Der epigenetische Regulator BRD4 ist an der durch Cadmium ausgelösten Entzündungsreaktion in Rattennieren beteiligt

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Zhongguo Gonget al

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ABSTRAKT

Cadmium (Cd) wurde als potenzieller Entzündungsauslöser beschrieben, während zunehmende Beweise zeigen, dass unangemessene Entzündungen ein beitragender Faktor sindNierenverletzung. Daher ist die Erforschung der Cd-getriggerten Entzündungsreaktion von großer Bedeutung für die Aufklärung des Mechanismus der Cd-induzierten Nephrotoxizität. Bromodomänenhaltiges 4(BRD4) ist ein wichtiger epigenetischer Regulator, der an der Entwicklung vieler entzündlicher Erkrankungen beteiligt ist, aber seine regulatorischen Rollen in Cd-ausgelöst werdenentzündlichAntwort noch zu klären. Hier fanden wir die Behandlung mit Cd bei Sprague-Dawley-Ratten (2 mg/kg KG, ip, 5 aufeinanderfolgende Tage) und bei RattenNierenzelleLinie (NRK{{0}}E, 0–10 μM, 12 h) induzierte die Transkription inflammatorischer Zytokine, die durch JQ1 (BRD4-Inhibitor, 25 mg/kg KG, ip , 3 aufeinanderfolgende Tage in vivo; 0,5 μM, 12 h in vitro) oder BRD4 small interfering RNA (siRNA, in vitro), was darauf hindeutet, dass BRD4 an der Cd-ausgelösten Entzündungsreaktion beteiligt ist. Als nächstes klärte unsere Studie die Rolle von BRD4 bei der Cd-ausgelösten Entzündungsreaktion. Die Hemmung von BRD4 verringerte die Cd-geförderte NF-κB-Kerntranslokation und -Aktivierung in vivo und in vitro. Cd erhöhte das Acetylierungsniveau von RelA K310 und verstärkte die BRD4-Bindung an acetyliertes NF-κB RelA in vivo und in vitro, die durch die Hemmung von BRD4 aufgehoben wurden. Zusammenfassend legt unsere Studie nahe, dass BRD4 an der Cd-getriggerten Transkription von entzündlichen Zytokinen beteiligt ist, indem es die Aktivierung des NF-κB-Signalwegs vermittelt und die Bindung an acetyliertes NF-κB RelA bei Ratten erhöhtNiere,daher könnte BRD4 ein potenzielles therapeutisches Ziel für Cd-induzierte Nierenerkrankungen sein.

Schlüsselwörter: BRD4CadmiumNierenentzündungZytokine NF-κB JQ1

1. Einleitung

Cadmium (Cd) ist ein Schwermetallschadstoff mit hoher Toxizität und langer Halbwertszeit. Mit der Entwicklung der industriellen Produktion hat die zunehmende Bedrohung der Umweltsicherheit und der menschlichen Gesundheit durch Cd-Belastung Anlass zur Sorge gegeben (Wang et al., 2020; Horiguchi und Oguma, 2016). Nachdem es vom Körper aufgenommen wurde, induziert Cd Multi-Organ-Schäden und dieNiereist das Hauptzielorgan (Fernando et al., 2020; Zhao et al., 2021). Zuvor haben wir systematisch verifiziert, dass Autophagiehemmung, oxidativer Stress und Apoptose synergistisch zur Cd-verursachten Nephrotoxizität bei Ratten beitragen (Liu et al., 2017; Wang et al., 2017). Entzündung ist eine physiologische Reaktion, die als Abwehrreaktion gegen Infektionen oder Verletzungen wirkt, aber Cd-induzierte unkontrollierte und unangemessene Entzündungsreaktionen können Schäden verursachen, wie z a., 2020). Cd-ausgelöste Entzündungsreaktion verschlimmerte Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Leberschäden, was darauf hindeutet, dass Entzündungen eine wichtige Rolle bei Cd-vermittelten spielen könnenNierepathologische Prozesse (Fagerberg et al., 2017; Almeer et al., 2019).

