Die hautaufhellenden Wirkungen von Ectoin über die Unterdrückung der -MSH-stimulierten Melanogenese und die Aktivierung von antioxidativen Nrf2-Signalwegen in UVA-bestrahlten Keratinozyten

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You-Cheng Hseu 1,2,3,4, Xuan-Zao Chen 1, Yugandhar Vudhya Gowrisankar 1,Hung-Rong Yen 3,4,5,6, Jing-Yuan Chuang 7 und Hsin-Ling Yang 8,*

Abstrakt:Die durch Ultraviolett-A (UVA)-Bestrahlung induzierte Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) ist übermäßigMelanogenesein Hautzellen, was zu einer Pigmentierung führt. Wir demonstrierten die depigmentierenden und antimelanogenen Wirkungen von Ectoin, einem natürlichen bakteriellen Osmolyten, in UVA-bestrahlten menschlichen (HaCaT) Keratinozyten, und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen wurden aufgeklärt. HaCaT-Zellen wurden mit niedrigen Konzentrationen von Ectoin (0,5–1,5 µM) vorbehandelt und auf verschiedene depigmentierende und antimelanogene Parameter getestet. Diese Vorbehandlung regulierte die ROS-Erzeugung, die Produktion des melanozytenstimulierenden Hormons (-MSH) und die Proopiomelanocortin(POMC)-Expression in UVA-bestrahlten HaCaT-Zellen signifikant herunter. Ebenfalls,AntioxidansHämoxygenase -1 (HO-1), NAD(P)H-Dehydrogenase [Chinon 1] (NQO-1) und -Glutamat-Cystein-Ligase-katalytische Untereinheit (-GCLC)-Proteinexpressionen waren vermittelt über die nukleare Translokation des Kernfaktors Erythroid2--bezogener Faktor 2 (Nrf2), dessen Knockdown diesen Effekt tatsächlich beeinträchtigte, was die Bedeutung des Nrf2-Signalwegs anzeigt. Ectoin vermittelte die Aktivierung von Nrf2 über die Signalwege p38, Proteinkinase B (auch bekannt als AKT), Proteinkinase C (PKC) und Caseinkinase II Proteinkinase (CKII). Das aus den mit Ectoin vorbehandelten und UVA-bestrahlten HaCaT-Zellen erhaltene konditionierte Medium regulierte dieTyrosinase, tyrosinase-related protein-1 und -2 (TRP-1/-2), zyklisches AMP (c-AMP) Proteinkinase, c-AMPresponse element-binding protein (CREB ) und Mikrophthalmie-assoziierte Transkriptionsfaktor (MITF)-Expressionen, die zu Melanom-B16F10-Zellen führen, die die Melaninsynthese gehemmt haben. Interessanterweise war dieser anti-melanogene Effekt in -MSH-stimulierten B16F10-Zellen nur bei Konzentrationen von 50–400 µM Ectoin beobachtbar, was die Schlüsselrolle anzeigt, die mit Ectoin (0,5–1 µM) behandelte Keratinozyten in der Haut spielenAufhellungAuswirkungen. Wir kamen zu dem Schluss, dass Ectoin als wirksames topisches Naturkosmetikmittel mit depigmentierender und antimelanogener Wirkung verwendet werden könnte.

Schlüsselwörter:Ectoin; Keratinozyten;Melanogenese; Tyrosinase; -MSH; Nrf2

Cistanche hat eine antioxidative Wirkung.

1. Einleitung

Die Exposition der menschlichen Haut gegenüber UVA-Strahlung löst die ROS-Erzeugung und auch die Überproduktion von Melanin in den Hautzellen aus. Die unkontrollierte Produktion von ROS könnte ebenfalls zu Melanomzuständen führen. Die meisten Hautaufheller zielen darauf ab und versuchen, diese zu minimierenMelanogeneseProzess durch die Hemmung von -MSH undTyrosinaseProduktionen [1]. Die meisten hautaufhellenden Cremes bestehen aus Hydrochinon [2] oder Hydrocortison [3], die dafür bekannt sind, die Bildung von Melanin zu verringern, aber auch mit schweren Nebenwirkungen verbunden sind. Zum Beispiel Akne, schuppige und juckende Haut, blaue und schwarze Verfärbungen der Haut, Ochronose, brennende und stechende Hautirritationen und sogar EntzündungenAufhellungWirkstoffe aus natürlichen Quellen, z. B. Kojisäure (ein Pilzderivat aus Penicillium- und Aspergillus-Arten), sollen bei Personen mit empfindlicher Haut ebenfalls „Kontaktdermatitis“ verursachen. Bei diesen Personen könnte mehr als 1 Prozent Kojisäure schwere überempfindliche Nebenwirkungen verursachen [4,5]. Daher nur wenige natürlich gewonnene HautAufhellungProdukte (Oleosin, Lakritzextrakt, Ascorbinsäure, Sojaprotein, N-Acetylglucosamin etc.) werden derzeit in der kosmetischen Industrie eingesetzt [6]. Die Hautpflegeprodukte, die hauptsächlich auf die depigmentierenden Eigenschaften abzielen, haben es jedoch manchmal versäumt, sich darauf zu konzentrieren, den schädlichen Wirkungen entgegenzuwirken, die durch den durch UVA-Bestrahlung induzierten Überschuss an ROS-Produktion verursacht werdenMelanogenesein Hautzellen.

