Der Zebrafisch-Embryo als Modell zum Testen der Schutzwirkung von antioxidativen Verbindungen in Lebensmitteln

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Abstrakt: DasAntioxidansDie Aktivität von Lebensmittelverbindungen ist aufgrund ihrer gesundheitlichen Vorteile und ihres Zusammenhangs mit der Prävention chronischer Krankheiten eine der interessantesten Eigenschaften. Diese Aktivität wird normalerweise unter Verwendung von In-vitro-Assays gemessen, die keine In-vivo-Effekte oder Wirkungsmechanismen vorhersagen können. Das Ziel dieser Studie war es, die in vivo schützenden Wirkungen von sechs phenolischen Verbindungen (Naringenin, Apigenin, Rutin, Oleuropein, Chlorogensäure und Curcumin) und drei Carotinoiden (Lycopin B, -Carotin und Astaxanthin) zu bewerten, die natürlicherweise in Lebensmitteln vorkommen ein Zebrafisch-Embryonenmodell. Der Zebrafischembryo wurde mit jeder der neun antioxidativen Verbindungen vorbehandelt und dann tert-Butylhydroperoxid (tBOOH), einem bekannten Induktor von, ausgesetztoxidativen Stressim Zebrafisch. Signifikante Unterschiede wurden durch Vergleich der Konzentrationsreaktion der tBOOH-induzierten Letalität und Dysmorphogenese gegenüber den vorbehandelten Embryonen mit der bestimmtAntioxidansVerbindungen. Es wurde eine schützende Wirkung jeder Verbindung, mit Ausnahme von -Carotin, gegen durch oxidativen Stress induzierte Letalität gefunden. Darüber hinaus zeigten auch Apigenin, Rutin und Curcumin Schutzwirkungen gegen Dysmorphogenese. Andererseits zeigte -Carotin im Vergleich zur tBOOH-Behandlung allein eine erhöhte Letalität und Dysmorphogenese.

Schlüsselwörter: oxidativen Stress; Zebrafischembryo; antioxidative Wirkung; Polyphenole; Carotinoide

1. Einleitung

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und reaktive Stickstoffspezies (RNS) entstehen während des Zellstoffwechsels. Sie sind für einen normalen physiologischen Zustand unerlässlich, nehmen aber im Übermaß an pathologischen Prozessen teil [1]. Aerobe Organismen haben Abwehrmechanismen, um ROS-induzierte oxidative Schäden zu verhindernAntioxidansEnzyme und/oder nicht-enzymatische Mechanismen, einschließlich endogen produzierter Antioxidantien oder die Aufnahme von Antioxidantien in der Nahrung [2].
Das Ungleichgewicht, wenn die Konzentration der reaktiven Spezies höher ist als dieAntioxidansAbwehrkräfte des Organismus, heißtoxidativen Stress(OS) [3]. Die Folgen von OS umfassen die Rekrutierung von Makrophagen; die Hemmung der normalen Funktion von Lipiden und Proteinen; und Mitochondrien-, Membran- und DNA-Schäden [4–7]. Diese Veränderungen wurden unter anderem mit verschiedenen Pathologien wie Krebs, Alterung, Diabetes, rheumatoider Arthritis sowie kardiovaskulären und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht [8–11].

Mehrere Studien haben herausgefunden, dass ein Organismus die Aufnahme von Antioxidantien über die Nahrung benötigt, um oxidative Schäden zu reduzieren [12] in physiopathologischen Situationen (aufgrund von UV-Exposition, Rauchen, verschmutzter Luft usw.), die überschüssige ROS produzieren. Verschiedene Antioxidantien werden über die Nahrung aufgenommen, wie z. B. Phenolverbindungen, Vitamine, Carotinoide undFlavonoide. Der Begriff "Phenolverbindungen" bezieht sich auf jede Substanz mit einer Phenolgruppe, die an aromatische oder aliphatische Strukturen gebunden ist. Phenolische Verbindungen stammen aus Pflanzen und gehören zu den wichtigsten Sekundärmetaboliten; Ihre Anwesenheit im Tierreich ist auf ihren Verzehr durch die Nahrung zurückzuführen. Unter diesen Verbindungen sindFlavonoidesind die am besten untersuchten und am häufigsten vorkommenden; ihre chemischen Strukturen enthalten aFlavonoidKern, der aus 15 Kohlenstoffatomen besteht, die in drei Ringen (C6–C3–C6) angeordnet sind [13]. Ihre antioxidativen Mechanismen umfassen die Hemmung von Enzymen oder die Chelatbildung von Spurenelementen, die an der Produktion freier Radikale, der Aufnahme von ROS und dem Schutz der endogenen antioxidativen Abwehr beteiligt sind [14]. Der MittelwertFlavonoidDie Aufnahme wird auf 23 mg/Tag geschätzt [15,16], und die Hauptquellen sind schwarzer Tee, Rotwein, Zwiebeln, Äpfel und Bier [17,18].

