mit steigenden Wassermengen im Bereich von 1 bis 30 µl vorgefüllt und zwei Beobachter unabhängig und blind beurteilen lassen, welches Wasservolumen dem Gelée Royale-Volumen entsprach. In allen 6 Fällen erhielt jede Gelée Royale-Probe von den beiden Beobachtern die gleiche Volumenschätzung. Anschließend wurde jede Gelée Royale-Probe mit 1x PBS (pH 7,4) auf eine Endkonzentration von 10 Volumenprozent verdünnt und verwirbelt. Anschließend wurden die Proben auf ein Hämozytometer aufgetragen und unter einem Leica DM6000-Fluoreszenzmikroskop untersucht. Auf dem Hämozytometer ist das Sichtfeld gleichmäßig in 9 Abschnitte unterteilt, und wir haben insgesamt an 5 Abschnitten Beobachtungen gemacht: den 4 Eckabschnitten und dem Mittelabschnitt. Dadurch konnten wir die Konzentration fluoreszierender Partikel pro Mikroliter Gelée Royale (C) mithilfe der folgenden Formel berechnen:

Dabei ist P die Gesamtzahl der in jeder Probe beobachteten positiven Fluoreszenzpartikel, S die Gesamtzahl der auf dem Hämozytometer beobachteten Quadrate (N{{0}}) und V das Volumen jedes auf dem Hämozytometer beobachteten Quadrats (0,1 µl) und D ist der Verdünnungsfaktor des Gelée Royale (10-fache Verdünnung). Alle Proben wurden unter identischen Mikroskopeinstellungen beobachtet.

Die Kamera wurde auf eine Auflösung von {{0}}Bit (Waters, 2009) eingestellt, was einen Helligkeitsintensitätswert im Bereich von 0 bis 65.535 ergibt. Um positive Fluoreszenzsignale in unseren Pathogen-Nahrungsproben zu identifizieren, mussten wir zunächst einen Grundpegel des Hintergrundrauschens ermitteln, über den wir feststellen konnten, ob es sich bei einem Signal um echte Fluoreszenz oder lediglich um ein Artefakt handelte. Zu diesem Zweck untersuchten wir die Intensitätswerte von jedem Bild unserer Kontrolldiätproben und subtrahierten in jedem Bild den minimalen Intensitätswert vom maximalen Intensitätswert, um eine Reihe von Hintergrundgeräuschen zu erhalten (Waters, 2009). Anschließend verglichen wir alle Probenbilder unserer Kontrolldiät, um einen Mittelwert und eine Standardabweichung des Bereichs des Hintergrundrauschens zu ermitteln. Danach betrachteten wir jedes Signal, das wir in unseren Pathogen-Diätproben beobachteten, als positives Fluoreszenzsignal über dem Hintergrundrauschen, wenn es mindestens 3 Standardabweichungen (P kleiner oder gleich 0,01) über dem mittleren Hintergrundintensitätsbereich lag. Der mittlere (SD) Hintergrundintensitätsbereich betrug 329 ± 27

Zusätzliche Positiv- und Negativkontrollen

Um zu bestätigen, dass markierte Bakterien in Gelée Royale fluoreszieren können, haben wir Gelée Royale-Proben aus mehreren europäischen und nordamerikanischen Regionen (Österreich, Norwegen, Arizona und Illinois, USA) gesammelt und sie in PBS-Puffer auf 1 0 Prozent verdünnt. und markierte Bakterien (1 Volumenprozent) direkt zu den Proben gegeben. Wir verwendeten PBS-Puffer bei Standard-pH-Wert 7,4 (wie oben verwendet) oder bei reduziertem pH-Wert 4.0, der dem Säuregehalt von Gelée Royale entspricht, um zu bestimmen, ob der Säuregehalt der Umgebung den Grad der Fluoreszenz beeinflusst, wie von angegeben Hersteller von Beschriftungskits. Darüber hinaus führten wir auch eine zusätzliche Negativkontrolle durch (PBS mit pH 4,0, keine markierten Bakterien), um zu bestätigen, dass die Fluoreszenzbeobachtungen nicht auf Mikroskopartefakte oder Autofluoreszenz von Materialkomponenten zurückzuführen waren. Wir fanden heraus, dass Gelée Royale-Proben aus allen geografischen Regionen bei Zugabe markierter Bakterien Fluoreszenz zeigten, unabhängig vom pH-Wert des verwendeten Puffers (Abb. S1). Diese Mikroskopiearbeit wurde an einem Zeiss AxioZoom V16 mit einer Axiocam HRm Monochromkamera durchgeführt.

