Untersuchung des östrogenähnlichen Mechanismus von Cistanche-Glykosiden mittels Metabolomics

Einführung

Östrogene spielen eine wichtige Rolle bei vielen entwicklungsbezogenen, physiologischen und verwandten Prozessen, einschließlich der Entwicklung der Gebärmutter.1–3 Allerdings kann die langfristige Einnahme von Östrogen viele Nebenwirkungen haben, wie zum Beispiel ein erhöhtes Risiko für Brustkrebs, Gebärmutterschleimhautkrebs und andere gynäkologische Tumoren.4,5 Daher haben sich Forscher auf die Suche nach Östrogenersatzstoffen gemacht, die diese Nebenwirkungen vermeiden könnten, sogenannte selektive Östrogenrezeptormodulatoren, zu denen Phytoöstrogene eine wichtige Kategorie darstellen.6 Phytoöstrogenverbindungen kommen natürlicherweise in Pflanzen mit Östrogenwirkung vor und können an Östrogenrezeptoren binden, um ihre Aktivität auszuüben. Daher könnten Phytoöstrogene das Uteruswachstum stimulieren, indem sie sich mit den reichlich vorhandenen Östrogenrezeptoren in der Gebärmutter verbinden, was bedeutet, dass der Uterotrophe-Assay für ein vorläufiges Screening und die Bewertung von Phytoöstrogenen verwendet werden könnte.

CistancheDeserticola (CD), in China als Rou Cong-Rong bekannt, ist angeblich wirksam für die Fortpflanzungs-, Entwicklungs- und Fruchtbarkeitsfunktionen und wird seit mehr als 1800 Jahren als Stärkungsmittel verwendet.8,9 Kürzlich haben pharmakologische Studien gezeigt, dass dies der Fall ist Tonikum hat breite medizinische Funktionen, wie zHormonregulierende, aperiente, immunmodulatorische, antioxidative, antiapoptotische, neuroprotektive, antinozizeptive, entzündungshemmende, ermüdungshemmende und östrogene Aktivitäten.10 Aus CD extrahierte Glykoside von Cistanche (GCs) gehören zu den wichtigsten aktiven Komponenten und weisen verschiedene biologische Aktivitäten auf.11 Obwohl die aktiven Bestandteile von CD bereits zuvor aufgeklärt wurden,12 wurde der östrogenähnliche Mechanismus von GCs nie untersucht.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUR VERHINDERUNG VON OSTEOPOROSE PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

In dieser fortlaufenden Studie wollten wir die mögliche Verwendung von GCs als Phytoöstrogene bestätigen und eine Metabolomics-Analyse durchführen, um den östrogenähnlichen Mechanismus von GCs zu untersuchen. Zunächst wurden ein Uterotrophentest und eine histologische Analyse durchgeführt, um die östrogene Aktivität von GCs zu bestätigen. Am wichtigsten ist, dass wir uns mithilfe der UPLC-MS/MS-basierten Metabolomikanalyse auf die Stoffwechselveränderungen im Rattenserum und -urin konzentrierten. Aufgrund der Mängel der nicht zielgerichteten Metabolomik, wie z. B. Wiederholbarkeit und komplizierter Matrixeinfluss, wurde eine auf dem MRM-Modus basierende Pseudomethode verwendet, um die Metaboliten und Indizes (einschließlich Energiestoffwechsel, oxidativer Stress, Lipidstoffwechsel und Aminostoffwechsel) gezielt zu überwachen. als Biomarker für den Nachweis ausgewählt. Unsere Ergebnisse geben Aufschluss über den östrogenähnlichen Mechanismus von GCs, der die Entwicklung und Nutzung von GCs unterstützen wird.

