Natriumthiosulfat-ergänzte UW-Lösung schützt Nierentransplantate vor längerer Verletzung durch Kälte-Ischämie-Reperfusion in einem Mausmodell der syngenen Nierentransplantation

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Max Y. Zhanget al

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ABSTRAKT

Einführung:Kalte Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) ist ein unvermeidliches Ereignis, das Komplikationen nach der Transplantation erhöht. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Ergänzung der Lösung der University of Wisconsin (UW) mit nicht von der FDA zugelassenen Schwefelwasserstoff (H2S)-Donormolekülen den Kälte-IRI minimiert und die Funktion des Nierentransplantats nach der Transplantation verbessert. Die vorliegende Studie untersucht, ob ein von der FDA zugelassenes H2S-Donormolekül, Natriumthiosulfat (STS), die gleiche oder eine überlegene Wirkung in einem klinisch relevanten Rattenmodell des syngenen Orthotops hatNiereTransplantation.

Methode:Dreißig Lewis-Ratten wurden einer bilateralen Nephrektomie gefolgt von einer syngenen orthotopischen Transplantation der linken Seite unterzogenNierenach 24-stündiger Aufbewahrung entweder in UW- oder UW plus STS-Lösung bei 4 ◦C. Die Ratten wurden bis Tag 14 nach der Transplantation überwacht und getötet, um die Nierenfunktion (Urinausscheidung, Serum-Kreatinin und Blut-Harnstoff-Stickstoff) zu beurteilen.NiereSchnitte wurden mit H&E, TUNEL, CD68 und Myeloperoxidase (MPO) gefärbt, um akute tubuläre Nekrose (ATN), Apoptose, Makrophageninfiltration und Neutrophileninfiltration nachzuweisen.

Ergebnis:UW plus STS-Transplantate zeigten unmittelbar nach der Transplantation eine signifikant verbesserte Transplantatfunktion, mit verbessertem Überleben des Empfängers im Vergleich zu UW-Transplantaten (p < {{0}},05).="" die="" histopathologische="" untersuchung="" ergab="" eine="" signifikant="" verringerte="" infiltration="" von="" atn,="" apoptose,="" makrophagen="" und="" neutrophilen="" sowie="" eine="" herunterregulierung="" proinflammatorischer="" und="" proapoptotischer="" gene="" in="" uw-="" und="" sts-transplantaten="" im="" vergleich="" zu="" uw-transplantaten="" (p=""><>

Fazit:Wir zeigen zum ersten Mal, dass die Konservierung von Nierentransplantaten in STS-ergänzter UW-Lösung vor anhaltendem Kälte-IRI schützt, indem sie apoptotische und entzündliche Wege unterdrückt und dadurch die Transplantatfunktion verbessert und das Überleben des Empfängers verlängert. Dies könnte eine neue klinisch anwendbare therapeutische Strategie darstellen, um die nachteiligen klinischen Folgen einer verlängerten Kälte-IRI zu minimierenNiereTransplantation.

Schlüsselwörter:Natriumthiosulfat (STS) Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) Statische Kühllagerung (SCS)NiereTransplantation Überleben von Transplantat und Empfänger

1. Einleitung

NiereTransplantation ist die optimale Behandlung für das EndstadiumNiereNieren-Krankheit (ESRD). Im Vergleich zur DialyseNiereTransplantation ist überlegen, da sie eine bessere Lebensqualität bietet und neben ihrer Kosteneffektivität einen signifikanten Überlebensvorteil verleiht [1–3]. Die Entnahme von Spendernieren ist jedoch zwangsläufig mit einer Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) verbunden, einer unvermeidlichen Folge der Unterbrechung und anschließenden Wiederherstellung des Blutflusses während der Transplantation [4]. Die aktuelle Strategie zur Milderung der durch Transplantation induzierten IRI ist die statische Kaltlagerung (SCS) von Nierentransplantaten in Standardkonservierungslösungen wie der Lösung der University of Wisconsin (UW) auf Eis bei 4 °C während der Zeit vor der Transplantation [5]. Es wurde jedoch gezeigt, dass eine verlängerte SCS mit erhöhtem Zelltod, Entzündungen und anderen schädigenden zellulären und molekularen Ereignissen verbunden ist, die letztendlich zu einer erhöhten Inzidenz von verzögerter Transplantatfunktion (DGF), akuter tubulärer Nekrose (ATN) und verringertem Transplantat führen Überleben [6–10]. Um mit der weltweit steigenden Inzidenz von ESRD und einer ständig steigenden Zahl von Patienten auf Wartelisten für Transplantationen Schritt zu halten, akzeptieren viele Transplantationszentren außerdem Nierentransplantate mit verlängerten kalten ischämischen Perioden, was weiter zur Gesamtgewebeschädigung beiträgt. Nach der SCS erfolgt die Reperfusion, wenn warmes, mit Sauerstoff angereichertes Blut in das kalte ischämische Transplantat zurückgeführt wird. Die Reperfusion, die Effektorphase der ischämischen Verletzung, ist durch eine erhöhte Gewebeverletzung gekennzeichnet [11–13].