Ectoin ist ein „natürlicher Extremolyt“, der von mehreren Arten von Mikroorganismen unter Stressbedingungen produziert wird [7,8]. Diese Verbindung wurde erstmals aus der Bakterienart Ectothiorhodospira isoliert, die in der ägyptischen Wüste lebt. Die Kaskade von ect-Operongenen (ectA, ectB, ectC oder ectD) ist an der Produktion dieser Verbindung beteiligt. Ectoin wird chemisch als 1,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidincarbonsäure bezeichnet [9]. Als Feuchtigkeitsbinder hilft Ectoin bei der Restrukturierung der Hautzellmembran [10], dem Schutz vor UV-Schäden und Umweltverschmutzung [11,12], der Feuchtigkeitsversorgung der Haut [13], der Verzögerung der vorzeitigen Hautalterung [14] usw. Darüber hinaus Neben den Hautschutzfunktionen hat sich Ectoin bei der Behandlung von atopischer Dermatitis [15], Alzheimer [16] sowie der Hemmung der HIV-Replikation [17], Strahlen- und Chemotherapie [18] und Leberzirrhose als nützlich erwiesen [ 19]. Es wird spekuliert, dass Ectoin seine depigmentierenden und hautaufhellenden Eigenschaften zeigt, ohne unerwünschte Nebenwirkungen zu verursachen [20]. Im Gegensatz dazu sind die durch Ectoin hervorgerufenen molekularen Mechanismen nicht bekannt. Daher war das Ziel dieser Studie, die Ectoin-vermittelten Depigmentierungs- und Anti-Melanogen-Mechanismen zu beschreiben, die in UVA-bestrahlten menschlichen (HaCaT) Keratinozyten als zelluläres Modellsystem hervorgerufen werden. Die Wirkung von Ectoin-induzierten Ausscheidungen von Hautschutzmitteln aus den HaCaT-Zellen in das Kulturmedium (konditioniertes Medium) wurde ebenfalls unter Verwendung einer typischen Melanom-Zelllinie (B16F10) getestet.

2. Materialien und Methoden

2.1. Reagenzien und Antikörper

Ectoin (Produkt-Nr.: 81619, Reinheit größer oder gleich 95 Prozent) wurde von Sigma-Aldrich (Taufküchen, Deutschland) bezogen. Fötales Rinderserum (FBS), Penicillin/Streptomycin, Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und 1-Glutamin wurden von Invitrogen/Gibco BRL (Carlsbad, CA, USA) gekauft. l-DOPA, Melanin, 3-4,5-Dimethyl-2-yl-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT) und -MSH wurden von Sigma Chemical Co. bezogen (St. Louis, MO, USA). N-Acetylcystein (NAC) und 20,70-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH2-DA) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Alle für JNK (SP600125), ERK1/2 (PD98059), p38 (SB203580), PKC (GF109203X) und CKII erforderlichen pharmakologischen Inhibitoren wurden von Calbiochem (La Jolla, CA, USA) bezogen. PI3K/AKT-Inhibitor (LY294002) wurde bezogen von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Alle Antikörper für POMC, CREB, -Aktin,Tyrosinase, Nrf2, p-CREB, NQO-1, PKC, Kelch-ähnliches ECH-assoziiertes Protein-1 (Keap-1) und TRP-1, TRP-2 wurden von Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, Deutschland) erhalten. Antikörper gegen -GCLC und HO-1 wurden von Gene Tex Inc. (San Antonio, TX, USA) bezogen. Wir haben Antikörper gegen c-AMP-Proteinkinase und CKII von Abcam (Cambridge, MA, USA) erhalten. Histone, MITF, p-p38, p38, p-AKT und AKT wurden von Cell Signal Technology (Beverly, MA, USA) bezogen. Nachweisreagenzien für verstärkte Chemilumineszenz (ECL) wurden von Millipore (Billerica, MA, USA) bezogen. Alle anderen Reagenzien (in HPLC-Qualität) wurden entweder von Sigma-Aldrich oder Merck & Co., Inc. gekauft. (Darmstadt, Deutschland).

2.2. Zellkultur

Wir erhielten unsterblich gemachte humane Hautkeratinozyt-HaCaT- und murine Melanom-B16F10-Zellen von Cell Line Services (CLS, Eppelheim, Deutschland) und American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA). Die Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 Prozent hitzeaktiviertem FBS, 1 Prozent Streptomycin/Penicillin und 2 mM L-Glutamin, in einem befeuchteten Inkubator, ergänzt mit 5 Prozent CO2, bei 37 °C kultiviert.