Eine weitere Gruppe von Verbindungen, die wegen ihrer antioxidativen Wirkung untersucht wurden, sind die Carotinoide. Sie sind Pigmente, deren Strukturen eine Reihe konjugierter C=C-Bindungen (Polyene) umfassen, die es ihnen ermöglichen, mit freien Radikalen zu interagieren; daher können sie als wirksame Antioxidantien wirken [19]. Carotinoide sind in natürlichen Systemen weit verbreitet, und ihre Rolle bei der Vorbeugung verschiedener Krankheiten wurde untersucht, hauptsächlich für die in der Nahrung vorhandenen Verbindungen wie -Carotin, Lutein und Lycopin [18,20,21].

Rollen identifizierenAntioxidantienbei Krankheiten und Störungen, die mit oxidativen Prozessen einhergehen, ist für die Analyse von Schutzwirkungen in vivo unerlässlich. Aus diesem Grund hat unser Labor ein Zebrafisch (ZF)-Embryonenmodell zur Bewertung der Schutzwirkung dieser entwickeltAntioxidansVerbindungen [22].Oxidativen Stresswird mit tert-Butylhydroperoxid (tBOOH) induziert. tBOOH erzeugt Butoxylradikale durch die Fenton-Reaktion [23]. Die gebildeten Radikale begünstigen den intrazellulären Abbau von Thiolgruppen und Glutathionreserven, was zu einer signifikanten Erhöhung der Letalität und Dysmorphogenese in exponierten Zebrafischembryos führt. Dieses Modell ermöglicht einen Vergleich zwischen den Konzentrations-Wirkungs-Kurven der Letalität und Dysmorphogenese für Zebrafischembryos, die tBOOH ausgesetzt waren, und den Kurven von Embryonen, die mit Antioxidantien vorbehandelt wurden; statistische Analysen können durchgeführt werden, um die Schutzwirkung der analysierten Antioxidansverbindung zu untersuchen.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die in vivo-Schutzwirkung von Lebensmittelverbindungen mit antioxidativer Aktivität gegen die durch Oxidationsmittel induzierte Entwicklungstoxizität in Zebrafischembryos zu bewerten.

2. Ergebnisse

2.1. Konzentrationseffektkurven für tBOOH in Zebrafischembryos

Unsere Forschungsgruppe hat zuvor einen ZF-Embryo entwickelt und validiertoxidativen StressModell, mit dem die Schutzwirkung von bewertet werden kannAntioxidansSubstanzen (22).

Zebrafischembryos werden Tertbutylhydroperoxid (tBOOH) ausgesetzt, um Letalitäts- und Dysmorphogenesekurven zu erhalten. Die Zebrafischembryos werden tBOOH 24 bis 48 h nach der Befruchtung (hpf) in verschiedenen Konzentrationen ausgesetzt, die von 1 bis 3,5 mM reichen (Abbildung 1). Die letale Konzentration 50 (LC50) wurde mit 2,1 mM festgestellt, während die effektive Konzentration 50 für die Dysmorphogenese (EC50) 1,7 mM betrug. Die oben erwähnten Kurven wurden verwendet, um Zebrafischembryos zu vergleichen, die zuvor antioxidativen Verbindungen ausgesetzt waren oder nicht, und danach tBOOH ausgesetzt wurden.

