Die vorteilhaften Wirkungen von Verbascosid aus Cistanche-Kraut

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Verbascosid schützt Mäuse vor Clostridiengasgangrän, indem es die Aktivität von Alpha-Toxin und Perfringolysin O hemmt

Gasbrand, der hauptsächlich durch das anaerobe Bakterium Clostridium perfringens (C. perfringens) verursacht wird, führt innerhalb von 48 h nach Beginn zum Tod. Es stehen begrenzte therapeutische Strategien zur Verfügung, und sie ist mit einer extrem hohen Sterblichkeit verbunden. Sowohl C. perfringens alpha-Toxin (CPA) als auch Perfringolysin O (PFO) sind wichtige Virulenzfaktoren bei der Entwicklung von Gasbrand, was darauf hindeutet, dass sie therapeutische Ziele sind. Hier haben wir das gefundenverbascosid, a Phenylpropanoidglykosidweit verbreitet in Chinesische Kräutermedizin Cistanche, könnte die biologische Aktivität sowohl von CPA als auch von PFO in hämolytischen Assays wirksam hemmen.

Die Oligomerisierung von PFO wurde durch Verbascosid bemerkenswert gehemmt. Obwohl keine antibakterielle Aktivität beobachtet wurde,verbascosidDie Behandlung schützte Caco-2-Zellen vor Schäden durch CPA und PFO. Zusätzlich werden infizierte Mäuse mit behandeltverbascosidzeigte sich deutlichgelinderte Schäden, reduzierte Bakterienbelastung, undverringerte Sterblichkeit. Zusammenfassend,Verbascosid hat sowohl in vitro als auch in vivo eine wirksame therapeutische Wirkung gegen die Virulenz von C. perfringensdurch gleichzeitiges Targeting von CPA und PFO. Unsere Ergebnisse bieten eine vielversprechende Strategie und eine potenzielle Leitsubstanz für C. perfringens-Infektionen, insbesondere Gasbrand.

Schlüsselwörter: Alpha-Toxin, Antiinfektion, Clostridium perfringens, Gasbrand, Perfringolysin O, Verbascosid

Clostridium perfringens (C. perfringens) ist ein grampositives anaerobes Bakterium, das in der Natur und im menschlichen Darm weit verbreitet ist (Fraser und Collee, 1975). C. perfringens kann vier Haupttoxine ( , , ε und Ì) sezernieren und wird dementsprechend in fünf Serotypen A–E unterteilt (Titball, 2005). Beim Menschen kann C. perfringens eine Vielzahl von Krankheiten verursachen, wie z. , 2015). Die Inkubationszeit von Gasbrand ist kurz und die Infektion kann sich innerhalb von 6–8 h etablieren (Uzal et al., 2015). Noch schwerwiegender ist, dass mehr als 50 Prozent der Infizierten weiterhin eine systemische Toxämie entwickeln, die schließlich zum Tod führt; daher kann Gasbrand ohne rechtzeitige und wirksame Behandlung zu ernsthaften wirtschaftlichen Verlusten führen (Low et al., 2018). Allerdings haben die üblichen Behandlungen wie Antibiotikabehandlung und chirurgische Behandlung von Gasbrand alle bestimmte Nachteile, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Antibiotikaresistenz und Amputationsverletzungen der Patienten (Park et al., 2010; Osman und Elhariri, 2013). Daher ist es notwendig, neue Methoden oder Ideen für die Behandlung von Gasbrand zu finden.