2.3. Zellbehandlungen und UVA-Bestrahlung

Vor der UVA-Bestrahlung wurden die Zellen mit Ectoin (0,5–1,5 µM für 24 h) oder Vehikel (PBS) vorbehandelt. Nach der Inkubation wurden mit PBS gewaschene Zellen 3 J/cm2 UVA-Strahlung (für 27 min, λmax, 365 nm, keine nachweisbaren Emissionen unter 320 nm) unter Verwendung des UV CROSS-LINKER CL-508 (UVItec, Cambridge, Großbritannien) [21].

2.4. Intrazellulärer ROS-Assay

HaCaT-Zellen wurden mit einer Dichte von 1,5 × 105 in einer Labor-Teck-Kammer mit 8- Vertiefungen ausgesät, die DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, enthielt, und wurden bis zu einer Konfluenz von 80 % gezüchtet. Diese Zellen wurden zuerst mit 1,5 µM Ectoin behandelt, gefolgt von einer Bestrahlung mit 3 J/cm² UVA-Strahlung für die vorgeschriebene Zeit. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, und die DCFH2-DA-Methode wurde verwendet, um die intrazelluläre ROS-Produktion zu bestimmen Verwenden der Olympus Software-Lösungssoftware für jede Bedingung [21].

2.5. Melanin-Quantifizierung

In eine 6-Well-Platte wurden murine Melanom-B16F10-Zellen mit einer Dichte von 2,5 × 105 Zellen/Well ausgesät. Sie wurden mit 100, 200 und 400 µM Ectoin für 2 Stunden in Abwesenheit oder Anwesenheit von -MSH vorbehandelt (1 μM). Das für die Quantifizierung von Melanin verwendete Protokoll folgte einer zuvor beschriebenen Methode [21]. Wir haben den Melaningehalt mit dem ELISA-Mikroplattenlesegerät mit einer Absorptionswellenlänge von 470 nm gemessen.

Cistanche hemmt Melanin.

2.7. Westlicher Fleck

HaCaT (1 × 106 Zellen/10 cm Schale) oder B16F10 (1 × 106 Zellen/10 cm Schale) Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Ectoin (0,5, 1 und 1,5 µM) oder -MSH (1 µM), gefolgt von einer Bestrahlung in Abwesenheit oder Anwesenheit von UVA für die vorgeschriebene Zeitdauer. Mit PBS gewaschene Zellen wurden geerntet, der Proteingehalt (nukleär und zytosolisch) wurde nach der Behandlung isoliert. Dann wurden die Zellen dem Western-Blot-Verfahren unterzogen, das zuvor zur Bestimmung der Expression verschiedener nukleärer und zytosolischer Proteine ​​verwendet wurde [21].

2.8. RNA-Extraktion und RT-PCR

Mit Ectoin vorbehandelte (1,5 &mgr;M, 24 h) HaCaT-Zellen wurden dem TRIzol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad) zur Isolierung von Gesamt-RNA aus diesen Zellen ausgesetzt. 1 µg Gesamt-RNA und die vom SuperScript-III One-Step RT-PCR Platinum Taq Kit (Invitrogen, Carlsbad) gelieferten Reagenzien wurden im PCR-Experiment mit dem Bio-Rad iCycler PCR-Instrument (Bio-Rad, Hercules, CA, Vereinigte Staaten). Die verwendeten Forward- und Reverse-Primer für Nrf2 waren: F: 50-AAACCAGTGGATCTGCCAAC-30,R-50-GCAATGAAGACTGGGCTCTC-30. Die verwendeten Forward- und Reverse-Primer für GAPDH waren: F: 50-GCATCCTGGGCTACACTGA-30, R: 50-CCACCACCCTGTTGCTGTA-30. Am Ende des Experiments wurde das PCR-Produkt unter Verwendung von 1-prozentigem Agarosegel analysiert. Dann wurde es mit Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht. Als interne Kontrolle verwendeten wir GAPDH [22].

2.9. Immunfluoreszenz-Assay

HaCaT-Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen/Vertiefung in DMEM-Ergänzung mit 10 % FBS in einer 8--Well-Lab-Tek-Kammer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) kultiviert. Wir haben die Zellen mit 1,5 &mgr;M Ectoin für die angegebene Zeit vorbehandelt, gefolgt von einer Bestrahlung in Abwesenheit oder Anwesenheit von UVA. Die Zellen wurden einem Immunfluoreszenzassay unterzogen, der ein zuvor beschriebenes Verfahren verwendet [21].