2.2. Identifizierung der Schutzwirkung von Antioxidantien in Zebrafischembryos

Das zuvor beschriebene Zebrafischmodell wurde verwendet, um die schützende Wirkung von sechs Polyphenolen und drei Carotinoiden in Lebensmitteln zu bewerten.

Von den sechs Polyphenolen waren dreiFlavonoide: Naringenin (20 uM), Apigenin (10 uM) und Rutin (10 uM). Die DreiFlavonoideerzeugte eine signifikante Drift in den Konzentrations-Antwort-Kurven für die Letalität. Darüber hinaus zeigten Apigenin und Rutin Schutzwirkungen gegen Dysmorphogenese, während Naringenin keine Schutzwirkung gegen Dysmorphogenese zeigte (Abbildung 2).

Oleuropein (15 μM), Chlorogensäure (20 μM) und Curcumin (15 μM) wurden ebenfalls analysiert. Diese Polyphenole führten zu einer signifikanten Drift in den Konzentrations-Wirkungs-Kurven für die Letalität. Lediglich Curcumin zeigte eine Schutzwirkung gegen Dysmorphogenese (Abbildung 3).

Außerdem wurden die Carotinoide Lycopin (20 μM), Astaxanthin (20 μM) und -Carotin (25 μM) bewertet. Lycopin und Astaxanthin führten zu einer signifikanten Drift in den Konzentrations-Wirkungs-Kurven für die Letalität. Im Gegensatz dazu zeigte keines der Carotinoide eine Schutzwirkung gegen Dysmorphogenese (Abbildung 4). Darüber hinaus führte -Carotin zu einer Linksdrift der Kurven für Letalität und Dysmorphogenese, was auf eine mögliche prooxidative Wirkung hindeuten könnte.

3. Diskussion

Sauerstoff ist für das menschliche Leben unerlässlich; Gleichzeitig produziert es jedoch toxische Substanzen wie freie Radikale und reaktive Sauerstoffspezies (ROS); diese Substanzen sind oxidierend, instabil und reaktiv. Darüber hinaus können sie mit jedem Makromolekül reagieren und Zellschäden verursachen [24]. Um diesen oxidierenden Substanzen entgegenzuwirken, verwendet der Körper antioxidative Enzyme wie Superoxiddismutase und Glutathionperoxidase sowie antioxidative Verbindungen, die aus der Nahrung stammen. Daher hat die Untersuchung der antioxidativen Kapazität von Verbindungen in den letzten Jahren Interesse geweckt. Es gibt mehrere In-vitro-Techniken zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität, obwohl sie aus ernährungsphysiologischer Sicht Einschränkungen aufweisen, da keine eine physiologische Situation reproduziert [25]. Aus diesem Grund würde eine Methode, die In-vivo-Techniken umfasst, zu wirkungsvolleren Ergebnissen führen, da oxidativer Stress Mechanismen impliziert, die von vielen Systembedingungen abhängen, insbesondere von den kinetischen Teilen von Reaktionen. Unser Team verwendete ein ZF-Embryomodell [22], das eine wertvolle In-vivo-Methode sein könnte, um die schützende Wirkung von neun antioxidativen Verbindungen zu testen, die umfassend in vitro untersucht wurden. Wir haben sechs Phenolverbindungen und drei Carotinoide bewertet. Phenolverbindungen leisten einen wichtigen Beitrag zum antioxidativen Potential der menschlichen Ernährung; Von diesen Verbindungen sind Flavonoide die am besten untersuchten und am häufigsten vorkommenden. Die antioxidative Aktivität der Flavonoide Apigenin, Rutin und Naringenin wurde untersucht. Diese Flavonoide sind bioaktive Verbindungen, die hauptsächlich in verschiedenen Früchten, Pflanzen und Gemüsen, Nüssen und Zwiebeln vorkommen. In-vitro-Studien haben gezeigt, dass diese Flavonoide wirksam Hydroxylradikale, Superoxid, Wasserstoffperoxid, Stickoxidradikale, DPPH und Lipidperoxidation neutralisieren [26–29]. Chen et al. führten 2012 [30] eine QSAR-Analyse unter Verwendung eines Zebrafischlarvenmodells durch, um die ROS-Abfangkapazitäten von fünfzehn Flavonoiden, einschließlich Rutin, gegen UV-induzierte Phototoxizität zu bewerten. In Übereinstimmung mit früheren Studien schlossen sie die Bedeutung der beiden Hydroxylgruppen und ihrer Positionen, wobei mindestens zwei Hydroxylgruppen für eine starke biologische Aktivität notwendig sind [30,31]. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Hydroxylgruppen an den Positionen C3, C5 und C7 eine bessere Flavonstabilität und -aktivität verleihen [31]. Unsere Ergebnisse zeigten eine Schutzwirkung gegen tBOOH-induzierte Letalität für die drei Flavonoide. Apigenin und Rutin zeigten auch Schutzwirkungen gegen Dysmorphogenese; Naringenin zeigte jedoch keine Wirkung gegen Dysmorphogenese.