Experimental

Reagenzien

L-Leucin, L-Kynurenin, L-Tryptophan, 5-HTP, Cholsäure, Nphenylacetylglycin, 5-HT, Glutathion (GSH) und 2,4-Dinitrophenylhydrazin (99 $.{{ 8}} %, HPLC) wurden von Dalian Melone Biology Technology Co. (Dalian, China) erworben. N-Ethylmaleimid (98 %, HPLC), oxidiertes L-Glutathion (GSSG, 98 %, HPLC) und 1,1,3-3-Tetraethoxypropan (TEP) wurden von Sigma (Madrid, Spanien) bezogen. L-Phenylalanin (Ring-D5, 98 %, DLM-1258-5) wurde von Cambridge Isotope Laboratories (MA, USA) gekauft. Methanol und Acetonitril in MS-Qualität wurden von ACS (Houston, USA) bezogen. Diethylstilbestrol (Reinheit: 99,0 %), Ameisensäure, Eisessig sowie Hämatoxylin und Eosin (H&E) wurden von Sigma-Aldrich (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) bezogen. Naringenin (Reinheit, 98 % (HPLC)) wurde von Shanghai Jingchun Aladdin Reagent Co. (Shanghai, China) gekauft. GCs wurden in unserem Labor hergestellt und ihre Reinheit wurde durch Ultraviolettspektrophotometrie unter Verwendung von Acteosid als Marker für die Bestimmung auf 60 % bestimmt.

Vorbereitung von GCs

Briey,Cistanche-Pulver(100 g) wurde 1 Stunde lang in 75 %igem Ethanol (1000 ml) eingeweicht und dann dreimal 2,5 Stunden lang reuxextrahiert. Der Überstand wurde unter Vakuum konzentriert, um zu erhaltenCistanche-Extrakt(23,3 g). Der Extrakt wurde mit Wasser auf eine Konzentration von 0,5 g mL- 1 verdünnt (Löslichkeit bestimmt mit Rohdroge). Nach 8-stündiger Adsorption mit makroporösem AB-8-Harz wurde die Säule nacheinander mit Wasser und 85 % Ethanol eluiert. Das 85 %ige Ethanol-Elutionsmittel wurde konzentriert, um einen Ethanolextrakt (8,4 g) zu erhalten. Ethanolextrakt (0.02 g) wurde genau abgewogen und in 50 % Methanol (10 ml) gelöst. Ein 1-ml-Aliquot der Lösung wurde mit Methanol in einer volumetrischen Probe auf 100 ml verdünnt. Schließlich wurde die verdünnte Lösung bei 330 nm durch Ultraviolettspektrophotometrie gemessen. Die UV-Absorption betrug 0,341 und die lineare Beziehung für Acteosid durch UV betrug y=24,905X + 0,0426 (R2=0,9982). Bei einem Gehalt von 5,04 g GCs betrug die Reinigungsrate 60 % (Acteosid wurde als Marker für die GC-Bestimmung verwendet). Die Fingerabdruckauswertung der GCs ist in ESI Abb. S1 dargestellt.

Tierversuche und Probensammlung

Weibliche SD-Ratten mit sexueller Unreife (45–60 g) und sexueller Reife (320–380 g) wurden vom Animal Center der Harbin Medical University, Labortierlizenz, SCXK- (Armee): 2013-001 zur Verfügung gestellt. Die Tiere wurden unter SPF-Laborbedingungen gehalten und ad libitum mit normalem Leitungswasser mit veränderter Laborernährung versorgt. Alle Tierversuche wurden von den Tierschutz- und Pflegerichtlinien der Provinz Heilongjiang genehmigt und gemäß den Richtlinien des National Institute of Health zu den Grundsätzen der Tierpflege (2004) durchgeführt. Alle in diesem Experiment verwendeten Ratten wurden eine Woche lang an die oben genannte Umgebung gewöhnt.

Die sexuell unreifen SD-Ratten wurden zufällig in drei Gruppen von 10 Ratten eingeteilt: Blindgruppe, Diethylstilbestrol-Gruppe und GC-Gruppe. In der Zwischenzeit wurden 10 geschlechtsreife SD-Ratten als Kontrollgruppe ausgewählt. Der Diethylstilbestrol-Gruppe wurde ig mit Diethylstilbestrol (0,35 mg kg- 1, 1 ml/100 g) verabreicht, der GC-Gruppe wurde ig mit der GC-Lösung (30 g kg- 1, 1 ml/100 g) verabreicht ), und die Blindgruppe und die Kontrollgruppe erhielten 3 Tage lang zweimal täglich (morgens und abends) destilliertes Wasser der gleichen Menge. Am dritten Tag wurden die Ratten nach der Verabreichung in Stoffwechselkäfigen gehalten und 24 Stunden lang kontinuierlich Urinproben gesammelt. Die Ratten wurden mit Pentobarbital anästhesiert und Blutproben wurden aus der Bauchaorta entnommen und bei 3000 × g (15 Min., 4 °C) zentrifugiert, um Serum zu erhalten. Alle Proben wurden bei - 20 gelagert. C. Darüber hinaus wurde die Gebärmutter abgetrennt, gewogen und mit 10 % Formalin untersucht.