2.10. Statistische Analyse

Wir verwendeten den Mittelwert ± Standardabweichung (Mittelwert ± SD) für alle in dieser Studie verwendeten Ergebnisse. Alle Daten wurden mit einer Varianzanalyse (ANOVA) analysiert, gefolgt von Dunnetts Test für paarweise Vergleiche und als Mittelwert ± SD von drei dargestellt oder mehr unabhängige Experimente. Die statistische Signifikanz wurde auf * p < 0="" festgelegt.05;="" **="" p="">< 0.01;="" ***="" p="">< 0.001="" im="" vergleich="" zu="" unbehandelten="" kontrollzellen="" und="" #="" p="">< 0,05;="" ##="" p="">< 0,01;="" ###="" p="">< 0,001="" im="" vergleich="" zu="" den="" uva-exponierten="" hacat-zellen="" oder="" -msh-behandelten="">

3. Ergebnisse

3.1. Ectoin hemmte die UVA-induzierte ROS-Erzeugung in HaCaT-Zellen

Zuerst haben wir die zytotoxischen Wirkungen von Ectoin (Abbildung 1A) auf UVA-bestrahlte HaCaT-Zellen getestet. und 3 J/cm2 UVA-exponierten HaCaT-Zellen konnten keine signifikante Abnahme der Zelllebensfähigkeit zeigen (Abbildung 1B). Darüber hinaus schwächte die Vorbehandlung mit Ectoin den durch UVA (3 J/cm2) induzierten Zelltod dosisabhängig ab (Abbildung 1B). Zusätzlich zu unseren Fluoreszenzdaten, die darauf hinwiesen, dass im Vergleich zu den Kontrollzellen eine UVA-Bestrahlung mit 3 J/cm2 und Behandlungen mit Ectoin allein (1,5 µM) die ROS-Spiegel um das 5-- und 2--fache signifikant hochregulierten, beziehungsweise. Im Fall der Ectoin-Vorbehandlung wurden die ROS-Spiegel jedoch signifikant herunterreguliert, und wir können daraus schließen, dass Ectoin eine Wirkung hatAntioxidansWirkung gegen UVA-Strahlung. Dies induziert auch Grundwerte von ROS in HaCaT-Zellen (Abbildung 1C, D).

3.2. Ectoin unterdrückte POMC- und -MSH-Expressionen in UVA-bestrahlten HaCaT-Zellen

UVA-exponierte Keratinozyten wurden für ihre ROS-p53-vermittelten POMC und auch ein kleines Peptidhormon -MSH, das von POMC abgeleitet ist, stimuliert [23]. Daher haben wir die Veränderungen in den Expressionsmustern von -MSH, POMC und anderen assoziierten Proteinen in mit Ectoin vorbehandelten HaCaT-Zellen bestimmt und sie dann UVA (3 J/cm2) ausgesetzt. Western-Blot-Daten zeigten, dass die UVA-induzierte Hochregulierung von -MSH- und POMC-Expressionen durch Ectoin-Vorbehandlung herunterreguliert wurde; wohingegen die Behandlung mit Ectoin ohne UVA-Bestrahlung die -MSH- und POMC-Expressionen von nicht bestrahlten HaCaT-Zellen vollständig gehemmt hat (Abbildung 2A). Später testeten wir die Wirkung von „konditioniertem Medium“ (10 ml/100-mm-Platte), das aus den mit Ectoin vorbehandelten und UVA-bestrahlten HaCaT-Zellen erhalten wurde, auf dieMelanogenesevon B16F10-Melanomzellen. Abbildung 2B zeigt dieses herunterregulierte konditionierte MediumTyrosinase, TRP-1, TRP-2, c-AMP-Proteinkinase, p-CREB, CREB und MITF-Spiegel in B16F10-Zellen.

3.3. Ectoin regulierte die Expression von Melanin und Tyrosinase in -MSH-stimulierten B16F10-Zellen herunter

B16F10-Melanomzellen wurden zuerst den höheren Konzentrationen von Ectoin ausgesetzt und die Wirkung der Zytotoxizität wurde unter Verwendung des MTT-Assays bestimmt. Abbildung 3A zeigt, dass Ectoin bei höheren Konzentrationen (100–400 μM für 72 h) keinen signifikanten Einfluss auf die Lebensfähigkeit von B16F10-Zellen hatte. Die Zelllebensfähigkeit wurde jedoch nach 24 und 48 h der Ectoin-Behandlung nicht beeinflusst (Daten nicht gezeigt). Daher wurden diese Konzentrationen verwendet, um die Wirkung von Ectoin auf -MSH-stimuliert zu bestimmenMelanogenesein B16F10-Zellen. Melanin-Quantifizierungsdaten zeigten, dass die Behandlung mit -MSH (1 μM) allein im Vergleich zu den Kontrollzellen die Melaninspiegel signifikant um mehr als 25 Prozent hochregulierte . Im Vergleich zur alleinigen Behandlung mit -MSH regulierten Zellen, die steigenden Konzentrationen von Ectoin (100–400 μM bei 72 h) ausgesetzt waren, dosisabhängig und signifikant den Prozentsatz des Melaningehalts mit einer maximalen Herunterregulierung von nur 85 Prozent (oder –15 Prozent als unbehandelt). Kontrolle) wurde bei 400 μM Ectoin-Vorbehandlung beobachtet (Abbildung 3B). Darüber hinaus zeigten unsere Western-Blot-Daten auch, dass -MSH stimulierteTyrosinase(24 h) und p-CREB (2 h)-Expressionen wurden mit zunehmenden Konzentrationen von Ectoin-Vorbehandlungen in diesen Melanomzellen signifikant herunterreguliert (Abbildung 3C).