Eine potenzielle therapeutische Strategie zur Begrenzung des Kälte-IRI währendNiereDie Transplantation beinhaltet die Ergänzung der Standardkonservierungslösung mit Schwefelwasserstoff (H2S), einem endogen produzierten Gasotransmitter, der nachweislich eine wichtige physiologische Rolle bei der Vasodilatation und der zellulären Signalübertragung spielt [14–16]. Wir haben zuvor gezeigt, dass eine verlängerte SCS in H2S-ergänzter UW-Lösung die durch Transplantation induzierte Kälte-IRI reduziert und das Transplantatüberleben in Mausmodellen der syngenen und allogenen Nierentransplantation verbessert [17–19, 41, 42]. Die in diesen Studien verwendeten H2S-Donormoleküle sind jedoch klinisch nicht brauchbar. Dies hat zu der Überlegung geführt, Natriumthiosulfat (STS) zu verwenden, ein H2S-Donor-Medikament, das von der Food and Drug Administration (FDA) zur Behandlung von Calciphylaxe bei ESRD-Patienten, Cisplatin-induzierter Toxizität in der Krebstherapie und als Gegenmittel dafür zugelassen ist Cyanidvergiftung [20–23]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass STS in Tiermodellen von IRI eine schützende Wirkung zeigt [24–26]. Seine Wirkung auf die durch Transplantation induzierte kalte renale IRI ist jedoch unbekannt. Daher untersucht die vorliegende Studie die renoprotektiven Wirkungen von STS in einem In-vitro-Modell der renalen IRI und im Rattenmodell der syngenen orthotopen Nierentransplantation.

2. Materialien und Methoden

2.1. Experimentelles In-vitro-Protokoll

Ein In-vitro-Modell für Kältehypoxie und Wärmereoxygenierungsverletzung, das die zellulären Bedingungen während einer In-vivo-Kälte-IRI nachahmt, wurde verwendet, um die schützenden Wirkungen von STS während einer Nieren-IRI zu bewerten. Rattennierenepithelzellen (NRK{{0}}E-Zelllinie; ATCC, USA) wurden in den In-vitro-Experimenten verwendet, da diese Zellen anfällig für ischämische Verletzungen sind [27] und ihre Verwendung mit der Ratte übereinstimmt Transplantationsmodell, das für das zweite Ziel dieser Studie verwendet wurde. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) kultiviert, das 1 0 Prozent fötales Rinderserum (FBS) enthielt, das durch Hitze bei 60 °C für 20 Minuten und 1 Prozent Penicillin/Streptomycin (P/S) inaktiviert wurde. Die Zellen wurden bei normalen Wachstumsbedingungen von 37 °C, 21 % O2 und 5 % CO2 inkubiert. Kontrollzellen befanden sich unter identischen Bedingungen wie die vorexperimentellen Zellen. Versuchszellen wurden entweder mit serumfreiem Medium (SF), SF plus 200 nM AP39 oder SF mit unterschiedlichen Konzentrationen (50 µM, 150 µM, 500 µM, 1 mM) von Natriumthiosulfat-Pentahydrat (STS) behandelt, die von erhalten wurden eine 250 mg/ml injizierbare Lösung von STS (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Kanada]). Es wurde eine Konzentration von 200 nM AP39 verwendet, weil wir zuvor gezeigt haben, dass AP39 in dieser Konzentration in einem ähnlichen Modell von kaltem IRI zytoprotektiv gegen dieselbe Zelllinie ist [20]. Die Zellen wurden dann bei 10 °C für 24 h unter hypoxischen Bedingungen (5 % CO2, 0,5 % O2, 95 % N2) in der Hypoxiekammer HypOxystation H85 (HYPO2YGEN, USA) inkubiert, um eine ischämische Verletzung durch Kälte zu induzieren. Es wurde eine hypothermische Temperatur von 10 °C verwendet, da dies die niedrigste Temperatur war, die technologisch erreicht werden konnte, während ein Hypoxie-Niveau von 0,5 Prozent O2 aufrechterhalten wurde. Nach der Hypoxie wurde das Medium mit den Versuchszellen durch Kontrollmedium ersetzt und die Zellen durch Inkubation unter normalen Wachstumsbedingungen (37 °C, 21 % O2 und 5 % CO2) für 24 h mit Sauerstoff versorgt, um eine Reperfusion und die damit verbundene Schädigung zu simulieren. Nach 24-stündiger Reoxygenierung wurde die zelluläre Lebensfähigkeit durch Färbung der Zellen mit FITC-konjugiertem Annexin-V (FITC-Annexin-V; BioLegend, USA) und 7-Aminoactinomycin D (7-AAD; BioLegend, USA) bewertet ), die zelluläre Apoptose bzw. Nekrose misst. Die Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung des CytoFLEX S (Beckman Coulter, USA) analysiert. FlowJo Version 11 (FlowJo LLC, USA) wurde verwendet, um die Daten für die statistische Analyse angemessen zu koppeln.

