Die Ursache der polyzystischen Nierenerkrankung

für weitere Informationen:ali.ma@wecistanche.com

Überexpression von PKD1 verursacht polyzystische Nierenerkrankung

Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté und Marie Trude

Die zugrunde liegenden pathogenetischen Mechanismenautosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung(ADPKD) müssen noch aufgeklärt werden. Es gibt zwar Hinweise darauf, dass Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Gen-Haploinsuffizienz und Verlust der Heterozygotie können bei Mäusen zur Zystenbildung führen, paradoxerweise hohe Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Expression wurde in den Nieren von ADPKD (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung) Patienten. Um festzustellen, ob Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Funktionsgewinn kann ein pathogenetischer Prozess sein, ein bakterielles künstliches Pkd1-Chromosom (Pkd1-BAC) wurde durch homologe Rekombination modifiziert, um ausschließlich eine anhaltende Pkd1-Expression bevorzugt auf die adulte Niere auszurichten. Es wurden mehrere transgene Linien erzeugt, die das spezifisch überexprimierten Pkdl-Transgen in den Nieren 2-, um die endogenen Pkd1-Spiegel zu 15-zu falten. Alle transgenen Mäuse entwickelten reproduzierbar tubuläre und glomeruläre Kosten und Niereninsuffizienz und starben an Nierenversagen. Dieses Modell zeigt, dass die Überexpression von Wildtyp-Pkd1 allein ausreicht, um eine Zystogenese auszulösen, die der menschlichen ADPKD ähnelt (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung). Unsere Ergebnisse deckten auch eine auffällig erhöhte renale c-myc-Expression bei Mäusen aller transgenen Linien auf, was darauf hindeutet, dass c-myc in vivo ein entscheidender nachgeschalteter Effektor von Pkd1 ist(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Molecular Dathwavs, Diese Studie produzierte nicht nur eine unschätzbare und erste PKD(polyzystische Nierenerkrankung)Modell zur Bewertung der molekularen Pathogenese und Therapien, liefert aber auch Hinweise darauf, dass Funktionsgewinn ein pathogenetischer Mechanismus bei ADPKD sein könnte (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung).

Klicken Sie auf Cistanche für Nierenerkrankungen

Autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung(ADPKD) ist eine der häufigsten genetischen Erkrankungen des Menschen. Es ist durch die fortschreitende Entwicklung multipler Nierenzysten gekennzeichnet, die alle Segmente des Nephrons betreffen. Weitere Manifestationen sind die Bildung von Zysten in Leber und Bauchspeicheldrüse sowie intrakranielle Aneurysmen und kardiovaskuläre Defekte. ADPKD (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung)führt typischerweise zu einer Niereninsuffizienz mit Progression zu einer Nierenerkrankung im Endstadium im späten mittleren Alter.

Ungefähr 85 Prozent von ADPKD (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung)Fälle sind mit Mutationen in der PKD1 assoziiert(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Gen. Diese PKD1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Das Gen ist groß, umfasst 54 kb und besteht aus 46 Exons. Es erzeugt ein 14,2--kb-Transkript und codiert ein 4., ein 302--Aminosäureprotein namens Polycystin-1(4, 9-11). Die menschliche PKD1- und Polycystin-1-Expression wurde bei normaler und ADPKD analysiert (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung)Nieren. Während der Nierenentwicklung wird Polycystin-1 leicht in glomerulären und tubulären Epithelzellen nachgewiesen (Übersicht in Referenz 37 und darin enthaltenen Referenzen). Bei normalen Erwachsenen haben wir und andere gezeigt, dass PKD1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)RNA und Protein werden in den Sammel- und distalen Tubuli in moderaten bis niedrigen Konzentrationen exprimiert, während die Konzentrationen bei ADPKD (~2--fach) anstiegen (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung)Nieren (22, 39). Interessanterweise wird bei der Mehrzahl der Nierenepithelzysten eine anhaltende oder verstärkte Polycystin-1-Expression nachgewiesen, obwohl bei einer signifikanten Minderheit der Zysten keine Färbung auftrat(29). Neben den Nieren ist PKD1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)die Expression ist normalerweise in anderen adulten Geweben weit verbreitet, einschließlich epithelialer und nicht-epithelialer Zelltypen (6, 14, 18, 29, 30, 39).

Mehr als 200 verschiedene PKD1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Es wurden Mutationen beschrieben, von denen die meisten Deletions-Insertion-, Frameshift- oder Nonsense-Mutationen sind. Es wird vorhergesagt, dass diese zu verkürzten Formen des Proteins führen, was mit der Inaktivierung eines Allels übereinstimmt.

Ein erheblicher Anteil sind jedoch Missense- oder In-Frame-Mutationen, die im gesamten Gen gefunden werden und oft nur für eine bestimmte Familie gelten (33, 34). Wie der Name schon sagt, ADPKD (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung)dominant ist und das mutierte PKD1 übertragen wird(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Allel ist ausreichend, um die Krankheit hervorzurufen. Allerdings ist die fokale Natur der Nierenzysten in ADPKD (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung)legt nahe, dass der Mutationsmechanismus für PKD1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)könnte ein Two-Hit oder ein Verlust der Heterozygotie sein. Unterstützung für diesen Mechanismus wurde durch den Nachweis von PKD1 erhalten(Polyzystische Nierenerkrankung 1)klonale somatische Mutationen in Zellen eines signifikanten Anteils von Zysten (3, 21, 32). Ein Mechanismus des Verlusts der Heterozygotie könnte für den stark variierenden Phänotyp verantwortlich sein, der üblicherweise in einzelnen Familien beobachtet wird.

