Studie zur neuroendokrinen Immunfunktion von Cistanche Deserticola und seinen Reiswein-Dampfprodukten im Glucocorticoid-induzierten Rattenmodell

Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com

Bonan Liu, Ji Shi, Zhe Li, Chao Zhang, Pengpeng Liu, Wei Yao und Tianzhu Jia

1 School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China

2 Zweites Krankenhaus der Medizinischen Universität Dalian, Dalian 116600, China

Abstrakt

Die WüstenwohnungCistanche-Krautwurde erstmals in „Shen Nong Herbal Classic“ aufgenommen und wird in dieser Veröffentlichung als erstklassige Kräutermedizin aufgeführt. /e Chinesisches Arzneibuch zeichnet diese Stücke auf Cistanche Deserticola(CD) und Reiswein gedämpftCistanche Deserticola(WCD) können in der Klinik als Hauptarten von Abkochungen verwendet werden. Nach dem Dämpfen mit Reiswein wird die Anti-Aging- und tonisierende Nieren-Yang-Wirkung verstärkt. In dieser Studie haben wir den chemischen Inhalt von Cistanche Deserticola und WCD und den pharmakologischen Mechanismus der Stärkung des Nieren-Yang-Mangels in Modellratten nachgewiesen. Ziel. Der Zweck dieser Studie war es, die Wirkungen von Cistanche Deseticola und WCD auf die neuroendokrinenImmunfunktionvon Nieren-Yang-Mangel bei Glucocorticoid-überdosierten Modellratten. Materialen und Methoden. Sprague Dawley (SD) Ratten wurden ausgewählt. /e-Ratten wurde subkutan eine Corticosteron-Wasser-Suspension für die Glucocorticoid-überdosierten Modellratten injiziert. /e positive Kontrollratten wurden mit Jinkuishenqi-Pillen und hoher, mittlerer und niedriger Dosis per Sonde versorgtCistanche Deserticola/WCD-Suspensionen (1,646 g/(kg Tag), 5,48 g/(kg Tag), 2,74 g/(kg Tag) bzw. 1,37 g/(kg Tag); Den Blindkontroll- (BC) und Modellkontrollgruppen (MC) wurde an 40 aufeinanderfolgenden Tagen in einer Dosis von 1 ml/100 g das gleiche Volumen an destilliertem Wasser wie in der Arzneimittelgruppe verabreicht. Nach der letzten Verabreichung wurde das Blut aus der abdominalen Aorta entnommen und die Serumspiegel von T, CRH, ACTH, CORT, Cortisol, IL-10, IL-6, IL-2, TNF bestimmt - und IFN-c gemessen. Organindizes der Thymusdrüse und der Milz wurden berechnet. Die Expression von Bax, Bcl-2, Caspase-3, Fas und FasL in der Nebenniere wurde durch Immunhistochemie gemessen. /e pathologische Veränderungen in der Thymusdrüse und der Nebenniere wurden durch HE-Färbung (x200) beobachtet. Untergruppen von T-Lymphozyten im peripheren Blut wurden durch Fellow-Zytometrie nachgewiesen, und die Expression von CaM-mRNA in den Geweben des Hypothalamus und der Hypophyse wurde auch durch RT-PCR gemessen. Ergebnisse. Verglichen mit der MC-Gruppe zeigten die Cistanche-Deserticola- und WCD-Gruppen Erhöhungen der Aktivität, des Organindex des Thymus und der Milz, der Serumspiegel von T, CRH, ACTH, CORT, Cortisol, IL-2 und IL -10, das Verhältnis von CD4 plus /CD8 plus und die Expression von Bcl-2, Caspase-3, Fas, FasL und CaM im Hypophysengewebe. /eCistanche Deserticolaund WCD-Gruppen zeigten auch Reduktionen der IL-6-, TNF- und IFN-c-Spiegel im Serum und der Expression von CaM-mRNA im Hypothalamus. Schlussfolgerungen. Jede Gabe von Cistanche Deseticola und WCD könnte den fehlregulierten Sexualhormonen und Immunfaktoren bei Glukokortikoid-überdosierten Modellratten entgegenwirken, die Wirksamkeit der Nervenzellen des Hypothalamus verstärken und wiederherstellen und sich verbessernImmunfunktion.