Probenvorbereitung für die Proteomanalyse

Die Gelée Royale-Proben wurden durch Zugabe von 150 µl 8 mol l−1 Harnstoff verdünnt und in einem Wasserbad beschallt. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Bradford-Assay auf 2,1 mg ml−1 mit einem Endvolumen von 100 µl eingestellt. Cysteinbindungen wurden mit 45 mmol l-1 Dithiothreitol (#D0632, Sigma-Aldrich) 20 Minuten lang bei 37 Grad reduziert und mit 0,1 mol l-1 Iodacetamid (#57670 Fluka, Sigma-Aldrich) bei Raumtemperatur alkyliert. Die Proben wurden durch Zugabe von 0,75 µg Trypsin (Sequencing Grade Modified Trypsin, V5111, Promega) über Nacht bei 37 Grad verdaut. Nach der Verdauung wurden die Peptide mit C18-Mikrospinsäulen (Harvard Apparatus) gemäß dem Protokoll des Herstellers gereinigt. Die getrockneten Peptide wurden in Puffer A (30 µl 0,1 Prozent Trifluoressigsäure in 1 Prozent Acetonitril) rekonstituiert.

Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)

Die Analyse wurde auf einem EASY-nLC1{{10}}00-Flüssigkeitschromatographen (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt, der mit einem Velos Pro-Orbitrap Elite-Hybrid-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) mit einer Nanoelektrospray-Ionenquelle verbunden war ( Thermo Fisher Scientific). Die LC-MS/MS-Proben wurden mithilfe eines Zweisäulenaufbaus getrennt, der aus einer 2 cm C18-Pepmap-Trap-Säule (Thermo Fisher Scientific) und einer anschließenden 15 cm C18-Pepmap-Analysesäule bestand ( Thermo Fisher Scientific). Der lineare Trenngradient bestand aus 5 Prozent Puffer B (0,1 Prozent Trifluoressigsäure in 98 Prozent Acetonitril) für 5 Minuten, 35 Prozent Puffer B für 60 Minuten, 80 Prozent Puffer B für 5 Minuten und 100 Prozent Puffer B für 10 Minuten bei einem Durchfluss Rate von 0,3 µl min−1. Für jeden LC-MS/MS-Lauf wurden 6 µl der Probe injiziert und analysiert. Ein vollständiger MS-Scan wurde mit einer Auflösung von 60,000 im normalen Massenbereich im Orbitrap-Analysator aufgenommen und mit den 20 intensivsten Vorläuferionen von CID-MS2 in der Ionenfalle verfolgt (Energie 35). Die Daten wurden mit der LTQ Tune-Software erfasst.

Proteinidentifizierung

Bei einem Shotgun-Proteomik-Ansatz werden Proteine ​​enzymatisch in kleinere Peptide verdaut, und diese Peptide werden dann Proteinen in einem annotierten Genom zugeordnet. Einige dieser Peptidsequenzen können von mehreren Proteinen gemeinsam genutzt werden, während andere nur für ein einzelnes Protein im Proteom gelten. Unsere Analyse ergab insgesamt 496 Proteintreffer, die mindestens 1 Peptidspektrum-Übereinstimmung (PSM) und 1 eindeutiges Peptid enthielten.

Um falsch-positive Ergebnisse weiter auszuschließen, betrachteten wir nur Proteine ​​mit mindestens zwei eindeutigen Peptiden als zuverlässige Proteintreffer, wie dies auch in anderen Studien zur Gelée Royale-Proteomik der Fall war (Hu et al., 2019; Zhang et al., 2014) und Dies liegt zum Teil daran, dass experimentelle Variationen in den Probenvorbereitungsschritten die am wenigsten vorkommenden Proteine ​​in massenspektrometrischen Proben am stärksten beeinflussen (Zhang et al., 2010). Proteine ​​wurden mit dem Genom der Amel_4.5-Honigbiene versehen, und wir verwendeten UniProt und GenBank, um ihre Identität und Funktionen zu bestätigen. Anschließend verglichen wir die Häufigkeit von vier immunbezogenen Proteinen in Gelée Royale aus der Kontrolldiät und der Pathogendiät: Glucoseoxidase, BiVSP, Lysozym und Defensin-1.