Epigenetik bezieht sich auf vererbbare Modifikationen in der Genexpression basierend auf Nicht-DNA-Sequenzänderungen, und die Reversibilität dieser Modifikationen ermöglicht die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele (Vendetti und Rudin, 2013). Die Familie der Bromodomänen und extraterminalen Domänen (BET) umfasst Bromodomänen enthaltend 2 (BRD2), BRD3, BRD4 und Bromodomänen testisspezifisch (BRDT), die durch zwei Bromodomänen und die Bindung an acetylierte Lysine von Histonen und Nicht-Histon ( Lochrin et al., 2014; Chatterjee und Bohmann, 2018). BET-Proteine ​​fungieren als transkriptioneller Co-Aktivator vieler Gene und regulieren so Zellzyklus, Entzündungsreaktion, oxidativen Stress und andere physiologische Prozesse in verschiedenen pathologischen Modellen (Jiao et al., 2020; Wang et al., 2019b). BRD4 ist ein besonders gut untersuchtes Mitglied der BET-Proteinfamilie, und zunehmende Untersuchungen haben ergeben, dass es ein neuartiges epigenetisches Ziel bei der Regulierung verschiedener Proteine ​​istNierenerkrankungen, einschließlich chronischer Nephritis, diabetischer Nephropathie und experimenteller Nierenschädigung (Zeng und Zhou, 2002; Morgado-Pascual et al., 2019). Es wurde bestätigt, dass BRD4 am Nuklearfaktor-κB (NF-κB)-abhängigen Transkriptionsprozess beteiligt ist, um Entzündungsreaktionen bei vielen Krankheiten zu regulieren (Xu und Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez et al., 2017). BRD4 kann durch acetyliertes RelA (NF-κB-Untereinheit, ein proteinkodierendes Gen) an Lysin 310 (RelA-K310ac) über seine Bromodomänen rekrutiert werden, wodurch die Cyclin-abhängige Kinase 9 (CDK9) aktiviert und die RNA-Polymerase II phosphoryliert wird, um dies zu fördern Transkription von NF-κB-Zielgenen (Hajmirza et al., 2018). Neuere Studien deuten darauf hin, dass BRD4-Inhibitoren eine mögliche Therapieoption für entzündliche Erkrankungen sein könnten. In Modellen mit Rückenmarksverletzungen bei Ratten schwächte die Hemmung von BRD4 die Entzündungsreaktion ab und förderte die funktionelle Wiederherstellung der Mikroglia (Dey et al., 2019). Außerdem hob die Hemmung von BRD4 experimentelle Nierenentzündungen in Mausmodellen mit einseitiger Harnleiterobstruktion, antimembranösem basalem GN und Infusion von Angiotensin II auf (Suarez-Alvarez et al., 2017).

Angesichts der möglichen entzündungsfördernden Wirkungen von Cd und der regulatorischen Wirkung von BRD4 auf Entzündungen stellten wir die Hypothese auf, dass BRD4 an der durch Cd ausgelösten Entzündungsreaktion beteiligt ist. Wie erwartet vermittelt BRD4 den Transkriptionsprozess von entzündlichen Zytokinen in Cd-exponierten Rattennierenmodellen. Unsere Studie deckt einen möglichen Mechanismus in der Cd-getriggerten Entzündungsreaktion auf und liefert neue Einblicke in die Therapie der Cd-induzierten Nephrotoxizität.

2. Materialien und Methoden

2.1. Chemikalien und Antikörper

Cadmiumchlorid (CdCl2, wasserfrei, 439800) wurde von Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA) bezogen. (plus)-JQ1 (HY-13030) wurde von MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, USA) erhalten. Ein Kernprotein-Extraktionskit wurde vom Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China, P0027) erworben. Ein wirksames Chemilumineszenz-Kit (ECL, 32209) und Bicinchoninsäure-Proteinassayreagens (BCA, 23225) wurden von Thermo Fisher Scientific (Madison, WI, USA) bezogen. Es wurden primäre Antikörper gegen die folgenden Proteine ​​verwendet: NF-κB p65 (10745-1- AP), IL -1 (26048-1- AP), TNF- (17590-1- AP) wurden gekauft von Proteintech Group (Wuhan, China); -Actin (3700 s), Histon H3 (His3, 4499), Sirtuin 1 (Sirt1, 8469), normales Kaninchen-IgG (IgG, 4394) wurden von Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) erworben; BRD4 (ab128874), K (Lysin)-Acetyltransferase 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-κB RelA (Acetyl K310) (RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488-konjugierter Esel-Anti-Kaninchen (ab150073) wurden gekauft von Abcam (Cambridge, UK). Zweite Antikörper: Ziegen-Anti-Maus-IgG (H plus L) (115-035-003) und Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H plus L) (111-035-003) wurden von Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) bezogen ).