Einführung

Cistanche Deserticola, der „Wüstenginseng“ genannt wird, ist eine traditionelle chinesische Medizin, die seit Jahrhunderten als Yang-Stärkungsmittel zur Stärkung der Nieren und zur Stärkung des Yang verwendet wird [1]. Acht Arten und eine Variation von Cistanches Herba wurden in China nachgewiesen und nur Cistanche deserticola YC Ma und Cistanche tubulosa (Schenk) Wight sind im Chinesischen Arzneibuch verzeichnet [2]. Pharmakologische Studien zeigten, dass Cistanches Herba neuroprotektiv [3], immunmodulatorisch [4], kardioprotektiv [5], ermüdungshemmend [6], entzündungshemmend [7], hepatoprotektiv [8], antioxidativ [9], antibakteriell [10] und abführend wirkt [11] und Antitumorwirkungen [12]. Das breite Spektrum der berichteten biologischen Aktivitäten dieser Gattung wurde der komplexen und vielfältigen phytochemischen Zusammensetzung zugeschrieben. Cistanche deserticola enthält Phenylethanoidglykoside, Iridoide, Polysaccharide [13] usw. Der Gehalt an Phenylethanoidglykosiden ist der höchste in den ursprünglichen medizinischen Materialien [14]. Die Verarbeitung von chinesischer Materia Medica (CMM) ist eine traditionelle pharmazeutische Technik, um die unterschiedlichen Anforderungen zu erfüllen zur Behandlung, Abgabe und Herstellung von Präparaten nach der Theorie der traditionellen chinesischen Medizin. Diese verarbeiteten Produkte werden Abkochungsstücke genannt, die in Kliniken verwendet werden. /Die Ziele der Verarbeitung sind die Steigerung der Wirksamkeit und/oder die Verringerung der Toxizität von Roharzneimitteln. Das Chinesische Arzneibuch von 2015 verzeichnete, dass dicke Cistanche-Scheiben (CD) und mit Reiswein gedämpfte Cistanche (WCD) als Abkochungsstücke in der Klinik verwendet werden könnten. Unsere Forschungsgruppe zeigte, dass die abführende Wirkung gelindert und die Anti-Aging- und Nieren-Yang-belebende Wirkung verstärkt wurden, nachdem Cistanche mit Reiswein gedämpft wurde [15].

Die Funktion der Achse Hypothalamus-Hypophyse-Nebennieren-Thymusdrüse (HPAT) ist beim Nieren-Yang-Mangel-Syndrom gestört [16]. Patienten mit Nieren-Yang-Mangel haben auch eine ausgedehnte Immunfunktionsstörung. Eine Dysfunktion der HPA-Achse steht in engem Zusammenhang mit einer Immunschwäche. Die Theorie des neuroendokrinen Immunnetzwerks (NEI) zeigt, dass das Immunsystem und das neuroendokrine System viele Liganden und Rezeptoren gemeinsam haben [17], und der Hypothalamus gilt als Dreh- und Angelpunkt für die Verbindung des neuroendokrinen mit dem Immunsystem.

In dieser Studie replizierten wir den Nieren-Yang-Mangel in Modellratten mit exogener Corticosteroid-Injektion und untersuchten den Mechanismus des Nieren-Yang-Mangels als Reaktion auf verschiedene verarbeitete Produkte von Cistanche deserticola aus der Perspektive der endokrinenImmunfunktion.

Materialen und Methoden

Materialien und Reagenzien.

Cistanche Deserticolawurde 2019 von Alashan Neimenggu gesammelt.5 und von Prof. Yanjun Zhai (School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, China) als die getrockneten fleischigen Stängel von Cistanche deserticola YC Ma identifiziert. Die Belegexemplare wurden im Liaoning Processing Engineering Technology Center aufbewahrt.

Standardverbindungen eines Jugols wurden von Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, China) bezogen; Cistanosid F, Echinacosid, Cistanosid A und Isoacteosid wurden von Must Company (Sichuan, China) bezogen; Acteosid wurde von Dalian Meilun Bio bezogen. Co., Ltd. (Dalian, China). Acetonitril und Methanol in MS-Qualität wurden von Merck KGaA (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Ameisensäure in HPLC-Qualität wurde von Merck KGaA (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Reiswein wurde von Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, China) bezogen.

Corticosteron (CAS: 50-22-6, Reinheit > 98 Prozent, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), Chinkuei-Shin-Chewan-Pillen (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), Ratten-ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}-, IFN-c-, TNF-, IL-2- und IL-10-ELISA-Nachweiskits wurden von Nanjing Jian cheng Co., Ltd. erworben. /e Ratten-Cortisol-ELISA-Kit wurde von BOSK Co ., Ratten-CD4-Antikörper, CD8a-Antikörper (Nr. 561833 und 559976), RBC-Lysat (Solarbio, R1010), PBS-Pufferlösung (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM und -Actin stromaufwärts und Downstream-Primer wurden vom Guangzhou Invitrogen Co. Reverse Transcription Kit (Nr. RR037A) und cDNA Synthesis Kit (Nr. 10000068167) wurden von Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. bereitgestellt. Chloroform, Isopropanol, 75 % Ethanol, und Urethanlösung waren alle analytisch rein und wurden von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. hergestellt. Ultrareines Wasser wurde von dem Milli-Q-System (18,2 MΩ, Millipore, MA, USA) hergestellt.

Experimentelle Instrumente

Ein Enzymmarker (Thermo, Modell 3530911931), automatischer Plattenwascher (Modell HBS- 4009), Push-Pull-Kraftmesser mit Digitalanzeige (Modell VICTOR- 50N), Hochgeschwindigkeits-Gefrierzentrifuge (Modell Sigma 3k15 ), Ultramikrospektrophotometer (Modell B-50Q), Genverstärker (Modell L96G), quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR (Modell StepOne), Durchflusszytometer (Modell AC66051710132), Paraffinmikrotom (Modell Laika), Mikroskop (Olympus , Modell BS-53) und ein Reinwasserinstrument (Modell F7JA36507) verwendet.

