Das Programm der renalen Fibrogenese wird von MicroRNAs kontrolliert, die den oxidativen Stoffwechsel regulieren

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Vernica Miguela,*, Ricardo Ramos, Laura García-Bermejob, Diego Rodríguez-Puyolc, gest

Santiago Lamesa,**

ein Programm für physiologische und pathologische Prozesse, Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM), 28049, Madrid, Spanien

b Genomic Facility, Parque Científico de Madrid, Madrid, Spanien

c Abteilung für Pathologie, Hospital Universitario „Ramn y Cajal“, IRYCIS, Madrid, Spanien

d Abteilung für Medizin und medizinische Fachrichtungen, Forschungsstiftung des Universitätskrankenhauses „Principe de Asturias“, IRYCIS, Universidad de Alcala´, Alcala´ de Henares, Madrid, Spanien

Schlüsselwörter: MicroRNAS, Nierenfibrose, Fettsäureoxidation, Extrazelluläre Matrix, CPT1A, Mitochondrien

Cistanche Bodybuilding ist sehr gut für die Nierenfunktion

A B S T R A C T

Eine übermäßige Ansammlung von extrazellulärer Matrix (ECM) ist das Kennzeichen von fibrotischen Erkrankungen. In der Niere ist es der letzte gemeinsame Weg weit verbreiteter Krankheiten, der zu chronischem Nierenversagen führt. Während Zytokine wie TGF- eine grundlegende Rolle bei der Transformation von Myofibroblasten spielen, haben neuere Arbeiten gezeigt, dass mitochondriale Dysfunktion und fehlerhafte Fettsäureoxidation (FAO), die die Hauptenergiequelle für renale tubuläre Epithelzellen beeinträchtigen, als grundlegende Mitwirkende vorgeschlagen wurden zur Entstehung und zum Fortschreiten der Nierenfibrose. Es wurde berichtet, dass MicroRNAs (miRNAs), die die Genexpression posttranskriptionell regulieren, die renale Fibrogenese kontrollieren. Um miRNAs zu identifizieren, die an der metabolischen Störung der Nierenfibrose beteiligt sind, führten wir einen miRNA-Array-Screen im Mausmodell der einseitigen Ureterobstruktion (UUO) durch. MiR-150-5p und miR-495-3p wurden aufgrund ihrer Verbindung zur menschlichen Pathologie, ihrer Rolle im mitochondrialen Metabolismus und ihrer Ausrichtung auf das Fettsäure-Shuttle-Enzym CPT1A ausgewählt. Wir fanden eine 2-- und 4--fache Hochregulierung von miR-150-5p bzw. miR-495-5p sowohl im UUO- als auch im Folsäure-induzierten Nephropathie (FAN)-Modell , während TGF- 1 ihre Expression in der humanen renalen tubulären Epithelzelllinie HKC-8 hochregulierte. Diese miRNAs synergierten mit TGF- bezüglich seiner profibrotischen Wirkung, indem sie die Fibrose-assoziierten Marker Acta2, Col1 1 und Fn1 verstärkten. Bioenergetische Studien zeigten eine Verringerung der FAO-assoziierten Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) in HKC-8-Zellen in Gegenwart beider miRNAs. Konsistent wurden die Expressionsniveaus ihrer mitochondrialen Zielgene CPT1A, PGC1 und des mitochondrialen Transkriptionsfaktors A (TFAM) in Nierenepithelzellen, die diesen miRNAs ausgesetzt waren, um die Hälfte reduziert. Im Gegensatz dazu haben wir keine Veränderungen der mitochondrialen Masse und des Transmembranpotentials (ΔѰm) oder der mitochondrialen Superoxidradikalanionenproduktion festgestellt. Unsere Daten unterstützen, dass miR-150 und miR- 495 zur renalen Fibrogenese beitragen können, indem sie das metabolische Versagen verschlimmern, das entscheidend an tubulären Epithelzellen beteiligt ist, was letztendlich zu Fibrose führt.

1. Einleitung

Die chronische Nierenerkrankung (CKD) ist ein klinischer Zustand, bei dem die Einschränkung der Nierenfunktion erhalten bleibt. Es wird allgemein als irreversibel und progressiv angesehen. Sie stellt ein wichtiges Problem der öffentlichen Gesundheit dar, das 12–14 Prozent der Allgemeinbevölkerung betreffen kann [1]. Es kann bei etwa 30–40 Prozent der Patienten mit weit verbreiteten Pathologien wie Diabetes mellitus und Bluthochdruck vorhanden sein, wo es zur Bestimmung der Entwicklung und Prognose beiträgt. Unabhängig von der Ätiologie der Erkrankung führt das Fortschreiten der CKD zu Tubuli-interstitieller und glomerulärer Fibrose [2]. Tubulo-interstitielle Fibrose beinhaltet die Erweiterung des Raums zwischen der tubulären Basalmembran und den peritubulären Kapillaren durch die Ablagerung von Matrixproteinen (ECM) (vorwiegend Kollagen Typ I und III und Fibronektin) in Verbindung mit Entzündungszellen, tubulärem Zellverlust und Myofibroblastenakkumulation [3].

Transforming Growth Factor- (TGF-) gilt als ein entscheidendes allgegenwärtiges pro-fibrotisches Zytokin und als Hauptregulator der Myofibroblasten-Differenzierung bei Fibrose [4]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass ein globaler Defekt in der Fettsäureoxidation (FAO), der zu einer Beeinträchtigung der Hauptenergiequelle für tubuläre Epithelzellen führt, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Nierenfibrose spielt [5,6]. TGF- unterdrückt FAO auf SMAD3-- und PGC1A-abhängige Weise und beeinflusst somit Transkriptionsregulatoren der Fettsäureaufnahme und -oxidation, einschließlich CPT1A [5]. Veränderungen der FAO führen schließlich zu intrazellulärer Lipidakkumulation und ATP-Mangel, was zu Fibrose führt [5,7]. Daher können Strategien, die darauf abzielen, die metabolische Störung, die bei CKD auftritt, wiederherzustellen, therapeutische Optionen bieten [8].

MicroRNAs (miRNAs) haben sich durch ihre Wirkung auf die posttranskriptionelle Regulation als kritische Regulatoren der Genexpression herausgestellt. In der Niere spielen miRs nachweislich eine entscheidende Rolle bei der Nephrogenese, Homöostase und Krankheit [9]. MiRNAs sind auch in der Lage, fibrotische Prozesse zu regulieren und wurden als „Fibrose“ bezeichnet [10]. Darüber hinaus wurde aufgrund des Fehlens einer wirksamen Therapie zur Verhinderung oder Umkehrung der Nierenfibrogenese [11] die Manipulation der miRNA-Expression durch In-vivo-Zufuhr von miRNA-Mimetika oder -Inhibitoren als vielversprechende therapeutische Strategie für CKD vorgeschlagen [12]. Darüber hinaus können zirkulierende miRNAs diagnostische und sogar prognostische Biomarker darstellen [13].

Die MiRNA-vermittelte Kontrolle der Nierenfibrose erfolgt hauptsächlich durch die Regulation der TGF- 1-Signalübertragung auf zellabhängige und kontextabhängige Weise, wobei der Smad-Weg als eines der Hauptziele genutzt wird [14]. In früheren Arbeiten haben wir mehrere miRNAs identifiziert, die einen Einfluss auf die Nierenfibrose haben, indem sie bestimmte Stoffwechselwege regulieren [15,16]. Die Überexpression von miR-9-5p verhindert die Dedifferenzierung der tubulären epithelialen Nierenzellen und reprogrammiert die Fibrose-bedingte Stoffwechselstörung [16], während der Verlust der Funktion von miR-33, entweder genetisch oder pharmakologisch, zu einer Zunahme führt FAO und Verhinderung der Lipidakkumulation in tubulären Epithelzellen. Dies ist mit einer erhöhten Energieversorgung, einer verbesserten mitochondrialen Bioenergetik und der Verhinderung experimenteller Nierenfibrose verbunden [15]. Somit sind miRNAs, die die zelluläre Bioenergetik regulieren, auch in der Lage, die renale Fibrogenese zu regulieren. In dieser Studie haben wir eine miRNA-Array-basierte Strategie im chronischen Nierenverletzungsmodell der einseitigen Ureterobstruktion (UUO) eingesetzt, um miRNAs zu identifizieren, die am renalen fibrotischen Phänotyp durch die Modifikation von Stoffwechselwegen beteiligt sind. Durch die Auswahl mehrerer Gene, die mit der Mitochondrienfunktion zusammenhängen (CPT1A, TFAM, PGC1A), identifizierten wir sowohl miR-150 als auch miR-495 als miRNAs, die in der Lage sind, die FAO-assoziierte Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) zu reduzieren und TGF{ zu fördern. {21}}induzierte fibrogene Transformation in der humanen renalen tubulären Epithelzelllinie HKC-8. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von miRNAs als mitochondriale Stoffwechselregulatoren, die an der renalen Fibrogenese beteiligt sind.