2.2. Tiere und Experimente

24 Sprague-Dawley-Ratten (männlich, 6 Wochen alt, 110–120 g) wurden von Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd (Jinan, Shandong, China) gekauft. Den Ratten wurde freier Zugang zu Nahrung und Wasser in einem klimatisierten Raum (24 ± 5 ​​Grad, 12 h Hell/Dunkel-Zyklus) gewährt. Die experimentellen Verfahren entsprachen der Richtlinie 2010/63/EU des Rates der Europäischen Gemeinschaften für Tierversuche, und alle Verfahren wurden vom Ausschuss für Tierpflege und -verwendung der Universität Yangzhou genehmigt. Nach einer Woche Akklimatisierung wurden die Ratten zufällig in vier Gruppen eingeteilt: (1) Kontrollgruppe: Intraperitoneal injiziert mit dem entsprechenden Lösungsmittel (physiologische Kochsalzlösung oder 2-Hydroxypropyl- -cyclodextrin-Lösung). (2) Cd-Gruppe: CdCl2 (2 mg/kg Körpergewicht, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung), intraperitoneal injiziert an 5 aufeinanderfolgenden Tagen, um das Cd-Intoxikationsmodell zu erstellen. (3) Cd plus JQ1-Gruppe: CdCl2 (2 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert an 5 aufeinanderfolgenden Tagen, um das Cd-Intoxikationsmodell zu etablieren, und JQ1 (25 mg/kg Körpergewicht, gelöst in 2-Hydroxypropyl{{ 25}}Cyclodextrin-Lösung) intraperitoneal an Tag 6–8 injiziert. (4) JQ1-Gruppe: JQ1 (25 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal an den Tagen 6–8 injiziert. Statistiken des Cd-Gehalts in Rattenseren und Nierengeweben sind in Tabelle S1 aufgeführt, was die erfolgreiche Etablierung von Cd-exponierten Rattenmodellen widerspiegelt.

Nach 8-tägiger Behandlung wurden die Ratten nach 12-stündigem Fasten durch zervikale Dislokation unter tiefer Anästhesie getötet. Die Nierengewebe wurden präpariert und 1 g Gewebe jeder Niere wurde schnell bei –80 °C für die anschließende Western Blot- und quantitative PCR (qPCR)-Analyse gelagert. Die restliche Gewebemenge wurde schnell in 4 Prozent Paraformaldehyd (PFA) für die immunhistochemische (IHC) Färbung fixiert.

2.3. Zellkultur und Behandlung

Die Rattennierenzelllinie (NRK{{0}}E) wurde von der Shanghai Cell Bank of China Academy of Sciences bezogen. NRK-52E-Zellen wurden mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Gibco, 12800-017) kultiviert, das 5 % fötales Rinderserum (FBS, Gibco, 10437-028), Penicillin und Streptomycin (1 00 U/ml) in befeuchtetem Zustand mit 5 % CO2 und 95 % Luft bei 37 Grad . CdCl2 (in Reinstwasser gelöst) und JQ1 (Dimethylsulfoxid gelöst) wurden getrennt bei 4 Grad und –20 Grad gelagert und vor der Verwendung in Arbeitslösungen verdünnt. Das experimentelle Design war wie folgt: (1) Zellen wurden mit 0, 2,5, 5, 10 μM Cd für 12 h oder 5 μM Cd für 0, 6, 12, 24 h behandelt, um die nachfolgenden Assays durchzuführen. (2) Die Zellen wurden mit 5 μM Cd und/oder 0,5 μM JQ1 für 12 h behandelt, um die nachfolgenden Assays durchzuführen. (3) Die Zellen wurden mit siBRD4 transfiziert und/oder mit 5 μM Cd für weitere 12 h behandelt, um die nachfolgenden Assays durchzuführen.

2.4. Kleine interferierende RNA-Transfektion

Wir transfizierten 20 nM kleine interferierende BRD4-RNA (siBRD4, Invitrogen, CA, USA) in die NRK-52-E-Zellen mit Lipofectamine RNAiMAX-Transfektionsreagenz (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. 13778150) für 24 h gemäß den Produkthandbüchern. Die folgenden Sense-siRNAs wurden verwendet:

siBRD4, mit einer Zielsequenz von 5′-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3′;

siCt (siRNA-Negativkontrolle), mit einer Zielsequenz von 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′.