Neben den Flavonoiden wurden auch die antioxidativen Wirkungen von Oleuropein, Chlorogensäure und Curcumin bewertet. In-vitro- und in-vivo-Studien haben gezeigt, dass diese

drei phenolische Verbindungen haben wichtige antioxidative Wirkungen [32–34]. Oleuropein ist ein Biophenol, das in Olivenblättern, nativem Olivenöl extra und einigen Arten der Oleaceae-Familie vorkommt [32]. Chlorogensäuren (CGAs) sind Ester, die zwischen Kaffee- und Chinasäuren gebildet werden und eine Gruppe von Polyphenolen darstellen, die in der menschlichen Ernährung vorkommen [35]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass das Trinken von CGA-haltigen Getränken wie Kaffee, Tee, Wein und verschiedenen Fruchtsäften das Risiko für die Entwicklung verschiedener chronischer Krankheiten verringert [36–38]. Einer der Gründe für diese Reduktion ist die antioxidative Kapazität der CGAs, die Wasserstoffatome spenden, um freie Radikale zu reduzieren und Oxidationsreaktionen zu hemmen [35]. Curcumin ist ein Polyphenol, das zum Färben und Würzen von Lebensmitteln verwendet wird. Seine antioxidative Aktivität wurde in den letzten Jahren untersucht, und eine Studie legt nahe, dass es Biomembranen vor peroxidativen Schäden schützen kann [39]. Unter Verwendung des ZF-Embryomodells wurde beobachtet, dass eine Vorbehandlung mit Oleuropein, Chlorogensäure oder Curcumin die Mortalität-induzierende Wirkung von tBOOH-induziertem oxidativem Stress reduzierte; Eine signifikante Schutzwirkung gegen Dysmorphogenese wurde jedoch nur für Curcumin beobachtet.

Eine weitere Gruppe mit antioxidativen Eigenschaften sind die Carotinoide, eine allgegenwärtige Gruppe von Isoprenoid-Pigmenten. Sie sind Quencher von Singulett-Sauerstoff und Scavenger von ROS [40]. Die molekularen Mechanismen, die der anti- und prooxidativen Aktivität von Carotinoiden zugrunde liegen, sind noch nicht vollständig verstanden. Zu den am besten untersuchten Carotinoiden gehören Lycopin und -Carotin. Diese sind reichlich in Tomaten, Tomatensauce, verschiedenen Früchten, Algen und Gemüse zu finden [18,41]. Bei der Bewertung der Schutzwirkung dieser Carotine wurde festgestellt, dass Lycopin eine antioxidative Aktivität mit einer schützenden Wirkung gegen embryonale Letalität aufweist; es wurde jedoch keine Wirkung gegen Dysmorphogenese gefunden. Andererseits erhöhte -Carotin das Auftreten von Letalität und Dysmorphogenese in den ZF-Embryonen im Vergleich zur Wirkung des Oxidationsmittels allein; dies steht im Einklang mit Studien, die gezeigt haben, dass hohe Dosen von -Carotin antioxidative Wirkungen haben, denen bei hoher Sauerstoffspannung eine prooxidative Wirkung folgt, die mit seinen nachteiligen Wirkungen zusammenhängen kann [42]. Darüber hinaus zeigte eine Studie, dass eine -Carotin-Supplementierung im Vergleich zu einem Placebo keine schützende Wirkung auf die Gesamtsterblichkeit diabetischer männlicher Raucher hatte [43]. Ein weiteres bewertetes Carotinoid war Astaxanthin; es ist ein Xanthophyll-Carotinoid, das in Algen, Hefe, Lachs, Forelle, Krill, Garnelen und Flusskrebsen vorkommt. Es ist ein rotes, fettlösliches Antioxidanspigment, das keine Pro-Vitamin-A-Aktivität hat [44]. In unserer Studie zeigte Astaxanthin eine schützende Wirkung gegen Letalität, aber es wurde keine Wirkung gegen Dysmorphogenese gefunden.

