Die hemmende Wirkung des Curcumin-Derivats J147 auf die Melanogenese und den Melanosomentransport durch Erleichterung des ERK-vermittelten MITF-Abbaus Teil 1

Der therapeutische Nutzen von Curcumin und chemisch modifiziertem Curcumin (CMC) zur Unterdrückung der Melanogenese und Tyrosinaseaktivität wurde erkannt. J147 ist eine modifizierte Version von Curcumin mit überlegener Bioverfügbarkeit und Stabilität. Es gibt jedoch keinen Bericht über die Auswirkungen von J147 auf die Pigmentierung in vitro und in vivo. In unseren Studien untersuchten wir die hypopigmentären Auswirkungen der J147-Behandlung auf Melanozyten und erforschten den zugrunde liegenden Mechanismus. Die vorliegenden Studien legen nahe, dass J147 sowohl die basale als auch die -MSH-induzierte Melanogenese unterdrückte sowie die Melanozyten-Dendritenverlängerung und den Melanosomentransport verringerte. J147 spielte diese Rolle hauptsächlich durch die Aktivierung des extrazellulären signalregulierten Proteinkinase (ERK)-Signalwegs. Sobald es aktiviert war, führte es zum MITF-Abbau und regulierte die Expression von Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, Myosin Va, Rab27a und Cdc42 weiter herunter, was letztendlich die Melaninsynthese und den Melanosomentransport hemmte. Darüber hinaus wurden die hypopigmentierenden Wirkungen von J147 in vivo in einem Zebrafischmodell und einem UVB-induzierten Hyperpigmentierungsmodell bei braunen Meerschweinchen nachgewiesen. Unsere Ergebnisse legen auch nahe, dass J147 in vitro und in vivo keine Zytotoxizität aufwies. Zusammengenommen bestätigten diese Daten, dass sich J147 als sichereres natürliches Hautaufhellungsmittel als durchaus nützlich erweisen könnte.

Cistanchehat auch die Funktion vonFörderung der Kollagenproduktion, das die Elastizität und den Glanz der Haut erhöhen und dabei helfen kann, geschädigte Hautzellen zu reparieren. CistanchePhenylethanolglycosidehaben eine deutlich herabregulierende Wirkung aufTyrosinaseAktivität, und die Wirkung auf Tyrosinase ist nachweislich eine kompetitive und reversible Hemmung, was eine wissenschaftliche Grundlage für die Entwicklung und Nutzung bieten kannaufhellende Inhaltsstoffein Cistanche. Daher spielt Cistanche eine Schlüsselrolle bei der Hautaufhellung. Es kannhemmen die Melaninproduktionum Verfärbungen und Mattheit zu reduzieren; und fördern die KollagenproduktionVerbesserung der Hautelastizitätund Strahlkraft. Aufgrund der weit verbreiteten Anerkennung dieser Wirkungen von Cistanche haben vieleHautaufhellungProdukte haben damit begonnen, pflanzliche Inhaltsstoffe wie Cistanche zu verwenden, um der Nachfrage der Verbraucher gerecht zu werden, wodurch der kommerzielle Wert von Cistanche in Hautaufhellungsprodukten erhöht wird. Zusammenfassend ist die Rolle von Cistanche bei der Hautaufhellung von entscheidender Bedeutung. Seine antioxidative und kollagenbildende Wirkung kann Verfärbungen und Mattheit reduzieren, die Elastizität und den Glanz der Haut verbessern und so einen aufhellenden Effekt erzielen. Auch die weit verbreitete Anwendung von Cistanche in Hautaufhellungsprodukten zeigt, dass seine Rolle im kommerziellen Wert nicht zu unterschätzen ist.

Schlüsselwörter: J147, hypopigmentäre Effekte, Melanosomentransport, ERK-Signalweg, MITF-Abbau

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EINFÜHRUNG

Die Hautpigmentierung hängt sowohl von der Melaninsynthese als auch von der Melaninverteilung in der Epidermisschicht ab. Melanin wird hauptsächlich um den Kern von Melanozyten herum produziert und in Melanosomen gespeichert (Tian et al., 2021). Nach der Reifung wanderten Melanosomen entlang von Mikrotubuli und Aktinfilamenten zu den Dendritenspitzen der Zellen und schließlich zu den benachbarten Keratinozyten, um den Verteilungsprozess abzuschließen (Beaumont et al., 2011; Ohbayashi und Fukuda, 2012). Im normalen physiologischen Zustand schützt Melanin die menschliche Haut vor Schäden durch ultraviolette (UV-)Strahlung, toxischen Chemikalien und anderen Umweltfaktoren (Slominski et al., 2004; Yousaf et al., 2020). Eine übermäßige Produktion und Akkumulation führt jedoch zu Hyperpigmentierung und geht mit Hauterkrankungen wie postinflammatorischer Melanodermie, Melasma und solaren Lentigines einher, was zu einer erheblichen psychosozialen Belastung führt (Pillaiyar et al., 2017). Daher ist es notwendig, wirksame und sichere Hautaufheller zu entwickeln.

In den letzten Jahren hat sich die Melaninzellbiologie zu einem breiteren Forschungsgebiet entwickelt und mehrere wichtige Proteine, die zur Melanogenese und zum Melanosomentransport beitragen, wurden aufgeklärt, was den Weg für die Identifizierung von Melaninsyntheseinhibitoren ebnete. Tyrosinase ist ausschließlich für die Melanogenese notwendig und die Hemmung der katalytischen Wirkung von Tyrosinase ist die häufigste Methode zur Reduzierung der Melaninproduktion (D'Mello et al., 2016). Mehrere bekannte Tyrosinasehemmer, darunter Arbutin und Kojisäure, wurden bereits als kosmetische Zusatzstoffe entwickelt (Ding et al., 2020). KIF5b und der Rab27A-Melanophilin-Myosin-Va-Komplex tragen zum Melanosomentransport nach außen bei (Ohbayashi und Fukuda, 2012; Noguchi et al., 2014). Cdc42 reguliert die Dendritenverlängerung, die für den Melanosomentransfer wesentlich ist (Luo, 2000). Die Hemmung dieser oben genannten Proteine ​​könnte den Melanosomentransport, einen wichtigen Mechanismus für die Entwicklung von Hautaufhellern, deutlich unterdrücken. Der Mikrophthalmie-assoziierte Transkriptionsfaktor (MITF) ist ein Haupttranskriptionsfaktor bei der Melanogenese. Darüber hinaus reguliert MITF auch den Melanosomentransport, indem es die Expression von Rab27a und Cdc42 induziert (Noguchi et al., 2016). Mehrere Signalwege sind an der Pigmentierung beteiligt, indem sie das Expressionsniveau von MITF regulieren. Die Aktivierung der cAMP-Proteinkinase A (PKA) stimuliert die Pigmentierung durch eine vom cAMP-Response-Element-Bindungsprotein (CREB) abhängige Hochregulierung der MITF-Expression (Rodríguez und Setaluri, 2014). Umgekehrt hemmt die Aktivierung der extrazellulären signalregulierten Proteinkinase (ERK) die Melanogenese, indem sie den MITF-Abbau beschleunigt (Lv et al., 2020a). Es wurden zahlreiche antimelanogene Wirkstoffe entwickelt, die auf die Tyrosinaseaktivität, den Melanosomentransfer oder melanogen bedingte Signalwege abzielen. Allerdings wurden nur wenige Inhibitoren in vivo-Studien unterzogen und zeigten gute Ergebnisse (Pillaiyar et al., 2017).

Curcumin ist eine Diarylheptanoidverbindung, die aus dem Rhizom von Curcuma longa (Zingiberaceae) isoliert und als gelber Geschmacksstoff oder Farbstoff in Lebensmitteln verwendet wird (Zheng J. et al., 2018). Studien haben auf seine verschiedenen physiologischen Funktionen hingewiesen, darunter entzündungshemmende, antioxidative, anti-amyloide und antitumorale Aktivitäten (Liu et al., 2016; Zheng Y. et al., 2018). Darüber hinaus hemmt Curcumin die Tyrosinase-Aktivität und unterdrückt die Melanogenese in Melanozyten (Lee et al., 2010; Tu et al., 2012). Allerdings schränkt die schlechte Bioverfügbarkeit von Curcumin seine Anwendung ein (Karthikeyan et al., 2020). Um dieses Problem zu lösen, wurde J147 als wirksame Verbindung eines Curcumin-Derivats mit größerer Stabilität und Bioverfügbarkeit entwickelt (Li et al., 2020). J147 hat eine neuroprotektive Wirkung und befindet sich derzeit in klinischen Phase-I-Studien zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit. Es liegen jedoch noch keine Berichte über die Auswirkungen von J147 auf die Pigmentierung in vitro und in vivo vor.

MATERIALEN UND METHODEN

Reagenzien

J147 (J302241), -MSH (M118985) und Tyrosinase aus Pilzen (T128536) wurden von Aladdin (Shanghai, China) erhalten. Wir erhielten Antikörper gegen Myosin Va (sc-365986), KIF5b (sc-133184), GP100 (sc-393094), Cdc42 (sc-8401), Rab27a (sc{{ 13}}), p-JNK (sc-6254), JNK (sc-7345), p-p38 MAPK (sc-166182) und p38 MAPK (sc-398546) aus Santa Cruz (CA, USA). Die Antikörper gegen MITF (97800), p-MEK (2338), MEK (4694), p-ERK (4370) und ERK (4695) wurden von Cell Signaling Technology (MA, USA) bezogen. Die Antikörper gegen Tyrosinase (ab180753), TRP-1 (ab235447), TRP-2 (ab221144), Cytokeratin (ab7753) und S100 (ab133519) wurden von Abcam (Cambridge, UK) erhalten. Der p38-Inhibitor SB203580 (S1863), der ERK-Inhibitor PD98059 (S1805), das BCA-Protein-Assay-Kit (P0012), der Zelllysepuffer (P0013) und -Actin (AF5001) wurden von Beyotime (Shanghai, China) bezogen. RT-qPCR-Kits (RR036A) wurden von Takara Biomedical Technology (Peking, China) gekauft.

Zellkultur

MTT-Assay

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mittels MTT-Assay untersucht (Yun et al., 2020). Kurz gesagt, die Zellen wurden in 96-Well-Platten ausgesät und 48 Stunden lang mit J147 (1–8 μM) behandelt. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und durch MTT-Lösung (20 μl) ersetzt. Nach weiterer 4-stündiger Inkubation wurde die überstehende Lösung entfernt und DMSO (200 μl) in jede Vertiefung gegeben. Abschließend wurde die optische Absorption bei 570 nm bestimmt.

Messung des Melaningehalts

Zellen mit einer Dichte von 2 × 105 Zellen/ml wurden in Kulturplatten mit 6--Wells ausgesät. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Zellen mit verschiedenen J147-Dosen (1, 2, 4 μM) und mit oder ohne -MSH-Stimulation (60 nM) kultiviert. Nach 48-stündiger Behandlung wurden die Zellen geerntet und das gesamte Melanin im Zellpellet 1 Stunde lang bei 80 °C in 100 μl NaOH-Arbeitslösung (1 mol/l, 10 Prozent DMSO) gelöst und die Absorption bei 405 gemessen nm (Lv et al., 2015; Lv et al., 2019).

Tyrosinase-Aktivitätstest

Die zelluläre Tyrosinaseaktivität wurde wie zuvor beschrieben untersucht (Liao et al., 2017; Lv et al., 2020a). Kurz gesagt, die Zellen wurden nach dreimaligem Waschen mit Zelllysepuffer lysiert und anschließend wurde der Überstand für den Tyrosinase-Aktivitätstest durch Zentrifugieren der Lysate erhalten. 100 μL PBS (0,1 M, pH 6,5) mit 10 μg Proteinen, gemischt mit 100 μL 0,1 Prozent L-DOPA. Die Platte wurde 1 Stunde lang bei 37 Grad inkubiert und dann die optische Absorption bei 475 nm überwacht.

Die direkte Wirkung von J147 auf die Tyrosinaseaktivität wurde mit einem zellfreien System wie zuvor beschrieben getestet (Lv et al., 2020a). Kurz gesagt, die Reaktion zur Bestimmung der Pilz-Tyrosinase-Aktivität wurde in einer 96--Wellplatte durchgeführt und die Reaktionsmischung enthielt Pilz-Tyrosinase (10 Einheiten), L-Tyrosin (0,03 Prozent, 50 μl) und 100 μl PBS (0,1 M, pH 6,5) unter Zugabe verschiedener Konzentrationen von J147. Nach 10-minütiger Inkubation bei 37 Grad wurde die Absorption bei 475 nm mit einem Mikroplatten-Spektrophotometer gemessen.

Masson-Fontana-Ammoniak-Silberfärbung

Um Melaninpigmente nachzuweisen, wurden Hautstücke und Melanozyten in Formalin fixiert und nach dem Standardprotokoll gefärbt (Gu et al., 2018; Lv et al., 2020b). Kurz gesagt, die Objektträger wurden dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen und dann 12 Stunden lang bei Raumtemperatur in ammoniakalischer Silberlösung inkubiert. Nach gründlichem Spülen in entionisiertem Wasser wurden die Objektträger 5 Minuten lang in Hypolösung inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger erneut gespült und weitere 5 Minuten lang mit einem neutralen roten Farbstoff gegengefärbt. Schließlich wurden die Objektträger nach gründlichem Spülen unter einem Nikon-Eclipse-Ti-Mikroskop untersucht.

Immunfluoreszenz für den Melanosomentransfer

Das Kokultursystem von B16F10- und HaCaT-Zellen wurde wie zuvor beschrieben auf der konfokalen Schale etabliert (Lee et al., 2015; Lv et al., 2020c). Nach der J147-Behandlung wurden die Zellen gemäß dem Standardprotokoll mit Anti-GP100 und Anti-Cytokeratin immungefärbt. Die Bilder wurden mit dem Nikon-Eclipse-Ti-Mikroskop aufgenommen.

Immunhistochemie für S-100

Die Immunhistochemie für S-100 wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Lee et al., 2013; Lv et al., 2020b). Eine kurze Beschreibung lautete wie folgt: Die Objektträger wurden 1 Stunde lang bei 25 °C mit 5 Prozent BSA blockiert und dann über Nacht bei 4 °C mit Anti-S-100-Primärantikörper inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Objektträger dreimal mit TBST-Lösung gewaschen und mit dem sekundären Antikörper inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger mit Aminoethylcarbazol behandelt, um die Schnitte zu entwickeln, und unter einem Mikroskop beobachtet.

Reverse Transkription – PCR

Die zelluläre Gesamt-RNA wurde mit TRIzol-Reagenz extrahiert und spektrophotometrisch quantifiziert. Anschließend wurde SuperScript II Reverse Transkriptase zur Synthese einzelsträngiger Proteine ​​verwendetcDNA gemäß den Herstellungsanweisungen.Oligonukleotidprimer wurden von GenScript erworben(Nanjing, China). Die Sequenzen vonMITFGenprimer sind 5′- AGAGCAGGGCAGAGAGTGAGTG -3′, 5′-AACTTGATTCCAGGCTGATGATGTC -3′. Die Sequenzen vonGAPDHGenPrimer sind 5′- AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′, 5′- TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA -3′. PCR-Produkte warendurch Elektrophorese auf 1-prozentigen Agarosegelen aufgetrennt und nachgewiesenunter ultraviolettem Licht (Lee et al., 2013).

Western Blot

Proteine ​​(40 μg) wurden durch SDS-PAGE-Gele aufgetrennt und durch ein elektrophoretisches Transfersystem (Bio-Rad) auf Nitrozellulosefiltermembranen (NC) übertragen. NC-Membranen wurden 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 3 Prozent BSA in TBST-Lösung blockiert. Anschließend wurden die Membranen über Nacht bei 4 Grad mit Primärantikörpern inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Blots dreimal mit TBST-Lösung gewaschen und dann mit Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörpern 1 Stunde lang bei 25 Grad inkubiert und mithilfe verstärkter Chemilumineszenz sichtbar gemacht (Lv et al., 2020d).

Bestimmung des Melaningehalts im Zebrafischmodell

Kurz gesagt, synchronisierte Embryonen wurden gesammelt und mit einer Pipette angeordnet (drei bis vier Embryonen pro Vertiefung mit 200 μl Embryomedium in 96-Wellplatten). Dann wurden J147 und PTU in 0,1 Prozent DMSO gelöst und 35 bis 60 Stunden lang (25 Stunden Exposition) dem Embryonenmedium zugesetzt. Der Einfluss von J147 auf die Melanogenese von Zebrafischen wurde unter dem Stereomikroskop beobachtet (Zheng J. et al., 2018).

Phänotypbasierte Bewertung und UVB-induziertes Hyperpigmentierungs-Meerschweinchenmodell

8 braune Meerschweinchen (6 Wochen, ca. 25–300 g) wurden vom Institute of Laboratory Animal Science (Peking, China) gekauft. Diese Meerschweinchen wurden allein in einem Raum mit konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit in einem 12-stündigen Licht-/Dunkelzyklus gehalten. Die einzelnen Bereiche (1 cm Durchmesserkreis) des Rückens jedes Tieres wurden eine Woche lang einmal täglich 500 mJ/cm2 UVB (Sigma SH-4, Shanghai, China) ausgesetzt, um das Hyperpigmentierungsmodell zu etablieren. Anschließend wurden den hyperpigmentierten Bereichen das Vehikel (PEG400/EtOH=7:3) und J147 (1 Prozent) 3 Wochen lang zweimal täglich verabreicht (20 μl Lösung pro Kreis). Der Pigmentierungsgrad wurde durch Berechnung des ΔL-Werts anhand des mit dem Spektrophotometer (YS3010, 3nh, Shenzhen, China) gemessenen L-Werts wie folgt bewertet: ΔL=L (an jedem gemessenen Tag)-L (am Tag 0) (Lee et al., 2013; Lv et al., 2020b). Alle Tierversuche in dieser Studie wurden vom Tierpflege- und Verwendungsausschuss der Universität Changzhou genehmigt.

Statistische Analyse

ERGEBNISSE

J147 verringerte Melanogenese und die Anzahl der Dendriten in B16F10-Zellen

Die Struktur von J147 ist in Abbildung 1A dargestellt. Zunächst wurde ein Zelllebensfähigkeitsexperiment durchgeführt, um zu untersuchen, ob J147 für B16F10-Zellen zytotoxisch ist. Wie in Abbildung 1B gezeigt, wurden bei einem Dosierungsbereich von 1–8 μM nach 48 Stunden keine zytotoxischen Wirkungen von J147 beobachtet. Anschließend untersuchten wir den Einfluss von J147 auf die Melaninsynthese. Wie in Abbildung 1C gezeigt, hemmte J147 die basale Melaninsynthese. -MSH fördert die Melanogenese in Melanozyten erheblich. Der durch -MSH induzierte Anstieg der Melanogenese wurde nach der Behandlung mit J147 umgekehrt. Übereinstimmend zeigte die Masson-Fontana-Ammoniaksilberfärbung, dass J147 den Melaningehalt in B16F10-Zellen mit oder ohne -MSH deutlich reduzierte (Abbildung 1D). Darüber hinaus waren die Anzahl und Länge der Dendriten sowie die Melaninkonzentration in Dendriten im Vergleich zu unbehandelten Zellen ebenfalls verringert (Abbildung 1D). Die Ergebnisse legen nahe, dass J147 die Melanogenese und Dendritenbildung ohne zytotoxische Wirkungen verringerte.

J147 hemmte die zelluläre Tyrosinase-Aktivität und die Expression von Tyrosinase, TRP-1, TRP-2

Die Tyrosinase-Proteinfamilie (Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2) war an der Melanogenese beteiligt. Unter diesen sind Tyrosinasen Schlüsselenzyme, die den Melanin-Biosyntheseweg regulieren (D'Mello et al., 2016). Um festzustellen, ob J147 die Tyrosinaseaktivität beeinflusst, verwendeten wir zunächst die L-DOPA-Oxidationsmethode, um die Auswirkungen von J147 auf die zelluläre Tyrosinaseaktivität zu bestimmen. Es wurde gezeigt, dass J147 (1–4 μM) dosisabhängig tiefgreifende hemmende Wirkungen auf die zelluläre Tyrosinaseaktivität in B16F10-Zellen ausübt (Abbildung 2A). Als nächstes wurde ein Pilz-Tyrosinase-Aktivitätstest durchgeführt, um die direkten Auswirkungen von J147 auf die Tyrosinase-Aktivität zu bestimmen. Wie in Abbildung 2B gezeigt, wurden keine hemmenden Wirkungen beobachtet, was darauf hinweist, dass J147 die enzymatischen Aktivitäten der Pilztyrosinase nicht beeinflusst (Abbildung 2B). Wie wir wissen, wird die Melanogenese durch die Aktivität und Menge dieser Tyrosinasen gesteuert. Um zu untersuchen, ob die anti-melanogenen Wirkungen von J147 mit der Expression von Tyrosinase zusammenhängen, wurde eine Western-Blot-Analyse durchgeführt. Wie in Abbildung 2C gezeigt, waren die Werte der Tyrosinase-Expression nach J147-Behandlung mit oder ohne -MSH signifikant reduziert, und die gleichen Ergebnisse wurden bei der TRP-1- und TRP-2-Expression beobachtet. Diese Beobachtungen deuteten darauf hin, dass J147 die zelluläre Tyrosinaseaktivität und Melanogenese hemmte, indem es die Expressionsniveaus von Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2 reduzierte.

J147 hemmte den Melanosomentransport durch Regulierung der Expression von Myosin Va, Rab27a und Cdc42

Die Pigmentierung der menschlichen Haut wird durch die Melaninsynthese sowie die Melaninverteilung bestimmt. In Melanozyten von Säugetieren wird Melanin hauptsächlich im Zellkörper hergestelltwandert entlang der Aktinfilamenteund Mikrotubuli zu Dendriten und schließlichzu den benachbarten Keratinozyten, um den Vorgang abzuschließender VertriebVerfahren (Ohbayashi und Fukuda, 2012). Wie in gezeigtAbbildung 1D, J147 verringerte die Dendritenbildung deutlich.Darüber hinaus wurde auch die Melaninkonzentration in Dendriten gemessenreduziert, da das Melaninpigment im Perinukleär aggregiert wurdeRegionen. Als nächstes haben wir B16F10- und HaCaT-Zellen gemeinsam kultiviertUntersuchen Sie, ob J147 Einfluss hatMelanosomenübertragung aufKeratinozyten durch konfokale Mikroskopie. Die Verteilung vonMelanin wurde in den HaCaT-Zellen der Co-Kultur beobachtetModell (Abbildung 3A). Im Gegensatz dazu war das Co-Kultur-Modell48 Stunden lang mit J147 behandelt, Melanosomen-Granulatsignale inHaCaT-Zellen waren signifikantreduziert (Abbildung 3A).

Um den zugrunde liegenden Mechanismus der Hemmwirkung des Melanosomentransfers durch J147 weiter zu klären, untersuchten wir mehrere entscheidende Faktoren, die am Melanosomentransport beteiligt sind. KIF5b vermittelt den Melanosomentransport nach außen entlang der Mikrotubuli, und der Rab27a-Melanophilin-Myosin-Va-Komplex trägt zum Melanosomentransport entlang der Aktinfilamente in Melanozyten bei (Reiner et al., 2020). Darüber hinaus stimuliert Cdc42 die Dendritenbildung in Melanozyten, die ebenfalls eine wesentliche Rolle beim Melanosomentransport spielt. Wie in Abbildung 3B gezeigt, war die Expression von Cdc42, Myosin Va und Rab27a, jedoch nicht von KIF5b, nach J147-Behandlung im Zustand mit oder ohne -MSH signifikant verringert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass J147 den Melanosomentransport hemmte, indem es die Expression von Myosin Va, Rab27a und Cdc42 verringerte.

J147 Beschleunigter MITF-Abbau

MITF ist einer der Schlüsselregulatoren für die Melanogenese und kontrolliert die Gentranskription von Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, Cdc42 und Rab27a (Noguchi et al., 2016; Kim et al., 2019). ). Wir untersuchten zunächst den Einfluss von J147 auf MITF-Transkripte. Wie in Abbildung 4A gezeigt, steigerte -MSH die MITF-Transkription deutlich, nach J147-Behandlung wurde jedoch keine Veränderung beobachtet, was darauf hindeutet, dass J147 die MITF-Expression nicht herunterreguliert. Als nächstes untersuchten wir, ob J147 die Übersetzung von MITF beeinflusst. Wie in Abbildung 4B dargestellt, stiegen die MITF-Proteinspiegel nach der -MSH-Behandlung an, erreichten nach 4 Stunden ihren Höhepunkt und begannen nach 8 Stunden zu sinken (Abbildung 4B). Im Gegensatz dazu sanken die MITF-Proteinspiegel 4 Stunden nach der J147-Behandlung nicht ab, aber 8 Stunden später sanken die MITF-Proteinspiegel rasch auf nicht mehr nachweisbare Werte, was darauf hindeutet, dass J147 die Translation von MITF nicht beeinflusst, aber den MITF-Proteinabbau deutlich beschleunigt.

J147 Unterdrückte Melanogenese durch den MEK/ERK-Signalweg

Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPK)-Signalwege, einschließlich extrazellulärer signalregulierter Proteinkinase (ERK), p38 und c-jun N-terminaler Kinase (JNK), spielen eine entscheidende Rolle bei der Pigmentierung (Lee et al., 2013). Es ist bekannt, dass die ERK-Phosphorylierung den Abbau von MITF erleichtert und schließlich die melanogenen Reize auflöst, was einen wichtigen negativen Rückkopplungsmechanismus darstellt (Kwon et al., 2017). Die Funktion des p38- und des JNK-Signalwegs bleibt jedoch umstritten. Daher untersuchten wir die Wirkung von J147 auf die MAPK-Signalwege. Wie in Abbildung 5A gezeigt, aktivierte J147 MEK/ERK und p38, wohingegen kein Einfluss auf die Phosphorylierung des JNK-Signalwegs festgestellt wurde.

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