Die funktionellen Eigenschaften von Proteinen können durch Hydrolyse durch bestimmte Proteasen verbessert werden

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Abstrakt:Um Methoden zur Verbesserung der Verarbeitung von Schweineabfällen zu untersuchen, wurde Schweinehaut unter Verwendung verschiedener kommerziell erhältlicher Proteasen (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex und Papain) unter mehreren optimalen Bedingungen hydrolysiert. Nach der enzymatischen Hydrolyse wurden die Kollagenhydrolysate (CHs) mittels Membran-Ultrafiltration nach Molekulargewicht (3 kDa) fraktioniert. Die CHS wurden auf physikalische Eigenschaften (pH, Proteinwiedergewinnung, Gehalt an freien Aminogruppen, Molekulargewichtsverteilung und Aminozusammensetzung) sowie auf funktionelle Eigenschaften (antioxidative Aktivitäten und Anti-Aging-Aktivitäten) analysiert. Unter den CHs zeigten durch Alcalase (CH-Alcalase) hydrolysierte CHs im Vergleich zu anderen CHs den höchsten Hydrolysegrad. Sowohl „CH-Alcalase“ als auch „CH-Alcalase<3 kda"="" fractions="" showed="" a="" considerably="" high="" antioxidant="" activity="" and="" collagenase="" inhibition="" activity.="" therefore,="" resulting="" bioactive="" have="" the="" potential="" for="" development="" as="" antioxidants="" and="" anti-aging="" ingredients="" in="" the="" food,="" cosmetics,="" and="" pharmaceuticals,="" from="" animal="">

Schlüsselwörter:Hydrolyse; kommerzielle Proteasen; Kollagenhydrolysat; Antioxidans; Antialterung

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1. Einleitung

Mit zunehmender Lebenserwartung erhalten Haut-Anti-Aging-Verfahren viel Aufmerksamkeit. Kollagen, das in Hautpflegeprodukten als Cosmeceutical-Inhaltsstoff für Anti-Aging verwendet wird, ist auf dem Kosmetikmarkt weit verbreitet. Kollagen ist ein hochmolekulares, faseriges Protein tierischen Ursprungs, das reichlich in Bindegewebe, Haut, Sehnen, Knorpel, Bändern, Zähnen, Nägeln und Haaren von Menschen und Tieren vorkommt. Die Viehzucht bleibt die Hauptquelle für industrielles Kollagen[1]. Jährlich werden weltweit große Mengen tierischer Nebenprodukte als Abfall von der Lebensmittel- und Fleischverarbeitungsindustrie entsorgt. Diese können jedoch als wichtige Proteinressourcen für neuartige Lebensmittelmaterialien verwendet oder durch Hydrolyse in Mehrwertprodukte umgewandelt werden, die häufig zur Verbesserung und Aufwertung der funktionellen und ernährungsphysiologischen Eigenschaften von Proteinen angewendet wird [2,3]. Kollagen wird auch zunehmend als Quelle für bioaktive Peptide angesehen, die sich als vielversprechende Verbindungen für die Verwendung in Ernährungs- oder pharmazeutischen Anwendungen erwiesen haben.Cistanche-Vorteile,Daher kann die Hydrolyse von Kollagen eine wichtige Rolle bei der Verbesserung seiner Bioverfügbarkeit und Eignung zur Verwendung in verschiedenen kommerziellen Verfahren spielen.

Physiologische Aktivitäten von bioaktiven Peptiden, die normalerweise 2-20 Aminosäurereste enthalten (<6000 da),="" are="" based="" on="" the="" composition="" and="" sequence="" of="" their="" amino="" acids="" [2,4].="" due="" to="" their="" structural="" properties="" such="" as="" molecular="" weight,="" bioactive="" peptides="" may="" possess="" specific="" characteristics="" that="" affect="" numerous="" physiological="" processes="" related="" to="" antimicrobial,="" antioxidant,="" emulsifying,="" antihypertensive,="" antidiabetic,="" and="" immunomodulatory="" functions="" in="" organisms[1,5,6].="" generally,="" low="" molecular="" weight="" hydrolysates="" display="" lower="" viscosity,="" better="" dispersion,="" higher="" hydrophobicity,="" and="" smaller="" particle="" size="" [7].="">Cistanche-CholesterinDer Hydrolysegrad beeinflusst direkt das Molekulargewicht und die Aminosäurezusammensetzung der Hydrolysate [8]. Daher kann der Hydrolyseprozess zur Herstellung neuer bioaktiver Peptide notwendig sein.