Probenvorbereitung für UPLC-Q-TOF-MS und pharmakologische Experimente.

WCD wurde in unserem Labor aus der gleichen Charge Cistanche deserticola verarbeitet. Zur Herstellung von WCD wurden trockene CD-Stücke (5 mm dick) (100 g) mit Reiswein (30 ml) aufgegossen, bei hohem Druck (1,25 kPa) für 4 h gedämpft und dann bei 55 Grad getrocknet.

Die groben CD- und WCD-Pulver wurden in 10-mal 95-prozentigem Ethanol für 0,5 h eingeweicht, dreimal jeweils für 1 h refluxextrahiert und filtriert, und die Filtrate von 3 mal wurden vereinigt. Ethylalkohol wurde unter reduziertem Druck wiedergewonnen und der Extrakt wurde zur Verabreichung erhalten. Ein Extrakt (1 ml) wurde zu 50 % Methanol gegeben, wodurch das Gesamtvolumen auf 20 ml gebracht wurde, und zur Inhaltsanalyse bei 4 Grad gelagert.

UPLC-QqQ-MS-Bedingungen für die Analyse von CD- und WCD-Extrakten

Das UPLC-MS/MS-System mit MassLynx 4.1 Analyst-Software wurde verwendet, um die Datenerfassung und -verarbeitung durchzuführen. Die analytische Säule war eine Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) bei einer Temperatur von 40 Grad C. /e mobile Phase war 0,1 % wässrige Ameisensäurelösung (A) und Acetonitril, das 0,1 % Ameisensäure enthielt (B). /e Elutionsgradient war 0,00–1,00 min mit 3 Prozent B, 1,01–2,00 min mit 3 Prozent –11,5 Prozent B, 2,01–3,{{ 29}} min mit 12 % B, 3,01–4,00 min mit 15 % B, 4,01–5,00 min mit 20 % B, 5,01–6,00 min mit 22 % B, 6,01–8,00 min mit 25 % B und 8,01–9,00 min mit 10 % B. Die Flussrate betrug 0,3 ml/min und das Injektionsvolumen war 1,0 μl.

Das Triple-Quadruple-Massenspektrometer von Waters (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA), das mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) ausgestattet war, wurde im negativen Ionenmodus verwendet. Das Desolvatisierungsgas war Stickstoff mit einer Flussrate von 500 l/h bei einer Temperatur von 250 Grad. Alle nachgewiesenen Verbindungen wurden im MRM-Modus (Multiple Reaction Monitoring) gemessen; Tabelle 1 zeigt die Energieparameter und Tabelle 2 zeigt die Kalibrierungskurven für analysierte Komponenten.

Herstellung von Referenzsubstanzen

Tubulosid A (3,02 mg), Echinacosid (3,00 mg), 2′-Acetylacteosid (2,34 mg), Acteosid (2,45 mg), Isoacteosid (0,61 mg), Cis-Tanosid F (2,14 mg), Salidrosid (3,39 mg), Geniposidinsäure (2,84 mg), Ajugol (1,58 mg) und Catalpol (2,39 mg) wurden in Methanol gelöst, um eine Stammlösung herzustellen. Die Stammlösung wurde mit Methanol verdünnt, um die geeigneten Konzentrationen für die Arbeitsstandardlösungen zu erhalten. Alle hergestellten Lösungen wurden vor Gebrauch bei 4 Grad gelagert.

Vorbereitung und Gruppierung von Tiermodellen

Männliche SD-Ratten (180–220 g) wurden von Liaoning Chang sheng Biotechnological Co., Tiergenehmigungsnummer: SCXK (Liao) 2015–0001, gekauft. Alle Ratten wurden mit freiem Zugang zu Futter und Wasser bei 25 Grad und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 30–50 Prozent gehalten. Die Tiere wurden für 7 Tage vor den Experimenten untergebracht.

Einhundert Ratten wurden zufällig in 1 {{30}} Gruppen eingeteilt: Blindkontrollgruppe (BC), Modellkontrollgruppe (MC), Positivkontrollgruppe (PC), Reisweinkontrollgruppe (WC), CD Gruppe mit hoher Dosis (CD-HD), CD-Gruppe mit mittlerer Dosis (CD-MD), CD-Gruppe mit niedriger Dosis (CD-LD), WCD-Gruppe mit hoher Dosis (WCD-HD), WCD-Gruppe mit mittlerer Dosis (WCD-MD )-Gruppe und WCD-Low-Dose-Gruppe (WCD-LD). /e-Dosen von CD-HD/WCD-HD, CD-MD/WCD-MD und CD-LD/WCD-LD waren 5,48 g/(kg ∙ d), 2,74 g/(kg ∙ d) und 1,37 g /(kg ∙ d). /e-Dosis für die PC-Gruppe betrug 1,646 g/(kg ∙ d) und für die WC-Gruppe 1 ml/100 g für 40 Tage. Am 6. Tag nach der Verabreichung wurde den Ratten die Corticosteron-Wasser-Suspension (Corticosteron plus 0,1 Prozent Dimethylsulfoxid plus 0,1 Prozent Tween-80 plus 0,9 Prozent Natrium) subkutan injiziert Chlorid) mit Ausnahme der BC-Gruppe [18]. /e-Konzentration von Corticosteron war 5 g/l, und die Dosis war 0,1 ml/100 g. /e-Ratten in der BC-Gruppe wurde normale Kochsalzlösung plus 0,1 Prozent Dimethylsulfoxid plus 0,1 Prozent Tween- 80 plus 0,9 Prozent Natriumchlorid durch Injektion in derselben Dosis verabreicht.