3.4. Ectoin regulierte die Expression von HO-1-, NQO-1- und -GCLC-Proteinen in HaCaT-Zellen hoch

Um die Wirkung der Zeit auf die Ectoin-vermittelte Kerntranslokation von Nrf2 und die anschließende nachgeschaltete Expression von HO-1-, NQO-1- und -GCLC-Proteinen zu bestimmen, wurden HaCaT-Zellen 1,5 µM Ectoin ausgesetzt und die zellulären Proteine ​​geerntet 0.5, 1, 2, 4, 8 oder 12 h nach der Ectoine-Behandlung. Western-Blot-Daten zeigten, dass mit Ausnahme des -GCLC-Proteins 1,5 µM Ectoin die maximale Expression der HO-1-, Nrf2- und NQO-1-Proteine ​​zum Zeitpunkt 4 h verursachten. -GCLC wurde zu einem Zeitpunkt von 8 h gezeigt (Abbildung 5A). Aus der Zeitkurve erhaltene Daten führen uns dazu, die Wirkung der Ectoin-Konzentration auf die Expression von zu testenAntioxidansProteine ​​zu einem 4-Stunden-Zeitpunkt. Abbildung 5B zeigt, dass alle drei antioxidativen Proteine ​​eine maximale Expression bei einer Ectoin-Konzentration von 1,5 µM aufwiesen. Später wurden die Auswirkungen der Ectoin-Vorbehandlung auf die Expression von Nrf2 und das Keap-1-Verhältnis in UVA-bestrahlten HaCaT-Zellen getestet. Die Analyse westlicher Daten zeigte, dass die Vorbehandlung mit 1,5 µM Ectoin eine Erhöhung des Verhältnisses von Nrf2/Keap-1 in UVA-bestrahlten HaCaT-Zellen zeigte (Abbildung 5C). Wir sahen auch übereinstimmende Daten mit der erhöhten Expression von NQO -1-, HO-1- und -GCLC-Proteine ​​in mit Ectoin vorbehandelten HaCaT-Zellen, die mit 3 J/cm2 UVA bestrahlt wurden (Abbildung 5D). Diese Daten legen nahe, dass die Vorbehandlung mit Ectoin eine schützende Rolle bei UVA-bestrahlten HaCaT-Zellen spielt.

3.5. Verschiedene Signalwege waren an der Aktivierung von Nrf2 in mit Ectoin behandelten HaCaT-Zellen beteiligt

Wir bestimmten die Signalwege, die an der Ectoin-vermittelten Kerntranslokation von Nrf2 beteiligt sind. HaCaT-Zellen wurden mit pharmakologischen Inhibitoren der PI3K/AKT-, ERK-, p38-, JNK-, PKC-, ROS- und CKII-Signalwege vorbehandelt, gefolgt von 1,5 μM Ectoin. Western-Blot-Daten von Nuklear-Nrf2 zeigten, dass p38-MAPK-, PI3K/AKT-, PKC- und CKII-Wege an diesem Mechanismus beteiligt waren (Abbildung 6A). Aus den erhaltenen Informationen haben wir auch die Wirkung der Ectoin-Vorbehandlung auf die Rolle bestimmt, die diese Signalwege bei der Expression von antioxidativen Proteinen spielen. Abbildung 6B zeigt, dass die pharmakologische Hemmung der MAPK-, p38-, PI3K/AKT-, CKII- und PKC-Signalwege die Expression von NQO-1, HO-1 und -GCLC herunterregulierteAntioxidansProteine ​​in HaCaT-Zellen. Darüber hinaus zeigt die Zeit, die für die Phosphorylierung von AKT, p38 und die Expression von PKC und CKII bei Exposition gegenüber Ectoin benötigt wird, dass die Phosphorylierung von p38 und die Expression von PKC und CKII mit Ausnahme von p-AKT später stattfanden nur Zeitpunkte (nach 30 min) (Abbildung 6C). Im Fall von AKT wurde die Phosphorylierung ab dem 15-Minuten-Zeitpunkt beobachtet, der bei 30 Minuten einen Höhepunkt erreicht hat (Abbildung 6C). Im Fall von AKT wurde die Phosphorylierung ab dem 15-Minuten-Zeitpunkt beobachtet, die einen Höhepunkt bei 30 Minuten erreicht hat (Abbildung 6C). Diese kumulativen Ergebnisse legten nahe, dass p38-, AKT-, PKC- und CKII-Signalwege die Antioxidantien Ectoin-vermittelte Kerntranslokation von aktivierten Nrf2 führt zur Expression von antioxidativen Proteinen.