2. Material und Methoden

Zelllinien und Kulturbedingungen. Humane renale proximale tubuläre Epithelzellen (HKC-8) wurden in DMEM/F12 (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium 1:1 (v/v)) (Corning, New York, NY), ergänzt mit 15 mM HEPES, 5 Prozent, kultiviert (Vol/Vol) fötales Rinderserum (FBS)

(HyClone Laboratories, Logan, UT), 1x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) (Gibco, Rockville, MD), 0,5 ug/ml Hydrocortison (Sigma, St. Louis, MO), 50 Einheiten/ ml Penicillin und 50 ug/ml Streptomycin (Gibco, Rockville, MD) bei 37 °C und 5 % CO2. Diese Zelllinie wurde freundlicherweise von Dr. Susztaks Labor (Philadelphia, Pennsylvania, USA) zur Verfügung gestellt. Behandlungen mit humanem rekombinantem 10 ng/ml TGF- 1 (R&D Systems, Minneapolis, MN) wurden nach serumfreiem Aushungern von HKC-8-Zellen für 12 h durchgeführt.

Transfektionsverfahren. Die Zellen wurden in 60-mm-Kulturschalen ausgesät, um eine Konfluenz von 70 Prozent zu erreichen. Sie wurden mit 40 nM entweder mirVana™ miRNA mimic of miR-150, miR-495 oder mirVana™ miRNA mimic negative control (Ambion Company, USA) unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) transfiziert. . Die Zellen wurden mit der Lipofectamin-prä-miRNA 6 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 5 ml frisches Medium mit 10 Prozent FBS zu den Kulturschalen gegeben und die Zellen wurden 6 h lang in Kultur gehalten, bis sie für nachfolgende Experimente verwendet wurden. Im Falle einer Kombination mit TGF- 1-Behandlung wurde es auf die Zellen nach miRNAs-Überexpression gemäß dem vorherigen Abschnitt aufgebracht.

Immunoblot. Die Zellen wurden in PBS gewaschen, homogenisiert und in 100 μl RIPA-Lysepuffer mit 150 mM NaCl, 0,1 % SDS, 1 % Natriumdeoxycholat, 1 % NP-40 und 25 mM Tris– lysiert. HCl, pH 7,6, in Gegenwart von Protease (Complete, Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) und Phosphatase-Inhibitoren (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) und durch Schaben geerntet. Ein Viertelstück jeder Nierenprobe (erhalten nach Längs- und Querzerschneidung) wurde in 300 ul RIPA-Puffer mit 5-mm-Edelstahlperlen (Qiagen, Valencia, CA) unter Verwendung von TissueLyser LT (Qiagen, Valencia, CA) unter Vibration homogenisiert 50 Hz für 15 min bei 4 ◦ C. Die Proben wurden durch Zentrifugation bei 10,000 g für 15 min bei 4 ◦ C geklärt. Das Pellet wurde dann verworfen und der Überstand wurde als Proteinlysat aufbewahrt. Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL) bestimmt und im Glomax®-Multi Detection System (Promega, Madison, WI) gemessen. Gleiche Proteinmengen (10–50 μg) aus dem Gesamtextrakt wurden auf 8–10-prozentigen SDS-Polyacrylamidgelen getrennt und bei 12 V für 20 min in einem halbtrockenen Zustand auf Nitrozellulose-Blottingmembranen (GE Healthcare, Chicago, IL) übertragen Trans-Blot-Turbo-System (Bio-Rad, Hercules, Kalifornien).

Die Membranen wurden durch 1-stündige Inkubation mit 5 % fettfreier Milch in PBS mit 0,5 % Tween-20 blockiert und über Nacht mit den spezifischen Antikörpern geblottet: CPT1A (Ab128568, Abcam; 1:1{ {26}}; 4 ◦ C über Nacht), -SMA (sc-32251, Santa Cruz Biotechnology; 1:1000; 4 ◦ C über Nacht), GAPDH (MAB374, Millipore; 1:15000; 1 h, Raumtemperatur ). Nach der Inkubation mit IRDye 800 Ziegen-Anti-Kaninchen- und IRDye 600 Ziegen-Anti-Maus- (1:15.000, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) sekundären Antikörpern wurden die Membranen dreifach mit dem Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, Nebraska). Banddensitometrie wurde unter Verwendung der ImageJ 1.48-Software (http://rsb.info.nih.gov/ij) durchgeführt und die relative Proteinexpression wurde durch Normalisierung auf GAPDH bestimmt. Fold-Änderungen wurden auf Werte der Kontrollbedingung normalisiert.

RNA-Extraktion. Gesamt-RNA wurde aus HKC-8-Zellen oder Mäusenieren unter Verwendung des miRNeasy Mini Kits (Qiagen, Valencia, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. RNA-Menge und -Qualität wurden bei 260 nm mit einem Nanodrop-1000-Spektrophotometer (Thermo Scientific, Rockford, IL) bestimmt.

Analyse der mRNA-Expression. Reverse Transkription (RT) wurde mit 500 ng Gesamt-RNA unter Verwendung des iScript TM -cDNA-Synthesekits (Bio-Rad, Hercules, CA) durchgeführt. qRT-PCR wurde mit dem iQ™SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) unter Verwendung eines 96-Well Bio-Rad CFX96 RT-PCR-Systems mit einem C1000 Thermocycler (Bio-Rad, Hercules, CA) durchgeführt. CA) nach Herstellerangaben. Aus jeder Amplifikationskurve wurde unter Verwendung der vom Hersteller bereitgestellten CFX96-Analysesoftware ein Ct-Wert erhalten. Die relative mRNA-Expression wurde mit der 2 − ΔΔCt-Methode bestimmt [17]. Das 18S-Gen wurde zu Normalisierungszwecken verwendet. Die für die mRNA-Quantifizierung verwendeten Primersequenzen waren: CPT1A (FW: TGCTTTACAGGCGCAAACTG, RV: TGGAATCGTGGA TCCCAAA), ACTA (FW: TTCAATGTCCCAGCCATGTA, RV: GAAGGAA-TAGCCACGCTCAG), COL1A1 (FW: CGGACGACCTGGTGAGAGA, RV: CATTGTGTCCCCTAATGCCTT), FNTT1 (FWAT: GTGGGT GGGGAATG, RV: CCAATGCCACGGCCATAGCAGTAGC), PGC1A (FW: TGCCCTGGATTGTTGACATGA, RV: TTTGTCAGGCTGGGGGTAGG), TF AM (FW: CATCTGTCTTGGCAAGTTGTCC, RV: CCACTCCGCCCTA-TAAGCATC), 18S (FW: AGCTATCAATCTGTCAATCCTGTC, RV: GCTTA ATTTGACTCAACACGGGA). Fold-Änderungen wurden auf Werte der Kontrollbedingung normalisiert.

Quantifizierung der miRNA-Expression. Die Quantifizierung der miRNAs-Expression wurde mit dem miRCURY Locked Nucleic Acid (LNA) miRCURY LNA RT Kit (Exiqon, Feedback, Dänemark) durchgeführt. Nach RT wurde die cDNA-Matrize unter Verwendung von mikroRNA-spezifischen LNA-Primern für reifes miR150-5p oder miR-495-3p (Exiqon, Feedback, Dänemark) amplifiziert. Die qRT-PCR wurde in einem 96-Well Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System mit einem C1000 Thermocycler unter Verwendung von iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt . Ein Ct-Wert für drei Vertiefungen wurde aus jeder Amplifikationskurve unter Verwendung der CFX Manager Bio-Rad-Software (Bio-Rad, Hercules, CA) erhalten. Die Ct-Werte wurden auf die endogene Kontroll-5S-rRNA normalisiert. Die Plasma-miRNA-Spiegel wurden auf miR-103a-5p normalisiert. Die relative miRNA-Expression wurde mit der 2 − ΔΔCt-Methode bestimmt [17]. Fold-Änderungen wurden auf Werte der Kontrollbedingung normalisiert.

Mausmodelle der Nierenfibrose. Die Mäuse wurden gemäß den EU-Vorschriften für alle Verfahren in der spezifischen Pathogen-freien (SPF)-Tiereinrichtung des CBMSO untergebracht. Der Umgang mit Tieren erfolgte in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren, der in der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments enthalten ist. Die Genehmigung wurde von der örtlichen Ethikkommission des Centro de Biología Molecular „Severo Ochoa“ in Madrid, der Ethikkommission des CSIC und der Regulierungseinheit für tierexperimentelle Verfahren der Comunidad de Madrid erteilt.