Cistanche kann Anti-Aging

Die Proteinhydrolyse, die zur Spaltung von Peptidbindungen führt, kann über enzymatische oder chemische Prozesse durchgeführt werden [9]. Chemische Prozesse, einschließlich alkalischer oder saurer Hydrolyse unter Verwendung von Lösungsmittelextraktionen, sind nicht nur schädlich für die Umwelt, sondern auch für Menschen, die die resultierenden Produkte konsumieren [4,10]. Schwer kontrollierbare chemische Prozesse führen zu Produkten, die modifizierte Aminosäuren enthalten [9]. Im Gegensatz dazu kann die enzymatische Hydrolyse unter milden Bedingungen durchgeführt werden, wodurch extreme Umgebungen vermieden werden, die durch chemische Behandlungen erforderlich sind. Darüber hinaus erzeugen die Prozesse weder Nebenreaktionen noch verringern sie den Nährwert der Proteinquelle [8]. Mehrere Proteasen, darunter Alcalase, Pepsin, Protamex, Trypsin und Neutrase, werden üblicherweise zur Hydrolyse von Proteinen verwendet, was zu verschiedenen Arten von Proteinhydrolysaten und Peptiden mit einer Vielzahl von biofunktionellen Aktivitäten führt. Eine Studie berichtete über die Herstellung von Kollagenhydrolysaten mit antioxidativer Aktivität aus Schweinehautgelatine unter Verwendung der enzymatischen Hydrolyse durch Pepsin und Pankreatin [11].Cistanche Deserticola NebenwirkungenLachs-Nebenprodukte wurden hydrolysiert, um peptische Hydrolysate unter Verwendung verschiedener Proteasen herzustellen, wobei die endgültigen Peptide hervorragende antioxidative und entzündungshemmende Eigenschaften zeigten [12].

Das Ziel der Forschung war: (a) die aktivsten Kollagenhydrolysate zu identifizieren, die durch enzymatische Hydrolyse unter Verwendung verschiedener kommerziell erhältlicher Proteasen (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Protamex, Bromelain und Papain) hergestellt wurden; (b) die Fraktionierungswirkung von zu bestätigen Kollagenhydrolysate, die aus enzymatischer Hydrolyse erhalten werden, und (c) um ihre antioxidativen und Anti-Aging-Aktivitäten in vitro zu bestimmen.

2. Ergebnisse und Diskussion

2.1.Enzymatische Hydrolysewirkung auf Kollagenhydrolysate

2.1.1.pH

Die funktionellen Eigenschaften von Proteinen können durch Hydrolyse durch bestimmte Proteasen verbessert werden. In dieser Studie wurden sechs verschiedene Proteasen (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex und Papain) verwendet, um Kollagen aus Schweinehaut zu hydrolysieren, um aktive Kollagenhydrolysate mit niedrigen Molekulargewichten zu erhalten.Cistanche-Dosierung redditDie pH-Änderung in Kollagenhydrolysaten (CH) ist in Abbildung 1 dargestellt. Der pH-Wert der Kollagensuspension (5-prozentige Schweinehautmischung) betrug anfänglich 6,39-6,55 (bei 0h). CH-Alcalase und CH-Flavorzyme erreichten den optimalen pH-Wert (pH 8,0) nach 12 h Inkubation. CH-Protamex, CH-Bromelain und CH-Papain erreichten nach 6-stündiger Inkubation den optimalen pH-Wert (pH7.0), während CH-Flavorzyme nach 24-stündiger Inkubation weiterhin von pH 6,39 auf pH 5,69 abfiel (Abbildung 1). Der pH-Wert eines Proteinhydrolysats ist ein wichtiger Faktor, der enzymatische Hydrolysereaktionen reguliert[13]. Daher kann die Bildung von Kollagenhydrolysaten unter Bedingungen unterschiedlicher pH-Werte auf pH-abhängige Änderungen der Enzymkonformation zurückzuführen sein, die ihre Bioaktivierung und physikalisch-chemischen Eigenschaften beeinflussen können.

