Studie über die Wirkung von Acteosid (ein Wirkstoff in Cistanche Deserticola) auf NAFLD durch Induzierung von Autophagie

Abstrakt:

 

Objektiv:Untersuchung der Autophagie-induzierenden Funktion von Wirkstoff Acteosid (ACT) bei Cistanche Deserticola und ihre Auswirkungen auf die nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD).

MethodenUm Echinacosid zu nehmen und als Forschungsobjekte zu fungieren, wurden 1 0 0 μmol/l Act und Echinacosid (Ech) mit Autophagie-Lysom-Inhibitor Bleomycin A1 zur Eingriffsbehandlung kombiniert. Das Proteinimmunblotting wurde verwendet, um das relative Expressionsniveau von Autophagie -Marker -Protein -Mikrotubuli -assoziiertem Protein 1 -Lichtkette 3 (LC 3- II) nachzuweisen. Hepg2 -Zellen wurden in vitro mit unterschiedlichen Konzentrationen von ACT interveniert, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung der Tetrazoliumsalzmethode nachgewiesen. In vitro -Intervention von Hepg2 -Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von ACT kombiniert mit Balofloxacin A1 und Nachweis der LC {{9} II -Protein -Expressionsniveaus unter Verwendung der Protein -Immunoblotting -Technologie. Ein in vitro mit Arzneimittelintervention konstruiertes NAFLD -Modell wurde verwendet, um Lipidtröpfchen unter Verwendung von Ölrot -O -Färbemethoden zu färben und intrazelluläre Triglyceridspiegel zu erfassen. Beobachten Sie die Lokalisierung von LC3 -Protein und Lipidtröpfchen durch Immunfluoreszenztechnologie. Die Ergebnisse können in Hepg2 -Zellen signifikant Autophagie induzieren, und das Expressionsniveau von LC 3- II -Protein ist im Vergleich zur Kontrollgruppe (1,36 ± {0. jeweils) mit statistischer Signifikanz (P0.05). 50 μmol/l wirken signifikant die Autophagie in Hepg2 -Zellen signifikant induzierte und das Expressionsniveau des LC 3- II -Proteins war signifikant erhöht (1,83 ± 0,53, 0,35 ± 0,18). Das TG -Grad von Hepg2 -Zellen in der ACT -Interventionsgruppe (19,11 ± 1,68) war signifikant niedriger als in der NAFLD -In -vitro -Zellmodellgruppe (34,15 ± 1,90), und die Unterschiede waren statistisch signifikant (P.<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Schlüsselwörter:Nichtalkoholische Fettlebererkrankung;Cistanche Deserticola;Acteosid; Autophagie

 

TCM Kräuter-Cistanche zur Behandlung von nichtalkoholischer Fettlebererkrankung (NAFLD)

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In den letzten Jahrzehnten alkoholfreies FettyLebererkrankung(NAFLD) ist der häufigste gewordenChronische Lebererkrankungmit einer globalen Prävalenz von ungefähr 25% der erwachsenen Bevölkerung und wird als eng mit dem metabolischen Syndrom verwandt [1]. Obwohl die Wahrscheinlichkeit von Komplikationen im Zusammenhang mit Leber bei NAFLD-Patienten weniger als 10%beträgt, ist NAFLD ein Risikofaktor für Leberkrankheiten wie Zirrhose und primärer Leberkrebs, der Patienten eine enorme wirtschaftliche Belastung auferlegt [2-5]. Trotz der zunehmenden Aufmerksamkeit, die NAFLD geschenkt hat, hat NAFLD als wichtige chronische Krankheit keine ausreichende Aufmerksamkeit erhalten. Daher ist ein weiteres eingehendes Verständnis der Pathogenese der NAFLD und der Suche nach wirksamen Behandlungsstrategien zu dringenden Problemen geworden, die zu lösen sind [{6-7].