Zusammenfassend zeigten acht der neun untersuchten Moleküle eine antioxidative Aktivität mit schützender Wirkung gegen ZF-Embryonalsterblichkeit. Nur Apigenin (10 µM), Rutin (10 µM) und Curcumin (15 µM) zeigten zusätzlich schützende Wirkungen gegen Dysmorphogenese durch tBOOH-induzierten oxidativen Stress. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass -Carotin den gegenteiligen Effekt hatte und die Mortalitäts- und Dysmorphogeneserate erhöhte, da es die LC50- und EC50-Werte senkte. Das Gleichgewicht und der Zeitpunkt der oxidativen und antioxidativen Kräfte sind der Schlüssel zur richtigen Regulierung und zum richtigen Zeitpunkt der Embryonalentwicklung [45]. Unterschiede in der Kinetik oder dem Wirkungsmechanismus dieser Antioxidantien könnten der Hauptgrund für die unterschiedlichen Schutzkapazitäten gegen Dysmorphogenese sein. Weitere Studien sind erforderlich, um zu untersuchen, warum nur einige Verbindungen eine schützende Wirkung auf die Morphogenese während der Embryonalentwicklung zeigten. Diese Studie versuchte, zwischen embryotoxischer Wirkung (Lethalität) und dysmorphogenetischer Wirkung (Teratogenität) zu unterscheiden. In einigen Fällen gehen Fehlbildungen wahrscheinlich voraus und führen zum Tod. In anderen Fällen können Letalität und Missbildung auf unterschiedliche Ursachen zurückzuführen sein. Die Unabhängigkeit dieser beiden Manifestationen würde vermutet werden, wenn eine Verbindung die Trennung zwischen der letalen und der dysmorphogenetischen Konzentrations-Antwort-Kurve vergrößert. Alle in unserer Studie getesteten antioxidativen Verbindungen erhöhten die teratogene Wirkung gegenüber der tödlichen Dosis nicht um mehr als das Doppelte; daher wurde für keine antioxidative Verbindung ein erhöhtes teratogenes Potenzial beobachtet [46].

Insgesamt weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass dieses ZF-Embryomodell ein wertvolles Werkzeug ist, um die schützende Wirkung der antioxidativen Moleküle, aus denen Lebensmittel bestehen, zu analysieren. Um die chemisch-strukturellen Gründe zu ermitteln, aus denen Apigenin, Rutin und Curcumin in unserer Studie die höchsten Schutzwirkungen zeigten, sind weitere Analysen erforderlich; beispielsweise zur Bestimmung quantitativer Struktur-Wirkungs-Beziehungen (QSARs).

4. Materialien und Methoden

4.1. Ethische Erklärung

Die Verfahren mit Zebrafischlarven und -embryonen wurden von der Tierethikkommission der Universität Barcelona genehmigt, Genehmigungsnummer oder Protokoll 7971 des Ministeriums für Viehzucht und Fischerei der Regierung von Katalonien (Procedure DAAM 7971).

4.2. Chemikalien und Lösung

Vorbereitung Tert-Butylhydroperoxid (tBOOH, CAS-Nummer: 75-91-2) und die Antioxidansverbindungen wurden von TCI Europe erworben. tBOOH wurde in 0,3X Danieau-Puffer (17,4 mM NaCl; 0,23 mM KCl; 0,12 mM MgSO4·7 H2O; 0,18 mM Ca) gelöst (NO3)2; 1,5 mM HEPES(N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N0 -(2-ethansulfonsäure); pH 7,4).