3.6. Die Ectoin-vermittelte anti-melanogene Wirkung wurde aufgrund des Knockdown von Nrf2 unterdrückt

Die Rolle von Nrf2 bei Ectoin-vermittelten Anti-Melanogenesewurde durch Silencing des Nrf2 in HaCaT-Zellen bestimmt. Daten aus dem Western Blot zeigten, dass Nrf2-Knockdown-Zellen, die 1,5 μM Ectoin ausgesetzt waren, eine minimale Expression von NQO-1, HO-1 und -GCLC zeigtenAntioxidansProteine ​​(Abbildung 7A). Später testeten wir die Wirkung von Nrf2-Knockdown auf die Expression von -MSH-Spiegeln in UVA-bestrahlten (3 J/cm2) HaCaT-Zellen. Die Western-Blot-Ergebnisse zeigten, dass zur Kontrolle der siRNA-transfizierten Zellen die UVA-Bestrahlung bei der Hochregulierung der Expression von -MSH-Spiegeln in Zellen, die Ectoin nicht ausgesetzt waren, signifikant war ( 7B ). 1,5 μM Ectoin hat diesen Effekt jedoch unterdrückt. Für den anderen Fall zeigten mit siNrf2 transfizierte Zellen eine Abnahme der Expression von -MSH-Spiegeln sowohl in unbehandelten als auch in behandelten Zellen (Fig. 7B). Ähnlich wie bei -MSH-Daten zeigten unsere Fluoreszenzdaten auch, dass die UVA-Bestrahlung die ROS-Produktion in mit Ectoin unbehandelten Kontroll-siRNA-Zellen signifikant hochregulierte (Abbildung 7C, D). Dieser Effekt wurde jedoch signifikant unterdrückt, wenn die Zellen 1,5 µM Ectoin ausgesetzt wurden. Andererseits zeigten Nrf2-transfizierte und UVA-bestrahlte HaCaT-Zellen einen etwa 8--fachen Anstieg der ROS-Spiegel im Vergleich zu Nrf2-transfizierten Zellen, die nicht mit UVA bestrahlt, sondern einer Ectoin-Behandlung ausgesetzt wurden (Abbildung 7C, D). All diese Daten weisen auf die Ectoin-vermittelte schützende Rolle hin, die Nrf2 bei der Minimierung der Melaninproduktion in UVA-bestrahlten HaCaT-Zellen spielt. . All diese Daten deuten auf die Ectoin-vermittelte schützende Rolle hin, die Nrf2 bei der Minimierung der Melaninproduktion in UVA-bestrahlten HaCaT-Zellen spielt.

Cistanche-Vorteil: Aufhellung der Haut

4. Diskussion

Verschiedene Haut-AufhellungWirkstoffe sind in der Kosmetikindustrie im Einsatz. Viele dieser Wirkstoffe sind chemischen Ursprungs und leiden unter den Einschränkungen, verschiedene Nebenwirkungen einschließlich Krebs zu verursachen [24–26]. Daher ist die Identifizierung sicherer und natürlicher Hautaufheller die Notwendigkeit der Stunde. Es ist bekannt, dass Ectoin (Abbildung 1A) als Wirkstoff in Gesichtscremes und anderen kosmetischen Mitteln verwendet wird. Dieses wirkt als Hautfeuchtigkeitsspender und soll auch die vorzeitige Hautalterung verzögern [27]. Fast alle bekannten Hautaufheller zielen auf die Herunterregulierung vonTyrosinaseEnzymaktivität in UV-bestrahlten Zellen, die die abnimmtMelanogenesein Hautzellen. Yao et al. demonstriertAufhellungEigenschaften von biosynthetisiertem Ectoin und schlug vor, dass es sich um ein aputatives Aufhellungsmittel handelt. In ihrer Studie testeten sie die hohe Konzentration (500 µM) von Ectoin auf seine aufhellende Wirkung auf Zelllinien von Maus-Melanomen (B16F0) und menschlichen Melanomen (A2058) und kamen zu dem Schluss, dass Ectoin ein sicheres und sicheres Mittel ist potenzieller Wirkstoff für die kosmetische und klinische Anwendung [20]. In dieser Studie haben wir jedoch die vorteilhaften Wirkungen niedriger Konzentrationen von Ectoin (0,5–1,5 µM) auf UVA-bestrahlte HaCaT-Zellen weiter getestet, und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen wurden entschlüsselt. In unserer Studie wurde gezeigt, dass Ectoin über den Nrf2/ARE-Weg nicht nur die Expression der antioxidativen Genexpression induziert, sondern auch die -MSH-Spiegel in UVA-bestrahlten HaCaT-Zellen über die Unterdrückung von POMC herunterreguliert. Eine Abnahme der -MSH-Spiegel war mit der Herunterregulierung der Tyrosinase-Enzymaktivität korreliert, was zu einer Abnahme der Melaninproduktion führte. Nach unserem Wissen ist dies der erste Bericht, der durch den Mechanismus nachgewiesen wurde, der durch Ectoin in UVA-bestrahlten HaCaT-Zellen ausgelöst wurde. Diese Studie skizzierte die molekularen Mechanismen, die Ectoin in HaCaT-Zellen als zelluläres Modellsystem zeigte.