Histologische Analyse

Aus der Gebärmutter wurden mehrere 5 mm dicke Gewebe geschnitten. Die Gewebeschnitte wurden dann in Paraffin eingebettet, mit Routinemethoden mit H&E gefärbt und mit einem optischen Mikroskop (BZ-9000; Keyence, Osaka, Japan) beobachtet. Die Höhe der Uterusepithelzellen wurde mit einem Mikrometer unter dem Mikroskop gemessen.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUR FÖRDERUNG DES BRUSTWACHSTUMS PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Metabolomik

Herstellung eines mit Aktivkohle befreiten Serums

Aus Rattenserum, das mithilfe von Aktivkohlepulver von endogenen Stoffen befreit worden war, wurde ein spezielles Blindserum hergestellt. Aktivkohlepulver (6 g) wurde dem Rattenserum (1 00 ml) zugesetzt, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt und bei 4 °C zentrifugiert. C und 13 500 U/min für 20 Minuten. Der Überstand wurde unter Verwendung von Millipore-Express-PES-Membranen (Merck Millipore, Ltd.), die an einer 20-ml-Spritze befestigt waren, in der folgenden Reihenfolge verändert: 5 mm, 1,2 mm und 0,45 mm. Das „gestrippte“ Serum wurde durch LC-MS/MS als frei von Biomarkern bestätigt.

Erstellung von Standardlösungen

L-Tryptophan (Try), L-Kynurenin (Kyn), GSSG, N-Phenylacetylglycin (N-Phe), 5- HTP, L-Leucin (Leu), 5-HT und Cholsäure ( CA) Stammlösungen (1 mg mL- 1) ​​wurden mit 100 % Methanol hergestellt. GSH wurde mit 0,5 mg mL- 1 in 10 mM NEM PBS-Puffer hergestellt und bei - 40 gelagert. C in braunen Flaschen. Kalibratoren wurden unter Verwendung einer Kombination aus L-Tryptophan, L-Kynurenin, GSSG, N-Phenylacetylglycin, 5-HTP, L-Leucin, 5-HT, Cholsäure und GSH-NEM erzeugt, die seriell mit destilliertem Wasser verdünnt wurden Wasser. Die IS-Stammlösung von L-Phenylalanin-d5 (d5-Phe) wurde in 100 % Methanol hergestellt, und die Arbeitslösung von d5-Phe (10 ng mL- 1) wurde hergestellt in 100 % Methanol und bei - 40 gelagert. C.

Während der Analyse war ein Derivatisierungsschritt notwendig, um einen GSH-Abbau zu vermeiden, was die Stabilität für den Nachweis und die Quantifizierung von GSH verbesserte. GSH wurde nach Reaktion mit NEM bestimmt.15,16 Dem vorherigen Bericht zufolge wurde 50 mM NEM für GSH ausgewählt.

Probenvorbereitung

Für Serumproben wurden 10 mM NEM (200 ml) zu der Probe (200 ml) gegeben, gefolgt von Methanol (1000 ml mit 10 ng mL IS Phe-d5- 1) und 20 Minuten bei - 1 inkubiert. {9}}. C. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 4 °C und 12 000 U/min wurden die Überstände (1000 ml) in 2-ml-Zentriöhrchen überführt und zur Trockne eingedampft. Der getrocknete Rückstand wurde nach 15-minütiger Zentrifugation bei 4 °C in destilliertem Wasser (100 ml) rekonstituiert. C und 13 500 U/min, und ein 10-ml-Aliquot des Überstands wurde zur Analyse injiziert.