Einseitige Harnleiterobstruktion (UUO): Das UUO-Operationsverfahren wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [18]. Kurz gesagt, Mäuse wurden mit Isofluran betäubt (3–5 Prozent zur Einleitung und 1–3 Prozent zur Aufrechterhaltung) und in zwei experimentelle Gruppen eingeteilt: die UUO-Gruppe und die Scheinoperationsgruppe. In der UUO-Gruppe wurden die Mäuse auf der linken Seite des Abdomens rasiert, es wurde ein vertikaler Einschnitt durch die Haut mit einem Skalpell vorgenommen und die Haut zurückgezogen. Ein zweiter Schnitt wurde durch das Bauchfell gemacht, um die Niere freizulegen. Der linke Ureter wurde zweimal 15 mm unterhalb des Nierenbeckens mit chirurgischer Seide ligiert und der Ureter dann zwischen den beiden Ligaturen durchtrennt. Dann wurde die abgebundene Niere vorsichtig wieder in ihre korrekte anatomische Position gebracht und sterile Kochsalzlösung wurde hinzugefügt, um den Flüssigkeitsverlust auszugleichen. Die Einschnitte wurden vernäht und die Mäuse wurden einzeln in Käfigen gehalten. Die Scheinoperation wurde in ähnlicher Weise durchgeführt, jedoch ohne Harnleiterligatur. Buprenorphin wurde als Analgetikum verwendet. Eine erste Dosis wurde 30 min vor der Operation und dann alle 12 h für 72 h in einer Dosis von 0,05 mg/kg subkutan verabreicht. In diesem Modell werden der renale Blutfluss und die glomeruläre Filtrationsrate innerhalb von 24 h signifikant reduziert und eine interstitielle Entzündung (Spitze nach 2–3 Tagen), tubuläre Dilatation, tubuläre Atrophie und Fibrose sind nach 7 Tagen offensichtlich. Die obstruierte Niere erreicht ihre maximale Dysfunktion etwa 2 Wochen nach dem Eingriff. Mäuse wurden durch CO 2 -Überdosis getötet und Kontroll- und verstopfte Nieren- und Blutproben wurden nach Perfusion mit PBS 3, 5, 7, 10 und 15 Tage nach UUO geerntet.

Folsäure-induzierte Nephropathie (FAN): In diesem Modell wurde Nierenfibrose durch intraperitoneale (ip) Injektion mit 25 0 mg Folsäure (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) pro kg Körpergewicht gelöst in induziert 0,3 M Natriumbicarbonat (Vehikel), wie zuvor beschrieben [19]. Kontrolltiere erhielten 0,3 ml Vehikel (ip). Mäuse wurden durch CO2-Überdosis getötet und Nieren und Blutproben wurden nach Perfusion mit PBS nach 15 Tagen FA-Verabreichung geerntet.

microRNA-Profilierung. Um spezifische miRNAs zu identifizieren, die das fibrotische Ergebnis regulieren, wurde ein benutzerdefiniertes miRCURY LNA-MikroRNA-Array (Exiqon, Feedback, Dänemark) als Plattform für die MikroRNA-Profilierung ausgewählt. Diese Plattform bestand aus insgesamt 175 einzigartigen Assays, die spezifisch für Maus-miRNAs sind, die in Sanger miRBase v22.1 (http://microrn a.sanger.ac. UK) vorhanden sind. Für jede microRNA wurde der vorherrschende Strang für die Analyse ausgewählt. Die MiR-Auswahl basierte auf vorhergesagten Zielgenen, die mit Nierenfibrose, mitochondrialem Metabolismus, Redoxprozessen und zirkadianem Rhythmus zusammenhängen. Diese Analyse wurde mit den Bioinformatik-Tools für sequenzbasierte miRNA-Zielvorhersage, Microcosm [20] (www.Ebi.ac. UK/Enright-SRV/microcosm), Targetscan 4.1 [21] (www.targetscan.org /vert{ {9}}/) Pictar I [22] (www.pictar.mdc-berlin.de), miRWalk [23] (www.mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/) und miRanda [24] (www.mic rorna.org/microrna/). Nach der RNA-Extraktion aus 7-Tage-UUO-Nierenproben wurde die in 20 ng Gesamt-RNA vorhandene miRNA-Fraktion einer reversen Transkription mit dem miRCURY LNA RT Kit (Exiqon, Feedback, Dänemark) gemäß den Anweisungen des Herstellers unterzogen. Die resultierenden cDNAs wurden mit den miRCURY miRNA PCR Panels in einem Roche LightCycler 480 Real-Time PCR-System unter Verwendung des miRCURY LNA SYBR Green PCR Master Mix (Exiqon, Feedback, Dänemark) analysiert. Jede Probe wurde doppelt analysiert. Dieses Verfahren wurde in der Genomics Facility der Fundacion Parque Científico de Madrid (Madrid, Spanien) durchgeführt. Die LC480-Software wurde verwendet, um Cq-Werte (Cq) für jede miRNA zu erhalten. Der Delta-Ct (ΔCt)-Wert wurde berechnet, indem die Ct-Werte auf die endogene Haushalts-snRNAU6 normalisiert wurden. Die Wärmekarte wurde mit den als ΔCt dargestellten Echtzeit-PCR-Daten erstellt. Hierarchisches Clustering wurde gemäß ΔCt-Werten erstellt. Der Delta-Ct (ΔΔCt)-Wert wurde durch Subtrahieren des ΔCt der Referenzprobengruppe (Kontrollniere) von dem ΔCt jeder verstopften Nierenprobe berechnet. Die relative Quantifizierung (RQ) oder Faltungsänderung jeder miRNA wurde unter Verwendung der 2 – ΔΔCt-Methode erzeugt [17]. Differentiell exprimierte miRNAs wurden durch den parametrischen Limma-Test identifiziert. Um das Testen mehrerer Hypothesen zu berücksichtigen, wurden die P-Werte unter Verwendung der Benjamini-Hochberg-False-Discovery-Rate (FDR)-Korrektur angepasst (adj.) [25]. Die Ergebnisse wurden in einem Vulkanplot graphisch dargestellt.

miRNA-Analyse im Blutplasma von CKD-Patienten. Die Konzentrationen ausgewählter miRNAs wurden in Plasmaproben von einer Kohorte von 1 00 CKD-Patienten analysiert, die unten detailliert beschrieben wird. Peripheres venöses Blut wurde in EDTA-sprühbeschichteten Vacutainern (BD, Franklin Lakes, NJ) gesammelt. Zur Plasmagewinnung wurde Blut 20 min bei 400 g zentrifugiert, der Überstand in ein neues Röhrchen überführt und 20 min bei 800 g zentrifugiert. Plasma wurde gesammelt und in Aliquots bei – 80 °C eingefroren gelagert. Plasma-miRNA wurde mit dem miRCURYTM RNA Isolation Kit – Biofluids und UniSp2 Spike-in RNA (Exiqon, Vedbaeck, Dänemark) aus Blut extrahiert. Analysen der miR-150-Spiegel in diesen Proben wurden wie im Abschnitt Quantifizierung des miRNA-Expressionsverfahrens beschrieben durchgeführt. Messungen der Sauerstoffverbrauchsrate. Die mit Fettsäureoxidation assoziierte Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) (verbunden mit oxidativer Phosphorylierung) und die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) (verbunden mit Laktatproduktion und Glykolyse) wurden mit dem Seahorse Bioscience Metabolic Analyzer gemäß den Anweisungen des Herstellers untersucht [26]. HKC-8-Zellen wurden in eine p60-Platte ausgesät und eine MikroRNA-Transfektion wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Wenn sie 48 Stunden später eine Konfluenz von 70 Prozent erreichten, wurden HKC-8-Zellen mit 10 ng/ml TGF{{ behandelt 18}} für 48 Stunden. Dann wurden Zellen mit 2 × 10 4 Zellen pro Vertiefung in einer Seahorse Bioscience XFe24-Zellkulturmikroplatte (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA) ausgesät. Nach der Zellanhaftung wurde das Wachstumsmedium durch ein substratbegrenztes Medium, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 0,5 mM Glucose und 1 mM Glutamat, ersetzt. Eine Stunde vor der Testmessung wurden die Zellen mit Krebs-Henseleit-Puffer (KHB)-Testmedium, ergänzt mit 0,2 Prozent Carnitin, bei 37 °C ohne CO2 inkubiert. 15 Minuten vor dem Assay wurde der CPT1-Inhibitor Etomoxir (Eto) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 400 μM in die entsprechenden Vertiefungen gegeben, und die Zellen wurden bei 37 °C ohne CO2 inkubiert. Schließlich wurde unmittelbar vor dem Assay BSA oder 200 &mgr;M Palmitat-BSA FAO-Substrat (Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA) hinzugefügt. Sofort wurde der XF Cell Mito Stress Test in einem Seahorse XFe24 Energieanalysator durchgeführt, indem nacheinander mehrere Modulatoren der mitochondrialen Funktion hinzugefügt wurden. Zuerst wurde der ATP-Synthase-Inhibitor Oligomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 &mgr;M) nach der Basalmessung verwendet. Dies verringert den Elektronenfluss durch das ETC, was zu einer Verringerung der mitochondrialen Atmung führt. Als nächstes wurde das Entkopplungsmittel Cyanid 4-(Trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP) (SigmaAldrich, St. Louis, MO) (3 μM), das den Protonengradienten kollabiert und das mitochondriale Membranpotential stört, hinzugefügt. Als Ergebnis ist der Elektronenfluss durch den ETC ungehindert und der Sauerstoffverbrauch durch den Komplex IV erreicht sein Maximum. Die dritte und letzte Injektion ist eine Mischung der Komplex-III- und -I-Inhibitoren Antimycin/Rotenon (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM). Diese Kombination schaltet die mitochondriale Atmung aus und ermöglicht die Berechnung der nicht-mitochondrialen Atmung, die von Prozessen außerhalb der Mitochondrien angetrieben wird. Substrate/Inhibitoren wurden in demselben Medium hergestellt, in dem das Experiment durchgeführt wurde, und wurden zu den angegebenen Zeiten automatisch aus den Reagenzienöffnungen injiziert. Die Messungen wurden für 3- min-Zeiträume (über einen Gesamtzeitraum von 2 h) registriert und die Werte wurden für den Gesamtproteingehalt normalisiert. Das Protein wurde mit 0,1 %iger NP-40-PBS-Lösung aus den Vertiefungen extrahiert und mit einem BCA-Proteinassay (Thermo Scientific, Rockford, IL) quantifiziert. Für jede Versuchsgruppe wurden vier Vertiefungen verwendet. Der Seahorse XFp Cell Mito Stress Test wurde verwendet, um die Schlüsselparameter der mitochondrialen Funktion zu bestimmen: basale mitochondriale Atmung, ATP-gekoppelte Atmung, Protonenleck (nicht -- ATP-gekoppelter Sauerstoffverbrauch), maximale Atmung, nicht-mitochondriale Atmung , und Atemkapazität reservieren, wie zuvor beschrieben [27].