Studien an der Maus Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Das Gen kann aufgrund der großen Ähnlichkeit zwischen dem menschlichen und dem murinen Gen und Genprodukt wertvolle Einblicke in die PKD1-Funktion(en) liefern. Bei normaler Entwicklung wird murines Pkd1 ab dem Morula-Stadium in hohen Konzentrationen exprimiert und in allen Derivaten von Neuralleistenzellen nachgewiesen. einschließlich des erwachsenen Gehirns, des Aortenbogens, des Knorpels und der mesenchymalen Kondensation (16, 17). Es wurde berichtet, dass homozygote mutierte Mäuse, die auf eine Pkd1-Deletion abzielen, im Uterus sterben und Nieren- und Pankreaszysten entwickeln (2, 19, 24-26, 40). Diese früheren Versuche, Mausmodelle zu erzeugen, lieferten postnatal leider keine lebensfähigen Tiere. Dennoch würde das Auftreten von Nierenzysten in diesen homozygoten Pkd1-Mutantenmäusen mit der Hypothese eines Zwei-Treffer-Mutationsmechanismus beim Menschen übereinstimmen, der eine Keimbahnmutation und eine somatische Inaktivierung des normalen Allels umfasst. Allerdings zeigten Mäuse, die für die Pkd1-gerichtete Deletion heterozygot waren, auch PKD mit gelegentlichen Leber- und Pankreaszysten trotz eines späten Auftretens im Erwachsenenalter, was einen Mechanismus der Haploinsuffizienz oder Gendosisreduktion unterstützt. Darüber hinaus ist der Verlust der Heterozygotie oder Haploinsuffizienz möglicherweise nicht der einzige Mechanismus für ADPKD (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung)Pathogenese. Tatsächlich stehen diese Mechanismen im Widerspruch zu der anhaltenden oder verstärkten Expression von PKD1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)bei den meisten menschlichen Nierenzysten beobachtet, es sei denn, es werden nichtfunktionale Proteine ​​produziert. Dieser Befund einer anhaltenden oder erhöhten PKD1-Expression wirft die Frage auf, ob ein Funktionsgewinn oder eine Überexpression wirksam sein könnte. Um den pathogenetischen Mechanismus des Pkd1-Funktionsgewinns zu untersuchen, haben wir ein künstliches murines Pkd1-bakterielles Chromosom (Pkd1-BAC) isoliert und charakterisiert, das anschließend durch homologe Rekombination in Escherichia coli modifiziert wurde, um die Expression von Pkd1 anzusteuern(Polyzystische Nierenerkrankung 1)speziell für die Nieren. Wir berichten über die Produktion von drei transgenen Linien, die das Pkd1-Transgen auf unterschiedlichen Ebenen exprimierten. Alle Mäuse zeigten reproduzierbar eine Reihe von Ähnlichkeiten mit menschlicher ADPKD und entwickelten konsistent einen frühen Beginn mit raschem Fortschreiten der morphologischen und funktionellen Veränderungen der Nieren und starben im mittleren Alter an Nierenversagen. Darüber hinaus beschreibt die aktuelle Studie einen In-vivo-Mechanismus, durch den Pkd1 diesen PKD-Phänotyp vermitteln kann. Diese Mäuse stellen das erste Modell von PKD dar, das durch die alleinige renale Überexpression des orthologen PKD1 erzeugt wird(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Gen.

MATERIALEN UND METHODEN

Isolierung von BAC-Klonen, die Pkd1 enthalten(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Ort. Pkd1-BAC-Klone aus dem bakteriellen Wirtsstamm E. coli DH10B (RecA; RecBC) wurden aus einer 129Sv-Maus-pBelo11BAC-Bibliothek (Research Genetics) isoliert. Das Screening von BAC-Superpools wurde durch PCR mit den folgenden Primern durchgeführt: 5 Regionen, 5-CTG ATGAGTTCTGGCCATGGATG-3 (Vorwärts-Pkd1-Exon 1) und 5-CTGCCA GCCAATGCCATAGTCAC-3 (Rückwärts Pkd1-Exon 1); und 3 Regionen, 5-TCG GCCCTAGCGTCTGCAGCC-3 (Vorwärts-Pkd1-Exon 39) und 5-TCCAGTCC CACCTACAGCCAAC-3 (Rückwärts-Pkd1-Exon 40). Ein positiver Klon für beide Amplifikationen wurde identifiziert und auf Standardgel und Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE), gefolgt von Southern-Blotting, analysiert. Für die Southern-Blot-Analyse wurden sieben Maus-Pkd1-Sonden entwickelt: genomisches Exon 1 (516 bp; Nukleotide [nt] 1 bis 516; NCBI-Zugangsnummer U70209), genomisches Exon 2-3 (220 bp), genomisches Exon {{ 31}} (8.479 bp), cDNA-Exon 15-20 (1.724 bp; nt 6455 bis 8179), cDNA-Exon 25-34 (1.315 bp; nt 9415 bis 10730), cDNA-Exon 36-45 ( 1.655 bp; nt 10963 bis 12618) und genomisches Exon 45-46 (1.640 bp) (16). Mehrere Regionen, einschließlich der BAC-Insert-Extremitäten dieses murinen Pkd1-BAC, wurden ebenfalls sequenziert und es wurde bestätigt, dass sie ortholog zum menschlichen PKD1-Gen und angrenzenden Regionen sind.