2.1.2. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Profile der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) von CHs, die 24 h lang mit verschiedenen Proteasen behandelt wurden, sind dargestellt (Abbildung 2). Das Peptidprofil der Kollagensuspension (bei 0 h) zeigte eine sichtbare Bande im Bereich des niedrigen bis hohen Molekulargewichts. Die Ergebnisse zeigten eine schnelle Hydrolyse in CH-Alcalase, CH-Neutrase, CH-Bronneline und CH-Protamex, da es nach 3-stündiger Inkubation keine Banden gab. Die Banden im hohen Molekulargewichtsbereich von CH-Alcalase, CH-Neutrase und CH-Protamex nahmen in einer zeitabhängigen Inkubationsweise ab. CH-Bromeline variierte jedoch nicht mit der Inkubationszeit, da es nach nur 1 h Inkubation vollständig hydrolysiert war. Interessanterweise verschwanden die CHs vollständig, wenn die Probe 6 h lang mit Alcalase oder Neutrase reagierte, was darauf hinweist, dass Kollagen als geeignetes Substrat für einige der anderen getesteten Enzyme fungierte.Cistanche-Extrakt Vorteile,Allerdings erschienen nach 24 h Banden von CH-Flavorzyme und CH-Papain im niedrigen bis hohen Molekulargewichtsbereich. Proteine ​​können durch enzymatische Hydrolyse teilweise in Peptide oder Aminosäuren hydrolysiert werden, abhängig vom Proteasetyp, der Inkubationszeit und dem Verhältnis von Protease zu Substrat (Proteinmenge)[14]. Der enzymatische Hydrolyseprozess wird hauptsächlich dadurch bestimmt, ob der beteiligte Proteasetyp eine Endopeptidase oder eine Exopeptidase ist [15,16]. Da Alcalase, Neutrase und Protamex Endopeptidasen sind, kann erwartet werden, dass ihre Hydrolyseprozesse zufällig Peptidbindungen von nicht-endständigen Aminosäuren brechen, wodurch eine weitere Hydrolyse von Proteinen erleichtert wird. Andererseits ist Flavorzyme sowohl eine Endo- als auch eine Exopeptidase, die den Nicht- oder N-Terminus von Peptidketten bricht. In dieser Studie enthielt das Kollagenprotein Bindungsstellen, die für die Exopeptidase-Aktivität anfälliger waren als für die Endopeptidase-Aktivität von Flavorzyme. Aufgrund der Exopeptidase-Aktivität umfasste die Hydrolyse von Kollagenproteinen durch Flavorzyme daher das schrittweise Aufbrechen von Peptidbindungen vom N-Terminus von Aminosäuren, was die Proteinhydrolyse verlangsamte.

2.1.3. Proteinwiederherstellung und Gehalt an freien Aminogruppen

Die Proteingewinnung der über verschiedene kommerzielle Proteasen erhaltenen CHs ist gezeigt (Abbildung 3A). Die Kontrolle (Kollagensuspension) hatte einen Proteinrückgewinnungsgehalt von 1,19 mg/ml. Die Proteingewinnung ist ein Parameter der Effizienz der enzymatischen Hydrolyse. Der niedrige Proteinwiedergewinnungsgehalt von CH weist auf einen erhöhten Proteinabbau hin. Darüber hinaus korreliert die Proteingewinnung gut mit der Proteinlöslichkeit. Eine höhere hydrolytische Aktivität kann durch eine Zunahme exponierter hydrophober Seitenketten verursacht werden, was zu erhöhten hydrophoben Wechselwirkungen zwischen Proteinen und/oder Peptiden führt. Diese hydrophoben Seitenketten können zu einer verringerten Proteinlöslichkeit führen, was zu einer erhöhten Proteingewinnung aus Hydrolysaten führt. In unserer Studie korrelierte der Proteinwiedergewinnungsgehalt gut mit Veränderungen in den SDS-PAGE-Mustern. Die niedrigsten und höchsten Proteinrückgewinnungsgehalte wurden für Alcalase- bzw. Flavorzyme-Hydrolyse aufgezeichnet. Für die Hydrolyseeffizienz bezogen auf die Inkubationszeit nahmen CH-Alcalase, CH-Bromelain und CH-Protamex innerhalb einer Stunde Inkubation im Vergleich zur Kontrolle drastisch ab. Die aus der Proteinhydrolyse resultierende Abnahme des Proteinrückgewinnungsgehalts zeigte eine umgekehrte Beziehung zum Gehalt an Aminogruppen. Darüber hinaus zeigten die meisten CHs, mit Ausnahme von CH-Neutrase, einen niedrigen Proteingehalt zwischen 3 h und 12 h. Nach 24 Inkubationen stieg ihr Proteingehalt in CH-Alcalase, CH-Flavorzyme, CH-Neutrase, CH-Bromeline, CH-Protamex und CH-Papain wie folgt wieder an: 0,83 mg/ml, 1,29 mg/ ml, 0,75 mg/ml, 0,97 mg/ml, 0,77 mg/ml bzw. 1,11 mg/ml. Einige Berichte weisen darauf hin, dass die optimale Hydrolysezeit von mehreren Faktoren abhängt, wie der ausgewählten Art, dem Rohmaterial, dem verwendeten Enzym, der Rohmaterial-/Enzymrate, der Konzentration des Enzyms und dem angestrebten Hydrolysegrad usw. [16 ]. Einige Berichte weisen darauf hin, dass eine verlängerte enzymatische Hydrolyse (über 24 h) zu einer Verringerung der Proteaseaktivität führen kann; daher sollte die enzymatische Hydrolyse innerhalb von 24 h nach der enzymatischen Hydrolyse durchgeführt werden [17,18].

The free amino group content of CH, which is an indicator of enzymatic hydrolysis efficiency, was estimated(Figure 3B). The expected outcome of protein breakdown is that protein may be hydrolyzed into shorter peptide products. The free amino group content of the control was initially 0.14 mg/mL. The free amino group content of all CHs dramatically increased with increasing incubation time. After 24 h incubation, the free amino group content by descending order was: CH-Alcalase (1.00 mg/mL)>CH-Protamex(0.70 mg/mL)> CH-Neutrase(0.68 mg/mL)>CH-Bromeline (0.67 mg/mL)>CH-Flavorzyme (0.53 mg/mL)>CH-Papain (0,40 mg/ml). Häufige Unterschiede im Gesamtprotein- oder freien Aminogruppengehalt enzymatisch hydrolysierter Proben können mit der Enzymspezifität zusammenhängen. Sie ist abhängig von den Eigenschaften eines Enzyms während des enzymatischen Hydrolyseprozesses [16,17]. Beispielsweise zeigen alkalische Proteasen (wie Alcalase) höhere hydrolytische Aktivitäten im Vergleich zu sauren oder neutralen Proteasen.

2.2. Ultrafiltrationseffekt auf die Eigenschaften von Kollagenhydrolysat

Ein Ultrafiltrationsverfahren kann ein nützliches, industriell vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung kleiner Peptidfraktionen mit einer gewünschten Molekülgröße und hoher Bioaktivität sein, abhängig von der Zusammensetzung des Ausgangshydrolysats und der untersuchten Aktivität [19]. Löslichkeit, Gehalt an freien Aminogruppen und die Ausbeute an CHs nach Gefriertrocknung sind gezeigt (Tabelle 1). Die Löslichkeit und der Gehalt an freien Aminogruppen der Kontrolle betrugen 11,95 Prozent bzw. 0,79 Prozent. Nach enzymatischer Hydrolyse und Ultrafiltration mit einer Molekulargewichtsgrenze von 3 kDa wurden die höchste Löslichkeit (21,17 Prozent) und der Gehalt an freien Aminogruppen (14,17 Prozent) in CH-Alcalase beobachtet<3 kda.="" however,=""><3kda was="" the="" lowest="" field="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" low="" molecular="" weight,="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">

Das durchschnittliche Molekulargewicht von Proteinhydrolysaten ist ein wichtiger Faktor, der ihre biologischen Eigenschaften bestimmt [19]. Im Allgemeinen ein durchschnittlicher Bruchteil mit MW<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw=""> 50 kDa represents gelatin, and an average fraction with MW>300 kDa repräsentiert Kollagen [20,21]. Die relative Molekulargewichtsverteilung der Kontrolle (Vorbehandlungsprobe), CH-Alcalase und CH-Alcalase<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).in="" ch-alcalase=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da(maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/="" proteins,="" which="" are="" larger="">

Die Aminosäurezusammensetzung in den CHs ist gezeigt (Tabelle 2). Das CHS von verschiedenen Proteasen hatte unterschiedliche Aminosäurezusammensetzungen und antioxidative Eigenschaften [23]. Die Aminosäurezusammensetzung von Kollagen war reich an Glycin (Gly), Prolin (Pro) und Glutaminsäure (Glu). Der Aminosäuregehalt von CHs (CH-Alcalase und die CH-Alcalase<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" 16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="" these="" amino="" acids="" have="" been="" reported="" to="" enhance="" antioxidant="" activity="" because="" of="" their="" increased="" solubilities="" in="" lipids="" or="" via="" free="" radical="" reactions="">

Dieser Artikel ist entnommen aus Molecules 2019, 24, 1104; doi:10.3390/molecules24061104 www.mdpi.com/journal/molecules