Luciferase-Assay. Zur Charakterisierung der miRNA-150- und miRNA-495-Kandidatenbindungsstellen in der humanen CPT1A 3'-UTR wurde ein Luciferase-Reporter-Assay, der die CPT1A 3'-UTR enthält (SwitchGear Genomics, Carlsbad, CA, Product ID S814347) verwendet wurde. Ortsgerichtete Mutationen in den Seed-Regionen der vorhergesagten miR-150- und miR-495-Stellen innerhalb der 3′-UTRs wurden unter Verwendung des Kits für gerichtete Mutagenese von Multisite-QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA) entsprechend erzeugt nach Herstellerprotokoll. The primer sequences used were for miR-495 PM1 (FW:GCATCATCCAAGCAGGGTAAACTTTTGTTCTAGAAAAA- GAAAAATGTGTTATTCATTGGTGTCCC, RV: GGGACACCAACTTGAA- TAACACATTTTTCTTTTTCTAGAA- CAAAAGTTTACCCTGCTTGGATGATGC) and PM3 (FW: TGTCTTAACGCAGCCATGGTTTGAATCTA- GAATCTTGGGCTGACCGGTGC, RV: GCACCGGTCAGCCCAAGATTCTA- GATTCAAACCATGGCTGCGTTAAGACA) and for miR{{24} } PM2 (FW: CTCATGCCGTGTAATCCCAGCACTTCTAGAGGCCAAGGCGGGCGG, RV: CCGCCCCGCCTTGGCCTCTAGAAGTGCTGGGATTACACGCATGAG), Alle Konstrukte wurden vor der Verwendung sequenziert, um ihre richtige Struktur zu bestätigen. HKC-8-Zellen wurden in Ap24-Well-Platten ausgesät und transient mit 200 ng pLightSwitch_CPT1A_3'-UTR (intakte oder mutierte Konstruktionen) und 4 transfiziert ng pGL3--Promotor (eine Glühwürmchen-Luciferase unter der Kontrolle des SV40-Promotors) (Promega Corporation, Madison, WI, USA) Reporterplasmide und 40 nM von entweder mirVana™ miRNA-Mimetikum von miR-150, miR -495 oder mirVana™ miRNA-Mimik-Negativkontrolle (Ambion Company, USA) unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), als sie wie oben beschrieben eine Konfluenz von 70 % erreichten. Für jede Versuchsgruppe wurden vier Vertiefungen verwendet. Luciferase-Assays wurden 24 h später unter Verwendung des Dual-Luciferase-Reportersystems (Promega, Madison, WI) durchgeführt. Die Vanille- und Glühwürmchen-Luciferase-Signale wurden unter Verwendung eines Glomax-Multidetektionssystems (Promega Corporation, Madison, WI, USA) nachgewiesen. Die Aktivität der Renilla-Luciferase wurde durch die Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität normalisiert.

Mitochondriales Membranpotential (MMP). Änderungen in MMP wurden als Unterschiede in der Fluoreszenz von Tetramethylrhodaminmethylester (TMRM) bestimmt (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Es reichert sich in negativ geladenen polarisierten Mitochondrien an und fluoresziert orange. Wenn das mitochondriale Membranpotential in apoptotischen oder metabolisch gestressten Zellen zusammenbricht, wird das TMRM-Reagenz im gesamten Zellcytosol verteilt und die Fluoreszenzniveaus fallen dramatisch ab. HKC-8-Zellen wurden kultiviert und transfiziert, wie in den Abschnitten Zellkultur und Transfektionsverfahren beschrieben. Als nächstes wurde das Wachstumsmedium durch Phenolrot-freie Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) mit 10 mM Hepes ersetzt. Behandlungen mit Oligomycin (5 μM) und FCCP (4 μM) für 5 min wurden als positive und negative Kontrollbedingungen verwendet. Als nächstes wurden die Zellen mit 250 nM TMRM für 30 min bei 37 °C gefärbt. Die Zellen wurden mit Trypsin geerntet, zentrifugiert (3000 rpm, 5 min) und das Pellet wurde in 200 μl HBSS mit 1 Prozent resuspendiert Rinderserumalbumin (BSA) und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Die Fluoreszenzintensität wurde durch Durchflusszytometrie unter Verwendung einer Emissionswellenlänge von 570 nm für TMRM (FL2) [28] in einem BD FacsCantoTM II-System (BD Bioscience, San Jos, CA) gemessen und mit der FlowJo 10.2-Software (FlowJo, LLC, Ashland , ODER). Für jede experimentelle Bedingung wurden mindestens 20.000 Singuletts dreifach analysiert.

Mitochondriale Superoxid-Radikalanionenproduktion. Die Bewertung der Produktion von Superoxid-Radikalanionen wurde unter Verwendung von Mito-SOX™ Red mitochondrialer Superoxid-Radikalanion-Indikator (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), einem hochselektiven fluorogenen Farbstoff für mitochondriale Superoxid-Radikalanionen in lebenden Zellen, gemäß Herstellerangaben durchgeführt Anweisungen. HKC-8-Zellen wurden kultiviert und transfiziert, wie in den Abschnitten Zellkultur und Transfektionsverfahren beschrieben. Als nächstes wurde das Wachstumsmedium durch Phenolrot-freie Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) mit 10 mM Hepes ersetzt. Die Behandlung mit Antimycin A (150 μM) und Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazon (CCCP) (50 μM) für 5 min wurde als positive und negative Kontrollbedingungen verwendet. Als nächstes wurden die Zellen mit 5 μM MitoSOX™ Red für 30 min bei 37 ◦ C gefärbt. Die Zellen wurden wie im Abschnitt zum Mitochondrienmembranpotential beschrieben geerntet. Die Fluoreszenzintensität wurde durch Durchflusszytometrie unter Verwendung einer Emissionswellenlänge von 580 nm für MitoSOX™ Red (FL2) in einem BD FacsCanto™ II-System (BD Bioscience, San Jos, CA) gemessen und mit der FlowJo 10.2-Software (FlowJo, LLC, Ashland, ODER). Für jede experimentelle Bedingung wurden mindestens 20 000 Singuletts dreifach analysiert.