2.5. Western-Blotting

Nierengewebeproben und NRK-52-E-Zellen wurden in RIPA-Puffer lysiert, der Protease-Inhibitoren enthielt, um Gesamtprotein zu extrahieren. Das Kernprotein wurde im Voraus aus frischen Geweben und Zellen hergestellt und bei –80 Grad gelagert. Proteinproben (20–30 ug pro Probe) wurden durch SDS-PAGE-Elektrophorese getrennt und dann auf die Polyvinylidenfluoridmembranen (Millipore, ISEQ00010) übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % Magermilch für 90 min blockiert und 12 h bei 4 Grad mit folgenden primären Antikörpern inkubiert: -Actin (1:5000), NF-κB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). Anschließend wurden die Membranen mit TBST gewaschen und mit entsprechenden Sekundärantikörpern (1:10000) für 90 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Die Membranen wurden mit Elektrochemilumineszenz (ECL, ThermoFisher Scientific) inkubiert und auf dem Chemidoc XRS (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Frankreich) bestimmt und die optische Dichte mit ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) analysiert.

2.6. Immunfluoreszenz (IF)-Färbung

NRK{{0}}E-Zellen, die in eine 24-Well-Platte ausgesät wurden, wurden bis zu etwa 60 Prozent Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden 12 h lang mit 5 μM Cd und/oder 0,5 μM JQ1 behandelt, dann mit PFA (4 Prozent, 10 Minuten) fixiert, mit Triton X- 100 (0,1 Prozent, 15 Minuten) permeabilisiert und mit BSA blockiert (2 Prozent, 90 min) bei RT und inkubiert mit primärem Antikörper (NF-&kgr;B p65, 1:50 Verdünnung) über Nacht bei 4 Grad. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit sekundärem Antikörper (Verdünnung 1:500) für 90 min und mit DAPI für 5 min bei RT inkubiert, dann wurden die Zellen unter einem konfokalen Mikroskop beobachtet. Die NF-κB-Kerntranslokation wurde in drei unabhängigen Studien analysiert.

2.7. qPCR

Die Gesamt-RNA von Nierengewebe und NRK-52-E-Zellen wurde mit dem RNAiso Plus-Kit (Takara Bio, Shiga, Japan) extrahiert. 1 ug Gesamt-RNA wurde verwendet, um cDNA der ersten Kette gemäß dem Handbuch des Herstellers (Roche, Basel, Schweiz) zu synthetisieren. 2 μl komplementäre DNA (cDNA) pro Vertiefung wurden entnommen, um die relativen mRNA-Spiegel unter Verwendung eines LightCycler® 96 Real-Time PCR-Systems (Roche) nachzuweisen. Berechnen Sie die relativen mRNA-Spiegel gemäß Gleichung 2-△△CT. Die Primer wurden in Tabelle S2 aufgeführt. -Actin war ein Ratten-Referenzgen.

2.8. Co-Immunpräzipitation (Co-IP)

Die Nierengewebe und NRK-52-E-Zellen wurden in frisch zubereitetem Zelllysepuffer (20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 1 Prozent Triton X{{8}) lysiert. }) mit PMSF. Protein-G-Kügelchen (100 &mgr;l pro Probe, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) wurden mit 2 &mgr;g BRD4, RelA-K310ac oder IgG-Antikörper pro Probe gemischt und für 10 min bei RT rotiert. Dann wurden die Gesamtproteinlysate mit dem Perlen-Antikörper-Komplex über Nacht bei 4 Grad inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit Zelllysepuffer wurden die Immunpräzipitate mit 1 × SDS-PAGE-Probenpuffer resuspendiert, um die Proben zu konfigurieren. Die Zielproteine ​​wurden mittels Western-Blotting mit Anti-BRD4- und Anti-RelA-K310ac-Primärantikörpern nachgewiesen.

2.9. statistische Analyse

Alle Daten wurden aus mindestens drei unabhängigen Experimenten erhalten und als Mittelwert ± SEM ausgedrückt, sofern nicht anders angegeben. Versuchsgruppen wurden durch ungepaarten zweiseitigen Student-t-Test oder einfache Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung von SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) verglichen. Die Signifikanz wurde auf p < 0,05="">