Clostridien-Gasgangrän ist die fulminante Infektionskrankheit, die hauptsächlich durch das Zusammenspiel eines C. perfringens-Toxins (CPA) und Perfringolysin O (PFO) verursacht wird (Hifumi et al., 2018). CPA, das zur Familie der bakteriellen Zink-Metallo-Phospholipase-Enzyme gehört, wird von allen C. perfringens produziert, wird von Chromosomen kodiert, ist ein Haupttoxin in C. perfringens und zeigt sowohl Phospholipase-C- als auch Sphingomyelinase-Aktivitäten (van Bunderen et al. , 2010; Masataka et al., 2015). In den 1990er Jahren haben Awad et al. (1995) verwendeten CPA-Mutanten, um ein Gasgangrän-Mausmodell zu testen, und stellten fest, dass Stämme, denen das CPA-Gen fehlt, eine verringerte Pathogenität und weniger Gewebeschäden nach der Infektion zeigten. Diese Arbeit bestätigte, dass CPA das Haupttoxin bei Gasbrand ist. Im Jahr 2000 führte Alberto eingehende Studien durch, indem er ein Molekularmodell von a-Toxin und Mutanten mit drei Schleifen in der C-terminalen Domäne konstruierte, und die hämolytische Aktivität und Zytotoxizität der Mutanten waren im Vergleich zu denen des Wildtyps verringert. Es wurde gezeigt, dass die Sphingomyelinase-Aktivität und die C-terminale Domäne für die Myotoxizität in vivo notwendig sind (Alape-Giron et al., 2000). PFO, ein cholesterinabhängiges Cytolysin (CDC), interagiert als Monomer mit der Zellmembran, und der hergestellte Komplex wird dann durch Oligomerisierung in die Membrandoppelschicht eingefügt und lysiert schließlich Wirtszellen (Johnson und Heuck, 2014). Obwohl PFO für die Letalität nicht notwendig ist, kann es in den frühen Stadien der Myonekrose Makrophagen-Zytotoxizität verursachen und ist wichtig für die Thrombusbildung in den späten Stadien der Infektion, was zur Pathogenese von Gasbrand beiträgt (Verherstraeten et al., 2015). CPA kann sich mit PFO verbinden, um Neutrophile zu schädigen, die sich an der infizierten Stelle angesammelt haben, und eine Funktionsstörung der Endothelzellen, Ödeme und Ischämie hervorrufen, was schließlich zu einer Gewebehypoxie führt und eine günstige anaerobe Umgebung für das Wachstum und die Reproduktion von C. perfringens bereitstellt (Bryant und Stevens, 1996 ). Daher zielt diese Studie auf CPA und PFO ab und zielt darauf ab, eine neue Methode zur Behandlung von Gasbrand aufzuzeigen.

In dieser Studie wurden zwei Toxin-Inhibitoren aus 17 natürlichen Verbindungen durch Hämolyse untersucht, um einen potenziellen Inhibitor von Gasbrand zu finden. Die hämolytischen Daten für verschiedene Verbindungen sind in Tabelle 1 gezeigt. Unter den 17 Arten natürlicher Verbindungen hat Verbascosid die beste Hemmwirkung auf beide Toxine, und wir haben daher Verbascosid als Zielverbindung für diese Studie ausgewählt. Verbascosid ist weit verbreitet in verschiedenen chinesischen Kräutermedizin-Kräutern wie Cistanche und wurde daraus isoliert und extrahiertVerbascosidvon einem italienischen Wissenschaftler im Jahr 1963 (Speranza et al., 2010; Zhu et al., 2016). Das haben Studien gezeigtVerbascosid hat viele biologische und pharmakologische Wirkungen, wie zum Beispielentzündungshemmende, antioxidative, antibakterielle, Antitumor-, antimykotische und chelatbildende Eigenschaften, undkann in der Hautkosmetik verwendet werdenundtopische Präparate.Andere Berichte haben gezeigt, dass Verbascosid innerhalb von 1 Stunde vollständig resorbiert werden kann und eine hohe Blutkonzentration erreicht und dass seine Bioverfügbarkeit bei der Verabreichung über verschiedene Injektionsmethoden 25 Prozent nicht übersteigt (Dai et al., 2017; Feng et al., 2018). Basierend auf den oben genannten pharmakologischen Aktivitäten fand und untersuchte diese Studie die HemmungWirkung von Verbascosidauf Gasbrand durch eine Reihe von In-vitro- und In-vivo-Experimenten.