Bestimmung von HPA-Achsenfunktionen

Gewichts-, Temperatur- und Haltekrafttest:Alle 3 Tage wurde ein Gewichtstest durchgeführt und alle 6 Tage wurde die Temperatur gemessen. während des Experiments. Am 39. Tag wurde die maximale Kraft der Hintergliedmaße mit einem Greifmesser gemessen. Die Ratten wurden auf glatten Plattformen platziert, sodass ihre Hinterbeine die Stange ergriffen. /e-Ratten greifen instinktiv jeden Gegenstand, um zu verhindern, dass sie sich rückwärts bewegen, wenn am Schwanz gezogen wird, bis die Zugkraft den Griff übersteigt. Wenn die Ratte den Halt verlor, konnte der Vorverstärker automatisch die maximale Griffkraft aufzeichnen.

Bestimmung des T-, CRH-, ACTH-, CORT- und Cortisolspiegels im Serum: Eine Stunde nach der letzten Verabreichung wurden die Ratten durch intraperitoneale Injektion einer Urethanlösung (20 g/100 ml) anästhesiert. /de wurden die Blutproben entnommen, zur Gewinnung des Serums 15 min bei 3500 r zentrifugiert und bei –20 °C gelagert. Die Konzentrationen von T, CRH, ACTH, CORT und Cortisol wurden mit Ratten-ELISA-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.

Mikroskopische Beobachtungen: Die morphologische Struktur des Nebennierengewebes wurde durch HE-Färbung beobachtet. Nebennierengewebe wurde in 10-prozentigem Paraformaldehyd fixiert, in Ethanol dehydriert, durch eine Xylollösung transparent gemacht, nach herkömmlichen Methoden eingebettet, in 4 μm dicke Scheiben geschnitten, mit Xylollösung entwachst, mit dem Ethanolgradienten hydratisiert und dann mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt Färbelösung. Nachdem sie mit Xylol transparent gemacht worden war, wurde die Platte mit neutralem Gummi versiegelt und unter einem Mikroskop betrachtet.

Immunhistochemische Färbung der Proteinexpression von Bax, Bcl-2, Caspase-3, Fas und FasL in der Nebenniere

Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete Nebennierenschnitte von Ratten wurden entparaffiniert und rehydriert, nachdem sie auf eine Dicke von 4 &mgr;m geschnitten worden waren. Zur Blockierung der endogenen Peroxidaseaktivität wurden die Schnitte 10 min im Wasserstoffperoxidblock vorinkubiert. Die Schnitte wurden in 0,01 M Citrat (pH 6,0) getaucht und zum Sieden erhitzt. Der Vorgang wurde nach 5–10 min wiederholt. Nach dem Abkühlen wurden die Schnitte 1–2 Mal mit PBS (pH 7,2–7,6) gewaschen, etwa 5 min bei Raumtemperatur belassen und 2–3 Mal mit PBS (pH 7,2–7,6) gewaschen. Bei Raumtemperatur wurde eine 5-prozentige BSA-Blockierungslösung zugegeben, und die überschüssige Flüssigkeit auf dem Schnitt wurde 20 min später abgeschüttelt. Verdünnte primäre Antikörper, die für Fas/FasL, Bcl-2/Bax und Caspase-3 (1:100 verdünnt mit PBS) spezifisch sind, wurden hinzugefügt und bei 37 Grad für 1 Stunde oder 4 Grad über Nacht inkubiert. /e-Schnitte wurden 2–3 Mal mit PBS (pH 7,2–7,6) gewaschen. /de wurde biotinyliertes Ziegen-Anti-Maus-IgG hinzugefügt, und die Schnitte wurden bei 20–37 Grad für 20 Minuten getrocknet und mit PBS (pH 7,2–7,6) viermal für 5 Minuten gewaschen. Nach gründlichem Waschen in PBS wurden die Schnitte mit einer Mischung der Reagenzien A und B für 30 min inkubiert, mit PBS für 45 min inkubiert und schließlich mit DAB-Substrat (DAKO) für 30 min entwickelt, bevor sie leicht mit Hämatoxylin gegengefärbt, dehydriert, und montiert.