3. Ergebnisse

3.1. Cd induziert die Expression von entzündlichen Zytokinen in vivo und in vitro

Als Umweltschadstoff verursacht Cd nachweislich Nierenschäden, indem es eine Reihe biologischer Prozesse reguliert (Wang et al., 2019c). In dieser Studie wurden die Veränderungen der Transkriptionsniveaus von entzündlichen Zytokinen nach Cd-Exposition untersucht, um zu untersuchen, ob eine Entzündung an der Cd-induzierten Nephrotoxizität beteiligt ist. Die Daten zeigten, dass die Cd-Exposition die Spiegel von Interleukin (IL)-1 und Tumornekrosefaktor (TNF)-Protein in NRK-52-E-Zellen (Abb. 1A-B) und Rattennierengewebe (Abb. 1C -D). Unterdessen, wie in Fig. 1E-F gezeigt, erhöhte die Cd-Exposition die Transkriptionsspiegel von entzündlichen Zytokinen (IL-1, IL-6, TNF- und (Monocyte chemoattractant protein-1) MCP -1) in vivo und in vitro. Diese Befunde legen nahe, dass Cd die Expression von entzündlichen Cytokinen in Rattennieren induziert.

3.2. BRD4 ist am Cd-induzierten Transkriptionsprozess von entzündlichen Zytokinen beteiligt

BRD4 ist ein neu beschriebener epigenetischer Regulator, der an acetylierte Histone oder Nicht-Histone bindet, um Entzündungsprozesse bei vielen Krankheiten zu regulieren. Hier wurden der BRD4-Inhibitor JQ1 und BRD4-siRNA verwendet, um die Rolle von BRD4 bei der durch Cd ausgelösten Entzündungsreaktion zu untersuchen. Die Daten zeigten, dass Cd-erhöhte IL-1- und TNF-Proteinspiegel durch JQ1-Behandlung in vivo und in vitro (Abb. 2A–D) und durch BRD4-Knockdown in vitro (Abb. S1A–B) herunterreguliert wurden. Unterdessen hemmte die JQ1-Behandlung signifikant die Cd-verstärkten Transkriptionsspiegel von IL-1, IL-6, TNF- und MCP-1 in NRK-52-E-Zellen (Abb. 2E). und Rattennierengewebe (Fig. 2F). Außerdem verringerte der BRD4-Knockdown signifikant die Cd-erhöhten Transkriptionsspiegel von entzündlichen Zytokinen in NRK-52E-Zellen (Abb. S1C). Zusammengenommen legen diese Befunde nahe, dass BRD4 ein kritischer Regulator der Cd-ausgelösten Entzündungsreaktion in Rattennieren ist.

3.3. BRD4-Expressionsniveaus bleiben nach Cd-Exposition unverändert

Als nächstes wurden Veränderungen in den Expressionsniveaus von BRD4 nach Cd-Exposition nachgewiesen. NRK-52E-Zellen wurden mit Cd unter einem Konzentrationsgradienten behandelt, und Ratten wurde 5 Tage lang intraperitoneal Cd injiziert, um die Wirkung von Cd auf die BRD4-Expression in der Niere in vivo und in vitro aufzuklären. Die Ergebnisse zeigten, dass die BRD4-Proteinspiegel sowohl in den Cd-exponierten NRK-52E-Zellen (Fig. 3A-B) als auch in Rattennierengeweben (Fig. 3C-D) unverändert waren. Auch die BRD4-mRNA-Spiegel waren nach der Cd-Exposition unverändert (Fig. 3E-F). Diese Ergebnisse zeigen, dass BRD4 die Cd-getriggerte Entzündungsreaktion nicht von Veränderungen im Expressionsniveau abhängig macht.

3.4. BRD4 reguliert die Cd-geförderte NF-κB-Kerntranslokation

Die Rolle von BRD4 bei der Cd-getriggerten Entzündungsreaktion wurde in unserer Studie untersucht. Die Veränderung des NF-κB-Signalwegs steht in engem Zusammenhang mit der Transkription von Entzündungszytokinen (Chi et al., 2021). Unsere Studie ergab, dass BRD4 an der Cd-regulierten Kerntranslokation und Aktivierung von NF-κB beteiligt ist. Zuerst wurde die subzelluläre Lokalisierung von NF-κB durch IF-Färbung und IHC-Färbung bestimmt. Die Daten in Fig. 4A und D zeigten, dass JQ1 die Cd-geförderte NF-κB-Kerntranslokation in NRK-52-E-Zellen und Rattennierengewebe hemmt. Unterdessen zeigten Western-Blot-Ergebnisse, dass JQ1 die Cd-erhöhten Kernproteinspiegel von NF-κB in vivo (Abb. 4B-C) und in vitro (Abb. 4E-F) signifikant senkte. In ähnlicher Weise hemmte BRD4-Knockdown auch signifikant die Cd-geförderte NF-κB-Kerntranslokation (Abb. S2A) und verringerte Cd-erhöhte Kernproteinspiegel von NF-κB (Abb. S2B-C) in NRK-52-E-Zellen. Zusammengenommen kann die Hemmung von BRD4 die Cd-geförderte NF-κB-Kerntranslokation reduzieren, was darauf hindeutet, dass BRD4 die Aktivierung des NF-κB-Signalwegs in der Niere nach Cd-Exposition vermittelt.