Jüngste Studien haben gezeigt, dass die zelluläre Autophagie eine wichtige Rolle in der Leberphysiologie und Pathologie spielt [8]. Autophagie -Dysfunktion oder Dysregulation ist mit einer Vielzahl von Lebererkrankungen verbunden, z.Alkoholbedingte Lebererkrankung[9], NAFLD [10], alkoholfreie Steatohepatitis [11] und hepatozelluläres Karzinom [12]. Die pathologischen Eigenschaften der NAFLD sind eine übermäßige Ablagerung von Triglyceriden (TG) und anderen neutralen Lipidtröpfchen (LD) in Hepatozyten unter nicht alkoholischer Stimulation. Für die Leber sind die beiden Hauptwege, die den Katabolismus dieser LDS regulieren, Lipolyse und Autophagie.
Der Lipolyseweg wird durch zytoplasmatische neutrale Lipasen wie hormonempfindliche Lipase und Fett-TG-Lipase reguliert. Im entsprechenden Lipoautophagie-Weg können LDS selektiv aufgenommen werden, indem autophagy-verwandte Proteine ​​zur Bildung von Autophagosomen rekrutiert werden, und dann werden die von Autophagosomen eingekapselten LDS durch Autophagosomen weiter geliefert und durch Säurelipase in Lysosomen zerlegt. Daher ist die Aktivierung der Lipoautophagie in Hepatozyten zu einer wirksamen Strategie für die Prävention und Behandlung von NAFLD geworden.
Cistanche Deserticola ist eine kostbare chinesische Kräutermedizin, die in der klinischen Praxis in traditionellen chinesischen Medizinformeln häufig eingesetzt wurde. Gleichzeitig wird es seit langem als Nahrungsergänzungsmittel für Gesundheitskost verwendet. Cistanche Deserticola enthält eine Vielzahl von bioaktiven Zutaten, von denen die wichtigste Cistanche Deserticola Phenylethanolglykoside ist. Als Vertreter von phenylethanoiden Glykosiden wurde berichtet, dass Echinacosid (Ech) und Verbascosid (ACT) viele wichtige biologische Aktivitäten wie antioxidatives, neuroprotektives, immunmodulierendes und Leberschutz aufweisen [13]. In Bezug auf den Leberschutz haben Studien festgestellt, dass Ech die Leber durch Reduzierung von Entzündungsmediatoren, die Hemmung der transformierenden Wachstumsfaktor und die Verringerung des Expressionsniveaus von Leberfibrose-Genen schützen kann. ACT hat eine signifikante schützende Wirkung auf chemische und drogeninduzierte Leberschäden wie Alkohol, Kohlenstofftetrachlor und Lipopolysaccharid. ACT reduziert den durch toxischen Chemikalien verursachten oxidativen Stress, entfernt in der Leber akkumulierten reaktiven Sauerstoff und reduziert die Malondialdehyd -Konzentration. Gleichzeitig erhöht es die Leber -Superoxiddismutaseaktivität signifikant und verringert den Glutathiongehalt und verbessert die histopathologische Leberschäden und die Apoptose signifikant. Es gibt jedoch keinen relevanten Literaturbericht darüber, ob Phenylethanoid -Glykoside von Cistanche Deserticola an dem Prozess der Autophagie bei der Ausführung des Leberschutzes beteiligt sind. Auf dieser Studie verwendete diese Studie herkömmliche Zellbiologie-Methoden und ein In-vitro-Zellmodell, um den autophagie-induzierenden Effekt von Cistanchen-Wüstenicola-Phenylethanoidglykosiden vorab zu untersuchen und ihre möglichen pharmakologischen Funktionen zu untersuchen, um eine wissenschaftliche Grundlage für die zukünftige Arzneimittelentwicklung bereitzustellen.