2.2. Versuchstiere

Dreißig männliche Lewis-Ratten mit einem Gewicht von 275–300 g, die von Charles River (St. Constant, QC, Kanada) bezogen wurden, wurden unter Standardbedingungen in der Tierpflege- und Veterinärdiensteinrichtung der Western University (London, ON) untergebracht. Tierstudien wurden vom Western University Council on Animal Care and Animal Use mit einer Protokoll-ID 2018–155 genehmigt.

2.3. Nierentransplantationsmodell

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >20 Prozent Gewichtsverlust) oder Tod. Humane Endpunkte wurden zweimal täglich überprüft und alle Ratten wurden durch CO2-Exposition in einer Kammer bei einer Durchflussrate von 40 Prozent eingeschläfert. Zum Zeitpunkt der Euthanasie gab es keine chirurgischen Komplikationen, die zu Abweichungen in den Ergebnissen hätten führen können.

2.4. Analyse der Nierenfunktion

Nach der Nierentransplantation wurden die Ratten 14 Tage lang in Stoffwechselkäfigen überwacht und dann getötet. Blut- und Urinproben wurden am POD 3, 5, 7, 10 und 14 gesammelt, um Parameter der Nierenfunktion (Serumkreatinin, Blutharnstoffstickstoff [BUN], Urinosmolalität und Urinausscheidung) zu bestimmen. BUN und Serumkreatinin stammten von Empfängern einer Nierentransplantation, und scheinoperierte Ratten wurden mit dem IDEXX Catalyst One Chemistry Analyzer (Markham, ON) gemessen. Urin-Osmolalitätswerte wurden durch Gefrierpunktosmometrie unter Verwendung des 3320-Osmometer-Geräts (Advanced Instruments, Norwood, MA) bestimmt und mit den vom Unternehmen bereitgestellten Standards verglichen.

2.5. Histopathologische und morphometrische Analyse

Paraffin-eingebettetes Nierengewebe wurde in 4 um dicke Schnitte geschnitten und für die Histologie auf mikroskopische Objektträger aufgebracht. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E), terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase-dUTP-Nick-End-Markierung (TUNEL) gefärbt, um den Grad von ATN bzw. Apoptose zu bestimmen. H&E-Schnitte wurden von einem verblindeten Nierenpathologen gemäß dem folgenden Schema mit einer Punktzahl für ATN versehen: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 Prozent Transplantat-ATN. Nierenschnitte wurden auch mit den folgenden primären Antikörpern gefärbt: Nierenverletzungsmarker (KIM-1), Makrophagen-Oberflächenmarker CD68 und neutrophilenspezifisches Enzym Myeloperoxidase (MPO; Abcam®, Toronto, Kanada) und mit sekundären Antikörpern und sichtbar gemacht DAB-Substratchromogen unter Verwendung des Dako Envision Systems (Dako, Glostrup, Dänemark) gemäß dem Herstellerprotokoll, gefolgt von einer Analyse unter einem digitalen Eclipse 90i-Lichtmikroskop (Nikon® Instruments, New York) bei 10-facher Vergrößerung und quantifiziert durch die ImageJ-Software v. 1.8 (National Gesundheitsinstitute, Bethesda, MD).

2.6. Quantitative PCR-Analyse

Gesamt-RNA wurde aus Nierentransplantatgeweben isoliert, die bei POD 3 mit dem RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Toronto, Kanada) erhalten wurden, und revers in cDNA transkribiert mit dem OneScript® Plus cDNA-Synthesekit (ABM, Kanada) in Verbindung mit Oligo(dT)12– 18 Primer nach Herstellerprotokoll. Isolierte RNA und cDNA wurden vor der Verwendung mittels Nanodrop (DeNovix DS-11 Spectrophotometer, Kanada) analysiert, wobei die A260/280-Bewertungen durchgehend > 1,95 bzw. > 1,8 waren. Das Reaktionsgemisch jeder qPCR-Probe hatte ein Volumen von 20 µl und wurde gemäß dem Protokoll Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Kanada) hergestellt und mit dem CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Kanada) analysiert. . Primersequenzen wurden unter Verwendung der Primer-BLAST-Software (NCBI) gegen Beta-Actin, Poly(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP), Interferon-Gamma (IFN-), Tumornekrosefaktor-Alpha (TNF-), Interleukin 6 (IL -6), B-Zell-Lymphom 2 (Bcl-2), Bcl-2--assoziiertes X-Protein (BAX), Caspase 3, BH3-Interaktionsdomänen-Todesagonist (BID), c-Jun N-terminale Kinase 1/2 (JNK1/2), Pparg Coactivator 1 alpha (PGC-1 ), Mitochondrienkomplex I (NDUFB8), Mitochondrienkomplex II (SDHB), Mitogen-aktivierte Proteinkinase 1/2 (ERK1 /2), Neutrophilen-Gelatinase-Lipocalin (NGAL) und Nierenverletzungsmolekül -1 (KIM-1)-Genen. Alle interessierenden Gene wurden gegen Beta-Aktin normalisiert. Vielfache Änderungen der Genexpression wurden mit scheinoperierten Ratten verglichen und unter Verwendung der ΔΔCt-Methode berechnet.