Wir bestimmten zunächst die subletalen Konzentrationen von Ectoin sowie die Wirkung von UVA-Strahlung auf die Lebensfähigkeit von HaCaT-Zellen. Unsere MTT-Daten zeigten, dass niedrige Konzentrationen von Ectoin (0.5–1,5 µM) keinen signifikanten Einfluss auf die Lebensfähigkeit von HaCaT-Zellen hatten (Abbildung 1B). Die Vorbehandlung mit Ectoin erhöhte die Lebensfähigkeit von 3 J/cm2 UVA-bestrahlten HaCaT-Zellen (Abbildung 1B). Basierend auf diesen Beobachtungen setzten wir unsere weiteren Experimente unter Verwendung von 1,5 &mgr;M Ectoin-Vorbehandlung und UVA-Bestrahlung bei 3 J/cm 2 -Dosierungen fort.

Die durch UVA-Strahlung induzierte ROS-Produktion in Hautkeratinozyten ist eine wohlbekannte Tatsache [28]. Daher haben wir auch auf positive Auswirkungen einer Ectoin-Vorbehandlung auf die durch UVA-Strahlung induzierte ROS-Produktion in HaCaT-Zellen getestet. Unsere DCF-Fluoreszenzintensitätsdaten zeigten, dass die Vorbehandlung mit 1,5 µM Ectoin die durch UVA-Strahlung induzierte ROS-Produktion in Keratinozyten signifikant herunterregulierte. Es war auch zu beobachten, dass 1,5 µM Ectoin einen basalen Anstieg der ROS-Spiegel in HaCaT-Zellen verursachen konnten, die sich als statistisch signifikant erwiesen (Abbildung 1D, E).

Rousseauet al. berichteten, dass POMC von humanen epidermalen Keratinozyten und Melanozyten sezerniert und stimuliert wurdeMelanogenese[29]. Vor diesem Hintergrund testeten auch wir die Wirkung von UVA-Bestrahlung und Ectoin-Vorbehandlungen auf die Melanogenese-assoziierten Proteine ​​in HaCaT-Zellen. Unsere Western-Blot-Daten zeigten, dass die dosisabhängige Herunterregulierung der Expression von -MSH- und POMC-Proteinen in UVA-bestrahlten HaCaT-Zellen durch die Vorbehandlung mit Ectoin verursacht wurde. Umgekehrt hat die Vorbehandlung mit Ectoin eine unterschiedliche Wirkung auf das Expressionsmuster vonMelanogenese-assoziierte Proteine. Bemerkenswerterweise fast alle getesteten Proteine ​​(Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, c-AMP-Proteinkinase, CREB und MITF) zeigten verringerte Expressionen mit steigenden Konzentrationen von Ectoinepre-Behandlung in UVA-bestrahlten HaCaT-Zellen (Abbildung 2A, B). Diese Daten zeigen die Tatsache, dass Ectoine antimelanogene Eigenschaften in UVA-bestrahlten HaCaT-Zellen besitzt.

Die anti-melanogene Wirksamkeit von Ectoin wurde weiter in B16F10-Zellen getestet, einer bekannten Melanom-Zelllinie, die in verwendet wirdMelanogeneseStudien [30]. Eine der bemerkenswerten Beobachtungen in unserer Studie war, dass im Gegensatz zu den HaCaT-Zellen hohe Konzentrationen von Ectoin (100–400 µM) notwendig waren, um die Melaninsynthese in -MSH-stimulierten B16F10-Zellen zu unterdrücken (Abbildung 3B). Unsere Western-Blot-Daten zeigten, dass Ectoin die Expression von dosisabhängig herunterregulierteTyrosinaseund p-CREB-Proteine ​​in -MSH-stimulierten B16F10-Zellen, was zu dem oben erwähnten Effekt führt (Fig. 3C). Daher haben wir auch getestet, ob diese hohen Konzentrationen von Ectoin die Lebensfähigkeit von B16F10-Zellen beeinträchtigen könnten. Unsere MTT-Ergebnisse zeigten, dass hohe Konzentrationen von Ectoin (100–400 µM) keine Auswirkung auf die Lebensfähigkeit von B16F10-Zellen hatten (Abbildung 3A). Diese Ergebnisse zeigen, dass Keratinozyten eine Schlüsselrolle bei der Ectoin-vermittelten Anti-Melanogeneseund depigmentierende Effekte.