Verbascosid hemmte die hämolytische Aktivität von PFO und CPA

Es wurde berichtet, dass einige Flavonoide wirksame Inhibitoren gegen porenbildende Toxine sind (Li et al., 2013; Wang et al., 2017; Zhou et al., 2017). Hier wurde festgestellt, dass Verbascosid, ein Phenylpropanoid, die hämolytische Aktivität der von C. perfringens ausgeschiedenen PFO- und CPA-Toxine hemmt. Wenn die Konzentrationen von Verbascosid zwischen 2 und 32 µg/ml lagen, hemmte die Behandlung mit Verbascosid die hämolytische Aktivität dieser Toxine in dosisabhängiger Weise signifikant, was darauf hinweist, dass Verbascosid ein wirksamer Inhibitor von sowohl PFO als auch CPA ist.

Verbascosid beeinflusst das Wachstum von C. perfringens nicht

We further performed MIC and bacterial growth curve studies to determine the antibacterial activity of verbascoside against C. perfringens, revealing a MIC assay result (Figure 2A) >256 μg/ml. In ähnlicher Weise zeigen die Ergebnisse der Bakterienwachstumskurve (Abbildung 2B), dass Verbascosid das normale Wachstum der Bakterien nicht beeinflusst. Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, dass die Behandlung mit Verbascosid keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit von C. perfringens bei den für die Hemmung der PFO- und CPA-Aktivität erforderlichen Konzentrationen hat.

Verbascosid schützt Zellen vor Schäden durch PFO oder CPA

Clostridium perfringens alpha-Toxin und PFO in C. perfringens sind die Haupttoxine, die Gasbrand verursachen; daher wurde auch untersucht, ob Verbascosid Zellen vor diesen beiden Toxinen schützen könnte. Zunächst führten wir einen Zytotoxizitätstest mit dem Wirkstoff Verbascosid durch, der die Zellen nicht schädigte (Abbildung 3A). Dann wurde diese Verbindung dem Co-Kultursystem von Zellen und PFO oder CPA zugesetzt. vErbascosid hemmte die Zytotoxizität dieser beiden Toxinein Caco{{0}}-Zellen. Verglichen mit Proben, die nicht mit Verbascosid behandelt wurden, war der durch die Toxine induzierte Schaden an Caco-2-Zellen, die mit Verbascosid bei 0,5 Jig/mL behandelt wurden, dosisabhängig signifikant reduziert. Insbesondere für das PFO-Protein wurden die Zellen bei einer Wirkstoffkonzentration von 0,25 ig/mL (P < 0,05)="" effektiv="" geschützt.="" ein="" anschließender="" zelllebensfähigkeits-/todesassay="" (figuren="" 3d-k)="" wurde="" weiter="" verwendet,="" um="" diese="" schutzwirkung="" zu="" beweisen.="" wie="" erwartet="" schützte="" die="" behandlung="" mit="" verbascosid="" sichtbar="" vor="" zellschädigung="" durch="" pfo="" oder="" cpa.="" zusammengenommen="" belegten="" unsere="" ergebnisse,="" dass="" verbascosid="" die="" durch="" pfo="" oder="" cpa="" induzierte="" zellschädigung="" dosisabhängig="" signifikant="">

Verbascosid hemmt die hämolytische Aktivität von PFO, indem es seine Oligomerisierung verringert

Die hämolytische Aktivität von PFO muss mit dem Auftreten von Oligomerisierung und Porenbildung einhergehen (Johnson und Heuck, 2014). Hier wurde die Oligomerisierung von PFO durch KCl und Kaninchenblut induziert, und die Oligomerisierung von PFO wurde nachgewiesen (Abbildung 4), was eine verringerte Intensität der Oligomerisierungsbande zeigt, wenn die Konzentration von Verbascosid erhöht wurde. Zusammengenommen legen unsere Ergebnisse nahe, dass die Behandlung mit Verbascosid die Oligomerisierung von PFO hemmt und dadurch die hämolytische Aktivität dieses Toxins reduziert.