2.7. statistische Analyse

Alle statistischen Analysen wurden mit dem statistischen Softwarepaket GraphPad (La Jolla, CA) Prism, Version 9, durchgeführt.0. Die Überlebensdaten wurden mithilfe der Kaplan-Meier-Überlebensanalyse und des Log-Rank-Tests analysiert, während die qPCR-Genexpressionsdaten mithilfe des ungepaarten Einweg-t-Tests analysiert wurden. Alle anderen Daten wurden unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Tukey's post-hoc-Test, analysiert, um statistische Unterschiede zwischen den Gruppen zu bestimmen. Statistische Signifikanz wurde auf p akzeptiert<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Ergebnisse

3.1. STS-ergänzte serumfreie Medien verbessern das Überleben der renalen tubulären Epithelzellen während kalter Hypoxie/Reoxygenierung

Die durchflusszytometrische Analyse nach Färbung auf Apoptose und Nekrose zeigte, dass NRK{{0}}-E-Zellen, die während der In-vitro-Kälte-IRI mit SF behandelt wurden, eine signifikant verringerte Zelllebensfähigkeit im Vergleich zu (normoxischen) Kontrollzellen aufwiesen (Abb. 1A; p < 0.05).="" während="" alle="" versuchsproben="" eine="" signifikant="" geringere="" lebensfähigkeit="" der="" tubulären="" nierenepithelzellen="" zeigten="" als="" zellen,="" die="" unter="" normoxischen="" bedingungen="" gezüchtet="" wurden="" (p="">< 0,05),="" zeigten="" zellen,="" die="" mit="" sf,="" ergänzt="" mit="" 150="" µm="" und="" 500="" µm="" sts,="" behandelt="" wurden,="" eine="" signifikant="" höhere="" lebensfähigkeit="" als="" die="" behandelten="" mit="" sf-medium="" allein="" (fig.="" 1a;="" p="">< 0,05),="" was="" einer="" deutlich="" verringerten="" apoptose="" im="" vergleich="" zu="" zellen="" entsprach,="" die="" nur="" mit="" sf-medium="" behandelt="" wurden="" (fig.="" 1b;="" p="">< 0,05).="" außerdem="" scheinen="" die="" erhöhung="" der="" zelllebensfähigkeit="" und="" die="" verringerung="" der="" apoptose="" bei="" 150="" µm="" und="" 500="" µm="" sts="" optimale="" werte="" zu="" erreichen,="" da="" eine="" höhere="" dosis="" diese="" trends="" umkehrte="" (fig.="" 1a="" und="">