 

1 Materialien und Methoden

1.1 Materialien

1.1.1 Forschungsfächer Ech und ACT wurden als Forschungsfächer verwendet.

1.1.2 Materialien Hepg2 -Zellen wurden von Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., Ech (Chargenzahl: B21209) und ACT (Chargenzahl: B20715, HPLC -Reinheit größer als 98%) gekauft. wurden von Hyclone Company, USA, gekauft, fetaler Rinderserum (Batchnummer: 04-002-1 A) wurde von BI Company, Israel, Penicillin/Streptomycin (Batchnummer: Sv30010.01) gekauft (Sv30010.01). (Batchnummer: BC0625) Das Erkennungskit wurde von der Halbao Company, Peking, China, Oil Red O (Los Nummer: O {0625-100 g), Dimethylsulfoxid (Los Nummer: BCBZ1685) gekauft, von Sigma-Aldrich, USA; Der Autophagy-Lysosomen-Inhibitor Bafilomycin A1 (BAFA1, Los Number: TLRL-BAF1) wurde von Invitrogen, USA, gekauft; Der Autophagieaktivator Rapamycin (Los Number: S17098) wurde von Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., China, gekauft; Mikrotubuli-assoziiertes Protein 1 Leichtkette 3 (LC3, Los Nummer: L7543, Spezies: Kaninchen, Verdünnungsverhältnis: 1: 1 000) und -Actin (Los Nummer: Zrb1312, Spezies: Rabbit, Verdünnungsverhältnis: 1: {5 000) AntiBodien wurden aus Sigma-Aldich, USA, USA. Meerrettichperoxidase-markiert sekundärer Antikörper (Los Nummer: 4010-05, Arten: Ziegen-Anti-Kaninchen, Verdünnungsverhältnis: 1: 1 000) wurde von Southern Biotech, USA Company, Alexa Fluor Fluoreszenz-Sekundärantikörper (Lot Number: 43328, Waveleng, 546, 546, 1 ° C) gekauft. Sigma-Aldrich Company, USA, und Bodipy 493/501 (Los Nummer: D3922) wurde von der Invitrogen Company, USA, gekauft.

 

1.2 Methoden

1.2.1 Zellkultur

Hepg2 -Zellen wurden im modifizierten Hochglukosemedium von Dulbecco kultiviert, das 10% fötales Rinderserum, 100 U/ml -Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin in einem 37 -Grad -Kohlendioxid -Inkubator enthielt. Als der Zellkonfluenz 85%erreichte, wurden Subkultur, Plattierung, Intervention und andere Operationen durchgeführt.

 

1.2.2 Protein -Immunoblot -Nachweis

1.2.2.1 Act und ECH -Behandlung

LC 3- ⅱ Proteinexpressionsniveau in Hepg2 -Zellen BAFA1 als Protonenpumpeninhibitor kann dazu führen, dass LC {{3} ⅱ Protein in großen Mengen in Zellen aggregiert wird, wodurch die Fähigkeit zur Induktion von Autophagie in der Autophagie amplifiziert wird. Daher kann die kombinierte Verwendung von BAFA1 als Autophagie -Überwachungssystem verwendet werden, um die Fähigkeit zur Autophagieinduktion zu bewerten. HepG2 -Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden für die Kultur über Nacht auf 3,5 cm Zellkulturschalen übertragen. 100 μmol/l Act, Ech und BAFA1 wurden 12 Stunden lang für die Intervention verwendet. Die Zellen wurden mit vorgekühlter Phosphatpufferlösung (PBS) gewaschen und 10 min sofort in RIPA-Proteinlyse-Puffer lysiert. Der Überstand wurde zentrifugiert und die Gesamtproteinkonzentration wurde unter Verwendung eines Bicinchoninsäure -Proteinkonzentrations -Assay -Kits bestimmt. Nach der Quantifizierung mit Natriumdodecylsulfatpuffer wurde die Probe 10 Minuten lang auf 95 Grad erhitzt, um das Protein zu denaturieren. Dann wurden 30 & mgr; l der Probe mit einer Mikropipette aufgenommen und auf einem Polyacrylamidgel elektrophores.
Nach der Elektrophorese wurde das Protein vom Gel auf eine Nitrocellulosemembran übernommen, die über Nacht mit 1 0% Milch blockiert, mit einem spezifischen primären Antikörper bei Raumtemperatur 1 h inkubiert wurde, 1 h mit einem Phosphatpuffer mit 0,5% Triton und inkubiert und mit einem bestimmten zweiten Antikörper bei einem Raumtemperatur bei 1 h inkubiert wurde. Die ECL -Methode wurde für die Farbentwicklung verwendet. Sie wurden als Leer -Kontrollgruppe, Rapamycin Group, Ech Group, ACT Group, Rapamycin+Bafa1 Group, Ech+BAFA1 Group und ACT+BAFA1 -Gruppe eingestellt.