statistische Analyse

Um die Häufigkeit immunbezogener Proteine ​​zwischen Kontrolldiät und Gelée Royale in Pathogendiät zu bewerten, verglichen wir die PSM-Werte unserer ausgewählten Proteine. Wir verwendeten nichtparametrische Wilcoxon-Rangsummentests, um unsere begrenzte Stichprobengröße (N=3 pro Behandlung) zu berücksichtigen. Wir verwendeten einseitige Vergleiche, da unsere geplanten Hypothesen vorhersagten, dass diese ausgewählten Immunproteine ​​in Gelée Royale aus mit Krankheitserregern gefütterten Kolonien hochreguliert würden. Faltungsänderungen in der Proteinhäufigkeit wurden als (PSMpathogen−PSMcontrol)/PSMcontrol berechnet. Alle Analysen wurden in R (Version 3.5.2) durchgeführt.

ERGEBNISSE

Erregerfragmente in Gelée Royale

Wir fanden heraus, dass Gelée Royale-Proben aus allen Kolonien mit pathogener Nahrung Partikel enthielten, die mit einer deutlich höheren Intensität fluoreszierten als unser festgelegter Hintergrundfluoreszenzschwellenwert (siehe Materialien und Methoden), was darauf hindeutet, dass die Bakterienfragmente in das Gelée Royale eingebaut waren. Keine Proben von Gelée Royale aus der Kontrolldiät enthielten Partikel, die diesen Schwellenwert überstiegen (Abb. 1). Im Durchschnitt hatten Kolonien, die mit Krankheitserregern gefüttert wurden, 66,67 ± 28,87 (Mittelwert ± Standardabweichung) fluoreszierende Partikel pro Mikroliter Gelée Royale (N=3), während Kolonien, die mit Kontrolltieren gefüttert wurden, 0 fluoreszierende Partikel pro Mikroliter Gelée Royale hatten ( N=3) (Abb. 1).

Proteomik

Wir fanden insgesamt 496 Proteintreffer, und 44 davon waren mindestens zwei eindeutigen Peptiden zugeordnet (Tabelle 1). Die am häufigsten vorkommenden Proteine ​​in allen Proben waren erwartungsgemäß die wichtigsten Gelée Royale-Proteine. Im Allgemeinen stimmten die Proteine, die wir in unseren Proben beobachteten, ziemlich gut mit anderen neueren Proteomikstudien von Gelée Royale überein (Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Fujita et al., 2012, 2013; Hu et al., 2019; Zhang et al., 2014), aber es wurden in dieser Studie einige Proteine ​​identifiziert, über die an anderer Stelle nicht berichtet wurde. Dazu gehören Transferrin, ein Eisentransportmolekül (Kucharski und Maleszka, 2003), das auch im Gewebe der Giftdrüsen von Honigbienen vorkommt (Peiren et al., 2008); Serpin-5, ein Serin-Protease-Inhibitor, von dem bekannt ist, dass er die Prophenoloxidase-Aktivierung bei anderen Insekten reguliert (Li et al., 2016); Artischocke, ein chemosensorisches Protein mit Funktionen bei der Fortbewegung der Larven in Drosophila melanogaster (Andrés et al., 2014); und NPC2-like, ein Cholesterintransporter mit impliziten alloparentalen Funktionen bei Honigbienen (Thompson et al., 2006). Wir fanden außerdem drei zusätzliche Proteine ​​in unseren Gelée Royale-Proben aus der Pathogendiät: Glutathionperoxidase, Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase und ein nicht charakterisiertes Protein (LOC725202). Diese Proteine ​​wurden auch in unseren Kontrollnahrungsproben gefunden, aber sie erfüllten nicht unsere Kriterien, zwei einzigartige Peptide zu haben (Tabelle 1).