3.2. Die Ergänzung der UW-Lösung mit STS verbessert das Überleben und die Funktion des frühen Nierentransplantats

Die Konservierung von Nierentransplantaten in STS-ergänzter UW-Lösung verbesserte das Überleben des Empfängers signifikant mit 83 Prozent Überleben bis POD 14 (Tag der Tötung) im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne STS-Ergänzung, die 12,5 Prozent Überleben zeigte, insbesondere in den ersten 3 Tagen (Abb. 2A; p < 0.05).="" darüber="" hinaus="" verbesserte="" die="" sts-supplementierung="" die="" transplantatfunktion="" während="" der="" frühen="" phase="" nach="" der="" transplantation="" im="" vergleich="" zur="" uw-behandlung="" allein="" deutlich.="" die="" serum-kreatinin-="" und="" bun-spiegel="" waren="" sowohl="" in="" den="" uw-="" als="" auch="" in="" den="" uw-plus-sts-gruppen="" am="" pod="" 3="" signifikant="" erhöht,="" was="" mit="" einer="" verringerten="" urinosmolalität="" im="" vergleich="" zu="" sham="" korrelierte="" (abb.="" 2b,="" c="" und="" 3a;="" p="">< 0).="" {{25="" }}5).="" die="" serumkreatinin-="" und="" bun-spiegel="" in="" der="" uw="" plus="" sts-gruppe="" nahmen="" jedoch="" am="" pod="" 3="" signifikant="" ab,="" mit="" einem="" entsprechenden="" anstieg="" der="" urinosmolalität="" im="" vergleich="" zur="" uw-gruppe="" (abb.="" 2b,="" c="" und="" 3a;="" p="">< 0,05).="" interessanterweise="" nahmen="" die="" serumkreatinin-="" und="" bun-spiegel="" in="" der="" uw="" plus="" sts-gruppe="" stetig="" von="" pod="" 3="" bis="" pod="" 14="" mit="" erhöhter="" urinosmolalität="" ab="" und="" waren="" mit="" denen="" von="" sham="" vergleichbar="" (="" 2b="" ,="" c="" und="" 3a="" ).="" außerdem="" war="" die="" urinausscheidung="" in="" der="" uw-plus-sts-gruppe="" während="" der="" ersten="" vier="" postoperativen="" tage="" im="" vergleich="" zu="" den="" uw-="" und="" scheingruppen="" signifikant="" höher="" (abb.="" 3b;="" p="">< 0,05).="" er="" nahm="" jedoch="" stetig="" in="" richtung="" des="" grundlinienwerts="" (schein)="" ab="" und="" war="" vergleichbar="" mit="" dem="" von="" schein="" bei="" pod="" 14,="" während="" die="" urinausscheidung="" bei="" der="" überlebenden="" ratte="" in="" der="" uw-gruppe="" höher="" als="" der="" grundlinienwert="" bei="" pod="" 14="" blieb="" (="" 3b="">

3.3. Die Zugabe von STS zu UW-Lösung mildert den durch Transplantation induzierten Zelltod nach einer Nierentransplantation

An POD 3 und 14 erhaltene Nierenschnitte wurden mit TUNEL als Maß für den apoptotischen Zelltod gefärbt und von einem verblindeten Nierenpathologen bewertet ( 4A ). Nierentransplantate aus der UW-Gruppe zeigten einen signifikant höheren apoptotischen Zelltod am POD 3, wie durch einen höheren TUNNEL-Score angezeigt wird, im Vergleich zu Nieren aus UW- plus STS- und Sham-Gruppen (Abb. 5A und b; p < 0).="" {{11}="" }5).="" transplantate="" aus="" der="" uw="" plus="" sts-gruppe="" unterschieden="" sich="" im="" vergleich="" zu="" denen="" von="" sham="" zum="" gleichen="" zeitpunkt="" und="" bei="" pod="" 14="" nicht="" signifikant="" (abb.="" 4b).="" während="" transplantate="" sowohl="" aus="" uw-="" als="" auch="" aus="" uw-plus-sts-gruppen="" signifikant="" erhöhte="" atn-scores="" auf="" pod="" 3="" im="" vergleich="" zur="" scheingruppe="" zeigten="" (abb.="" 5;="" p="">< 0.05),="" uw-plus-sts-transplantate="" zeigten="" verringerte="" atn-scores="" auf="" pod="" 3="" im="" vergleich="" zu="" uw="" (abb.="" 5;="" p="">< 0,05).="" während="" die="" empfänger="" von="" uw-transplantaten="" pod="" 14="" nicht="" überlebten="" und="" daher="" ihre="" atn-scores="" nicht="" auf="" pod="" 14="" bestimmt="" werden="" konnten,="" überlebten="" diejenigen="" von="" uw="" plus="" sts-transplantaten="" bis="" pod="" 14,="" zeigten="" aber="" signifikant="" erhöhte="" atn-scores="" im="" vergleich="" zur="" scheingruppe="" (abb="" .5;="" p=""><>

3.4. Nierentransplantate, die in STS-ergänzter UW-Lösung aufbewahrt wurden, zeigten nach der Nierentransplantation verringerte Verletzungsmarker und entzündliches Infiltrat

An POD 3 und 14 erhaltene Nierenschnitte wurden mit KIM-1 gefärbt, um proximale tubuläre Verletzungen sowie CD68 (Makrophagenmarker) und MPO (Neutrophilenmarker) nachzuweisen, und von einem verblindeten Nierenpathologen bewertet (Abb. 6A, 7A, und C). Die Expression von KIM-1, CD68 und MPO im Nierengewebe war in der UW-Gruppe am POD 3 signifikant höher als in den Gruppen UW plus STS und Schein (Abb. 6B, 7B und D; p < {{11}="" }.05),="" während="" die="" expression="" dieser="" marker="" in="" uw="" plus="" sts-transplantaten="" im="" vergleich="" zu="" sham="" auf="" pod="" 14="" nicht="" signifikant="" unterschiedlich="" war="" (fig.="" 6b,="" 7b="" und="" d;="" p=""> 0,05).