Mitochondriale Kennzeichnung. Die Bewertung des Mitochondriengehalts wurde unter Verwendung von MitoTracker™ green FM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) durchgeführt, das gemäß den Anweisungen des Herstellers passiv durch die Plasmamembran diffundiert und sich unabhängig vom mitochondrialen Membranpotential in aktiven Mitochondrien ansammelt. HKC-8-Zellen wurden kultiviert und transfiziert, wie in den Abschnitten Zellkultur und Transfektionsverfahren beschrieben. Als nächstes wurde das Wachstumsmedium durch Phenolrot-freie Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) mit 10 mM Hepes ersetzt. Die Zellen wurden mit 150 nM mit MitoTracker™ green FM für 30 min bei 37 ◦ C gefärbt. Für die durchflusszytometrische Analyse wurden die Zellen wie im Abschnitt mitochondriales Membranpotential beschrieben geerntet. Die Fluoreszenzintensität wurde unter Verwendung einer Emissionswellenlänge von 516 nm mit MitoTracker™ green FM (FL1) in einem BD FacsCanto™ II-System (BD Bioscience, San Jos, CA) gemessen und mit der Software FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC , Ashland, ODER). Für jede experimentelle Bedingung wurden mindestens 20 000 Singuletts dreifach analysiert. Für die Fluoreszenzbildgebung wurden die Kerne auch mit DAPI (Sigma, St. Louis, MO) für 5 min bei RT gefärbt. Lebende Zellen wurden mit einem konfokalen Zeiss LSM 710-Umkehrmikroskop mit Zellbeobachtung, einem 63X/1,2-Wasser-C-Apochromat-Corr-UV-VIS-IR-M27-Objektiv sichtbar gemacht und mit der Zeiss Zen2010B sp1-Software (Zeiss, Oberkochen, Deutschland) analysiert. .

Mitochondriale Kopienzahlbestimmung. Genomische DNA wurde aus HKC-8-Zellen unter Verwendung des DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die Mitochondrienhäufigkeit wurde mit dem Human Mitochondrial DNA Copy Number Assay Kit (Detroit R&D, Detroit, MI) bestimmt. Die relative mtDNA-Kopienzahl wurde als Verhältnis von mtDNA zu Kern-DNA dargestellt.

Humane CKD-Patientenproben. Eine Kohorte von 100 CKD-Patienten (Stadium 3–4) aus dem Hospital Principe de Asturias wurde für die Analyse der miRNA-Plasmaspiegel ausgewählt. Sie umfasste zwei verschiedene Untergruppen, die nach der Entwicklung ihrer Nierenfunktion basierend auf dem GFR-MDRD-Indikator [29] über einen Zeitraum von 24 Monaten klassifiziert wurden: 50 Patienten wiesen weniger als 10 Prozent aufNiereFunktionsverschlechterung, während der Rest von ihnen eine mindestens 40-prozentige Verringerung der Nierenfunktion erfahren oder begonnen hatteNieren-Ersatztherapie (Dialyse). Wir quantifizierten auch den Grad der Fibrose inNiereBiopsien aus einer anderen Kohorte von 26 Patienten mit nachfolgender TransplantatdysfunktionNiereTransplantation aus dem Krankenhaus Ramn y Cajal. Alle Biopsien wurden nach den Kriterien von Banff 2007 [30] ausgewertet.

Statistische Analyse. Die Daten wurden mit nichtparametrischen Tests analysiert, sofern nicht anders angegeben. Der Unterschied zwischen den beiden unabhängigen Gruppen wurde mit dem Mann-Whitney-Test untersucht, während mehr als zwei Gruppen mit dem Kruskall-Wallis-Test verglichen wurden. Ein P-Wert von 0.05 oder weniger wurde als statistisch signifikant angesehen (*/#: P < 0.05,="" **/##:="" p="">< 0.01,="" ***/###:="" p="">< 0,001).="" die="" daten="" wurden="" unter="" verwendung="" von="" graphpad="" prism="" 6.0="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca)="" analysiert.="" die="" daten="" werden="" als="" mittelwert="" ±="" standardfehler="" des="" mittelwerts="" (sem)="">

3. Ergebnisse

miRNA-Expressionsdaten bei UUO-induzierter FibroseNieren. Den Beitrag von miRNAs zur Stoffwechselregulation von zu entschlüsselnNieren-Fibrogenese wurde das 7-Tage-UUO-Modell in WT-Mäusen durchgeführt. RNA wurde aus der Kontrolle und fibrotischen isoliertNiereProben und das miRNA-Expressionsprofil wurde in einem maßgeschneiderten microRNA-Array analysiert. Die Auswahl der miRNAs basierte auf ihrem potenziellen Targeting von Schlüsselenzymen, die am mitochondrialen Metabolismus, an Redoxprozessen und am zirkadianen Rhythmus beteiligt sind, nach einer „in silico“-Analyse (weitere Einzelheiten im Abschnitt „Methoden“). Die Heatmap zeigte deutlich unterschiedliche Expressionsmuster in einigen miRNAs beim Vergleich von Fibrose und KontrolleNiereProben (Abb. 1A). Die Volcano-Plot-Analyse zeigte, dass 73 von 175 miRNAs in den fibrotischen Nierenproben im Vergleich zu den Kontrollproben unterschiedlich exprimiert wurden, 17 hoch- und 56 herunterreguliert (Abb. 1B, Ergänzungstabelle 1). Darunter wurden spezifische miRNAs ausgewählt, die das fibrotische Ergebnis in der Niere über Stoffwechselwege regulieren könnten. Zu diesem Zweck wurde mit drei unabhängigen Vorhersagewerkzeugen (Targetscan, miRWalk und miRanda) eine In-Silico-Analyse der 3'UTR (untranslated region) spezifischer Gene durchgeführt, die an metabolischen und mitochondrialen Funktionen beteiligt sind, CPT1A, TFAM, PGC1A. Zu den Auswahlkriterien gehörten auch das Niveau der renalen Expression, die Neuheit der Ziele, der Kenntnisstand über den Stoffwechselweg und die biologische Bedeutung. Die Verbindung zur menschlichen Pathologie, dem Expressionsniveau des Nierengewebes, ihrer Rolle im mitochondrialen Metabolismus und ihrem potenziellen Targeting des Fettsäure-Shuttle-Enzyms CPT1A ermutigte uns, uns auf drei miRNAs zu konzentrieren, miR-150-5p, miR-495-3p und miR-33-5p, als Kandidaten, die metabolische Veränderungen im Zusammenhang mit renaler Fibrogenese regulieren können (Abb. 1C). Zu beachten ist, dass CPT1A 3'-UTR eine Seed-Site für miR-150 und zwei Seed-Sites für miR-495 enthält. Wir beobachteten, dass miR-150 und miR-495 die Aktivität eines Luciferase-Reporter-Assays, der die CPT1A 3′-UTR enthielt, um ~15 Prozent bzw. 25 Prozent verringerten. Diese Herunterregulierung war im Fall von Punktmutationen (PMs) in der 3′-UTR von CPT1A für die miR-150-Bindungsstelle (PM2) vollständig aufgehoben und fehlte teilweise in beiden miR-495-Bindungsstellen (PM1 und PM3) (ergänzende Abb. 1A und B). Diese Daten weisen auf eine direkte Wechselwirkung von CPT1A mit miR-150 und miR-495 hin. MiR-33-5p war Gegenstand einer separaten Studie [15]. MiR-150-5p und miR-495-3p waren in fibrotischen Nierenproben im Vergleich zu den Kontrollproben hochreguliert, mit einer 3,69-fachen Änderung (P-Wert: 0.012 ) bzw. 1,95 (p-Wert: 0,012).