Verbascosid schützt Mäuse vor einer C. perfringens-Infektion

Ein Maus-Beinmuskelmodell von Gangrän wurde etabliert, um zu bestimmen, ob der in vitro beobachtete Schutz auch in vivo beobachtet werden kann. Die Beine von ATCC13124--infizierten Mäusen waren dagegen nach der Behandlung mit Verbascosid in der Wirkstoffgruppe signifikant reduziert und das Gewebe intakt. Darüber hinaus war die Zahl der in der Beinmuskulatur angesiedelten Bakterien nach der Behandlung mit Verbascosid signifikant reduziert. Wie in den Versuchsergebnissen gezeigt, starben 93,33 Prozent der infizierten Mäuse innerhalb von 32 Stunden nach der Infektion. Wie erwartet stieg die Überlebensrate von Mäusen, die Verbascosid erhielten, um 33,33 Prozent, da nur 60 Prozent der infizierten Mäuse starben (P=0.015 gemäß einem Log-Rank-Test). Darüber hinaus verzögerte die Behandlung mit Verbascosid den Höhepunkt der Todesperiode um fast 8 Stunden (von 32 Stunden bei ATCC 13124--infizierten Mäusen auf 40 Stunden bei mit Verbascosid behandelten Mäusen) und könnte somit die kostbare Zeit verlängern, die für die klinische Rettung erforderlich ist. Zusammengenommen zeigten unsere Ergebnisse, dass Verbascosid bei Mäusen einen systemisch wirksamen Schutz gegen Gasbrand bieten kann, der durch C. perfringens verursacht wird.

Als grampositives anaerobes Bakterium ist C. perfringens in der Natur weit verbreitet und kann eine Vielzahl von Toxinen sezernieren, die zu einer Vielzahl von Krankheiten bei Mensch und Tier führen können, einschließlich Gasbrand (Fraser und Collee, 1975; Verherstraeten et al ., 2015). Gasbrand wird hauptsächlich durch die Kombination von a- und theta-Toxinen verursacht, die von C. perfringens ausgeschieden werden, was zum Tod infizierter Tiere führen kann, was zu großen wirtschaftlichen Verlusten führt. Bis heute umfassen jedoch wirksame Methoden zur Behandlung von Gasbrand hyperbaren Sauerstoff, Chirurgie und Antibiotika. Unter ihnen kann eine Operation erhebliche körperliche Schäden bei Patienten verursachen und eine sehr unangenehme Auswirkung auf das postoperative Leben haben. Zahlreiche Tetracyclin-Resistenzgene wurden in C. perfringens-Isolaten aus Schweden, Norwegen, Dänemark und anderen Orten gefunden. Daher werden neue Strategien oder Wirkstoffe benötigt, um diese bakterielle Infektion zu bekämpfen (Park et al., 2010; Osman und Elhariri, 2013). In dieser Studie konnte das Phenylpropanoid Verbascosid, das sich von traditionellen antibakteriellen Behandlungen (Antibiotika) unterscheidet, die hämolytische Aktivität von CPA und PFO hemmen, zwei wichtige porenbildende Toxine, die entscheidend zur Pathogenität von C. perfringens beitragen. Auf zellulärer Ebene könnte Verbascosid Caco-2-Zellen in niedrigen Konzentrationen (0,25-2 ig/ml) auch wirksam vor diesen beiden Toxinen schützen. Insbesondere Verbascosid könnte die Aktivitäten der Toxine reduzieren, indem es die Oligomerisierung von PFO hemmt. Diese Ergebnisse könnten ausreichende Basisdaten für die In-vivo-Forschung liefern.