Bestimmung von Immunfunktionen

Berechnung des Immunorganindex:Eine Stunde nach der letzten Verabreichung wurden die Ratten durch intraperitoneale Injektion von Urethanlösung (20 g/100 ml) anästhesiert, und dann wurden die Milz und die Thymusdrüse entfernt und sofort in einer sterilen Haube gewogen. Die Gewichtskoeffizienten der Milz oder des Thymus (Prozent) Milz- oder Thymusgewicht (mg)/Körpergewicht (g).

Experimentelle Ergebnisse

UPLC-QqQ-MS-Analyse:Um die beste Trennung, Peakform und eine kurze Analysezeit zu erreichen, wurden die chromatographischen Bedingungen einschließlich Säule, mobiler Phase und Gradientenprogramm in unserem Vorversuch untersucht. /e typische Chromatogramme mit MRM-Modus sind in Abbildung dargestellt.Aus Tabelle 4 konnten wir ersehen, dass die Gehalte an Phenylethanolglykosiden in WCD im Vergleich zu denen von CD anstiegen, insbesondere für Echinacosid und Acteosid, während der Gehalt an Iridoiden in WCD abnahm.

Regulierung der HPA-Achsenfunktion: Die Ratten der MC-Gruppe und der experimentellen Gruppen zeigten nach und nach Nieren-Yang-Mangelsymptome, nachdem ihnen Corticosteron verabreicht worden war. /e-Symptome, wie Gewichtsverlust, Hypothermie, Verlust des Haarglanzes, herabhängender Geist, verzögerte Reaktion, die signifikante Abnahme des Wasserverbrauchs und der Aktivität, verbesserten sich stark in den CD- und WCD-Gruppen. Abbildung 2(a) zeigt die Gewichtsänderungen. Das Gewicht jeder der Arzneimittelgruppen nahm zu, insbesondere in den CD-HD- und WCD-HD-Gruppen. Die Gewichtszunahme in der MC-Gruppe war am geringsten. Abbildung 2(b) zeigt die Temperaturänderungen, die in der MC-Gruppe am niedrigsten waren, und die Temperatur, die in den WCD-HD-, WCD-MD- und WCD-LD-Gruppen anstieg.

Spiegel von T, CRH, ACTH, CORT und Cortisol: Abbildung 3 zeigt, dass im Vergleich zu denen der BC-Gruppe die Spiegel von T, CRH, ACTH und CORT im Rattenserum abnahmen (P < 0.="" 01)="" und="" cortisolspiegel="" verringert="" (p="">< 0.05)="" in="" der="" mc-gruppe.="" im="" vergleich="" zu="" denen="" der="" mc-gruppe="" stieg="" der="" t-spiegel="" in="" den="" wcd-hd-="" und="" wcd-md-gruppen="" (p="">< 0.01),="" der="" crh-spiegel="" in="" der="" wcd-ld,="" wcd-md-="" und="" wc-gruppen="" verbessert="" (p="">< 0.01),="" der="" acth-gehalt="" in="" den="" cd-hd-,="" wcd-md-="" und="" wcd-hd-gruppen="" erhöht="" (p="">< 0,01),="" cort-pegel="" erhöht="" in="" den="" cd-md-,="" wcd-md-="" und="" wcd-hd-gruppen="" (p="">< 0,01)="" und="" verstärkt="" in="" den="" cd-hd-="" und="" wcd-ld-gruppen="" (p="">< 0,05),="" und="" der="" cortisolspiegel="" stieg="" in="" jeder="" der="" medikamentengruppen="">

Ergebnisse der mikroskopischen Beobachtung: Nebennierengewebe kann in die kortikale Schicht und die Medullaschicht unterteilt werden. Die kortikalen Schichten umfassen Kugel-, Bündel- und Netzschichten. Die Zellen enthalten mehr Lipide, und die Medullaschicht besteht hauptsächlich aus Phäochromozytomzellen und einer kleinen Menge fibrösen Gewebes. Wie in Abbildung 4 gezeigt, stellten wir fest, dass in der BC-Gruppe alles normal war, während in der MC-Gruppe die Nebennierenrinde eine offensichtliche Hyperplasie, Zellatrophie und zunehmende Dichte aufwies. Der bauchige Streifen verdickt und die durchscheinende faszikuläre Zone, die schmale Zona reticularis und kleinere Zellen zeigten eine ungleichmäßige Färbung und eine Kapillarverstopfung. In der PC-Gruppe waren die kortikalen und medullären Grenzen sichtbar. Die Zellen der Kugel- und Bündelbänder waren gleichmäßig angeordnet, und die morphologische Struktur war wiederhergestellt. Die gleiche bessere Wiederherstellung wurde in den WCD-Gruppen beobachtet, und die Wirkungen in der WCD-MD-Gruppe waren besser als die der WCD-HD- und WCD-LD-Gruppen. Die Morphologie der Nebenniere in den CD-Gruppen war nicht so gut wie die in den WCD-Gruppen.