3.5. Die STS-Ergänzung zur UW-Lösung unterdrückte die renale Expression von pro-inflammatorischen, pro-apoptotischen und mitochondrialen Genen

Die Genexpression von entzündungsfördernden, pro-apoptotischen, auf Mitochondrien gerichteten und Nierenverletzungsmarkern wurde mittels qRT-PCR in transplantierten Nieren bestimmt, die am POD 3 erhalten wurden. Die Expression der entzündungsfördernden Gene IFN-, TNF- und IL{{8 }} waren bei UW-Transplantaten im Vergleich zu UW plus STS-Transplantaten am POD 3 deutlich erhöht (Fig. 8A; p < 0.05)="" und="" folgten="" dem="" gleichen="" muster="" mit="" den="" pro-apoptotischen="" genen="" parp,="" bax="" ,="" caspasen-3,="" bid,="" jnk1="" und="" jnk2="" (fig.="" 8a;="" p="">< 0.05),="" während="" die="" expression="" von="" anti-apoptotischem="" bcl-2="" in="" uw="" leicht="" erhöht="" war="" plus="" sts-gruppe="" im="" vergleich="" zur="" uw-gruppe,="" obwohl="" dieser="" anstieg="" keine="" statistische="" signifikanz="" erreichte="" (fig.="" 8a).="" darüber="" hinaus="" war="" die="" expression="" der="" mitochondrialen="" gene="" pgc-1,="" ndufb8="" (komplex="" i)="" und="" sdhb="" (komplex="" ii)="" in="" uw-transplantaten="" im="" vergleich="" zu="" uw="" plus="" sts-transplantaten="" signifikant="" verringert="" (abb.="" 8b;="" p="">< 0="" .05),="" während="" das="" gegenteil="" bei="" erk1-="" und="" erk2-expressionen="" beobachtet="" wurde="" (fig.="" 8b;="" p="">< 0,05).="" darüber="" hinaus="" war="" die="" kim-1-genexpression="" in="" uw-transplantaten="" im="" vergleich="" zu="" uw="" plus="" sts-transplantaten="" signifikant="" erhöht="" (abb.="" 8c;="" p="">< 0,05),="" während="" die="" verringerte="" ngal-expression="" in="" uw="" plus="" sts-transplantaten="" keine="" statistische="" signifikanz="" im="" vergleich="" dazu="" erreichte="" uw-transplantate="" (abb.="" 8c;="" p=""> 0,05).

4. Diskussion

Diese Studie etabliert die Ergänzung der Standard-Konservierungslösung mit STS, einem klinisch brauchbaren, von der FDA zugelassenen H2S-Spender, um die durch Transplantation induzierte kalte Nieren-IRI zu mildern, die Transplantatqualität zu verbessern und das Überleben des Empfängers zu verlängern. Unter Verwendung eines In-vitro-Modells der renalen IRI und eines Rattenmodells der syngenen orthotopen Nierentransplantation zeigen wir zum ersten Mal, dass die Supplementierung von UW-Lösung mit STS während längerer SCS to- und organprotektiv ist.

Das primäre Ergebnis unseres In-vitro-Modells ist, dass die STS-Ergänzung zu serumfreien Medien Nierenepithelzellen vor kalter Hypoxie und warmer Reoxygenierung-induzierter Apoptose schützt und die Lebensfähigkeit erhöht, was mit unserer früheren Studie übereinstimmt, in der wir die schützenden Wirkungen der Mitochondrien gezeigt haben -Targeting-H2S-Donor-Medikament, AP39, in einem In-vitro-Modell von kaltem Nieren-IRI [20]. Interessanterweise kehrte eine höhere STS-Konzentration von 1 mM die vorteilhaften Wirkungen um, was impliziert, dass STS ein zweiphasiges Dosis-Wirkungs-Phänomen aufweist, das als Hormesis bezeichnet wird, bei dem eine niedrigere Konzentration zytoprotektiv ist, während eine höhere Konzentration zytotoxisch ist. Eine mitochondriale Schädigung ist eine Hauptfolge der renalen IRI, da die mitochondriale Permeabilität die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) hemmen und die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) erhöhen kann, einem destruktiven Mediator von Gewebeverletzungen [13]. Es wurde kürzlich vorgeschlagen, dass Mitochondrien ein primärer Ort der STS-Aktivität sind. Es ist nicht nur bekannt, dass STS H2S in den Mitochondrien über Glutathion-abhängige Reduktion und umgekehrt über den Sulfidoxidationsweg erzeugt, sondern auch die mitochondriale ATP-Synthese erhält, die ROS-Produktion verringert und komplexe Enzymaktivitäten in der Elektronentransportkette (ETC) verbessert [24 ,28–30]. Darüber hinaus zeigten neuere Studien, dass STS die Expression von PGC-1, einem positiven Regulator der mitochondrialen Biogenese und ATP-Produktion, signifikant erhöhte [26], was mit unserer in vivo-Beobachtung übereinstimmt. Diese molekularen Mechanismen könnten für die signifikant erhöhte Expression der mitochondrialen ETC-Komplexe I und II (NDUFB8 bzw. SDHB) in unserem Nierentransplantationsmodell mit erhöhtem Überleben und erhöhter Funktion verantwortlich sein, wie dies bei Nierentransplantaten beobachtet wurde, die in STS-ergänzter UW-Lösung aufbewahrt wurden.