ERGEBNISSE

Herstellung von SBPkdl(Polyzystische Nierenerkrankung 1) rAc-BAC durch homologe Rekombination. Um zu bestimmen, ob die Pkd1-Funktionsverstärkung allein ausreicht, um die ADPKD zu erzeugen (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung)Phänotyp isolierten wir zuerst einen genomischen Klon, der das gesamte Pkdl-Gen in einer BAC-Vektor-129/Sv-Bibliothek enthält. Diese Bibliothek wurde durch PCR mit zwei Sätzen von Primern für das Pkd1-Gen gescreent, das Exon 1 am 5'-Ende und die Exons 39 bis 40 zum 3'-Ende hin umspannte (Fig. 1). Ein positiver BAC-Klon für das Pkd1-Gen wurde identifiziert, der den gesamten angrenzenden Tsc2-Genkörper umfasste. Das Pkd1-Insert wurde detailliert charakterisiert, um sicherzustellen, dass die genomische Struktur mit der des endogenen Pkd1 übereinstimmt(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Gen des Mausstamms 129/Sv, von dem das Insert stammt, und des Inzuchtstamms C57BL/6J. Genomkarten des Pkd1-Locus im BACand in diesen Inzuchtstämmen durch Southern-Blot-Analyse mit vier Restriktionsenzymverdauungen und sieben Sonden, die das gesamte Pkdl-Gen abdecken, erschienen identisch, ohne Anzeichen von Umlagerungen (Fig. 1). Dieses BAC enthielt ein ~121- kb-Insert, einschließlich -37 kb einer stromaufwärts gelegenen und -39 kb einer stromabwärts gelegenen Sequenz von Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Gen, bestimmt durch Elektrophorese und Sequenzierung.

Dieser Pkd1-BAC-Klon wurde durch zwei aufeinanderfolgende homologe Rekombinationsereignisse in E.coli modifiziert. Die Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Gen wurde in Exon 10 markiert, indem ein Nukleotid (G zu A) ersetzt wurde, um eine neue EcoRI-Stelle an Position 2355 auf der cDNA-Karte zu erzeugen. Diese stille Punktmutation wurde erzeugt, um die Pkd1 zu unterscheiden(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Gen und Transkript des BAC von dem endogenen Ursprungs. Darüber hinaus haben wir die 5'-regulatorischen Elemente des Pkd1-BAC-Gens ersetzt, indem wir die zuvor identifizierten "SB"-Nierenepithel-spezifischen Elemente aus dem SBM (verknüpft mit c-Myc) oder SBF, verknüpft mit c- fos)-Konstrukt-Transgen, um die Expression auf die Nieren zu beschränken (36, 38) (Fig. 2a).

Dieses neue SBPkd1TAc-BAC wurde mit Notl verdaut, einer einzigartigen Stelle, die sich unmittelbar stromaufwärts der SB-Elemente befindet, und ClaI innerhalb des Tsc2-Genkörpers, wodurch die regulatorischen Tsc2-Elemente und die 5'-Hälfte des Genkörpers verkürzt wurden, um sicherzustellen, dass keine exogene Tsc2-Expression stattfindet in allen Geweben und zur Entfernung der prokaryotischen BAC-Vektorsequenzen (Abb. 1 und 2). Dieses 70- kb Not1-Clal-linearisierte Fragment wurde isoliert, gereinigt und für die Oozyten-Mikroinjektion quantifiziert (36).

Produktion und Analyse von transgenen SBPkd1rAc-Mäusen. Vier transgene Gründer, die mehrere Kopien des SBPkd1rAc-Transgens trugen, entwickelten konsequent PKD(polyzystische Nierenerkrankung). Aus den vier durch Southern-Analyse bestimmten SBPkdlrAc-Gründermäusen wurden drei transgene SBPkd1rAG-Linien mit zwei bis neun Kopien des Transgens etabliert (Fig. 2b). Die Charakterisierung der Transgenintegrität in diesen Linien wurde mit 5'-, internen und 3'-Sonden überwacht, wie durch repräsentative Beispiele in Fig. 2b gezeigt. Transgene Linien zeigten mit der 5'-"SB"-Sonde eine Bande bei 10,9 kb, die damit übereinstimmt, dass das SBPkd1rAc-Transgen in einer Kopf-an-Schwanz-Orientierung integriert ist, und zeigten mit der 3'-Sonde eine 7,1--kb-Bande (Abb. 2b). Darüber hinaus detektierte die interne Sonde die endogene Pkd1-Bande von 9,4-kb sowie die Banden von 6,9-kb und 2,5-kb des Transgens aufgrund der EcoRI-Insertionsstelle in Exon 10 (Abb. 2b). Diese Mäuse enthielten vollständige Kopien des Transgens, basierend auf der Analyse der genomischen überlappenden Struktur.

Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Funktionsgewinn in erwachsenen transgenen SBPkdlrAc-Mäusen. Die Expression des SBPkdlrAG-Transgens und des Pkd1-Gens wurde in verschiedenen Organen untersucht. Die Quantifizierung der Transkriptspiegel des Transgens und/oder des endogenen Gens wurde durch Northern-Blot-Analyse durchgeführt (Fig. 3a). Wie erwartet waren die transgenen und endogenen Gentranskripte von ähnlicher Länge (14,2 kb). Basierend auf der Kontroll-GAPDH-Expression wiesen die Nieren aller SBPkd1TAG-Mauslinien eine konsistent erhöhte Transkriptexpression im Vergleich zu normalen Pkdl-Spiegeln in erwachsenen Nieren (n=3) ähnlichen Alters auf. Renale transgene und endogene Expression für die verschiedenen transgenen Linien zeigten einen Bereich von 2-- bis 15--fach über den endogenen Pkd1-Niveaus der Kontrollniere (Abb. 3a). Insbesondere transgene Linie 39 (n {{11}) }) zeigte einen höheren Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Ebenen als Zeilen 3 (n=3) und 41 (n =4). Darüber hinaus korrelierten die durch Northern-Blot-Analyse gemessenen Pkd1-Expressionsniveaus mit denen, die durch Echtzeit-PCR unter Verwendung von Primern in den Exons 1 und 2 erhalten wurden (Abb. 3b).

Die Quantifizierung der transgenen Expressionsniveaus wurde speziell durch Real-Time-PCR und semiquantitative RT-PCR in den drei transgenen Linien im Erwachsenenalter unter Verwendung von Primern in der 5'-untranslatierten Region (B, -Globin-Promotor) und in Exon 2 von Pkd1 durchgeführt(Polyzystische Nierenerkrankung 1)(Abb.3b). Die SBPkdlrAc-Expression in transgenen Mäusen wurde mit dem Genprodukt des ribosomalen S16-Proteins als internem Standard verglichen. Die für die semiquantitative RT-PCR-Amplifikation verwendeten Bedingungen lagen im linearen Bereich. Die Transgenexpression durch Echtzeit-PCR und semiquantitative RT-PCR zeigte konsistent und spezifisch die höchste Expression in der Niere aller transgenen Linien im Vergleich zu anderen Organen (Abb. 3b und c). Die Nierenexpressionsniveaus für eine einzelne Probe waren mit jeder der verwendeten Nachweistechniken reproduzierbar. Die höchsten Ebenen von Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)transgene renale Expression wurde für die Linien 39 und 41 gemessen. Um zu überwachen, ob die erhöhte Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Expression aus dem Transgen oder dem endogenen Gen resultierte, wurde die gleiche Gruppe von Mäusen aus den drei transgenen Linien hinsichtlich der renalen Pkd1-Transgenexpression und der renalen Pkd1-Gesamtexpression (Transgen und endogenes) durch Echtzeit-PCR verglichen. Interessanterweise zeigten die Linien 39 und 41 relativ zu Linie 3, dass die erhöhte Nierenexpression des Pkdl-Transgens ähnlich oder höher war als die der Pkd1-Gesamtnierenexpression, was darauf hindeutet, dass das Transgen spezifisch für diese induzierte Expression verantwortlich ist. In verschiedenen Organen (einschließlich Herz, Lunge, Gehirn, Leber, Bauchspeicheldrüse und Milz) zeigte das SBPkd1rAg-Transgen eine sehr schwache Expression, die gelegentlich in Milz und Lunge nachgewiesen wurde, mit geringer bis nicht nachweisbarer Expression in anderen Organen (Abb. 3b). Die Quantifizierung durch Echtzeit-PCR zeigte eine 10-- bis 1,000--fach geringere Transgenexpression in extrarenalen Geweben im Vergleich zur Nierenexpression (Abb. 3c). Die "SB"-regulatorischen Elemente des SBPkdlrA-Transgens verliehen eine bevorzugte renale Expression; diese besondere Organverteilung wurde auch bestimmt, wenn sie in Transgenen verwendet wurde, die mit c-myc (SBM) und c-fos (SBF) verknüpft waren (36, 38).

C-myc, ein nachgeschalteter Effektor von Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Signalwege in SBPkdlrAc-Mäusen. Um einen Einblick in den intrazellulären pathogenetischen Mechanismus von transgenen SBPkdlrAg-Mäusen zu erhalten, versuchten wir als nächstes, das c-myc-Nierenexpressionsniveau zu überwachen, basierend auf unserer früheren Beobachtung der c-myc-Deregulierung in menschlicher ADPKD (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung)Nieren(22). Eine Analyse der Nieren wurde von allen drei transgenen Linien 3(n =4), 39(n =7) und 41 (n=4) sowie Kontrollen durchgeführt (n=4). Wie in Fig. 3d gezeigt, gibt es eine beträchtliche Expression von endogenem c-myc, das in SBPkd1TAG-Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen ähnlichen Alters induziert wird. Interessanterweise das Niveau der c-myc-Expression in einigen SBPkd1-c-Nieren. insbesondere Linie 39, erreichte Niveaus, die mit denen vergleichbar waren, die in dem transgenen PKD-SBM-Mausmodell beobachtet wurden, das durch renale c-myc-Expression erzeugt wurde.