 

1.2.2.2 verschiedene Konzentrationen von ACT intervenierten das Expressionsniveau von LC 3- ⅱ Protein in Hepg2 -Zellen

Die hepG2 -Zellen der logarithmischen Wachstumsphase wurden für die Kultur über Nacht auf 3,5 cm Zellkulturschalen übertragen, und 25, 50 und 100 & mgr; mol/l, kombiniert mit BAFA1, wurden für 12 h zur Interventionsbehandlung verwendet, und das Expressionsniveau von LC {{8} ⅱ -Protein wurde durch Protein -Immunoblotting erkannt. Die Kontrollgruppe (Con -Gruppe, Blankheitskontrolle), Hungergruppe (STA -Gruppe, Hepg2 -Zellen der Hungerbehandlung), 25, 50 und 100 μmol/l ACT -Gruppe und BAFA1 in Kombination mit 25, 50 und 100 μmol/l ACT -Gruppe.

1.2.3 MTT -Methode zum Nachweis der Überlebensrate von HepG2
Hepg2 -Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden in einer 96- -Wellplatte mit einer moderaten Inokulationsdichte inokuliert und 12 h in einem Inkubator kultiviert. 2 0, 40, 60, 80 und 100 μmol/l Act wurden für 24 und 48 Stunden zugegeben. 0,5 mg/ml MTT -Lösung wurde in einer dunklen Umgebung zugegeben und in einem Inkubator inkubiert. Nach 4 h wurde der Überstand verworfen, jeweils 100 & mgr; l Dimethylsulfoxid zugesetzt, und die Zellen wurden 10 min bei 37 Grad in einem konstanten Temperaturschüttler geschüttelt. Der Wert der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 490 nm wurde durch einen Enzymmarker nachgewiesen und die Zellüberlebensrate wurde berechnet.

 

1.2.4 In -vitro -Konstruktion des NAFLD -Zellmodells

Ein bestimmtes Gewicht von Palmitinsäure (PA) wurde gewogen und in einem bestimmten Volumen von Isopropanol vollständig gelöst, um eine 100 mmol/l -PA -Stammlösung vorzubereiten, die dann in einem -20 -Grainierungskühlschrank für die spätere Verwendung gespeichert und gespeichert wurde. Die PA-Stammlösung wurde unter Verwendung eines vollständigen Kulturmediums auf 100 μmol/l verdünnt, und 1% fettsäurefreies Rinderserumalbumin wurde zugegeben. Die Zellen wurden 3 Stunden lang bei 37 Grad inkubiert, um die Induktionslösung herzustellen. Hepg2 -Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden in eine 3,5 -c -Zellkultur -Kulturschale in einer geeigneten Dichte für die Kultur über Nacht übertragen, und dann wurde die vorbereitete Induktionslösung zur Intervention verwendet.