Für Urinproben wurden 100 ml der Probe in ein 2-ml-Röhrchen gegeben und jeder Urinprobe wurde 1 Volumen PBS (m/v) mit 50 mM NEM zugesetzt. Dann wurde Methanol (1000 ml mit 10 ng ml - 1 IS) zugegeben und die Probe bei - 20 inkubiert. 20 Minuten lang bei C zentrifugiert und dann 10 Minuten lang bei 4 °C bei 12 000 U/min zentrifugiert. C. Der Überstand (1000 ml) wurde unter einem sanften Stickstoffstrom bei Raumtemperatur zur Trockne eingedampft, und dann wurde der Rückstand in 60 ml mobiler Phase gelöst und 1 Minute lang gevortext, bevor er bei 13 500 U/min und 4 zentrifugiert wurde . C für 15 Min. Zur Analyse wurde ein aliquoter Überstand von 10 ml injiziert.

Validierung der Methodik

Die Assay-Validierung wurde gemäß den „Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation“ (Food and Drug Administration, September 2013) durchgeführt. Die Kalibratoren wurden unter Verwendung einer Ersatzmatrix für Trp, Kyn, GSH, GSSG, 5-HT, 5-HTP, N-Phe und CA aus Standardarbeitslösungen im „gestrippten“ Serum generiert. Jeder Konzentrationskalibrator wurde dupliziert. Die Standardkurve wurde durch 1/X-gewichtete lineare Regression der kleinsten Quadrate der Standardkurven-Kalibratorkonzentrationen und der Peakflächenverhältnisse für den Analyten zu IS berechnet.

Präzisions- und Richtigkeitstest

Die Assay-Präzisionen gepoolter QC-Proben und unbehandelter Rattenserum-/-urin-QC-Proben wurden anhand eines analytischen Laufs innerhalb eines Tages und dreier analytischer Läufe zwischen den Tagen bewertet. Die QC-Proben mit drei verschiedenen Konzentrationen wurden durch Zugabe von L-Tryptophan, L-Kynurenin, GSSG, N-Phenylacetylglycin, 5-HTP, L-Leucin, 5-HT, Cholsäure und GSH-NEM erzeugt Standardlösungen zu „gestripptem“ Serum/PBS, die dann auf die gleiche Weise wie In-vivo-Proben verarbeitet wurden. Try-, Kyn-, GSSG-, N-Phe-, 5-HTP-, 5-HT-, Leu- und CA-Standard-Stammlösungen (1 mg mL- 1) wurden in 10 hergestellt. 0 % Methanol, außer GSH, das mit 0,5 mg mL- 1 in 10 mM NEM PBS-Puffer hergestellt wurde. Standardkurven bei acht verschiedenen Konzentrationen wurden auf die gleiche Weise wie QC-Proben erstellt und durch 1/X-gewichtete lineare Regression der kleinsten Quadrate analysiert. Für die Methodenvalidierungsstudie wurde gleichzeitig eine weitere QC-Methode durchgeführt, wobei gepooltes Serum/Urin (50 ml) aus jeder Probe der Kontroll- oder Modellgruppen verwendet wurde, um eine QC-Probe zu erhalten und diese dann wie In-vivo-Proben zu verarbeiten. Für jeweils 50 Tierproben wurde eine Reihe von QC-Proben und Standardkurven erstellt.

Matrixeffekte

Die Matrixvariation, definiert als die Variation der Assaygenauigkeit für verschiedene Matrixchargen, wurde anhand von sechs verschiedenen Parzellen mit versetztem Rattenserum/-urin zur Analyse und Bewertung der dotierten Wiederfindung bewertet.17 Die Bewertung des gesamten Matrixeffekts für einen endogenen Verbindungstest ist eine Herausforderung . Eine Möglichkeit zu testen, ob ein Assay einen (Gesamt-)Matrixeffekt hat, besteht darin, die erhöhte Wiederfindung zu bewerten. Beim Spiked-Recovery-Test wird der Analyt in Proben vor der Extraktion dotiert. Dies unterscheidet sich vom Test der Matrixfaktoren (MF), bei dem der Analyt in Proben nach der Extraktion dotiert wird.18 Der MF wurde als Peakfläche des Analyten in berechnet das Vorhandensein einer biologischen Matrix im Vergleich zum Fehlen einer biologischen Matrix. Es wurde der IS-normalisierte MF verwendet: MF ¼ Peakfläche/IS-Verhältnis in Gegenwart einer Matrix vs. Peakfläche/IS-Verhältnis in Abwesenheit einer Matrix.