Nierenanomalien bei SBPkd1raG-Mäusen ähnlich der PKD(polyzystische Nierenerkrankung). To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size(Fig.4a and b). SBPkdl-AG kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n =25;n>6 für jede Linie) entwickelten mehrere tubuläre (T) und glomeruläre Zysten (G) (Abb. 4d und e). Transgene Mäuse zeigten eine tubuläre epitheliale Hyperplasie (Pfeilspitze), die sowohl zystische als auch nicht-zystische Tubuli und häufige Hypertrophie umfasste ( 4g und h), aber der Schweregrad variierte zwischen einzelnen Mäusen. Interstitielle Fibrose (F), perivaskuläre lymphoide Infiltrate und proteinhaltige Zylinder (P) wurden häufig beobachtet (Abb. 4d und e).

Um die Lokalisationsstelle erhöhter Pkd1 genauer zu definieren(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Expression in den Nieren führten wir eine In-situ-Hybridisierung unter Verwendung der zuvor verwendeten Exon-36-45-Sonde durch (16). Das Hybridisierungssignal wurde spezifisch auf die Epithelzellen lokalisiert, die Zysten und hyperplastische Tubuli sowie glomeruläre Zysten auskleiden. Darüber hinaus wurde ein gewisses Signal über dem Epithel von nicht zystischen oder leicht erweiterten Tubuli gesehen, was wahrscheinlich Tubuli identifiziert, die für zukünftige zystische Veränderungen prädestiniert sind (Abb. 4i und j).

Eine histologische Analyse der Nieren wurde auch an transgenen Mäusen bei der Geburt (n =8), postnatalen Tag 10 (P10) (n =3), P20 (n =5), P35 (n { {7}}) und P45(n=3) im Vergleich zu negativen Wurfgeschwistern derselben Altersgruppe (n 2 bis 4). Interessanterweise zeigten alle neugeborenen transgenen Mäuse eine tubuläre und glomeruläre Dilatation im Vergleich zu Kontroll-negativen Wurfgeschwistern ( 4k und 1 ), was anzeigt, dass Nierenanomalien in utero initiiert wurden, wie bei SBM-Mäusen und bei ADPKD beobachtet (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung)Patienten. Die tubuläre und glomeruläre Dilatation nahmen mit fortschreitendem Alter an Größe und Anzahl zu. Bei P35 zeigten transgene Mäuse eine schwerere Hyperplasie und Hinweise auf Glomerulosklerose. Veränderte physiologische Nierenfunktionen bei SBPkd1TAG-Mäusen. Die physiologischen Nierenfunktionen aller transgenen Mäuse zeigten ähnliche Merkmale wie PKD(polyzystische Nierenerkrankung), während die nicht-transgenen Wurfgeschwister nie die Krankheit entwickelten. Innerhalb weniger Monate nach der Geburt entwickelten die betroffenen Tiere eine chronische Niereninsuffizienz. Diese Tiere wurden auf Nierenfunktionsparameter durch Messung von Serum- und Urinspiegeln, Blutharnstoffstickstoff (BUN) und Kreatinin, Urinosmolalität, Urinprotein und Ionenausscheidung überwacht (Tabelle 1). Alle Mäuse aus den drei Linien zeigten im Vergleich zu den Kontrollen Konzentrationsstörungen, ein häufiger Befund bei ADPKD, und zeigten folglich verringerte BUN-, Kreatinin-, Protein- und Eisenkonzentrationen im Urin. Transgene SBPkd1TAG-Gründer und Nachkommen (n 6) aus jeder Linie wurden qualitativ auf Proteinurie in Urinproben durch SDS-PAGE überwacht ( 5 ). Mäuse, die älter als 2 Monate waren, zeigten eine nichtselektive Proteinurie, die mit zunehmendem Alter fortschritt. Außerdem waren die Serum-BUN- und -Kreatininspiegel erhöht, was auf eine Niereninsuffizienz hinwies (Tabelle 2). Da chronische Niereninsuffizienz häufig zu Veränderungen der hämatologischen Parameter führt, wurden diese an SBPkd1TAG-transgenen Mäusen im Alter von 3 bis 14 Monaten untersucht (Tabelle 2). Diese transgenen Mäuse waren anämisch, was durch die signifikant verringerte Anzahl roter Blutkörperchen belegt wurde, wobei Hämoglobin und Hämatokrit die Hälfte der normalen Werte erreichten. Andere Erythrozytenparameter, wie der Prozentsatz an Retikulozyten, blieben wie erwartet unbeeinflusst, wenn sie durch einen Nierenschaden induziert wurden. Diese Tiere starben durchweg an Nierenversagen im Alter von 5,9  2,8 Monaten (n 42) für die transgene Linie 39 und in späteren Altern, 14,6 3,1 Monaten (n 20) und 11 .7 6.5 Monate (n 7), für Zeile 3 bzw. 41.