3.5. Cd erhöht die Acetylierungsspiegel von RelA K310

Studien haben bestätigt, dass BRD4 über seine Bromdomänen an acetyliertes RelA K310 bindet, um die NF-κB-abhängige Transkription zu regulieren (Morgado-Pascual et al., 2019; Zhong et al., 2018). So wurden der Acetylierungsgrad von RelA K310 und die Expression von zwei Enzymen nachgewiesen. Die Daten zeigten, dass die Proteinspiegel von RelA-K310ac und Acetylase Ep300 mit zunehmender Cd-Konzentration kontinuierlich abnahmen, während der Sirt1-Proteinspiegel von Deacetylase in NRK-52E-Zellen (Abb. 5A-B) und Rattennierengewebe allmählich zunahm (Abb .5C-D). Auch die Ep300- und Sirt1-mRNA-Spiegel zeigten die gleichen Trends (Fig. 5E-F). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Cd das Acetylierungsniveau von RelA K310 fördert, daher könnte BRD4 an der Cd-getriggerten Transkription von entzündlichen Zytokinen in der Niere beteiligt sein.

3.6. Cd erhöht die BRD4-Bindung an RelA-K310ac, um seine Transkriptionsfunktion zu verstärken

Die Bindung an Acetylierungsstellen ist die Grundlage für die Transkriptionsregulation von BRD4 (Huang et al., 2009). Um zu überprüfen, ob Cd die BRD4-Funktion reguliert, indem es die BRD4-Bindung an RelA-K310ac erhöht, wurde die Interaktion zwischen RelA-K310ac und BRD4 über Co-IP nachgewiesen. Die Daten in Fig. 6A zeigten, dass Cd die Wechselwirkung zwischen RelA-K310ac und BRD4 in NRK-52-E-Zellen signifikant verstärkte, was durch JQ1-Behandlung oder BRD4-Knockdown gemildert wurde. Derselbe Trend wurde auch in Rattennierengeweben beobachtet (Fig. 6B). Diese Ergebnisse zeigen, dass Cd die Bindung von BRD4 an RelA-K310ac verstärkt, was die NF-κB-abhängige Transkription fördert und anschließend zur Cd-ausgelösten Entzündungsreaktion beiträgt.

4. Diskussion

Cd wurde aufgrund seiner hohen Toxizität als potenzieller Auslöser von Entzündungen gemeldet, während der genaue Mechanismus noch nicht vollständig verstanden ist (Arab-Nozari et al., 2020; Ghosh, 2018). Unsere Studie bestätigte, dass Cd die Expression entzündlicher Zytokine in Ratten-Nierenzellen induziert, und stellte fest, dass BRD4, ein epigenetisches Ziel, das entscheidende Funktionen in einer Reihe von zellulären Prozessen, einschließlich Entzündungen, hat, zu einer Cd-ausgelösten Entzündungsreaktion beiträgt. Weitere Experimente zeigten, dass BRD4 an der Aktivierung des Cd-geförderten NF-κB-Signalwegs beteiligt ist. Außerdem erhöhte Cd den Acetylierungsgrad von RelA K310, wodurch die BRD4-Bindung an acetyliertes NF-κB RelA erhöht wurde, um die Transkription von NF-κB-abhängigen entzündlichen Zytokinen zu fördern.