MiR-150 und miR-495 verstärken die TGF-profibrotische Reaktion beim MenschenNieren-tubuläre Epithelzellen. Quantitative Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) wurde durchgeführt, um die Änderung der miR-150-5p- und miR-495-3p-Expression zu bestätigen, die durch miRNA-Expressionsprofilierung im UUO identifiziert worden warNiereProben (Abb. 2A und B). Darüber hinaus wurde die Kinetik der miR-150-5p- und miR- 495-3p-Expression in den Nieren 3, 5, 7, 10 und 15 Tage nach dem UUO-Verfahren durch qRT-PCR analysiert. Die Expression dieser miRNAs war 5 Tage nach UUO um das 2--Fache signifikant verstärkt und blieb 15 Tage nach UUO erhöht (Fig. 2C und D). Das Expressionsniveau dieser miRNAs wurde auch im Folsäure-Nephropathie (FAN)-Modell bewertet. Wir fanden eine 4-- und 2--fache Hochregulierung von miR-495-3p bzw. miR-150-5p bei FibroseNiereProben aus dem FAN-Modell (Abb. 2E). TGF- 1, einer der Hauptregulatoren der Fibrogenese, induzierte auch die miR-150- und miR-495-Expression in HKC-8-Zellen mehr als 2--fach und {{ 6}}-fach nach 48 h, was eine potenzielle Rolle dieser miRNAs bei mit der TGF-Signalübertragung zusammenhängenden Ereignissen unterstützt (Abb. 3A und B). Um festzustellen, ob miR-150 und miR-495 an der pro-fibrotischen Transformation von tubulären Epithelzellen durch TGF- 1 beteiligt waren, wurde die menschliche Zelllinie HKC-8 mit miR transfiziert -150-5p oder miR-495-3p und unterschiedlich lange mit TGF- 1 behandelt. Steigende miR-150-5p- und miR-495-3p-Spiegel verstärkten signifikant die TGF- 1--induzierte mRNA-Spiegel-Expression der Fibrose-assoziierten Marker Acta2, Col{1 1 und Fn1 ( Abb. 3C und D). In ähnlicher Weise reduzierte die Überexpression von miR-150-5p oder miR-495-3p CPT1A stark und erhöhte die -SMA-Proteinhäufigkeit (Fig. 3E und F). Diese Daten legen nahe, dass diese miRNAs möglicherweise an der Pathogenese von beteiligt sindNieren-Fibrose durch Förderung der TGF- 1--abhängigen epithelialen Dedifferenzierung von tubulären Zellen sowie durch Beeinträchtigung der Expression eines kritischen Enzyms, das an FAO beteiligt ist.

MiR-150 und miR-495 induzieren bioenergetische Veränderungen der Mitochondrien und reduzieren die Expression von Genen, die an der entscheidenden Mitochondrienfunktion beteiligt sind. Um einen Einblick in die metabolischen Folgen zu erhalten, die durch die Verabreichung von miR-150-5p oder miR-495-3p induziert werden, haben wir das bioenergetische Profil des Menschen untersuchtNieren-tubuläre Epithelzellen.

Abb. 1. miRNA-Expressionsdaten bei UUO-induzierter Fibrose. (A) Wärmekarte, die die relative miRNA-Expression von kontralateral und obstruiert zeigtNierenvon C57/BL6-J-Mäusen, die 7 Tage lang dem UUO-Verfahren unterzogen wurden (n=6). Der Maßstabsbalken reicht von grün bis rot (hoher bis niedriger Ausdruck) und Zahlen repräsentieren ΔCt-Werte. Auf der linken Seite sind die für die Untersuchung ausgewählten miRNAs angegeben. (B) Volcano-Plot-Analyse von UUO-modulierten miRNAs. Log10 relative Quantifizierung (RQ) und negative ( − ) log10 adjustierte (adj.) P-Werte werden auf der x- bzw. y-Achse aufgetragen. Jede miRNA wird durch einen Punkt dargestellt. 73 von 175 miRNAs zeigten eine veränderte Expression in den fibrotischen Proben (adj. P-Wert größer oder gleich 0,05). Ausgewählte miRNAs zur weiteren Analyse sind hervorgehoben. (C) miR-150-5p und miR-495-3p wurden aufgrund ihrer Leistungsfähigkeit für das In-silico-Targeting der Gene CPT1A, TFAM und PGC1A ausgewählt. Für jede ausgewählte microRNA sind konservierte Seed-Targetstellen in der 3'-UTR dieser Gene, ihre Faltungsänderung und Signifikanz (adj. P-Wert) angegeben.

Abb. 2. Expressionsniveaus von miR-150-5p und miR-495-5p inNierenvon den Modellen UUO und FAN. (A, B) qRT-PCR-Analyse der Expression von miR-150-5p (A) und miR-495- 3p (B) inNierenvon Mäusen 7 Tage nach UUO in Proben, die zuvor mit dem microRNA-Array analysiert wurden. (C–E) qRT-PCR-Analyse der miR-150-5p- und miR-495-3p-Expression nach dem FAN-Modell (C) und 3, 5, 7, 10 und 15 Tage danach UUO für miR-150-5p (D) und miR{{10}}p (E). Balkendiagramme stellen den Mittelwert der Expressionsniveaus der fachen Änderung ± Standardabweichung von 6 (A, B, E) und 3 (C und D) Mäusen pro Gruppe dar. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001="" im="" vergleich="" zu="" ihren="" entsprechenden="" kontrollbedingungen;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" im="" vergleich="" zur="">Nierenvon Mäusen mit der gleichen experimentellen Behandlung.

TGF- 1 wurde als Modellzytokin verwendet, das an pro-fibrotischen Veränderungen beteiligt ist. Um den bioenergetischen Status dieser Zellen zu bestimmen, wurden die FAO-assoziierte Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) von HKC-8-Zellen während der sequentiellen Behandlung mit Verbindungen gemessen, die die mitochondriale Aktivität in Gegenwart von Palmitat modulieren B. unter Verwendung eines Seahorse XF24 Extrazellulärfluss-Analysators (weitere Einzelheiten im Abschnitt Methoden). Nach 48 Stunden mit TGF- 1 zeigten HKC-8-Zellen in Gegenwart von miR-150-5p eine konsistente Abnahme der basalen, an die ATP-Erzeugung gekoppelten OCR, ATP-gekoppelten Atmung und maximalen Atmung, was bezieht sich auf FCCP-sensitive OCR (Fig. 4A). Die Beeinträchtigung des OXPHOS spiegelte sich in einer Abnahme des ATP-Gehalts in HKC-8-Zellen wider, die miR-150-5p überexprimierten (Fig. 4C). Wir haben nicht beobachtet, dass diese miRNAs Variationen in ECAR induzierten (Daten nicht gezeigt). In Übereinstimmung damit sind die mRNA-Expressionsniveaus ihrer mitochondrialen

verwandte Zielgene CPT1A, PGC1 und der mitochondriale Transkriptionsfaktor A (TFAM), waren in mit miR-150-Mimetikum behandelten Zellen im Vergleich zu mit miRNA-Mimetikum NC behandelten Zellen um die Hälfte reduziert (Abb. 4E). Studien mit demselben experimentellen Ansatz mit miR-495-3p ergaben ähnliche Ergebnisse (Abb. 4B, D, F). Die mitochondriale Masse, bestimmt anhand der mtDNA-Kopienzahl und der mitochondrialen Färbung mit MitoTrackerTM green FM, wurde jedoch nicht signifikant durch miRNA-150 und miRNA- 495 moduliert, sowohl unter basalen Bedingungen als auch unter TGF-Behandlung. Ein abnehmender Trend bei diesem Parameter wurde basal beobachtet (ergänzende Abb. 2A, B, C). Insgesamt unterstützen diese Daten, dass miR-150 und miR-495 a fördern

profibrotische Wirkung in tubulären Epithelzellen durch die Beeinträchtigung der Mitochondrienfunktion.

MiR-150 und miR-495 verändern das mitochondriale Transmembranpotential (ΔѰm) und das mitochondriale Superoxidradikal nicht

Abb. 3. MiR-150 und miR-495 verstärken die TGF- 1--abhängige profibrotische Reaktion beim MenschenNieren-tubuläre Epithelzellen. (A, B) RT-PCR-Analyse der Expression von miR{{0}}p (A) und miR-495-3p (B) in HKC-8-Zellen, die mit 1{{24 }} ng/ml TGF- 1 für die angegebenen Zeiten. (C, D) mRNA-Spiegel von Alpha-Glattmuskel-Aktin ( -SMA), Alpha-1-Typ--1-Kollagen (Col1 1), Fibronektin (FN) aus Zellen, die mit miR-NC transfiziert wurden und mimisch miR -150-5p (C) oder miR-495-3p (D) wurden durch qRT-PCR mit Sybr Green bestimmt. Die Zellen wurden mit TGF- 1 (10 ng/ml) nach MiRNA-Überexpression behandelt, wo angegeben (siehe auch Methodenabschnitt). (E, F) Immunoblots, die CPT1A- und -SMA-Spiegel zeigen, Proteinspiegel in Zellen, die mit miR-NC transfiziert sind und miR-150-5p (E) oder miR{{20}}p (F) nachahmen die angegebenen Zeitpunkte. GAPDH wurde zu Normalisierungszwecken verwendet. Balkendiagramme (rechte Tafeln) stellen den Mittelwert des Faltungsänderungsausdrucks ± Sem aus 3 unabhängigen Experimenten dar. *P < {{30}},05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" im="" vergleich="" zu="" ihren="" entsprechenden="" kontrollbedingungen;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" im="" vergleich="" zu="" zellen,="" die="" mit="" mir-nc="" unter="" denselben="" experimentellen="" bedingungen="" behandelt="">

Abb. 4. MiR-150 und miR-495 verstärken die TGF 1--induzierte FAO-Repression in HKC-8-Zellen. (A, B) Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von transfizierten HKC-8-Zellen