Immunhistochemie: Die neuronale Apoptose wird durch viele apoptotische und antiapoptotische Gene kontrolliert, hauptsächlich das Apoptose-fördernde Gen Bax und die antiapoptotischen Gene der Bcl-2-Genfamilie. Bcl-2 ist in reaktiven Sauerstoff produzierenden Organellen wie den Mitochondrien, dem endoplasmatischen Retikulum und den Kernmembranen lokalisiert. Bcl-2 hat wenig Einfluss auf freie Sauerstoffradikale, kann aber oxidative Schäden in Zellen verhindern. Bax transportiert vom Zytoplasma zur mitochondrialen Membran, verändert die mitochondriale Membranstruktur und fördert die Freisetzung von Cytochrom c und die Induktion von Apoptose.

Es gab eine Expression im Zytoplasma der Nebenniere von Bax- und Bcl{{0}}-Protein. /e-Färbung zeigte alle gelben Partikel. Im Vergleich zu der der BC-Gruppe stieg die durchschnittliche optische Dichte des Bax-Proteins in der MC-Gruppe signifikant an (P < 0,01).="" verglichen="" mit="" der="" mc-gruppe="" nahm="" die="" durchschnittliche="" optische="" dichte="" in="" den="" cd-ld-="" und="" wcd-ld-gruppen="" signifikant="" ab="" (p="">< 0,01)="" (abbildung="">Die Ergebnisse zeigten, dass CD und WCD Apoptose in Entzündungszellen induzieren und Nebennierenschäden reduzieren können, indem sie die Expression des FasL-Proteins und die Bindung an das Fas-Protein fördern, das Caspase-3-Protein aktivieren und eine Caspase-Kaskade auslösen. Die Wirkung der WCD-HD-Gruppe war am besten.

Bestimmung der Immunfunktion

Index der Immunorgane

Im Vergleich zu denen der BC-Gruppe nahmen der Thymus-Koeffizient und der Milz-Index der MC-Gruppe signifikant ab (P < {{0}}.01).="" im="" vergleich="" zur="" mc-gruppe="" hatte="" die="" wcd-md-gruppe="" den="" größten="" unterschied="" (p="">< 0,05).="" der="" thymus-koeffizient="" war="" fast="" wieder="" auf="" dem="" normalen="" niveau.="" für="" den="" milzindex="" zeigten="" die="" wcd-md-,="" wcd-ld-="" und="" cd-md-gruppen="" signifikante="" unterschiede="" im="" vergleich="" zu="" denen="" der="" mc-gruppe="" (p="">< 0,01)="" (siehe="" abbildung="" 6).="" daher="" konnte="" die="" wcd-="" und="" cd-behandlung="" die="" immunorgane="" schützen,="" und="" die="" wirkungen="" der="" wcd="" waren="">

Nachweis von T-Lymphozyten-Untergruppen in peripherem Blut

Der Prozentsatz an CD4-Plus-Zellen im oberen linken Quadranten und an CD8-Plus-Zellen im rechten unteren Quadranten war in der BC- und jeder Arzneimittelgruppe höher als in der MC-Gruppe. Verglichen mit dem der BC-Gruppe nahm das Verhältnis von CD4 plus /CD8 plus in der MC-Gruppe signifikant ab (P < 0.01).="" im="" vergleich="" zur="" mc-gruppe="" stieg="" das="" verhältnis="" von="" cd4="" plus="" d8="" plus="" in="" der="" pc-gruppe,="" der="" wcd-gruppe="" und="" der="" cd-hd-gruppe="" signifikant="" an="" (p="">< 0,01)="" (abbildung="" 7).="" {12}},="" il-6,="" il-2,="" tnf-="" und="" ifn-c="" im="">

Abbildung 8 zeigt, dass im Vergleich zu denen der BC-Gruppe der Spiegel von IL-6, TNF- und IFN-c signifikant angestiegen ist (P < 0,01).="" der="" -spiegel="" von="" il-10="" und="" il-2="" nahm="" in="" der="" mc-gruppe="" ab.="" im="" vergleich="" zu="" dem="" der="" mc-gruppe="" nahm="" der="" spiegel="" von="" il-6,="" tnf-="" und="" ifn-c="" ab="" und="" il-10="" und="" il-2="" stiegen="" im="" serum="" in="" jeder="" der="" arzneimittelgruppen="" an.="" die="" wirkung="" von="" wcd="" war="" besser="" als="" die="" wirkung="" von="" cd,="" insbesondere="" in="" der="" wcd-md-gruppe,="" in="" der="" die="" wirkung="" der="" der="" pc-gruppe="" nahe="">

Ergebnisse des Thymusgewebe-Mikroskop-Beobachtungsexperiments

Abbildung 9 zeigt, dass in der BC-Gruppe eine große Anzahl von Lymphozyten vorhanden war. Lymphozyten und Retikulozyten waren locker im Zentrum angeordnet mit verstreuten runden oder ovalen Thymozyten. Es gab keine Nekrose, keine entzündliche Zellinfiltration und keine abnormalen Veränderungen.