Entzündung ist einer der natürlichen Abwehrmechanismen gegen exogene Chemikalien, während die unkontrollierte und unangemessene Entzündungsreaktion normales Gewebe schädigen und Autoimmunerkrankungen auslösen kann (Jian et al., 2018). Cd-erhöhte biologische Entzündungsmarker wurden häufig mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht. Studien haben gezeigt, dass Cd-induzierte Entzündungen an der Atherogenese beteiligt sind (Tinkov et al., 2018). Darüber hinaus förderte Cd die Expression von entzündlichen Zytokinen, die zur Schädigung von Lungen- und Hodengewebe beitrugen und Hepatotoxizität induziert (Koopsamy Naidoo et al., 2019; Arafa et al., 2014). Diese schädlichen Wirkungen stimmen mit unseren Ergebnissen überein, dass die Entzündungsreaktion an der Cd-induzierten Nierenschädigung beteiligt ist. Zunehmende Forschungen haben sich auf die Entstehungsmechanismen von Cd-induzierten Entzündungen konzentriert. Als gut untersuchtes Mitglied der BET-Proteinfamilie spielt BRD4 eine entscheidende Rolle bei vielen biologischen Prozessen, einschließlich Entzündungen. Hier wurden JQ1 (ein Inhibitor von BRD4) und siRNA verwendet, um die funktionelle Aktivität von BRD4 zu deregulieren und festgestellt, dass die Hemmung von BRD4 die Cd-induzierte Transkription von entzündlichen Zytokinen in Rattennieren reduziert, was darauf hindeutet, dass BRD4 an der Cd-ausgelösten Entzündungsreaktion beteiligt ist . Es wird allgemein angenommen, dass die Dysregulation der BRD4-Expression ein entscheidendes Ereignis beim Auftreten einer Entzündungsreaktion ist. Bei Rückenmarksverletzungen, pathologischer Herzhypertrophie und anderen entzündungsassoziierten Erkrankungen trug die gestörte BRD4-Expression zur Expression von entzündlichen Zytokinen bei (Zhu et al., 2020; Marazzi et al., 2018; Ren et al., 2019). Cd hatte jedoch unter den vorliegenden experimentellen Bedingungen keine Wirkung auf die Expressionsniveaus von BRD4, was uns zu der Überlegung veranlasste, ob BRD4 die Cd-ausgelöste Entzündungsreaktion über andere Wege vermittelt.

NF-κB ist ein wichtiger regulatorischer Faktor bei Entzündungsprozessen und für die Kontrolle der Expression vieler Entzündungsmediatoren verantwortlich (Lawrence, 2009). Es wurde von Studien berichtet, dass BRD4 an der Regulation des NF-κB-Signalwegs beteiligt ist. Huanget al. (2017) schlugen vor, dass BRD4 die IKK-vermittelte NF-κB-Aktivierung über die p38- und JNK-MAPK-Signalwege reguliert. Wanget al. (2019a) fanden heraus, dass BRD4-Knockdown oder JQ1-Behandlung den Lipopolysaccharid (LPS)-aktivierten NF-κB-Signalweg in Mikroglia blockierten. Meng et al. (2014) zeigten, dass die JQ1-Behandlung die Expression der entzündlichen Zytokine blockierte, indem sie die Aktivierung von NF-κB in LPS-behandelten RAW 264.7-Zellen hemmte. Diese Berichte zeigten, dass BRD4 die Aktivierung von NF-κB in vielen Entzündungsmodellen vermittelt, während die Hemmung von BRD4 ein wirksamer therapeutischer Ansatz zur Entzündungsbekämpfung ist. In der aktuellen Studie blockierte die Hemmung von BRD4 die Kerntranslokation von NF-κB in Cd-exponierten Rattennierengeweben und NRK-52E-Zellen, was darauf hindeutet, dass BRD4 den Cd-aktivierten NF-κB-Signalweg vermittelt.

Nachdem NF-κB durch verschiedene Stimuli aktiviert wurde und in den Zellkern transloziert wurde, bindet BRD4 typischerweise an acetyliertes NF-κB RelA an der K310-Stelle, was seine Stabilität und Transkriptionsaktivität im Zellkern erhöht (Hajmirza et al., 2018). Somit beeinflusst das Acetylierungsniveau von RelA K310 die regulatorische Funktion von BRD4 auf die Entzündungsreaktion. In hippocampalen Neuronen vermittelte die Deacetylase Sirt1 die Deacetylierung von RelA K310, um die BACE1-Expression zu regulieren, was zur Produktion von neuronalem Amyloid beitrug (Flores-Leon et al., 2019). In Glioblastomzellen regulierte der photodynamische Therapiestress die Deacetylase Sirt1 herunter und aktivierte die Acetylase Ep300, was die RelA-K310ac-Spiegel erhöhte und zu einer erhöhten Produktion des überlebensfördernden Stickoxids führte (Fahey et al., 2019). Unsere Studie ergab, dass Cd das Acetylierungsniveau von RelA K310 fördert, indem es die Ep300-Expression erhöht und die Sirt1-Expression verringert, was darauf hinweist, dass Cd die regulatorische Funktion von BRD4 beeinflusst, indem es das Acetylierungsniveau von RelA K310 erhöht.