FEIGE. 1. Schematische Darstellung und detaillierte Restriktionskartenanalyse eines murinen Pkd1-BAC.

Genomische DNA-Verdauungsmuster des Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)-BAC wurden mit denen von Pkd1 verglichen(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Locus in den 129Sv- und C57Bl/6J-Inzucht-Mausstämmen. Sieben Sonden, die den größten Teil des murinen Pkd1-Gens umfassen, wurden hergestellt:

(a) Exon 1, (b) Exon 2-3, (c) Exon 7-15, (d) Exon 15-20, (e) Exon 25-34, (f) Exon 36-45 und (g) Exon 45-46, markiert a bis g auf dem genomischen Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Darstellung und über einzelne Blots.

Southern-Blot-Analyse nach Restriktionsverdaus (BamHI, EcoRI, HindIII und KpnI) von genomischer DNA aus Pkd1-BAC und murinem Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Loci zeigten mit allen sieben Sonden identische Muster. M, HindIII-Marker; 129, 129/Sv; C57, C57Bl/6J.

DISKUSSION

Hier berichten wir über die Isolierung und Charakterisierung eines murinen Pkd1-BAC. Diese Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Das Gen wurde markiert und regulatorische Elemente wurden ersetzt, um die Expression durch zwei aufeinanderfolgende homologe Rekombinationsereignisse spezifisch auf die Nieren auszurichten. Transgene Mäuse, die mit diesem neuartigen SBPkd1TAG-Gen produziert wurden, zeigten einen 2-- bis 15--fachen Anstieg der Pkd1-Expression und entwickelten reproduzierbar frühe morphologische Veränderungen der Niere, die für PKD typisch sind. Niereninsuffizienz ist im mittleren Alter offensichtlich, und Mäuse sterben vorzeitig an Nierenversagen. Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass der für diesen Phänotyp verantwortliche Pkd1-Überexpressionsmechanismus durch die Signalaktivierung von c-myc in vivo vermittelt wird. Diese Studie zeigt, dass der murine Pkd1-Funktionsgewinn in den Nieren ausreicht, um einen PKD-Nierenphänotyp zu erzeugen. Da das murine Pkd1-Gen nicht wie beim Menschen dupliziert wird (27), haben wir direkt einen BAC-Klon identifiziert und isoliert, der das gesamte Pkd1-Gen enthielt. Die vollständige Charakterisierung des murinen 129/Sv-Pkd1-BAC und der indirekte Vergleich mit zwei anderen Inzucht-Mausstämmen bestätigten die Integrität des Pkd1-Locus. Das Pkd1-BAC-Insert enthielt 37 bis 39 kb stromaufwärts und stromabwärts gelegene Sequenzen des Pkd1-Gens. Unsere Analyse zeigte, dass das Pkd1-Gen in diesem BAC ein echter muriner Wildtyp-Lokus war, der für weitere Studien dienen könnte. Obwohl es starke Hinweise darauf gibt, dass die Zystenbildung bei ADPKD auftritt (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung)kann aus dem Verlust der Heterozygotie nach somatischer Inaktivierung der normalen PKD1 resultieren(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Allel (3, 21, 32), gibt es auch Hinweise auf eine anhaltende oder sogar erhöhte Polycystin-1-Expression im zystischen tubulären Epithel (22, 29). Die letztgenannte Beobachtung wirft die Frage auf, ob die Überexpression von Pkd1 per se eine hinreichende unmittelbare Ursache der Zystogenese ist. In transgenen Mäusen, die die menschliche PKD1 tragen(Polyzystische Nierenerkrankung 1), TSC2, RAB 26, NTHL1 und SLC9A3R2-Gene entwickelten nur eine Minderheit von Mäusen Zysten und keine hatte trotz 30 Kopien des Transgens eine nachweisbare Transgenexpression im Erwachsenenalter (31). Bei diesen transgenen Mäusen war es schwierig, eine klare Rolle für die Pkd1-Überexpression bei der Zystogenese festzustellen. Unser Modell unterscheidet sich dadurch, dass nur zwei bis neun Wildtyp-Kopien von Pkd1 ohne zusammenhängende Gene in transgene Mäuse integriert wurden. Da das Pkd1-Gen essentielle Funktionen in verschiedenen Organen oder Geweben hat, wie für zahlreiche Mäuse mit Ablation des Pkd1-Gens beschrieben, könnte eine systemische Überexpression von Pkd1 zu zusätzlichen Störeffekten führen. Folglich haben wir uns mit der Rolle des Pkd1-Funktionsgewinns befasst, indem wir einen Ansatz verwendet haben, der Pkd1 speziell auf die Nieren abzielt. Durch homologe Rekombination haben wir zuerst die stromaufwärts gelegene regulatorische Region von Pkd1 durch die renal eingeschränkten regulatorischen Elemente "SB" ersetzt, wodurch die verringerte Genexpression, die normalerweise für Pkd1 im Erwachsenenalter beobachtet wird, sowie eine potenzielle sekundäre Rückkopplungsschleifenregulation verhindert werden (36, 38). Zweitens haben wir das murine Pkd1-Transgen (Pkd1TAG) mit einer stillen Punktmutation in Exon 10 markiert, aber kein Epitop-Tag eingefügt, um sicherzustellen, dass ein voll funktionsfähiges "Wildtyp"-Protein mit konservierter Struktur und Integrität produziert wird. Aus diesem modifizierten BAC wurde ein SBPkd1TAG-Fragment vom Tsc2-Gen und BAC-Vektor entfernt, um eine Störung durch das Tsc2-Gen zu verhindern, das auch einen zystischen Phänotyp induzieren kann (8, 20, 28), sowie um die inhibitorische Wirkung von zu vermeiden prokaryotische Sequenzen (5).