Basierend auf unseren In-vitro-Ergebnissen haben wir uns entschieden zu untersuchen, ob die Schutzwirkung von STS in vivo anwendbar ist, indem wir ein Transplantationsmodell verwenden, bei dem kalter IRI einen wesentlichen Beitrag zur Transplantat-Dysfunktion und zu erhöhten Komplikationen nach der Transplantation leistet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine verlängerte (24 h) SCS von Nierentransplantaten in STS-ergänzter UW-Lösung die Transplantatqualität und -funktion signifikant verbessert, gekennzeichnet durch verringerte Serumkreatinin- und BUN-Spiegel, höhere Urinausscheidung und verlängertes Überleben des Empfängers im Vergleich zu Transplantaten, die nur in UW-Lösung konserviert wurden . Es ist wichtig zu beachten, dass die Unmittelbarkeit der Urinabgabe auch nach einer klinischen Nierentransplantation ein kritisches Ergebnis ist, das bestimmt, ob eine Dialyse erforderlich ist, um die verzögerte Transplantatfunktion (DGF) zu behandeln. Daher ist unsere Beobachtung, dass STS die Urinausscheidung unmittelbar nach der Transplantation erhöht und mit der Scheingruppe am POD 14 vergleichbar ist, ein vielversprechender Befund. Die beobachtete Verbesserung der Nierenfunktion nach der Transplantation von Transplantaten, die in STS-ergänzter UW-Lösung aufbewahrt wurden, verlieh auch einen signifikanten Überlebensvorteil. Quantitativ verlängerte die STS-Ergänzung die Lebensdauer des Transplantats, so dass 83 Prozent (5/6) der Ratten, die UW plus STS-Transplantate erhielten, bis POD 14 (Tag der Tötung) überlebten, verglichen mit nur 12,5 Prozent (1/8) der Empfängerratten von Transplantate, die in UW-Lösung ohne STS-Ergänzung aufbewahrt werden. Dieser Befund aus der vorliegenden Studie stimmt auch mit unserer früheren Studie überein, in der nur 14 Prozent (1 von 7) der Empfängerratten von Transplantaten in UW-Lösung für 24 Stunden ohne H2S (GYY4137)-Supplementierung konserviert wurden und bis POD 14 überlebten [20]. .

Neben der Verbesserung der Nierenfunktionsparameter hemmte die STS-Supplementierung auch die Apoptose und Entzündung von Nierentransplantaten, indem sie die Gewebeexpression von pro-apoptotischen und pro-inflammatorischen Genen herunterregulierte, während sie gleichzeitig anti-apoptotische Gene hochregulierte und CD68--positive Makrophagen verringerte und MPO-positive Neutrophile, die insgesamt zu einer reduzierten KIM-1-Expression und ATN und letztendlich zu einer erhaltenen Nierenmorphologie führten. Diese entzündlichen Zytokine sind bekanntermaßen Mediatoren des Zelltods während kalter IRI [31], und ihre Verringerung bei UW plus STS-Transplantaten ist wahrscheinlich auf die bekannten Eigenschaften von STS zurückzuführen, die Endothelpermeabilität in vaskulären Endothel-Monoschichten zu verringern und die Zytokinproduktion abzuschwächen und die Produktion von entzündungshemmenden Zytokinen hervorrufen [32]. Auch unser Befund, dass die STS-Ergänzung zu UW-Lösung die Expression entzündungsfördernder Gene herunterreguliert, stimmt mit dem einer früheren Studie über die entzündungshemmende Aktivität von STS überein, indem die Spiegel von TNF- und IL-6 bei neurologischen Erkrankungen reduziert werden [33 ,34]. Mechanistisch inaktiviert STS Caspase-3, indem es sich über starke Wasserstoffbrückenbindungen an sein aktives Zentrum bindet und dadurch den Zugang von natürlichem Substrat zum aktiven Zentrum verhindert und letztendlich die Apoptose stoppt [35]. STS blockiert auch die Aktivierung von JNK, einem Protein, das eine entscheidende Rolle bei der apoptotischen Signalübertragung spielt [35], was unsere Erkenntnisse über die herunterregulierende Wirkung von STS auf Caspase3 und JNK unterstützt. Wir können jedoch nicht feststellen, ob solche Mechanismen in der vorliegenden Studie wirksam sind, da wir keine zusätzlichen Experimente zur Erforschung dieser molekularen Mechanismen durchgeführt haben.