UPLC-MS/MS-Analyse

Für die LC-MS wurde eine MS-Ausrüstung verwendet, die mit einer analytischen Säule XP Waters /MS-Analyse. Die mobile Q-Phase mit linearem Gradienten, bestehend aus 0,1 % Ameisensäure, Wasser (Lösungsmittel A) und Methanol (Lösungsmittel B), wurde gemäß dem folgenden Gradientenprogramm verwendet: 0–3.0 min (0–1 % B); 3.0–10.0 min (1–3 % B); 10.0–14.0 min (3–50% B); 14.0–18,0 Min. (50–95 % B); 18,0–22,0 Min. (95–0 % B), die Stoppzeit beträgt 25 Min. Das Injektionsvolumen betrug 10 ml und die Rate betrug 0,6 ml pro Minute- 1. Die letzte Methode verwendete die folgenden Parameter: Scantyp, MRM; Ionenmodus, Elektrospray-Ionisation (ESI) im positiven und negativen Ionenmodus; Ionensprühspannung, ± 4500 V; Vorhanggas, 20; Temperatur: 450 °C; Ionenquellengas 1, 40; Ionenquellengas 2, 40. Alle UPLC-MS-Daten wurden mit der AB Analyst-Software (Version 1.6.2) erhalten und das m/z 171,1–125,2 für den internen Standard d5-Phe (DP, 63 V; CE). , 8 V; CXP, 21 V; EP, 24 V) und detaillierte MS-Bedingungen sind in Tabelle S1 aufgeführt.

statistische Analyse

Alle Werte wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde durch einen einfachen ANOVA-Test verglichen, gefolgt von Dunnetts Test unter Verwendung des Statistical Package for Social Sciences-Programms (SPSS 20.0, Chicago, IL, USA). Die Signifikanzschwelle wurde in diesem Test auf p < 0,05 festgelegt.

Resultate und Diskussion

Wirkung von GCs auf die Gebärmutter

Uterusgewicht und histologische Analyse wurden verwendet, um die Wirkung von GCs auf die Gebärmutter zu bewerten. Das Uterusgewicht war in der Diethylstilbestrol-, GC- und Kontrollgruppe im Vergleich zur Blindgruppe signifikant erhöht (P < {{0}}.01). In der Blindgruppe war das Endometriumepithel niedrig säulenförmig mit kleinen Drüsen, einem kubischen Drüsenepithel und ohne interstitielle Entzündungszellen. In der Diethylstilbestrol-Gruppe waren das Drüsenepithel und das Endometrium hochsäulig und zeigten eine Hyperplasie mit vielen interstitiellen Entzündungszellen. In der GC-Gruppe waren das Drüsenepithel und das Endometrium stark säulenförmig gezahnt und zeigten eine Hyperplasie mit vielen interstitiellen Entzündungszellen und einer Intimaverdickung. In der Kontrollgruppe war das Endometrium hochsäulig und das Drüsenepithel niedrig säulig, mit wenigen interstitiellen Entzündungszellen. Im Vergleich zur Blindgruppe war die Höhe der Uterusepithelzellen in den anderen Gruppen signifikant erhöht (P < 0,01) (Abb. 1).

Methodenvalidierung des nachgewiesenen Biomarkers mittels UPLC-MS/MS

Linearität und Kalibrierbereich

Für jede Messung wurde eine lineare Kalibrierungskurve mit einem Gewichtungsfaktor von 1/X in der untersuchten Matrix erstellt. Die Eichkurven für Analysen im Serum wurden an verschiedenen Tagen analysiert. Die Kalibrierungsbereiche für die Analysen wurden auf sieben Kalibrierungspunkte verteilt, wie in Tabelle 1 dargestellt.

Genauigkeit und Präzision. Die Methode erwies sich im Hinblick auf Genauigkeit und Präzision sowohl im Tages- als auch im Tagesverlauf für alle untersuchten Proben als geeignet. Die Werte dieser Parameter lagen bei den eingestellten Konzentrationen für GSH, GSSG, Leu, Trp, Kyn, 5-HTP, Cholsäure, 5-HT und N-Phenylacetylglycin bei drei Wiederholungen unter 5 % jeder analysierten Konzentration. Die Daten, die den Interday- und Intraday-Werten für Genauigkeit und Präzision entsprechen, sind in der ESI-Tabelle S2 aufgeführt.