Beim Vergleich von Kontrolldiät- und Krankheitserregerdiätproben konnten wir nur sehr geringe Veränderungen in der relativen Proteinhäufigkeit im Gelée Royale beobachten (Tabelle 1). Unter unseren fokalen Immunproteinen fanden wir keinen signifikanten Unterschied in den Proteinspiegeln zwischen Behandlungen für Glucoseoxidase (U=7, P=0.9), Bi-VSP (U=1.5, P=0.134) oder Lysozym (U=2, P=0.184). Wir fanden jedoch deutlich mehr AMP Defensin-1 in Proben aus Pathogendiäten als in Proben aus Kontrolldiäten (U=0, P=0.05) ( Abb. 2). Es hatte eine Fold-Change von plus 0,68.

DISKUSSION

Diese Studie zeigt, dass Krankenschwestern, die Zellen des Erregers P. larvae aufnehmen, offenbar Fragmente der Zellen in das von ihnen produzierte Gelée Royale einbauen (Abb. 1). Wir haben kürzlich gezeigt, dass von Arbeitern aufgenommene Bakterien zu den Hypopharynxdrüsen transportiert werden, dem Ort der Synthese von Gelée Royale (Harwood et al., 2019), und hier zeigen wir, dass sie in das Gelée Royale eingebaut werden. Dieser Befund stellt einen übersehenen Weg der sozialen Immunität dar, der es Nestkameraden ermöglichen kann, das immunologische Gedächtnis zu teilen. Unsere Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die Zusammensetzung von Gelée Royale möglicherweise empfindlich auf Fremdstoffe reagiert, die systemisch in der Hämolymphe zirkulieren. In einer ähnlichen aktuellen Studie fanden Forscher heraus, dass Krankenschwestern, die mit doppelsträngiger RNA (dsRNA) gefüttert wurden, diese Moleküle in das Gelée Royale einbauen und auf Larven übertragen konnten, wo die dsRNA biologisch aktiv blieb (Maori et al., 2019). dsRNA aktiviert den antiviralen RNA-Interferenzweg (RNAi), der eine sequenzspezifische Gen-Stummschaltung auslöst, und synthetische dsRNA wird häufig für gezielte Gen-Knockdown-Studien verwendet (Fire et al., 1998). Darüber hinaus zeigte eine andere Studie, dass mit Pestiziden gefütterte Krankenschwestern auch Spuren dieser Agrochemikalien in ihr Gelée Royale einbauen können (Böhme et al., 2018), wobei der Schwerpunkt hier darauf lag, wie gut die Hypopharynxdrüsen verhindern, dass systemische Pestizide in das Gelée Royale gelangen .

Dennoch deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Zusammensetzung des Gelée Royale möglicherweise empfindlich auf den Zustand der Ammenbienen reagiert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Gelée Royale als Kanal für AB dienen kann. Abb. 1. Fluoreszenz- und Hellfeldmikroskopaufnahmen von Gelée Royale-Proben aus Kontroll- und Krankheitserreger-Diätbehandlungen, beobachtet mit einem Hämozytometer. Alle Proben (A, Behandlung mit Kontrolldiät; B, Behandlung mit Pathogendiät) wurden gleichzeitig nach identischen Protokollen hergestellt und unter identischen Mikroskopeinstellungen mit einem Leica DM6000 beobachtet. Die dunklen Bilder in den linken Spalten wurden mit einem TRITC-Laser aufgenommen, um Fluoreszenz in der Wellenlänge von Texas Red zu identifizieren, während die Bilder in den rechten Spalten Hellfeldbilder desselben Bereichs sind, um die Ablagerung von Gelée Royale auf dem Hämozytometer zu zeigen. Positive Fluoreszenzflecken (weiße Pfeile) wurden nur in den Pathogen-Diätproben (B) und nicht in den Kontroll-Diätproben (A) beobachtet. 4 unmittelbare Fragen.

Erstens: Wie führt die Exposition gegenüber einem Krankheitserreger dazu, dass Krankenschwestern einen erhöhten Defensinspiegel-1 im Gelée Royale produzieren? Eine Möglichkeit besteht darin, dass P. larvae-Fragmente im Toll-Weg (für grampositive Bakterien) an Rezeptoren zur Mustererkennung von Krankheitserregern binden und eine stärkere Gentranskription von Defensin-1 induzieren, aber die Beweise dafür sind etwas inkonsistent. Studien haben gezeigt, dass erwachsene Arbeiter, die Bakterien, einschließlich Amerikanischer Faulbrut, ausgesetzt sind, die Expression von Defensin-1 erhöhen (Evans et al., 2006; CasteelsJosson et al., 1994), aber in einer kürzlich durchgeführten Studie konnte keine signifikante Hochregulierung beobachtet werden Defensin-1-Expression im Kopfgewebe von Ammen nach Exposition gegenüber Amerikanischer Faulbrut (López-Uribe et al., 2017).