Eine wesentliche Einschränkung unseres In-vitro-Experiments ist unsere technische Herausforderung, die derzeitige Standardkonservierungstemperatur von 4 ◦C [36] zu verwenden, da die von uns verwendeten 10 ◦C die niedrigste Temperatur war, die technologisch erreicht werden konnte, ohne die hypoxische Umgebung zu gefährden. Dies ist ein echter Unterschied in Bezug auf zellphysiologische Prozesse und auch in Konservierungstechniken. Eine mögliche Lösung besteht darin, chemisch induzierte Hypoxie in einem Plastikbeutel zu verwenden und ihn in einen Kühlschrank mit 4 °C zu stellen, um die klinischen Bedingungen von SCS widerzuspiegeln. Diese Beutel zur Erzeugung anaerober Atmosphäre wurden jedoch für die Verwendung bei warmen Temperaturen (21–37 °C) entwickelt, da die chemischen Verbindungen, die die hypoxische Umgebung induzieren, unter diesen Bedingungen funktionieren. Zukünftige Studien sollten darauf abzielen, die Temperatur in der Hypoxiekammer zu optimieren, um klinische SCS-Einstellungen nachzuahmen. Das Erreichen einer konstanten Temperatur von 4 ◦C ohne Beeinträchtigung einer hypoxischen Umgebung ermöglicht es uns zu bestimmen, ob die beobachteten Phänotypen im experimentellen In-vitro-Kälte-IRI-Modell konsistent exprimiert werden. Abgesehen vom In-vitro-Experiment ist unser Rattentransplantationsmodell auch nicht ohne Nachteile. Wir haben eine syngene Nierentransplantation (genetisch identische Spender und Empfänger mit immunologischer Kompatibilität) durchgeführt, die nur für eineiige Zwillinge bei der klinischen Nierentransplantation anwendbar ist, während die meisten klinischen Nierentransplantationen allogen sind (genetisch unterschiedliche Spender und Empfänger). Die allogene Transplantation zwingt Transplantatempfänger, sich vor der Transplantation immunologischen Tests zu unterziehen, um die humanen Leukozytenantigene des Spenders (HLA; Moleküle, die die Immunantwort induzieren und regulieren) zu identifizieren, die immunologische Kompatibilität zwischen Spendern und Empfängern zu bestimmen und eine Organabstoßung zu vermeiden [37,38]. Zukünftige Studien mit STS sollten eine allogene Transplantation in Betracht ziehen. Eine weitere Einschränkung des Nierentransplantationsmodells ist die Tatsache, dass wir uns auf lebende Spender konzentriert haben. Suboptimale Transplantate von Spendern nach dem Herztod (DCD) werden in vielen Transplantationszentren weltweit immer häufiger als Quelle für Spendernieren verwendet [39]. DCD setzt Spenderorgane zusätzlich zu kalten ischämischen Zeiten während SCS verschiedenen Perioden warmer Ischämie aus und ist im Vergleich zu lebenden Spendern mit erhöhten DGF-Raten und verringertem Überleben des Transplantats verbunden [40]. Daher sollten zukünftige Studien das DCD-Nierentransplantationsmodell berücksichtigen, um die Wirkung von STS gegen IRI in diesem Modell zu bewerten.

Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass die Ergänzung einer Standard-Konservierungslösung mit einem klinisch brauchbaren H2S-Donor-Medikament während längerer SCS von Nierentransplantaten vor transplantatinduzierter kalter Nieren-IRI schützt, die Gesamtqualität und Funktion des Transplantats verbessert und das Überleben des Transplantatempfängers verlängert. In Anbetracht dessen, dass das DGF-Risiko mit verlängerter kalter ischämischer Zeit bei der klinischen Nierentransplantation zunimmt, was ein großes klinisches Problem aufwirft, bietet die Beobachtung, dass STS Nierentransplantate während längerer SCS schützt und DGF nach der Transplantation verhindert, ein großes klinisches Versprechen, das das verringern oder verhindern könnte Inzidenz von DGF bei klinischer Nierentransplantation in naher Zukunft. Daher könnte der zukünftige Vorteil des Hinzufügens von STS zu Konservierungslösungen eine potenzielle Lösung für dieses anhaltende Problem darstellen. Insgesamt trägt diese Studie zu der wachsenden Literatur bei, die die zytoprotektiven Wirkungen von STS und anderen H2S-Spendern gegen Organ-IRI unterstützt, insbesondere die Verbesserung der Transplantatergebnisse bei transplantationsinduzierter kalter renaler IRI. Diese Strategien könnten die Verwendung von mehr Transplantaten erleichtern, die verlängerten kalten ischämischen Zeiten ausgesetzt sind, was den Pool an transplantierbaren Organen erhöhen könnte.

CRediT-Urheberschaftsbeitragserklärung

Alle Autoren haben der Einreichung dieses Manuskripts zugestimmt. Es besteht kein Interessenkonflikt.

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