Matrixeffekte

Wie in der ESI-Tabelle S3† gezeigt, betrugen die Spitzenausbeuten 92,5–118,1 %, wenn 1000 ng ml - 1 GSH, 2000 ng ml - 1 GSSG und 1000 ng ml - 1 Leu hinzugefügt wurden , 6000 ng ml- 1 Trp, 50 ng ml- 1 Kyn, 2 ng ml- 1 5-HTP, 400 ng ml- 1 Cholsäure , 8 ng ml- 1 5-HT und 2500 ng ml- 1 N-Phenylacetylglycin in drei verschiedene Parzellen Rattenserum und bei Zugabe von 100 ng ml- 1 GSH, 200 ng ml- 1 GSSG, 1000 ng ml- 1 Leu, 6000 ng ml- 1 Trp, 50 ng ml- 1 Kyn, 2 ng ml{ {37}} von 5-HTP, 400 ng ml- 1 von Cholsäure, 8 ng ml- 1 von 5-HT, 2500 ng ml- 1 von N -Phenylacetylglycin in drei verschiedene Parzellen von Rattenurin mit unterschiedlichen Ausgangswerten. Die CVs der gemessenen Trp- und Kyn-Konzentrationen dieser Chargen betrugen #10 % (n=5). Diese Ergebnisse zeigten, dass unterschiedliche Matrizen den Test nicht wesentlich beeinflussten.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUR VORBEUGUNG VON GEBÄRMUTTERKREBS PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Analyse der Metabolitenprofilierung mittels pseudozielgerichteter Methode

Die pseudotargetierte Methode wurde genutzt, um die MRM-Proliferation von Serum- und Urinmetaboliten in vier Gruppen (Leerwert, Diethylstilbestrol, Kontrolle und GC) zu untersuchen.

Erstens wurde das PCA-Modell entwickelt, um die metabolische Unterscheidung der vier Gruppen darzustellen. Aus der multivariaten Analyse ergaben sich offensichtliche metabolische Unterschiede zwischen den GC-Gruppen (einschließlich Diethylstilbestrol und Kontrollgruppen) und der Blindgruppe. Die QC-Proben gruppierten sich im PCA-Score-Diagramm eng zusammen, was darauf hinwies, dass die Systemstabilität für diese Metabolomics-Studie akkommodierend war (Abb. 2).

Anschließend wurde der kritische P-Wert für signifikant unterschiedliche Metaboliten in dieser Untersuchung auf 0,05 festgelegt. Dementsprechend wurden, wie in Tabelle 2 gezeigt, unterschiedliche Metaboliten im Vergleich zur Blindgruppe vorläufig wie folgt identifiziert: 17 in Serumproben und

12 in Urinproben der GC-Gruppe, 15 in Serumproben und 9 in Urinproben der Diethylstilbestrol-Gruppe, 12 in Serumproben und 11 in Urinproben der Kontrollgruppe und 11 in Serumproben und 7 in Urinproben, die gleichzeitig in der GC-, Diethylstilbestrol- und Kontrollgruppe vorhanden waren. Um die metabolischen Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen besser zu verstehen, wurde für alle unterschiedlichen Metaboliten eine Cluster-Heatmap erstellt, die die relative Zunahme (rot) oder Abnahme (grün) zeigt (Abb. 3).

Achtzehn unterschiedliche Metaboliten, die gleichzeitig in der GC-, Diethylstilbestrol- und Kontrollgruppe vorhanden waren, wurden als beschrieben