Dennoch können Insekten-AMPs wie Defensin-1 noch Wochen nach der Exposition gegenüber dem Krankheitserreger in der Hämolymphe beobachtet werden (Casteels, 1998), auch wenn die Transkription solcher AMP-Gene während dieser Zeit nachlässt (Uttenweiler-Joseph et al., 1998). Nur die Messung der Genexpression kann dazu führen, dass wichtige Informationen über die Verfügbarkeit der endgültigen Peptidprodukte fehlen. Alternativ kann die Exposition gegenüber Krankheitserregern die Übersetzung von Defensin-1-mRNA in Peptide hochregulieren oder die Rate posttranslationaler Modifikationen erhöhen, die zur Aktivierung des Peptids verwendet werden (Casteels-Josson et al., 1994), aber das muss sein weiter studiert.

Die zweite durch diese Ergebnisse aufgeworfene Frage ist, ob eine relative Faltungsänderung von plus 0.68 in Defensin-1 biologisch relevant ist. Herkömmlicherweise entscheiden sich viele Studien zur Humanproteomik für einen Schwellenwert von plus 1,2 für eine signifikante Hochregulierung (Serang et al., 2013; Keenan et al., 2009), sodass Defensin-1 dieses Kriterium nicht erfüllen würde. Selbst eine geringfügige Erhöhung der Defensin-1-Konzentration in Gelée Royale kann jedoch die Resistenz der Larven gegen amerikanische Faulbrut verbessern. Es wurde nicht nur gezeigt, dass Defensin-1 die Amerikanische Faulbrut direkt hemmt (Bachanová et al., 2002; Bíliková et al., 2001), sondern es ist auch gegen grampositive Bakterien bei Konzentrationen von nur 1 µmol l− wirksam 1 (Fujiwara et al., 1990). Darüber hinaus ist bekannt, dass mehrere Komponenten des angeborenen Immunsystems synergistisch wirken, wobei zwei Komponenten zusammen eine stärkere hemmende Wirkung auf Krankheitserreger haben als die Summe jeder Komponente, die unabhängig voneinander wirkt.

Beispielsweise haben Tests zur Hemmung des Bakterienwachstums gezeigt, dass AMPs und Lysozym zusammenarbeiten, um die Wirksamkeit des anderen erheblich zu steigern (Chalk et al., 1994). Es wurde auch gezeigt, dass Lysozym Krankheitserreger synergistisch mit Apolipoprotein-III (ApoLp-III) bekämpft (Zdybicka-Barabas et al., 2013), einem Lipidtransportprotein mit antipathogenen Funktionen bei Insekten (Whitten et al., 2004; Kim und Jin, 2015), das in Gelée Royale vorkommt (Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Zhang et al., 2014; Fujita et al., 2013). Schließlich kann es sein, dass das heranreifende Immunsystem junger Honigbienenlarven Schwierigkeiten hat, ihr Defensin-1 zu produzieren, wenn es von Amerikanischer Faulbrut angegriffen wird, da Studien gezeigt haben, dass eine solche Herausforderung in den Larven kaum oder gar keine Defensin-1-Expression hervorruft (Romanelli et al., 2011 Cremer et al., 2007; Serang et al., 2013; Keenan et al., 2009, obwohl Bachanová et al., 2002 als Ausnahme aufgeführt ist). Somit kann zusätzliches Defensin-1 von exponierten Ammen den Mangel an diesem entscheidenden AMP in den Larven ausgleichen. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass selbst ein geringfügiger Anstieg des Defensins-1 in Gelée Royale biologisch relevant für den Schutz der am stärksten gefährdeten Mitglieder der Kolonie sein könnte.