 

1.2.5 ACT -Intervention NAFLD In -vitro -Zellmodell TG -Detektion und Ölrot O -Färbung

 

1.2.5.1 TG -Erkennung

Hepg2 -Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden gemäß der Blank -Kontrollgruppe, der Modellgruppe und der ACT -Interventionsgruppe in eine 3,5 -c -cm -Zellkulturschale für die Kultur übertragen. Die Modellgruppe wurde mit einer 100 μmol/l -PA -Induktionslösung induziert, und die ACT -Interventionsgruppe wurde mit 100 & mgr; mol/l PA -Induktionslösung induziert und gleichzeitig wurde 50 & mgr; mol/l ACT zugegeben. Die Interventionszeit betrug 24 h. Entfernen Sie das alte Kulturmedium vorsichtig, waschen Sie die Zelloberfläche langsam mit vorgekühlten PBS und geben Sie 100 & mgr; l/Schale vorgekühlter Rip-Lyse-Lösung, die 15 Minuten lang vollständig auf Eis gelangen, Zentrifuge bei 4 Grad und {12 000 R/min für 10 min, sammeln Sie den Supernatanten, nehmen 10 μl für den Enzym-Detektion für TG-Detektion ein. Die TG -Kit -Anweisungen und schließlich korrigieren Sie den TG -Wert pro mg Protein.

1.2.5.2 Ölrot O -Färbung

HepG2 -Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden auf eine 3,5 -cm -Kulturschale übertragen, die mit einer sterilen Deckglase für Übernachtungskultur bedeckt war. 100 μmol/l Pa induzierten die Zellen zu Lipidtröpfchen. Gleichzeitig wurde 50 μmol/l Aktion für 24 Stunden zugegeben.
Die Zellrutschen wurden gesammelt, dreimal mit vorgekühltem PBS gewaschen, mit 4% Formaldehyd bei Raumtemperatur 10 min fixiert, die Zelloberfläche mit PBS gewaschen, die vorbereitete rot o-färbende Arbeitslösung hinzugefügt, die bei Raumtemperatur gefärbt in der Dunkelheit gefärbt wurde, 15 Minuten, aspirierte die öl reduzierte O-Färblösung mit doppeltem destilliertem Wasser, mit einem doppelten Wasser. und unter einem Mikroskop fotografiert.

 

1.2.6 Immunfluoreszenzbeobachtung von Autophagosomen und Lipidtröpfchen nach der ACT -Behandlung

HepG2 -Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden auf eine 3,5 -cm -Kulturschale übertragen, die mit einer sterilen Deckglase für Übernachtungskultur bedeckt war. 1 0 0 μmol/l pa wurde verwendet, um die Bildung von Lipidtröpfchen in den Zellen zu induzieren. Gleichzeitig wurde ACT für die Interventionsbehandlung für 24 Stunden hinzugefügt. Die Zellrutschen wurden gesammelt, dreimal mit vorgekühlter PBS gewaschen, die 10 min mit 4% Formaldehyd fixiert waren und 15 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Permeabilisierungspuffer, der 0,1% Saponin enthielt, mit einem Ziegenserum, der mit einer Pokal-Temperatur, mit 1 H-Pokodie, mit einer Pokal-Temperatur, mit 1 H mit einer 3-H-Temperatur, mit 1 H mit LC {{14}, mit einer 3-H-{-14} -Sponum, mit einem LC {{14} -Sponum, fixiert war, mit einer Raumtemperatur. und hinzugefügt mit einem spezifischen fluoreszierend markierten sekundären Antikörper, der bei Raumtemperatur inkubiert und 1 h von Licht entfernt ist. Nach der Antikörper-Inkubation wurden die Objektträger dreimal mit PBS gewaschen, mit lipidtröpfchenspezifischer Sondenbodypie 493/503 bei Raumtemperatur 10 Minuten lang gefärbt, mit PBS gewaschen und mit einem Anti-Verfassungsdichtungsmedium versiegelt, in der Dunkelheit betrogen, mit einem Laser konfokalen Mikroskop beobachtet und aufgezeichnet und aufgezeichnet. Die Blank -Kontrollgruppe, die Rapamycin -Behandlungsgruppe und die ACT -Interventionsgruppe wurden festgelegt.

 

1.3 Statistische Analyse

SPSS25. 0 Statistische Software wurde zur Datenanalyse verwendet. Die quantitativen Daten wurden als x ± s ausgedrückt. Eine Einweg-Varianzanalyse und der LSD-T-Test wurden verwendet. P<0.05 was considered statistically significant.