40 nM miR-NC und imitieren miR-150-5p (A) oder miR-495-3p (B) und ausgesetzt 10 ng/ml TGF{{5} } nach miRNA-Überexpression (siehe auch Abschnitt Methoden). Balkendiagramme (rechte Felder) zeigen die OCR-Raten in Verbindung mit basalen, Protonenlecks, ATP-gebundenen, maximalen und Reservekapazitäten und nicht-mitochondrialen Atemzuständen. Die Daten werden nach Normalisierung nach Proteinmenge dargestellt. (C, E) ATP-Spiegel in HKC-8-Zellen, die mit miR-NC transfiziert sind und miR-150-5p (C) oder miR-495-3p (E) nachahmen. (D, F) mRNA-Spiegel von CPT1A, PGC1A und TFAM in HKC-8-Zellen, die mit miR-NC transfiziert wurden und mimischen miR-150-5p (D) oder miR-495-3p (F) waren bestimmt durch qRT-PCR unter Verwendung von Sybr Green. Balkendiagramme zeigen den Mittelwert ± SEM von 4 unabhängigen Experimenten. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001="" im="" vergleich="" zu="" ihren="" entsprechenden="" kontrollbedingungen;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" im="" vergleich="" zu="" zellen,="" die="" mit="" mir-nc="" unter="" denselben="" experimentellen="" bedingungen="" behandelt="">

Anionenproduktion. Das von Protonenpumpen (Komplexe I, III und IV) erzeugte mitochondriale Membranpotential (ΔΨm) ist eine wesentliche Komponente im Prozess der Energiespeicherung während der oxidativen Phosphorylierung. Ein erhöhtes ΔѰm kann zu einer mitochondrialen Redoxstörung führen, während seine Abnahme eine Verringerung der ATP-Produktion verursacht und die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt [254]. Das Superoxid-Radikalanion (O2•−) ist ein freies Radikal, das in den Mitochondrien als Folge des Elektronenverlusts erzeugt werden kann, der innerhalb mehrerer Schritte des ETC auftreten kann. Die Bildung von O2•− innerhalb der mitochondrialen Matrix hängt auch entscheidend von den NADH/NAD plus- und CoQH2/CoQ-Verhältnissen und der lokalen O2-Konzentration ab [255]. Seine Überproduktion kann durch verschiedene Mechanismen zum Verlust der mitochondrialen Redox-Homöostase führen, ein Zustand, der mit vielen pathologischen Zuständen, einschließlich AKI und CKD, in Verbindung gebracht wurde [201]. ΔѰm wurde mit dem TMRM-Farbstoff und die Superoxidradikalanionenproduktion mit dem MitoSOX-Farbstoff untersucht. Zuerst validierten wir diese Assays durch die Behandlung von Zellen mit FCCP und CCCP als Negativkontrollen für TMRM bzw. MitoSOX und Oligomycin und Antimycin A als Positivkontrollen für TMRM bzw. MitoSOX in der menschlichen Zelllinie HKC{{7} }. Im Fall des TMRM-Assays induzierte die Oligomycinbehandlung einen 3--fachen Anstieg des Fluoreszenzmittelwerts des TMRM im Vergleich zum Kontrollfarbstoff, während die FCCP-Behandlung zu einer 9--fachen Abnahme führte. Antimycin A und CCCP erzeugten im MitoSOX-Assay eine 35--fache Zunahme bzw. eine 2--fache Abnahme (Ergänzende Abb. 3A und B). Um zu bestimmen, ob miR-150- und miR-495-Effekte auf den mitochondrialen Metabolismus Veränderungen dieser Parameter auslösten, wurden HKC-8-Zellen mit einem miR-150-5p oder miR{{17} transfiziert. }p mimic oder das entsprechende miR-NC. Zwischen den Behandlungsbedingungen mit den ausgewählten miRs und miR-NC wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Fluoreszenzquantifizierung der TMRM- oder MitoSOX-Sonden gefunden (ergänzende Abb. 3C).

Die MiR-150- und miR-495-Spiegel sind in Plasma- und Nierenproben von CNE-Patienten nicht betroffen. Wir untersuchten die Expression der ausgewählten miRNAs in Plasma- und Nierenbiopsien von Patienten mit CKD. Die Analyse von Nierenbiopsien von 26 Patienten (Krankenhaus Ramn y Cajal) zeigte keine Korrelation zwischen dem Grad der Fibrose und den miR-150-5p- bzw. miR-495-3p-Werten (ergänzende Abb. 4A und B). . Zirkulierende Plasmaspiegel von miR-150-5p, der miRNA mit der höchsten Nierenexpression der beiden, wurden auch in einer Kohorte von 100 CKD-Patienten (Hospital Príncipe de Asturias) bestimmt. Aufgrund der begrenzten Probenverfügbarkeit konnten wir in dieser Kohorte keine Serumwerte von miR- 495-3p bestimmen. Diese Patienten wurden zuvor basierend auf der Entwicklung ihrer Nierenfunktion über einen Zeitraum von 24 Monaten in zwei Untergruppen eingeteilt, so dass 50 Patienten eine Verschlechterung der Nierenfunktion von weniger als 10 Prozent aufwiesen, während der Rest eine Verringerung der Nierenfunktion von mindestens 40 Prozent aufwies Funktion. Die qRT-PCR-Quantifizierung der Plasmaspiegel von miR-150-5p zeigte keinen klaren Trend zu einer unterschiedlichen Expression in den beiden Untergruppen von Patienten (ergänzende Abb. 4C).

4. Diskussion

Die Entdeckung von miRNAs als Schlüsselregulatoren pathophysiologischer Prozesse hat die Erforschung ihrer Verwendung als Therapeutika in fast allen klinischen Umgebungen, einschließlich Nierenerkrankungen, vorangetrieben [31]. Nierenfibrose ist ein weit verbreitetes Ergebnis einer chronischen Nierenerkrankung (CKD) mit unabhängiger Ätiologie, und ihr Vorhandensein ist ein klarer Prädiktor für die Evolution. Daher wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um miRNAs zu identifizieren, die mit Nierenfibrose in Verbindung stehen [32,33]. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die zunehmend wichtige Rolle der Stoffwechselstörung beiNieren-Schadenund wir identifizierten zwei miRNAs, miR-150 und miR-495, die zuvor unbekannte Akteure in der Szene waren. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass sie eine tiefgreifende Wirkung auf die zelluläre Bioenergetik ausüben, indem sie mit TGF synergisieren und wichtige Stoffwechselwege im Zusammenhang mit Fett modifizierenSäure Oxidation.

Eine Epithelverletzung besteht gleichzeitig mit einem FettdefektSäureOxidation, die Hauptenergiequelle für tubuläre Epithelzellen [5]. Es führt zu ihrer Dedifferenzierung, die eine Beeinträchtigung der tubulären Funktion induziert, einen Zellzyklusarrest auslöst und die Freisetzung kritischer pro-fibrotischer Zytokine fördert, die zur Aktivierung interstitieller Myofibroblasten beitragen können [5,34]. MiR-150- und miR-495-Expression waren bei der Maus erhöhtfibrotischNierenund inMensch NiereEpithelzellen (HKC-8) nach Behandlung mit TGF- , was auf ihre Beteiligung an der pro-fibrotischen Reaktion hindeutet. Interessanterweise erlaubt die in silico-Analyse der genomischen Regionen, die für miR-150 und miR-495 kodieren, die Identifizierung von Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, die mit der TGF-Signalübertragung und anderen Signalwegen in Verbindung stehen, die an UUO-Schäden beteiligt sind (Suche in genecards.org für miR-150 und miR-495). Sowohl miR-150 als auch miR-495 verringerten das Expressionsniveau ihrer Zielgene CPT1A, PGC1 und TFAM, was sich in einem verringerten basalen, ATP-gebundenen und maximalen OCR- und ATP-Gehalt nach der Behandlung mit widerspiegelte miR-150 und miR-495. Dieser Effekt wurde von einer verstärkten TGF-pro-fibrotischen Reaktion in HKC-8-Zellen begleitet. Wir fanden heraus, dass TGF die mitochondriale Masse und die mitochondriale DNA verringerte. Nach der Behandlung mit miRNA-150 und miRNA-495 wurde ein abnehmender Trend beim Mitochondriengehalt unter basalen Bedingungen beobachtet, obwohl keine Signifikanz erreicht wurde. Dies weist auf einen Mechanismus hin, der von der Rolle von PGC1 oder TFAM unabhängig ist und höchstwahrscheinlich mit einem metabolischen Effekt zusammenhängt, der mit der Herunterregulierung von CPT1A als Hauptvariable verbunden ist, die durch das Vorhandensein der miRNAs beeinflusst wird. Veränderungen in der mitochondrialen Bioenergetik sind entscheidend bei Nierenerkrankungen [35]. Wir haben kürzlich gezeigt, dass CPT1A ein entscheidendes Enzym für die Erhaltung eines gesunden tubulären Kompartiments ist, da seine Überexpression vor Nierenfibrose schützt [6]. Allerdings PGC1