Vier verschiedene transgene SBPkd1TAG-Gründermäuse und drei unabhängige Linien wurden mit spezifischem Nieren-Pkd1 produziert(Polyzystische Nierenerkrankung 1)-verstärkter Ausdruck. Besonders auffällig ist die vollständige Penetranz des Phänotyps bei diesen transgenen Mäusen. Die SBPkd1TAG-Gründer- und -Mauslinien teilten mehrere physiopathologische Merkmale mit ADPKD (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung). Dazu gehören die Entwicklung von Zysten in Cortex, Medulla und Glomeruli zusammen mit epithelialer Hyperplasie, interstitieller Fibrose und fokaler interstitieller Entzündung.

Denn die PKD(polyzystische Nierenerkrankung)Phänotyp konsistent in allen verschiedenen transgenen Gründermäusen beobachtet wurde und die Transgen-Integration in das Mausgenom ein Zufallsphänomen ist, kann der Phänotyp nicht aus einem chromosomalen Positionseffekt resultieren, sondern nur aus einer erhöhten Pkd1-Expression. Tatsächlich wurde gezeigt, dass die Expression des Pkd1-Transgens in allen Linien auf die Nieren beschränkt ist, wie zuvor für andere Transgene beobachtet wurde, die durch die "SB"-Elemente reguliert werden (36, 38). Darüber hinaus wurde diese erhöhte Pkd1-Expression durch das Transgen und nicht durch eine indirekte endogene Pkd1-Aktivierung verursacht. Daher liefern unsere Ergebnisse einen klaren Beweis dafür, dass der Funktionsgewinn einer funktionellen Wildtyp-Pkd1 mehrere Nierenzysten hervorrufen kann. Wichtig ist, dass diese SBPkd1TAG-Mäuse das erste Mausmodell darstellen, das durch die alleinige Überexpression des Mausorthologs des menschlichen PKD1-Gens erzeugt wurde.

Die SBPkd1TAG-Mäuse zeigen, dass Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Überexpression ist ein primärer pathogenetischer Mechanismus der renalen Zystogenese. Wichtig ist, dass die höchsten Transgen-Expressionsniveaus in den Nieren mit dem Fortschreiten und der Schwere des Phänotyps zu korrelieren schienen. Wir fanden auch heraus, dass die Pkd1-Überexpression bei der Entwicklung des SBPkd1TAG-Phänotyps wahrscheinlich die Aktivierung von c-myc in vivo signalisiert. Es ist denkbar, dass diese Aktivierung sogar direkt durch den C-terminalen Schwanz von Polycystin-1 erfolgen könnte, der einer proteolytischen Spaltung und Kerntranslokation unterzogen wird (7). Da gezeigt wurde, dass eine verstärkte renale Expression von c-myc in erwachsenen Mäusen PKD induziert, wäre es sehr konsequent, c-myc als einen wichtigen nachgeschalteten Effektor von Pkd1-Signalwegen zu unterstützen. Dieses Ergebnis korrelierte auch mit unseren früheren Befunden einer erhöhten c-myc-Expression in den Nieren aller menschlichen ADPKD (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung)analysiert (22). Insgesamt weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass c-myc ein primärer Mediator von Pkd1 ist(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Zystogenese. Unsere Ergebnisse aus dem Pkd1-Funktionsgewinnmodell weisen zusammen mit muriner Pkd1-Haploinsuffizienz und Funktionsverlust darauf hin, dass jede Pkd1-Dysregulation zu Zystogenese führen könnte (2, 19, 23–26, 31, 40).

Schwere Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Ungleichgewicht bei Mäusen, induziert durch Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Ablation oder transgene Überexpression verursachten einen frühen Beginn und ein schnelles Fortschreiten von Nierenzysten und betrafen einen hohen Anteil an Tubuli. Im Gegensatz dazu führte ein milderes Pkd1-Ungleichgewicht wie Haploinsuffizienz zu einem langsameren Fortschreiten der PKD mit mehr fokalen Zysten. Die scheinbar paradoxe Entwicklung eines ähnlichen Phänotyps durch entgegengesetzte Polycystin-1-Dysregulation könnte durch das gemeinsame Ergebnis erklärt werden, nämlich ein relatives Ungleichgewicht der Proteinkonzentration, das die Bildung oder Funktion eines aktiven Polycystin-Multiproteinkomplexes verändern könnte. Zusammengenommen argumentieren unsere Ergebnisse und die anderer Forscher, dass der Mechanismus der Zystenbildung bei ADPKD (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung)ist wahrscheinlich auf drei pathogenetische Mechanismen zurückzuführen: Funktionsgewinn, Funktionsverlust und Gendosiseffekte. Die neuartigen SBPkd1TAG-Mäuse stellen ein leistungsstarkes Modell der renalen Zystogenese dar, das wichtige Einblicke in die Pathophysiologie der PKD liefern kann(polyzystische Nierenerkrankung), Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Signaltransduktionswege und Interaktionspartner. Die Untersuchung dieses Modells kann auch zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien führen, um das normale Proteingleichgewicht innerhalb des multimeren Pkd1-Komplexes wiederherzustellen.