Naringenin (20 µM) (CAS-Nummer: 67604-48-2), Oleuropein (15 µM) (CAS-Nummer: 32619-42-4), Rutin (10 µM) (CAS-Nummer : 207671-50-9), Chlorogensäure (20 µM) (CAS-Nummer: 327-97-9), Apigenin (10 µM) (CAS-Nummer: 520-36-5), Curcumin (15 µM) (CAS-Nummer: 458-37-7), Lycopin (20 µM) (CAS-Nummer: 502-65-8), Astaxanthin (20 µM) (CAS-Nummer: 472-61-7) und -Carotin (25 µM) (CAS-Nummer: 7235-40-7) wurden von Sigmar-Aldrich® erworben. Antioxidantien wurden in 100 Prozent Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma Aldrich, Madrid, Spanien) gelöst und anschließend in 0,3 × Danieau-Puffer auf eine endgültige DMSO-Konzentration von 0,05 Prozent (v/v) verdünnt. Antioxidantien wurden in unterschiedlichen Konzentrationen verwendet, abhängig von der höchsten Konzentration, bei der keine Auswirkung auf die Letalität oder die Embryonalentwicklung beobachtet wurde (maximal tolerierbare Konzentration, MTC)

4.3. Zebrafischpflege und Eierproduktion

Erwachsene Wildtyp-Zebrafische wurden unter standardisierten Bedingungen gehalten. Die Embryonen wurden gesammelt, gereinigt und nach ihrer Lebensfähigkeit selektiert. Die befruchteten Embryonen wurden mit Wasser behandelt, das gemäß den Standards der International Organization for Standardization (ISO) 7346-1 und 7346-2 (ISO, 1998; 2 mM CaCl2·2H2O, 0,5 mM MgSO4) standardisiert war ·7H2O, 0,75 mM NaHCO3 und 0,07 mM KCl). Befruchtete Eier wurden gemäß früheren Studien von Kimmel et al., 1995 [47], inszeniert und für die anschließende Exposition unter einem sezierenden Stereomikroskop (Motic SMZ168, Motic China Group, LTD., Luwan, Shanghai, China) ausgewählt. Die Fischembryos wurden in Glasfläschchen bei einer kontrollierten Temperatur von 27 ± 1 °C gehalten.

4.4. Exposition von Zebrafischembryos gegenüber oxidativem Stress (Tert-Butylhydroperoxid)

Für die Erstellung der tBOOH-Kurve wurde die Methodik von Boix, 2020, befolgt. Diese Methodik basiert auf dem Erhalt einer Konzentrations-Letalitäts-Reaktionskurve (LC50) und einer Dysmorphogenese (EC50), indem die ZF-Embryonen einem oxidativen Stressinduktor, Tertbutylhydroperoxid (tBOOH), ausgesetzt werden. Sobald Zebrafischembryos erhalten sind, werden sie in 0,3X Danieau-Medium von 0 bis 24 hpf gehalten. Von 24 bis 48 hpf werden die Embryonen tBOOH-Lösungen in verschiedenen Konzentrationen von 1, 1,5, 2, 2,5, 3 und 3,5 mM ausgesetzt. Es wurden Embryonen aus 3 verschiedenen Kupplungen von Zebrafischen in dreifacher Ausfertigung verwendet (Abbildung 5A).

4.5. Bestimmung der Schutzwirkung von Antioxidansverbindungen

Um festzustellen, ob eine Verbindung eine schützende Wirkung gegen oxidativen Stress hat, wurden Zebrafischembryos zuerst der antioxidativen Verbindung von 0 bis 24 hpf ausgesetzt. Die Konzentrationen wurden in Abhängigkeit von den maximal tolerierbaren Konzentrationstests berechnet. Dann wurden die Embryonen von 24 bis 48 hpf dem Stressauslöser tBOOH ausgesetzt. Anschließend wurde jede Gruppe von Embryonen bei jeder der Konzentrationen von tBOOH (Abbildung 5B) bewertet. Um festzustellen, ob es einen signifikanten Unterschied gab, wurden die Kurve für die Exposition gegenüber tBOOH allein und die Kurve für die Vorexposition gegenüber der Antioxidansverbindung verglichen.