Die Rolle des Transkriptionsfaktors Nrf2 im Hautzellstoffwechsel ist gut dokumentiert [31]. Daher haben wir die Mechanismen des Nrf2/Keap-1-Signalwegs bei Ectoin-vermittelten Effekten in Keratinozyten weiter getestet. 4A zeigt, dass Ectoin dosisabhängig und signifikant das Nrf2/Keap-1-Verhältnis erhöhte, wobei eine maximale Wirkung bei einer Ectoin-Konzentration von 1,5 &mgr;M beobachtet wurde. Es wurde auch beobachtet, dass 1,5 µM Ectoin die Kerntranslokation des Nrf2-Proteins begünstigte, wobei die maximale Expression von Nrf2 aus der Kernproteinfraktion zum Zeitpunkt 2 h beobachtet wurde (Abbildung 4B). Daten aus der Immunfluoreszenzfärbung von HaCaT-Zellen haben diesen Effekt ebenfalls unterstützt (Abbildung 4D).

In menschlichen Melanozyten und Keratinozyten haben Marrot et al. und andere haben die Bedeutung des Nrf2-Abwehrwegs bei photooxidativen Stressreaktionen erklärt [32]. Auch wir untersuchten die Wirkung der Ectoin-vermittelten antioxidativen Proteinexpression in HaCaT-Zellen. Unsere Zeitkurvendaten zeigten, dass die Ectoin-vermittelte Expression aller drei antioxidativen Proteine ​​(HO-1, NQO-1, -GCLC) und Nrf2 mit zunehmender Zeit ({{ 8}}.5–12 h) mit einem beobachtbaren Effekt wurde zum Zeitpunkt 4 h festgestellt (Abbildung 5A). Daraus ergibt sich eine Konzentrationskurve, die die Wirkung der Ectoine-Konzentration auf misstAntioxidansDie Proteinexpression wurde auch zu einem Zeitpunkt von 4 h bestimmt. Abbildung 5B zeigt, dass die Behandlung mit Ectoin im Vergleich zu den unbehandelten Zellen die Expression von HO-1-, NQO-1-, -GCLC-Proteinen dosisabhängig erhöht hat. Wir haben auch gemessen, wie die Ectoin-Konzentration Schutzwirkungen in HaCaT-Zellen zeigte, die UVA-Strahlung ausgesetzt waren. Western-Blot-Daten zeigten, dass Ectoin dosisabhängig die Expression von antioxidativen Proteinen mit einer dramatischen Hochregulierung des Nrf2/Keap-1-Verhältnisses erhöhte (Abbildung 5C, D). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Ectoin-Vorbehandlung (1,5 µM, 4 h) die potenzielle Wirkung hat, die antioxidative Proteinexpression in HaCaT-Zellen zu induzieren, die den schädlichen Wirkungen durch UVA-Exposition entgegenwirken könnte.

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5. Schlussfolgerungen

Aus den obigen Daten schlossen wir, dass niedrige Konzentrationen von Ectoin (0,5–1,5 µM) die -MSH- und Melaninproduktion über die Unterdrückung von POMC herunterregulieren könnten undTyrosinaseSignalweg in UVA-bestrahlten HaCaT-Zellen, was auf seine Anti-MelanogeneseWirksamkeit. Darüber hinaus war Ectoin auch an der Unterdrückung der intrazellulären ROS-Produktion in HaCaT-Zellen beteiligt. Im Gegensatz zu HaCaT-Zellen konnten hohe Konzentrationen von Ectoin (50–400 µM) eine ähnliche Wirkung in B16F10-Melanomazellen zeigen, was darauf hinweist, dass Keratinozyten eine Schlüsselrolle bei der Ectoin-vermittelten Anti-Melanogeneseund Haut-AufhellungWirkungen in Hautzellen. Am wichtigsten ist, dass Ectoin vorteilhafte Wirkungen über die Aktivierung des Nrf2-Signalwegs vermittelt, der die Expression von induziertAntioxidansProteine ​​HO-1, NQO-1 und -GCLC. Es wurde gezeigt, dass AKT der erste Signalweg ist, der die Aktivierung von Nrf2 initiiert, gefolgt von den anderen Signalwegen (p38, PKC und CKII). Schließlich lieferte die Stummschaltung von Nrf2 direkt den Beweis, dass Nrf2 eine Schlüsselrolle bei der Regulation von intrazellulärem ROS sowie der -MSH-Produktion spielt. Wir kamen zu dem Schluss, dass der Hauptaufhellungsmechanismus von Ectoin auf die Hemmung des ROS-p53/POMC- -MSH-Signalwegs in UVA-bestrahlten HaCaT-Zellen zurückzuführen sein sollte. Daher könnten Ectoin oder seine Derivate ein Wirkstoff in Feuchtigkeitscremes und Lotionen sein die als potenzielle und natürliche Haut verwendet werdenAufhellungWirkstoffe in der Kosmetikindustrie.

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