und TFAM-Gene sind auch eng mit der mitochondrialen Funktion und Biogenese verbunden [36]. Die beeinträchtigte Expression dieser Gene ist mit CKD verbunden, während ihre Erhaltung zur Nierenintegrität beiträgt, wie in mehreren Schädigungsmodellen gezeigt wurde. Daher haben Han et al. fanden heraus, dass der tubuläre Funktionsgewinn von PGC1 Mäuse vor Notch-induzierter Nierenfibrose schützte und die mit diesem Modell verbundene mitochondriale Dysfunktion umkehrte [37]. In ähnlicher Weise verhinderte die Reexpression von Tfam in Tubuluszellen eine Notch-induzierte metabolische und profibrotische Reprogrammierung [38]. Daher ist es denkbar, dass die durch miR-150 und miR-495 induzierte verminderte mRNA-Expression dieser mitochondrialen Gene ebenfalls zu einem geschädigten epithelialen Phänotyp beiträgt.

Der von uns beobachtete Rückgang der OCR im Zusammenhang mit Epithelzellschäden steht im Einklang mit früheren Berichten, einschließlich unserer Studien mit miR-33 und miR-9 [15,16]. Während Kang et al. berichteten auch, dass die Glukoseoxidation in Menschen- und Mausmodellen der Nierenfibrose geringer war [5], unsere Daten zeigen, dass die mikroRNA-vermittelte Abnahme der OCR per se keine Variationen der ECAR induziert, was darauf hindeutet, dass die glykolytische Abschaltung bei fibrotischen Zuständen höchstwahrscheinlich davon abhängt eher auf fibrotische Stimuli als auf eine gestörte oxidative Phosphorylierung. Mehrere miRNAs wurden als Hauptmodifikatoren der mitochondrialen Funktion identifiziert, einschließlich der archetypischen pro-fibrotischen miRNA, miR-21 [39]. Die Unterdrückung der PPAR-Expression durch miR-21 wurde als Mechanismus angeführt, durch den diese miRNA ihre pro-fibrotische Wirkung ausübt. Zusätzlich zur Hemmung von FAO zeigten die Zielgene für miR-21, dass diese miRNA eine Vielzahl von mitochondrialen Prozessen zum Schweigen bringt. Weitere Beispiele sind mir-9 [16], miR-33 [15] und miR-30e [40,41]. Unseres Wissens gibt es jedoch nur wenige Berichte, die sich mit der microRNA-Regulierung der CPT1A-, PGC1- und TFAM-Gene im Zusammenhang mit Nierenfibrose befassen. Interessanterweise zielt microRNA-214, die den Übergang vom Epithel zum Mesenchym (EMT) während der Nierenfibrose fördert, direkt auf TFAM in Dickdarmkrebszellen ab [42]. Diese Repression wurde auch für miR-590-3p berichtet [43]. Die miR-29-Familie, einer der am besten charakterisierten Regulatoren der ECM-Produktion bei Organfibrose, zielt direkt auf PGC1 ab und bewahrt die kardiale Homöostase. Somit führt eine pathologische Stummschaltung von miR-29 zu einer Hochregulierung von PGC1, was zu tiefgreifenden Veränderungen in der mitochondrialen Biogenese führt, die zu Herzerkrankungen beitragen [44]. Während unsere Daten eindeutig eine Rolle von miR-150 und miR-495 bei Nierenfibrose unterstützen, wären weitere In-vivo-Studien erforderlich, um diese Behauptung zu bestätigen.

Um die Integrität der mitochondrialen Elektronentransportkette (ETC) zu bewerten, konzentrierten wir uns auf zwei Merkmale: ΔѰm und Superoxid-Radikalanionenproduktion. Wir haben festgestellt, dass miR-150 und miR-495 diese Parameter nicht verändert haben. Ein stabiles ΔѰm ist für die Zelllebensfähigkeit erforderlich und seine Größe variiert zwischen den Zelltypen [45]. Seine Aufrechterhaltung ist streng abgestimmt, da eine Erhöhung von ΔѰm zu Störungen im Redoxzustand führen kann, während seine Verringerung eine Verringerung der ATP-Produktion verursacht und Apoptose auslösen kann. In unserer Studie wurden Änderungen in ΔѰm mit dem kationischen Fluoreszenzfarbstoff TMRM quantifiziert, während die mitochondriale Superoxid-Radikalanionenproduktion mit dem fluorogenen Farbstoff MitoSOX Red gemessen wurde. Der Einsatz dieser Hilfsmittel bei Erkrankungen, die die Nierenfunktion beeinträchtigen, ist in der Literatur nicht auffällig. Angesichts des Fehlens von Änderungen in unserer Studie haben wir jedoch andere Strategien zur Bewertung der Redox-Hormese nicht eingehend verfolgt, und daher können wir nicht ausschließen, dass diese miRNAs den nukleophilen Tonus oder die Funktion der verschiedenen Komponenten von verändern können das ETC.

In der klinischen Umgebung wurde miR-150 als pro-fibrotische miRNA bei Lupusnephritis vorgeschlagen, indem es die TGF-Signalgebung modulierte [46,47], während miR-495 mit einer schützenden Rolle bei diabetischem Herz in Verbindung gebracht wurde Fibrose [48]. Um ihre potenzielle Beteiligung an CKD herauszufinden, haben wir ihre Serum- und Parenchymspiegel in zwei verschiedenen Patientenkohorten bewertet. Serumspiegel von miRNAs wurden als potenzielle Biomarker für das Fortschreiten der chronischen Nierenerkrankung vorgeschlagen [49,50]. Daher korrelieren die zirkulierenden miR-21-Spiegel im Serum und die Häufigkeit von miR-29c in Harnexosomen mit Nierenfibrose, was auf ihre potenzielle Rolle als Biomarker hindeutet [51, 52]. Die miR-150- und miR-495-Spiegel waren jedoch weder in Plasma- noch in Nierenproben von CNE-Patienten unterschiedlich. Die unterschiedlichen microRNA-Expressionsmuster zwischen Arten und Zelltypen können dieses Fehlen von Unterschieden in den miR-150- und miR-495-Spiegeln in fibrotischem Gewebe erklären [53]. Während in einigen Fällen die gemeldeten microRNA-Plasmaspiegel die im Nierengewebe widerspiegeln könnten, sollten auch andere Mechanismen im Zusammenhang mit der Sekretion von miRNAs in das Kreislaufsystem oder ein Gegengewicht zu dieser Sekretion durch andere Organe in Betracht gezogen werden [13,54].

Insgesamt belegen unsere Ergebnisse, dass miR-150 und miR-495 Werbung machenNieren-epithelialZelleDedifferenzierung, höchstwahrscheinlich durch Energieentzug, vermittelt durch die Unterdrückung der mitochondrialen Funktion von CPT1A, PGC1 und TFAM. Sie bieten auch eine Basis, um ihre Rolle in vivo zu verfolgen, sowie ihre potenzielle Nützlichkeit als diagnostische oder prognostische Biomarker.

Autorenbeiträge

SL konzipierte und leitete die Forschung. VM hat die Mehrheit der Experimente entworfen, durchgeführt und analysiert. RR unterstützte bei der microRNA-Array-Analyse. DRP und LGB führten Studien an zwei verschiedenen Kohorten von CNI-Patienten durch. Alle Autoren halfen bei der Diskussion der Ergebnisse und SL und VM schrieben das Manuskript.

Erklärung konkurrierender Interessen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des spanischen Wissenschaftsministeriums SAF2015-66107-R und PID2019-104233RB-I00 (SL), PI17/01513 (DRP), kofinanziert von der Europäischen Union, unterstützt Fonds für regionale Entwicklung, Instituto de Salud Carlos III REDinREN RD12/0021/0009 und RD16/0009/0016 (SL und DRP), FIS PI17/00625 (DRP), Comunidad de Madrid „NOVELREN“ B2017/BMD3751 (SL und DRP), ein Stipendium der Spanischen Gesellschaft für Nephrologie (Fundacin Senefro 2017) an SL und FundacionNieren"Iigo Alvarez de Toledo" (SL) alle aus Spanien. Institutionelle Unterstützung erhält das CBMSO von der Fundacion „Ramn Areces“. VM wurde durch ein Vordoktorandenstipendium des FPI-Programms (BES- 2013-065986) des spanischen Wissenschaftsministeriums unterstützt.