Zehn befruchtete Eier wurden 2,5 ml für jede Substanz und Konzentration ausgesetzt. Es wurden drei unabhängige Replikationen durchgeführt, wobei Eier von verschiedenen Laichereignissen verwendet wurden. Die ZF-Embryonen wurden den Antioxidansverbindungen 24 h lang vorexponiert, dann wurde die Antioxidanslösung entfernt, es wurde mit Danieau-Medium gewaschen und die ZF-Embryonen wurden unterschiedlichen tBOOH-Konzentrationen ausgesetzt. Die Letalität wurde nach 48 h bewertet, und der Mittelwert toter Embryonen wurde nach den entsprechenden Assays berechnet. Für die Bewertung der Dysmorphogenese folgten wir dem von Teixido et al. [48], um die Dysmorphogenese der Embryonen bei etwa 48 hpf zu berechnen. Wir wählten neun morphologische Merkmale aus, die in Tabelle 2 beschrieben sind. Die Häufigkeit abnormaler Embryonen wurde für jede Konzentration und behandelte Gruppe berechnet (definiert als Embryonen mit einer Punktzahl von 1 in jedem morphologischen Merkmal).

Eine Verschiebung der Konzentrations-Antwort-Kurve nach rechts aufgrund einer Vorexposition gegenüber den Antioxidantien weist auf eine schützende Wirkung gegen den oxidativen Stressinduktor hin, da eine höhere Konzentration des Induktors erforderlich ist, um die gleichen Ergebnisse zu erzielen wie bei einer Exposition gegenüber tBOOH allein. Aufgrund der Vorbelastung durch Antioxidantien impliziert eine Verschiebung der Konzentrations-Wirkungs-Kurve nach links eine Erhöhung des oxidativen Stresses.

4.6.Statistische Analyse

Die Konzentrations-Antwort-Kurven für Mortalität und Dysmorphogenese wurden berechnet und unter Verwendung von GraphPad 7.02 Software Inc. ausgewertet. Der Extra-Quadratsummen-F-Test wurde verwendet, um die Anpassung der Parameter jeder Datengruppe der Kurve zu vergleichen. Das Konfidenzintervall wurde auf 95 Prozent angepasst.

5. Schlussfolgerungen

In dieser Studie wurden Zebrafischembryos als Modellorganismus verwendet, um die Schutzkapazität von sechs Phenolverbindungen und drei Carotinoiden zu testen, die häufig in Lebensmitteln vorkommen. Alle Verbindungen, mit Ausnahme von -Carotin, zeigten Schutzwirkungen gegen durch oxidativen Stress induzierte Letalität. Darüber hinaus zeigten auch Apigenin, Rutin und Curcumin Schutzwirkungen gegen tBOOH-induzierte Dysmorphogenese. Wir schlagen vor, dass ein Zebrafisch-Embryo-Test, wie er hier vorgestellt wird, angewendet werden könnte, um die in-vivo-Schutzwirkung von neuartigen bioaktiven Lebensmittelkomponenten mit potenzieller antioxidativer Kapazität zu bewerten.

Cristina Arteaga 1,20, Nuria Boix13,Elisabet Teixido 13⑤,Fernanda Marizande 2,Santiago Cadena4 und Alberto Bustillos 5,*

1 Abteilung für Toxikologie, Abteilung für Pharmakologie, Toxikologie und therapeutische Chemie, Fakultät für Pharmazie,

Universität Barcelona, ​​Avda Joan XXIIs/n,08028Barcelona, ​​Spanien;

2 Fakultät für Gesundheitswissenschaften, Ernährung und Diätetik, Technische Universität Ambato, Ambato 180207, Ecuador;

3 INSA-UB Nutrition and FoodSafety Research Institute, Food and Nutrition Torribera Campus,

Die Universität Barcelona, ​​Prat de la Riba 171, 08921 Santa Coloma de Gramenet, Spanien

4 Fakultät für Angewandte Wissenschaften, International SEK University, Quito 170134, Ecuador;

5Fakultät für Gesundheitswissenschaften, Medizin, Technische Universität Ambato, Ambato 180207

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