wie folgt: Glucose, Zitronensäure, Prolin, Betain, Ornithin, N-Phenylacetylglycin, Phenylbrenztraubensäure, Inosin, C16:0LPC, Kreatinin und Xanthosin im Serum sowie Benzolacetylglycin, Pyroglutaminsäure, Acetylcarnitin und N6-Acetyllysin im Urin waren signifikant verringert (P < 0.05); während Taurin, Ornithin, α-Ketoglutarsäure und Spermidin im Urin signifikant erhöht waren (P < 0.05). Zusätzlich war Taurin (Serum) signifikant erhöht, während α-Ketoglutarsäure (Serum), C18:0LPC (Serum) und Betain (Urin) in den Diethylstilbestrol- und GC-Gruppen signifikant verringert waren (P < 0.05); L-Kynurenin (Serum) war in der Diethylstilbestrol-Gruppe hochreguliert, in der GC-Gruppe jedoch herunterreguliert (P < 0,05). Pyroglutaminsäure (Serum) und Prolin (Urin) waren herunterreguliert und Zitronensäure (Urin) und Nicotinamid (Urin) waren in der Kontroll- und GC-Gruppe deutlich erhöht (P < 0,05). Phenylalanin war in der GC-Gruppe herunterreguliert (P < 0,05).

In dieser Studie wurden die Auswirkungen von GCs auf die Gebärmutter unreifer Ratten untersucht. Die Gebärmutter ist das empfindlichste Organ für die Untersuchung der ER-abhängigen Wirkung von Chemikalien.Herba CistanchesEs wurde berichtet, dass es eine Zunahme des Uterusgewichts induziert, indem es die Lutropin-Freisetzungsfunktion des Hypothalamus, der Hypophyse und des Eierstocks verstärkt,20 was in dieser Studie auch für GCs beobachtet wurde. Dies deutete darauf hin, dass GCs eine östrogenähnliche Aktivität aufweisen. In jüngster Zeit konzentrierten sich Berichte hauptsächlich auf den vorherrschenden Mechanismus, durch den östrogene Wirkungen durch Bindung an die ERs ausgedrückt werden,21–23, aber der Stoffwechselmechanismus wurde nicht eingehend untersucht. In dieser Studie wurde eine Pseudometabolomics-Methode verwendet, um den östrogenähnlichen Mechanismus von GCs zu untersuchen.

Stoffwechselintermediate einer aufeinanderfolgenden Reaktionsreihe veränderten sich stärker als die enzymatische Kinetik oder individualisierten.24 Siebzehn Metaboliten im Serum, darunter Glucose, Zitronensäure, Taurin, Prolin, Betain, Ornithin, Pyroglutaminsäure, a-Ketoglutarsäure, N- Phenylacetylglycin, Phenylpyruvatsäure, Inosin, C18:0LPC, C16:0LPC,

Kreatinin, Phenylalanin, L-Kynurenin und Xanthosin sowie 12 Metaboliten im Urin, darunter Benzol, Acetylglycin, Betain, Taurin, Zitronensäure, Ornithin, Pyroglutaminsäure, Acetylcarnitin, N6-Acetyllysin, Nicotinamid, a-Ketoglutarsäure Es wurde festgestellt, dass Säure, Spermidin und Prolin am östrogenähnlichen Mechanismus von GCs beteiligt sind. Mehrere veränderte Metaboliten waren von besonderem Interesse, da sie sowohl im Serum als auch im Urin vorhanden waren. Beispielsweise wurde Zitronensäure, die durch die Kondensation von Acetyl-Coenzym A und Oxalessigsäure entsteht und eine wichtige Rolle im Zitronensäurezyklus im Zusammenhang mit dem Energiestoffwechsel spielt,25 im Serum der GC-Gruppe herunterreguliert, im Urin jedoch hochreguliert . Darüber hinaus wurde a-Ketoglutarsäure mit einem Glutamin-Kohlenstoff-Gerüst, das das Gesamtstickstoffgleichgewicht aufrechterhalten und die Proteinsynthese fördern kann und das zentrale Material des Zitronensäurezyklus ist, im Serum der GC-Gruppe herunterreguliert, jedoch hochreguliert im Urin.26 Der Zitronensäurezyklus ist nicht nur der letzte Stoffwechselweg der drei Hauptnährstoffe (Kohlenhydrate, Lipide und Aminosäuren), sondern auch die Verbindung zwischen Zucker-, Lipid- und Aminosäurestoffwechsel und der Hauptweg zur Energiegewinnung für den Körper.27,28 Dies zeigte, dass der östrogenähnliche Mechanismus von GCs mit dem Energiestoffwechsel zusammenhängt, der mit dem von Diethylstilbestrol identisch ist. Daher bestand ein klarer Zusammenhang zwischen dem Zitronensäurezyklus und der Zunahme des Uterusgewichts bei unreifen Ratten, die mit GCs behandelt wurden. Als wichtiger Methylspender spielt Betain eine wichtige Rolle beim Wachstum und der Entwicklung des Fötus, was darauf hindeutet, dass Betain an der Zunahme des Uterusgewichts beteiligt ist.29 Interessanterweise wurde Taurin sowohl im Serum als auch im Urin hochreguliert, was die Lipidverdauung und -absorption fördern könnte und Zellaufnahme und -verwertung von Glukose durch Förderung des Glukosestoffwechsels. Es wurde auch berichtet, dass Taurinmangel bei jungen Tieren zu Gewichtsverlust führt, was darauf hindeutet, dass Taurin eine wichtige Rolle bei Wachstum und Entwicklung spielt.30 Darüber hinaus folgte die Regulierungswirkung von Betain und Taurin durch GCs dem gleichen Trend bei Verwendung von Diethylstilbestrol, jedoch mit einer verstärkten Wirkung Wirkung im Vergleich zu Diethylstilbestrol.