VERWEISE

1. Blouin, MJ, H.Beauchemin, A.Wright, MEDe Paepe, M.Sorette, A.-M. Bleau.B. Nakamoto. C.-N, Ou, G. Stamatovannopoulos und M. Trudel 2000. Genetische Korrektur der Sichelzellkrankheit: Einblicke mit transgenen Mausmodellen. Nat. Med. 6: 177-182.

2. Boulter, C., S. Mulroy, S. Webb, S. Fleming, K. Brindle und R. Sandford. 2001. Herz-Kreislauf-, Skelett- und Nierendefekte bei Mäusen mit gezielter Störung des Pkd1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)gene.Proc. Natl. Akad. Wissenschaft. USA 98:12174-12179.

3. Brasier, JL und EPHenske.1997.Loss of thepolyzystische Nierenerkrankung(PKD1)-Region des Chromosoms 16p13 in Nierenzystenzellen unterstützt ein Funktionsverlustmodell für die Zystenpathogenese. J. Clin. Investig.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connors, WRDackowski, LRPetry, TJVan Raay, JM Millholland, M. Venet, G. Miller, RM Hakim, GM Landes, KW Klinger, F. Qian, LF Onuchic, T. Watnick, GG Germino, and NA Doggett.1995. Analyse der genomischen Sequenz für dieautosomal dominant polyzystische Nierenerkrankung(PKD1)-Gen sagt das Vorhandensein einer leucinreichen Wiederholung voraus. Summen. Mol. Genet.4: 575-582.

5. Chada, K, J. Magram, K. Raphael, G. Radice, E. Lacy und F. Costantini. 1985. Spezifische Expression eines fremden Globin-Gens in erythroiden Zellen von transgenen Mäusen. Natur 314: 377-380.

6. Chauvet, V, F. Qian, N. Boute, Y. Cai, B. Phakdeekitacharoen, LF Onuchic, T. Attie-Bitach, L. Guicharnaud, O. Devuyst, GG Germino und M.-C. Gübler.2002. Expression von PKD1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)und PKD2(polyzystische Nierenerkrankung 2)Transkripte und Proteine ​​im menschlichen Embryo und während der normalen Nierenentwicklung. Bin. J. Pathol 160: 973-983.

7. Chauvet, V., X. Tian, ​​H. Husson, DHGrimm, T. Wang, T. Hiesberger, P. Igarashi, AM Bennett, O. Ibraghimov-Beskrovnava, S. Somlo und MJ Caplan.2004. Mechanische Stimuli induzieren Spaltung und Kerntranslokation des Polycystin-1-C-Terminus. J. Clin. Untersuchen. 114: 1433-1443.

8. Cheadle, JPMP Reeve, JR Sampson und DJ Kwiatkowski.2000. Molekulargenetische Fortschritte bei der tuberösen Sklerose. Summen. Genet.107: 97-114. 9. Konsortium, EPKD1993. Identifizierung und Charakterisierung des Gens für tuberöse Sklerose auf Chromosom 16. Zelle 75: 1305-1315.

10. Konsortium, EPKD1994. Das Gen für die polyzystische Nierenerkrankung 1 codiert ein 14-kb-Transkript und liegt in einer duplizierten Region auf Chromosom 16. Zelle 77: 881-894.

11. Konsortium, IPKD1995. Polyzystische Nierenerkrankung: die vollständige Struktur der PKD1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Gen und sein Protein. Zelle 81: 289-298.

12. Couillard, M., R. Guillaume, N. Tanji, V. DAgati und M. Trudel.2002. c-myc-induzierte Apoptose bei polyzystischer Nierenerkrankung ist unabhängig von der FasL-Fas-Wechselwirkung. Krebsres. 62: 2210-2214.

13. De Paepe, ME und M. Trudel.1994. Die transgene SAD-Maus: ein Modell der menschlichen Sichelzellen-Glomerulopathie. Niere Int. 46: 1337-1345.

14. Geng, L., Y. Segal, B. Peissel, N. Deng, Y. Pei, F. Carone, HG Rennke, AM Glücksmann-Kuis, MC Schneider, M. Ericsson, STreeders und J. Zhou. 1996. Identifizierung und Lokalisierung von Polycystin, der PKD1(Polyzystische Nierenerkrankung 1)Genprodukt. J. Clin. Untersuchen. 98:2674-2682.

15. Gong, S., XWYang, C. Li und N. Heintz. 2002. Hocheffiziente Modifikation bakterieller künstlicher Chromosomen (BACs) unter Verwendung neuartiger Shuttle-Vektoren, die den R6Ky-Replikationsursprung enthalten. Genomres. 12;1992-1998.