Die MC-Gruppe zeigte eine große Menge an lymphoidem Nekrosegewebe mit einer ungeordneten Anordnung von Lymphozyten und Retikulozyten im Zentrum. Runde oder ovale Thymozyten verschwanden, massive Zelldegeneration oder Nekrose war erkennbar, und es kam zu einer entzündlichen Zellinfiltration mit abnormen pathologischen Veränderungen.

In den CD-Gruppen hatten sich die morphologischen Eigenschaften der Lymphozyten wieder normalisiert, und die Anordnung der zentralen Lymphozyten und Retikulozyten war fast normal. Runde oder ovale Thymozyten hatten sich erholt, aber eine kleine Anzahl von degenerativen oder nekrotischen Lymphozyten und infiltrierenden Entzündungszellen blieb zurück.

In den WCD-Gruppen und der PC-Gruppe wurden die morphologischen Merkmale der Lymphozyten besser repariert. /e Lymphozyten und Retikulozyten in der Mitte waren gut ausgerichtet, die runden oder ovalen Thymozyten waren fast normal, aber es blieb eine kleine Anzahl infiltrierender und degenerativer Lymphozyten.

Genexpression des CaM-Proteins

Der RQ-Wert (CaM-mRNA/-Actin-mRNA) wurde berücksichtigt, um die Expression von CaM-mRNA zu untersuchen. Der RQ der BC-Gruppe war 1. Die Expression von CaM-mRNA im Hypothalamus in der MC-Gruppe stieg signifikant an (P < 0.01),="" während="" der="" wert="" in="" der="" wcd-hd="" abnahm,="" gruppen="" wcd-md,="" wcd="" ld="" und="" cd-hd="" (p="">< {{10}}.05)="" (abbildung="" 10).="" die="" expression="" von="" cam-mrna="" in="" der="" hypophyse="" in="" der="" mc-gruppe="" war="" niedriger="" als="" in="" der="" bc-gruppe="" (p="">< 0,01).="" die="" -expression="" in="" den="" wcd-hd-,="" wcd-md-,="" wcd-ld-,="" cd-hd-="" und="" cd-ld-gruppen="" nahm="" zu="" (p="">< 0,05),="" und="" die="" wirkung="" in="" den="" wcd-gruppen="" war="" besser="" als="" die="" wirkung="" in="" den="">

Diskussion

Das Chinesische Arzneibuch [2] hält fest, dass CD und WCD in der Klinik als Hauptarten von Auskochstücken verwendet werden können. Nach dem Dämpfen mit Reiswein wurden die Anti-Aging- und tonisierenden Nieren-Yang-Effekte verstärkt. Durch UPLC-QqQ-MS haben wir die quantitativen Änderungen in der chemischen Materialbasis während des Prozesses des Reisweindampfens nachgewiesen. Iridoidglykoside waren instabil und der Gehalt dieser Glykoside nahm ab und wurde sogar nicht mehr nachweisbar. Auch der Gehalt an Phenylethanolglykosiden veränderte sich, was zu Veränderungen der Pharmakodynamik und der klinischen Wirkung führen könnte.

Das klassische Nieren-Yang-Mangelmodell wurde durch subkutane Injektion von Corticosteron repliziert [19]. Eine Überdosis Kortikosteron könnte das Geheimnis von CRH im Hypothalamus hemmen. Inzwischen wurde auch das Geheimnis von ACTH gehemmt. /e-Spiegel des Hormons der Nebennierenrinde sank, und somit wurde die Funktion der HPA-Achse reduziert. Eine Unterfunktion der HPA-Achse ist ein häufiges Merkmal des Nieren-Yang-Mangels [20]. Dann zeigen die Ratten "Erschöpfungserscheinungen", und die Symptome stimmen mit denen eines Nieren-Yang-Mangels in der Klinik überein.

In der MC-Gruppe nahm der CRH-, ACTH-, T- und CORT-Spiegel im Rattenserum signifikant ab (P < 0,01).="" nach="" der="" behandlung="" mit="" cd="" und="" wcd="" stieg="" der="" gehalt="" an="" crh,="" acth,="" t,="" cort="" und="" cortisol="" alle="" bis="" zu="" einem="" gewissen="" grad="" an,="" und="" die="" wirkung="" von="" wcd-md="" war="" am="" besten,="" fast="" gleich="" der="" in="" der="" pc-gruppe.="" diese="" ergebnisse="" zeigten,="" dass="" das="" relative="" hormongleichgewicht="" in="" der="" hpa-achse="" in="" der="" mc-gruppe="" zerstört="" worden="" war,="" cd="" und="" wcd="" die="" funktionelle="" wiederherstellung="" von="" abnormalen="" hormonspiegeln="" der="" nebennierenachse="" verbessern="" konnten,="" aber="" die="" wirkung="" von="" wcd="" war="">