Darüber hinaus waren zahlreiche Aminosäuren deutlich verändert. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass GCs Stoffwechselanomalien bei Aminosäuren verursachten. Der Aminosäurestoffwechsel könnte für die Synthese spezifischer Proteine, Peptide und anderer stickstoffhaltiger Verbindungen oder für die Decarboxylierung durch Desaminierung, Transaminierung, kombiniert mit der Ammoniakzersetzung oder für die Energiefreisetzung durch den Zitronensäurezyklus genutzt werden.31,32 Daher sind Änderungen hiervon erforderlich Verbindungen können an den wichtigen Signalereignissen beteiligt sein, die die Zunahme des Uterusgewichts auslösen.

Darüber hinaus wurden für eine detaillierte Stoffwechselweganalyse die unterschiedlichen Metaboliten in mehrere Hauptwege eingeteilt, darunter der Citratzyklus (TCA-Zyklus), der Glutathionstoffwechsel,

Arginin- und Prolin-Metabolismus, D-Glutamin- und D-Glutamat-Metabolismus, Biosynthese von Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan, Phenylalanin-Metabolismus und andere Wege mithilfe der Pathway-Analyse der MetaboAnalyst-Software (http://www.metaboanalyt.ca), wie gezeigt in Abb. 4. Der mit dem Energiestoffwechsel verbundene Weg, einschließlich des TCA-Zyklus und des Glutathionstoffwechsels (sowohl im Serum als auch im Urin), war eines der Hauptziele östrogener Wirkungen. Die entscheidende Rolle östrogener Chemikalien im Energiestoffwechsel wurde anhand früherer Studien durch ERs bestätigt, die die für die Mitochondrienfunktion, den TCA-Zyklus und mehr erforderlichen Gene regulieren.33,34 Daraus konnte geschlossen werden, dass der östrogenähnliche Mechanismus von GCs ähnlich war mit dem von Diethylstilbestrol, wobei beide in gewissem Maße mit dem TCA-Zyklus und dem Glutathionstoffwechsel zusammenhängen, wobei GCs jedoch eine bessere Leistung erbringen als Diethylstilbestrol.

Obwohl die möglichen Mechanismen in dieser Studie nicht geklärt werden konnten, wurden einige Metaboliten ausgewählt, die zur Erforschung anderer östrogener Mechanismen von GCs in der Gebärmutter in der Zukunft verwendet werden könnten. Um den Mechanismus besser zu erforschen, werden daher in der zukünftigen Forschung andere Technologien wie die Proteomik eingesetzt.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine auf UPLC-QTRAP MS basierende pseudotargetierte Metabolomik-Methode für Serum und Urin zur Erforschung der östrogenähnlichen Mechanismen von GCs entwickelt wurde, die robuste und zuverlässige Ergebnisse lieferte. Unter Verwendung des etablierten pseudotargetierten Ansatzes wurde eine ganzheitliche Sicht auf die Veränderungen der Serum- und Urinmetabolomik des östrogenähnlichen Mechanismus (GCs) ermöglicht.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUR VERBESSERUNG DER SEXUELLEN FUNKTION PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %