Der Weg zum Fortschritt präklinischer Studien zu altersbedingten neurodegenerativen Erkrankungen: Eine Perspektive auf Nagetier- und HiPSC-abgeleitete Modelle Teil 5

Vorteile von hiPSC-abgeleiteten Zellsystemen und Krankheitsmodellen

Verbesserte Plattformen zur Krankheitsmodellierung und Arzneimittelentwicklung

Das Potenzial für hiPSC-basierte In-vitro-Modelle, für NDDs mit einer Untersuchung humaner genetischer Komponenten äußerst aussagekräftig zu sein, ist hoch.

Der Zusammenhang zwischen menschlicher Genetik und Gedächtnis ist ein vieldiskutiertes Thema, insbesondere in der modernen Gesellschaft, in der wir uns auf persönliche Entwicklung und Lernen konzentrieren. Obwohl unsere genetischen Informationen unsere grundlegenden Merkmale bei der Geburt bestimmen, unterscheidet sich das Gedächtnis von festen Merkmalen wie unserer Größe und Hautfarbe. Stattdessen kann es kultiviert und verbessert werden und spielt eine wichtige Rolle im täglichen Leben.

Erstens zeigen wissenschaftliche Untersuchungen, dass das Gedächtnis nicht direkt mit genetischen Genen zusammenhängt. Obwohl einige Menschen von Geburt an klüger sind als andere, kann das Gedächtnis auf lange Sicht durch Lernen und Kultivierung schrittweise verbessert werden. In unserem Lernprozess von der Grundschule bis zur Universität müssen wir unser Gedächtnis ständig nutzen und verbessern, um unsere schulischen Leistungen zu verbessern. Beispielsweise erinnern wir uns an Probleme und Lösungen durch wiederholtes Durchsehen und Üben, was dabei hilft, unser Gedächtnis zu trainieren.

Zweitens hilft ein gesunder Lebensstil auch unserem Gedächtnis sehr. Die körperliche Gesundheit hat einen großen Einfluss und Einfluss auf das Gedächtnis, beispielsweise ausreichend Schlaf, eine gesunde Ernährung und mäßige Bewegung. Wir beginnen bei unserem eigenen Körper und bleiben durch Bewegung und einen gesunden Lebensstil gesund, wodurch unser Gedächtnis klarer und schärfer wird.

Schließlich können wir auch unsere Gedächtnisleistung erweitern, indem wir unseren Horizont ständig erweitern und uns an verschiedenen neuen Dingen beteiligen. Wir können zum Beispiel versuchen, eine neue Sprache zu lernen und an sozialen Aktivitäten wie Reisen teilzunehmen, und diese Erfahrungen können mehr Erinnerungen in unserem Kopf hervorrufen.

Kurz gesagt, die Beziehung zwischen menschlicher Genetik und Gedächtnis ist komplex und vielfältig, und natürlich wird es entsprechende Unterschiede aufgrund persönlicher genetischer Unterschiede geben. Aber wir sollten nicht außer Acht lassen, was wir tun können: Die Verbesserung unseres Gedächtnisses und unserer Selbstmanagementfähigkeit durch kontinuierliches Lernen, eine gesunde Lebensweise und die ständige Erweiterung unseres Horizonts ist für uns der beste Weg, genetische Unterschiede zu überwinden. Es ist ersichtlich, dass wir unser Gedächtnis verbessern müssen, und Cistanche kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche ein traditionelles chinesisches Arzneimittel mit vielen einzigartigen Wirkungen ist, darunter die Verbesserung des Gedächtnisses. Die Wirksamkeit von Cistanche beruht auf seinen verschiedenen Wirkstoffen, darunter Gerbsäure, Polysaccharide, Flavonoidglykoside usw. Diese Inhaltsstoffe können die Gesundheit des Gehirns auf vielfältige Weise fördern.

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Die Fähigkeit, NDD-Kandidatengene mit zellulären Phänotypen wie RNA- und Proteinexpressionsprofilen, morphologischen Veränderungen und biochemischen Signaturen in hiPSC-abgeleiteten Zellen zu korrelieren, erleichtert Studien, die untersuchen, wie die menschlichen genetischen Komponenten komplexer NDDs wie AD und PD exprimiert werden eine zelluläre Ebene.

Darüber hinaus ermöglichen hiPSCs die Einbeziehung der genetischen Komplexität der zugrunde liegenden genetischen Hintergründe des Patienten in das Modell, was häufig negiert (z. B. chemische Modelle) oder zu stark vereinfacht (z. B. monogenetische Tiermodelle) wird.

Es ist allgemein anerkannt, dass der Beginn, das Fortschreiten und die Schwere der Neurodegeneration durch komplexe genetische Faktoren und das Zusammenspiel mehrerer genetischer Varianten mit relativ geringen Auswirkungen bestimmt werden.

Diese angeborene genetische Landschaft, die in von Patienten abgeleiteten hiPSC-Modellen erfasst wird, ermöglicht es uns, genetische Determinanten und biologische Faktoren zu untersuchen, gepaart mit der Fähigkeit, modulare, hochpräzise In-vitro-NDD-Modelle zu generieren, um auf unserem aktuellen Verständnis der Krankheitsbiologie aufzubauen. Die hiPSC-Technologie stellt derzeit die einzige verfügbare Technologie für den Menschen dar -basierte Modelle, in denen die gesamte genetische Landschaft der Patienten erfasst wird.

Darüber hinaus ermöglichte die Möglichkeit, Genom-Editierungstechnologien wie CRISPR-Cas9 mithilfe von hiPSCs anzuwenden, die Erstellung isogener Modelle zur Bewertung präziser genetischer Varianten. Zusätzlich zur Skalierbarkeit sind hiPSCs selbsterneuerbar.

Daher stellen von hiPSC abgeleitete Modelle ein vielversprechendes System für präklinische Studien dar. Darüber hinaus eignet sich die genetische Vielfalt des Menschen, die in patienteneigenen hiPSC-Kapazitäten erfasst wird, für die Bewertung von Ansätzen der „personalisierten Medizin“.

Die Möglichkeit, individuelle Reaktionen auf Behandlungen effektiv zu testen und vor der Verabreichung in einer klinischen Umgebung Non-Responder oder ungenügende Responder zu identifizieren, unterstreicht die Eignung von hiPSC-abgeleiteten Modellen für präklinische Bewertungen (Abbildung 2).

Insgesamt sind die potenziellen Informationen, die durch präklinische Studien in hiPSC-Modellen generiert werden, robust, für menschliche Probanden relevant und für die Implementierung in die Gestaltung klinischer Studien (z. B. Stratifizierung der Probanden) zur Verbesserung der Genauigkeit der Ergebnisse unerlässlich.

Grenzen von Tiermodellen überwinden

hiPSCs bieten eine Möglichkeit, viele der Probleme zu überwinden, die in aktuellen Tiermodellen auftreten, wie bereits erwähnt. Erstens bieten iPS-abgeleitete Modelle eine menschenbasierte Plattform zur Bewertung potenzieller Therapeutika in der tatsächlichen genetischen Landschaft der menschlichen Krankheit.

Zweitens werden durch die Gewinnung von Zellen von Patienten viele technische Probleme hinsichtlich der besten Methode zur Modellierung menschlicher Krankheitsmutationen umgangen, da das Modell den einzigartigen genetischen Hintergrund des Patienten enthält. Drittens sind hiPSC-Zellen für genetische und pharmakologische Manipulationen leicht zugänglich, was strukturelle und funktionelle Assays mit hohem Durchsatz zur Beurteilung des Krankheitsphänotyps ermöglicht.

Zu diesem Zweck haben wir kürzlich ein hiPSC-abgeleitetes DA-Neuronenmodell entwickelt, das von einem PD-Patienten mit SNCA-Triplikation erhalten wurde, um einen All-in-One-LV-GT zu bewerten, der auf die Reduzierung der SNCA-Werte abzielt. Unsere LV-Intervention reduzierte erfolgreich die SNCA-Spiegel und rettete krankheitsbedingte Phänotypen durch die Erzeugung reaktiver oxidativer Spezies (ROS) und die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen.140

Viertens kann die Erstellung von In-vitro-HiPSC-basierten Modellen im Vergleich zum Standard-Nagetiermodell in deutlich kürzerer Zeit erreicht werden, in der Größenordnung von 30 Tagen, im Gegensatz zu Tiermodellen, die zwischen Monaten und Jahren liegen können.

Fünftens und im Einklang mit dem vorherigen Punkt sind hiPSC-basierte Modelle erheblich kostengünstiger und energieverbrauchender als Nagetiermodelle, insbesondere im Hinblick auf laufende Tierhaltungspflichten und Infrastruktur, Vorschriften sowie Schulungs- und Compliance-Anforderungen. Die zunehmend wirtschaftliche präklinische Krankheitsmodellierung erhöht den Zugang für Forschungsgruppen zur Bewertung mutmaßlicher Therapeutika, verbessert die Übersetzbarkeit und verbessert letztendlich die Effizienz der DMT-Entwicklung.202

Insgesamt verschaffen diese Vorteile den von HiPSC abgeleiteten Modellen einen deutlichen Vorteil bei der Untersuchung der Neurodegeneration, und solche Modelle haben das Potenzial, neue Entdeckungen zu generieren, die in früheren Zellkultur- und Tierkrankheitsmodellen nicht zugänglich waren.

Die hier besprochenen Studien zeigen die Notwendigkeit und den Wert der Einbeziehung von 2D- und 3D-hiPSC-basierten Modellen in NDD-Mechanismusstudien zur Aufklärung von Faktoren, die an der Krankheitsverursachung und pathogenen Signalwegen beteiligt sind, sowie in translationalen Studien und Studien zur Wirkstoffentdeckung, wie z. B. der Identifizierung und Validierung von therapeutischen Zielen .

Zusammengenommen stellen die von hiPSC abgeleiteten NDD-Modelle einen Fortschritt in der medizinischen Forschung dar, da sie eine verbesserte Krankheitsmodellierung ermöglichen, die mit vergleichsweise kürzeren Experimenten, die kostengünstig und vielleicht am wichtigsten sind, genau und für die Modellierung menschlicher Krankheiten geeignet sind.

Abbildung 2. Schematische Darstellung einer verbesserten DMT-Arzneimittelentwicklungspipeline für NDDs durch verstärkte Einbindung und/oder Substitution von hiPSC-abgeleiteten Modellen. Die Entwicklung eines mutmaßlichen DMT beginnt mit der Entdeckungsphase, die sowohl die Identifizierung relevanter Genziele als auch Krankheitsmechanismen umfasst.

Nachfolgende Krankheitsmodelle werden in der frühen präklinischen Phase entwickelt, um die Pathophysiologie der zellulären Erkrankung zu untersuchen und Wirkstoffziele zu validieren sowie ein frühes Screening und die Optimierung früher CGT-IPs/DMTs durchzuführen. Die fortschreitende Entwicklung von DMTs, einschließlich der weiteren Modellentwicklung und Zielvalidierung sowie der Untersuchung von Off-Target-Effekten, erfolgt in der mittleren präklinischen Phase.

Mit fortschreitender DMT werden in der späten präklinischen Phase weitere Informationen zur pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Aktivität gewonnen. Der verstärkte Einsatz von hiPSC-abgeleiteten Modellen in diesen Phasen stellt aus mehreren Gründen eine attraktive Verbesserung der bestehenden Medikamentenentwicklungspipeline dar; Sie sind nämlich kostengünstig, vielseitig und, was am wichtigsten ist, sie überwinden viele der angeborenen Einschränkungen bestehender Tiermodelle von NDDs.

In dieser Phase können IND-Anträge für mutmaßliche DMTs eingereicht werden, die derzeit vier kritische Ziele enthalten, die mit jedem neuen DMT, insbesondere CGT-IPs, erfüllt werden müssen: (1) Zielauswahl, (2) Entwicklung und Optimierung von Leitverbindungen, (3) Initialisierung und eskalierendes Dosierungsschema und (4) Feststellung der Machbarkeit und des ROA.

Jedes davon kann durch den Ersatz von hiPSC-basierten Modellen in präklinischen Studien genau und angemessen berücksichtigt werden. DMTs erhalten dann möglicherweise die FDA-Genehmigung für den Beginn klinischer Studien.

Die Einbeziehung von hiPSC-basierten Modellen in eine zusätzliche Phase 1a kann einbezogen werden, was ein verbessertes Kandidaten-Screening in der Rekrutierungsphase und die Identifizierung potenzieller Non-Responder oder Poor-Responder auf der Grundlage präklinischer genetischer Studien ermöglicht.

DMTs mit nachweislicher Sicherheit in Phase 1a durchlaufen dann die klinischen Studien der Phasen 1, 2 und 3. Danach erhalten diejenigen mit einer signifikanten positiven Wirkung die behördliche Genehmigung für den New Drug Application (NDA) und werden für den Verbrauchergebrauch freigegeben, wobei die Pharmakovigilanz kontinuierlich fortgeführt wird, um bisher nicht identifizierte Substanzen zu identifizieren nachteilige Folgen im Laufe der Zeit.

Einschränkungen von hiPSC-abgeleiteten In-vitro-Modellen: Zeit und Reproduzierbarkeit

Die Kultivierungstechnologien für hiPSCs sind im letzten Jahrzehnt entstanden und ihr Nutzen für die Modellierung von Krankheiten und die präklinische Bewertung mutmaßlicher DMTs ist relativ neu.

Wie bei jeder neuen Technologie müssen mehrere Einschränkungen berücksichtigt werden, wenn versucht wird, die biologischen Eigenschaften von NDDs genau nachzubilden. Erstens kann die Kultivierung von hiPSCs und die Erstellung genauer und zuverlässiger Zellmodelle teuer, arbeitsintensiv und zeitaufwändig sein. Im Durchschnitt kostet die Validierung von hiPSC-Linien nach einem geeigneten Standard für die medizinische Forschung.203

Die Prozesse der Neuprogrammierung, Differenzierung und Reifung werden verlängert. Die zelluläre Umprogrammierung von Startergewebe in hiPSCs kann mindestens 20 bis 30 Tage dauern,151 und die anschließende Zelldifferenzierung und -reifung variiert je nach gewünschtem Zelltyp und verwendeter Methode; Beispielsweise kann die Erzeugung reifer Neuronen, Astrozyten und Mikroglia zwischen 6 und 15 Wochen,204 4 und 9 Wochen,205.206 bzw. 5 bis 9 Wochen,164.207 dauern.

Daher bevorzugen Forscher oft die Verwendung von Vorläuferzellen als stabile Zwischenprodukte für Experimente, da sie weitgehend repräsentativ für den Zielzelltyp sind und in einem schnelleren Zeitrahmen erzeugt werden können.204 Daher können die für die Einrichtung des hiPSC-Modellsystems erforderlichen Zeitbeschränkungen und Kosten anfallen stellen für viele Forschungsgruppen ein Problem dar.

Darüber hinaus wird bei der Modellierung von NDDs auch die Zeit berücksichtigt, die für die Entwicklung wichtiger krankheitsassoziierter Zellphänotypen in von hiPSC abgeleiteten Zellen erforderlich ist. Während es Jahrzehnte im Leben eines Patienten dauert, bis klinische und pathologische Symptome auftreten, wurden krankheitsbedingte molekulare Phänotypen in hiPSC-abgeleiteten Modellen etwa zwei Monate nach der Reifung entdeckt.208

Die Einschränkungen ergeben sich jedoch aus der begrenzten Lebensdauer von hiPSC-basierten Modellen in Kultur, die möglicherweise nicht ausreicht, um ein vollständiges Bild zu entwickeln, das der Krankheit auf Zell- und Gewebeebene ähnelt.

Strategien zur Beschleunigung des Differenzierungs- und Reifungsprozesses, wie der Einbau von Notch- und G-Sekretase-Inhibitoren zur Verkürzung der Reifungszeit,209 und die Überexpression von Neurogenin-2 (Ngn2) oder NeuroD1158 waren teilweise erfolgreich und führten zu weiteren Bedenken, die sich aus der ektopischen Expression ergeben.

Weitere Einschränkungen hängen mit der Reproduzierbarkeit der Systeme in sich wiederholenden Experimenten und der inhärenten Modell-zu-Modell-Variabilität zusammen, einschließlich Rückschlägen hinsichtlich der Reinheit der von hiPSC abgeleiteten Kulturen und des Vorhandenseins unerwünschter heterogener Zellpopulationen.210

Daher ist es wichtig, die Heterogenität in Zellpopulationen zu berücksichtigen, wenn von hiPSC abgeleitete Krankheitsmodelle verwendet werden, insbesondere beim InDMT-Screening und der Wirksamkeitsbewertung. Darüber hinaus wurde berichtet, dass hiPSC-Kulturen eine genomische Instabilität aufweisen und während der Zellexpansion und Neuprogrammierung dazu neigen, genetische Aberrationen und Mutationen zu erwerben.211

Auch bei der Verwendung von isogenen Linien, die durch verschiedene Genom-Editierungstechniken erzeugt wurden, ist Vorsicht geboten, da potenzielle Off-Target-Effekte auftreten können (z. B. unbeabsichtigte klonale Variabilität über isogene Linien hinweg und Off-Target-Mutagenese).212,213 Daher ist es wichtig, regelmäßig zu evaluieren die genomische Stabilität von hiPSCs, um ein strenges DMT-Screening sicherzustellen.

Herausforderungen bei der Rekapitulation sporadischer NDD-Pathophysiologie und zellulärer Phänotypen

Die Komplexität von NDDs und das Fehlen einer umfassenden Charakterisierung und eines mechanistischen Verständnisses ihrer zellulären Phänotypen stellen eine Herausforderung dar, sie mit zellulären Modellen, einschließlich hiPSC-basierten Systemen, zu rekapitulieren.

Die Ursachen von NDDs sind komplex und multifaktoriell und umfassen polygene Risikofaktoren (d. h. mehrere Gene und Varianten), epigenetische Merkmale, Alterung, Geschlecht und Umweltfaktoren wie Auslöser von oxidativem Stress, von denen einige schwer zu induzieren sind, insbesondere in einer endlosen Liste verschiedener Kombinationen in einem Laborsystem.

Darüber hinaus stammen die meisten von hiPSC abgeleiteten AD-PD-Modelle von Patienten mit familiären Mutationen, die nur einen sehr kleinen Anteil aller Fälle ausmachen.214,215 Da sich die Mechanismen, die den familiären und sporadischen Formen zugrunde liegen, möglicherweise nicht unterscheiden, besteht die Notwendigkeit, davon abgeleitete Modelle zu etablieren hiPSCs und Fibroblasten, die von Patienten mit sAD oder sporadischer Parkinson-Krankheit gewonnen wurden.

Um dieses Ziel zu erreichen, sind in den letzten Jahren Initiativen zur Zellaufbewahrung von Patienten entstanden. Dazu gehören Applied StemCell (ASC), California Institute for Regenerative Medicine (CiRA), Cedars Sinai Induced Pluripotent Stem Cell Core, European Bank for Induced Pluripotent StemCells (EBiSC), Korean National Stem Cell Bank (KSCB), NationalInstitute of Aging (NIA). , National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS), National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) und WiCell Research Institute (WiCell) (Tabelle S2).

Das erwartete Wachstum dieser Sammlungen wird die Etablierung von HiPSC-abgeleiteten Modellen erleichtern, die besser für die Erforschung der häufigen sAD und sporadischen Parkinson-Krankheit geeignet sind.

Nichtsdestotrotz erzeugen hiPSC-Modelle, die von sporadischen NDD-Patienten abgeleitet wurden, bei Umweltmanipulationen, wie z. B. Exposition gegenüber Neurotoxinen und chemischer Induktion von oxidativem Stress, geeignete zelluläre Phänotypen, die für AD181 und PD216 charakteristisch sind.

Außerdem ergab eine aktuelle Studie Veränderungen in der mitochondrialen Proteinexpression und erhöhten oxidativen Stress in hiPSCs, die von sAD-Patienten erzeugt wurden, trotz eines deutlichen Mangels an Ab- und Tau-Pathologie,217 was darauf hindeutet, dass hiPSC-Modelle wertvolle Einblicke in die nuancierte Pathophysiologie speziell für sporadische NDD-Subtypen liefern könnten.

Darüber hinaus wurden in einer aktuellen Studie von Meyer et al.218 hiPSCs von sAD-Patienten verwendet und festgestellt, dass MAPT, das für das Tau-Protein kodiert, in von sAD abgeleiteten Zellen im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen signifikant erhöht war.

Trotz dieser Herausforderungen sind aktuelle hiPSC-abgeleitete Modelle hervorragende Ersatzmodelle, die die Möglichkeit bieten, die Pathophysiologie von Krankheiten nachzuahmen und Goldstandard-Krankheitsmerkmale mit den vollständigen genetischen Grundlagen bei sporadischen Patienten zu etablieren, die als Ergebnismaße zur Verbesserung nachfolgender Krankheitsmodelle genutzt werden können.

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