Die Modulation des Anteils der Mitglieder der Bcl{0}}-Familie ist einer der Kernmechanismen, durch die Fas/FasL den Todesrezeptorweg vermittelt, und die Bcl-2-Familie reguliert den mitochondrialen Weg [21]. Der Apoptose-inhibierende Faktor Bcl-2 und Apoptose-induzierende Faktoren wie Bax gehören alle zur Bcl-2-Familie [22]. Die Zellapoptose kann durch das relative Verhältnis von Apoptose-inhibierenden Faktoren und Apoptose-induzierenden Faktoren bestimmt werden [23]. Mitochondrien hatten die Funktion zentraler Kontrollpunkte für viele Formen der Apoptose [24]. Die vorliegende Studie zeigte, dass CD-MD und WCDs die Expression von Bax ableiten und Bcl-2 erhöhen konnten, um den Nieren-Yang-Mangel zu verbessern. Fas ist der wichtigste Todesrezeptor, der Apoptose durch Ligation mit dem Fas-Liganden (FasL) induziert [25]. Die Expression von Fas und FasL in der MC-Gruppe nahm zu, während diese Expression in der WCD-MD-Gruppe (P < 0.01)="" im="" vergleich="" zur="" mc-gruppe="" signifikant="" zunahm.="" sowohl="" fas/fasl-="" als="" auch="" bax/bcl-2-systeme="" übertragen="" die="" apoptotischen="" signale="" an="" die="" caspase-familie="" [26].="" caspase-3="" ist="" eine="" der="" zentralen="" proteinasen,="" die="" die="" zellapoptose="" einleiten.="" die="" aktivierung="" von="" caspase-3="" zeigt="" an,="" dass="" die="" apoptose="" in="" ein="" irreversibles="" stadium="" eintritt="" [27].="" die="" expression="" von="" caspase-3="" in="" der="" mc-gruppe="" nahm="" zu="" und="" nahm="" in="" den="" wcd-hd-="" und="" wcd-md-gruppen="" signifikant="" zu="" (p=""><>

Mangel anImmunfunktionist eine der wichtigen Manifestationen des Nieren-Yang-Mangels [28]. In dieser Studie fanden wir heraus, dass sich der Index von Milz und Thymus der WCD-MD-Gruppe signifikant erholte (P < 0.01,="" p="">< 0.{{3{="" {32}}}}5).="" immunantwort="" des="" immunsystems="" wird="" hauptsächlich="" durch="" die="" untergruppen="" reguliert="" [29].="" il-2="" ist="" der="" wachstumsfaktor="" für="" t-zellen,="" der="" von="" t-zellen="" und="" makrophagen="" sezerniert="" wird,="" an="" der="" entzündungsregulation="" beteiligt="" ist,="" die="" immunität="" reguliert="" und="" die="" infektionsresistenz="" erhöht="" [30].="" der="" il-2-spiegel="" in="" der="" mc-gruppe="" nahm="" ab="" (p="">< 0,01),="" und="" nach="" der="" behandlung="" mit="" cd="" und="" wcd="" erholte="" sich="" der="" il-2-spiegel.="" il-6="" und="" tnf-="" sind="" proinflammatorische="" zytokine.="" erhöhte="" spiegel="" von="" il-6-="" und="" tnf-zytokinen="" verursachen="" zytokin-ungleichgewichte="" und="" verschlimmern="" entzündungen.="" die="" spiegel="" von="" il-6="" und="" tnf-="" stiegen="" in="" der="" mc-gruppe="" an,="" während="" die="" spiegel="" von="" il-6="" und="" tnf-="" nach="" der="" behandlung="" abnahmen.="" t-zellen="" werden="" in="" cd4-zellen="" und="" cd8-zellen="" unterteilt,="" und="" das="" cd4="" plus="" d8="" plus-verhältnis="" kann="" als="" wichtiger="" index="" der="" immunregulation="" verwendet="" werden="" [31].="" cd4="" plus="" d8="" plus="" nahm="" in="" der="" mc-gruppe="" offensichtlich="" ab="" (p="">< 0,01),="" während="" es="" in="" den="" wcd-="" und="" cd-hd-gruppen="" zunahm="" (p=""><>

Die HPA-Achse ist das wichtigste Regulationssystem, da sie die Glucocorticoid-Sekretion und das endokrine System reguliert, um die sekretorische Funktion der Nebennierenrinde aufrechtzuerhalten [32]. Die Überexpression von CaM-mRNA im Hypothalamus-Gewebe war mit einem Mangel an Nieren-Yang verbunden. CD und WCD könnten die Calciumkanäle blockieren, die CaM-mRNA-Expression im Hypothalamus hemmen und den Calciumeinstrom verringern, wodurch die Aktivität des Ca2-plus-CaM-Komplexes verringert wird.

Die Bildung von Nieren-Yang-Mangel hat einen chronischen Krankheitsentwicklungsprozess. Die Niere ist kein rein anatomisches Konzept mehr, sondern ein allgemeiner Begriff für die neuroendokrine Immunität und das Urogenitalsystem. Das neuroendokrine Immunnetzwerk (NEI) ist ein wichtiges integriertes Regulationssystem [33]. CD und WCD können die Funktion der HPAT-Achse regulieren und die Erholung des Nieren-Yang-Mangels verbessern. Dieses Ergebnis liefert die experimentelle Grundlage für die klinische Prävention und Behandlung von Nieren-Yang-Mangel.

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