Insbesondere zeigten unsere Ergebnisse, dass die JQ1-Behandlung bei der Linderung der Cd-ausgelösten Entzündungsreaktion wirksamer war als der BRD4-Knockdown. JQ1 hat eine hohe Bindungsaffinität zu BRD4 und kann die BRD4-Bindung an das Chromosom fast vollständig blockieren, während siBRD4 nur die BRD4-Proteinexpression stören kann, um die BRD4-Bindung an die Zielstelle zu reduzieren, was darauf hindeutet, dass BRD4 eine Cd-ausgelöste Entzündungsreaktion vermittelt, die möglicherweise von der Bindung mit acetyliertem NF-κB RelA. Jüngste Studien haben einen ähnlichen Regulationsmechanismus gezeigt: Nach der nuklearen Translokation und Aktivierung von NF-κB interagierte BRD4 dann mit acetyliertem RelA, um die transkriptionelle Aktivierung von NF-κB zu koaktivieren (Huang et al., 2009). RelA-BRD4 wurde bei verschiedenen entzündlichen Stimulationsbedingungen zu NF-κB-Zielpromotoren rekrutiert, während die JQ1-Behandlung wirkte, indem sie die BRD4-Bindung an acetyliertes NF-κB RelA verhinderte und somit die transkriptionelle Aktivität von NF-κB reduzierte (Zou et al., 2014). Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Hemmung von BRD4 die Cd-verstärkte Wechselwirkung zwischen BRD4 und RelA-K310ac in Rattennieren blockiert, was unsere obigen Ergebnisse stützt, dass die Hemmung von BRD4 die Cd-induzierte Transkriptionsaktivität von NF-κB unterdrückt, was darauf hinweist, dass Cd die BRD4-Bindung an Acetylierung verstärkt NF-κB RelA zur Erhöhung der Transkription von entzündlichen Zytokinen.

Zusammenfassend hat unsere Studie die Regulationsmechanismen von BRD4 bei Cd-getriggerten Entzündungsreaktionen in Rattennieren aufgezeigt: (1) BRD4 vermittelt Cd-induzierte NF-κB-Kerntranslokation und -Aktivierung. (2) Cd erhöht die Acetylierung von RelA K310 und verstärkt die Bindung von BRD4 an acetyliertes NF-κB RelA, das die Transkription von NF-κB-abhängigen Entzündungszytokinen fördert. Darüber hinaus verringerte die Hemmung von BRD4 signifikant Cd-erhöhte entzündliche Zytokinspiegel, was darauf hindeutet, dass zielgerichtetes BRD4 das Potenzial hat, als wirksames Mittel zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Cd-induzierter Nephritis, entwickelt zu werden.

CRediT-Urheberschaftsbeitragserklärung

Zhongguo Gong: Konzeptualisierung, Methodik, Visualisierung, formale Analyse, Validierung, Untersuchung, formale Analyse, Datenpflege, Schreiben – Originalentwurf. Gang Liu: Konzeptualisierung, Methodik, Visualisierung, Datenpflege, Schreiben – Originalentwurf, Projektverwaltung, Fördermittelakquise. Wenjing Liu: Software, Ressourcen, Methodik, Formale Analyse. Hui Zou: Projektleitung, Supervision. Ruilong Song: Software, Formale Analyse, Supervision. Hongyan Zhao: Software, Formale Analyse, Supervision. Yan Yuan: Aufsicht. Jianhong Gu: Aufsicht. Jianchun Bian: Fördermittelakquise, Betreuung. Jiaqiao Zhu: Schreiben – Überprüfung & Bearbeitung, Supervision. Zongping Liu: Schreiben – Überprüfung & Bearbeitung, Supervision,

Projektleitung, Fördermittelakquise, Konzeption.

Erklärung konkurrierender Interessen

Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die die in diesem Dokument beschriebene Arbeit beeinflusst haben könnten.

Wissen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31872533, 31902329, 32072933), dem National Key Research and Development Program of China (Nr. 2016YFD0501208) und dem Projekt des Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education unterstützt Institution (PADP). Das Manuskript wurde von einem oder mehreren der hochqualifizierten englischsprachigen Redakteure bei ELIXIGEN auf korrekte englische Sprache, Grammatik, Interpunktion, Rechtschreibung und allgemeinen Stil hin bearbeitet.

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