Diese Studie zeigte auch weiter die entscheidende Rolle, die das Protein Vg bei der Immunität von Honigbienen spielt. Aufgrund seiner Rolle als Pathogenmustererkennungsrezeptor, die in einer Vielzahl tierischer Taxa dokumentiert wurde (Salmela et al., 2015; Du et al., 2017; Garcia et al., 2010; Knight, 2019; Li et al., 2008, 2009; Liu et al., 2009; Zhang et al., 2011) sowie seine Rolle bei der Eibildung wurde Vg als Trägerprotein identifiziert, das Immunauslöser in die Eier der Königin transportiert (Salmela et al., 2015). Auch bei Pflegekräften deuten neuere Erkenntnisse darauf hin, dass Vg eine Schlüsselrolle beim Transport aufgenommener Krankheitserreger zu den Hypopharynxdrüsen spielt (Harwood et al., 2019). Vg wird von den Hypopharynxdrüsen der Krankenschwestern aufgenommen und dient als Aminosäurespender bei der Herstellung von Gelée Royale (Amdam et al., 2003). Vg kann Bakterien in die Drüsen transportieren, um dort in das Gelée aufgenommen zu werden. Daher kann Vg in allen Stadien der TGIP auf Kolonieebene bei Honigbienen eine Rolle spielen, von der ersten Inokulation und Einarbeitung in das Gelée Royale über die Lieferung an die Königin oder die Larven bis hin zum Transport in die Eierstöcke der Königin.

Diese Studie hat gezeigt, dass die Zusammensetzung von Gelée Royale durch eine Pathogenbelastung verändert werden kann, sowohl durch den Einbau von Pathogenfragmenten als auch durch erhöhte Spiegel des AMP-Defensins-1. Die Fähigkeit, Krankheitserregerfragmente in Gelée Royale zu übertragen, bedeutet, dass die transgenerationale Immunvorbereitung bei Honigbienen auf volksweiter Ebene funktionieren kann. Zusätzlich zur vertikalen Übertragung von Immunauslösern von einem fortpflanzungsfähigen Weibchen auf ihren Nachwuchs können Honigbienen einen komplexeren Übertragungsweg haben, der vom erwachsenen Nachwuchs (Ammenfrau) zum fortpflanzungsfähigen Weibchen und zum zukünftigen Nachwuchs führt, sowie eine horizontale Übertragung vom erwachsenen Nachwuchs zum unreifen Nachwuchs Nachwuchs. Der Vorteil hierbei wäre, dass die Larven mit einem größeren Repertoire an Immunauslösern geimpft werden, das aus der kollektiven immunologischen Erfahrung von Arbeitern stammt, die Ressourcen von außerhalb des Nests sammeln, wodurch die Larven resistenter gegen Krankheitserreger werden, denen sie wahrscheinlich begegnen, wenn sie sich aus dem Nest wagen .

Danksagungen

Wir danken Siiri Fuchs, Salla Lohi, Mati Leponiemi, Franziska Dickel, Maarit Nurminen, Marianne Teichmann und Taina Stark für ihre Unterstützung bei der Datenerfassung und Analyseberatung. Wir danken auch Austin Cyphersmith für die technische Unterstützung bei der Mikroskopie.

Konkurrierende Interessen

GH und GA erklären keine konkurrierenden oder finanziellen Interessen. HS und DF sind als Erfinder eines Patents (WO2017017313A1) für einen essbaren Bienenimpfstoff aufgeführt. Dieses Patent ist Dalan Animal Health Inc. übertragen, wo DF als Chief Scientific Officer fungiert. Die in diesem Dokument vorgestellte Forschung wurde unabhängig und ohne finanzielle, materielle oder analytische Ressourcen von Dalan Animal Health Inc. oder einem anderen kommerziellen Unternehmen durchgeführt.

Autorenbeiträge

Konzeptualisierung: GH, HS, GA; Methodik: GH, HS; Validierung: GH; Formale Analyse: GH, HS; Untersuchung: GH, HS; Ressourcen: HS, DF, GA; Datenkuration: GH; Schreiben – Originalentwurf: GH; Schreiben – Rezension und Bearbeitung: GH, HS, DF, GA; Visualisierung: GH; Betreuung: GA; Projektverwaltung: DF, GA; Finanzierungseinwerbung: GH, DF, GA

Finanzierung

GH wurde vom Arizona State University Graduate Research and Support Program (LM51097GH) unterstützt. DF wurde durch ein Business Finland-Stipendium (2348/31/2017) und ein Academy of Finland-Stipendium (6303369) unterstützt. GA wurde vom Norges Forskningsråd (262137) unterstützt.

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