Theaflavin-regulierte Imd-Kondensate kontrollieren die intestinale Homöostase und das Altern von Drosophila Teil 2

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Hintergrund:Fibrose ist eines der häufigsten pathologischen Merkmale des Alterungsprozesses der Niere, und Fibrose in alternden Nieren verschlimmert auch den Prozess der chronischen Nierenerkrankung (CKD). Corallodiscus flabellata BL Burtt (C. flabellata, CF) ist eine häufig verwendete botanische Droge in der chinesischen Folklore. Allerdings haben nur wenige Studien über seine pharmakologischen Wirkungen berichtet. Diese Studie zielte darauf ab, die Wirkung von CF-Ethanolextrakt auf die Nierenfibrose bei SAMP8-Mäusen zu untersuchen und potenziell aktive Verbindungen zu identifizieren.

Methoden:Senescence-accelerated mouse-prone 8 (SAMP8) wurden als Tiermodelle verwendet, und unterschiedliche CF-Dosen wurden einen Monat lang per Schlundsonde verabreicht. Es sollte der Grad der Nierenalterung bei Mäusen unter Verwendung von -Galactosidase-Färbung beobachtet werden. Die Masson-Färbung und die Expressionsniveaus von Col-1I, a-SMA und FN wurden verwendet, um die Nierenfibrose bei Mäusen zu bewerten. Die Proteinexpressionsniveaus des Nrf2-Signalwegs und des Wnt/-catenin/RAS-Signalwegs in der Niere wurden gemessen. Und -galactosidase ( -gal) induzierte NRK-52E-Zellen als In-vitro-Modell zum Screening der aktiven Komponenten von CF.

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Ergebnisse:Der CF-Ethanolextrakt hemmte signifikant die Aktivität von renaler Galactosidase und die Expressionsniveaus von Coll-, a-SMA- und FNin-SAMP8-Mäusen und verbesserte die Masson-Färbung in SAMP8-Mäusen. CF reduzierte die Protein-, Kreatinin-, Harnstoff-Stickstoff- und Serumspiegel von TNF-a und IL-1 im Urin bei SAMP8-Mäusen bemerkenswert und erhöhte die SOD- und GSH-Px-Spiegel signifikant. Darüber hinaus aktivierte CF den Nrf2-Weg und blockierte den Wnt/-catenin/RAS-Weg in den Nieren von Mäusen. Außerdem3,4-Dihydroxyphenylethanol (SDC-0-14,16) und (3,4-Dihydroxyphenylethanol-8-O-[4-O-trans -Caffeoyl- -D-Apiofuranosy-(1→3)- -D-Glucopyranosyl (1→6)]- -D-Glucopyranosid (SDC-1-8) wurden aus CF isoliert , die die Alterung von NRK-52-E-Zellen reduzierten, und vielleicht spielen die Wirkstoffe von CF die Anti-Aging-Rolle.

Schlussfolgerungen:Unsere Experimente zeigten, dass CF-Ethanolextrakt die Nierenfibrose bei SAMP8-Mäusen über den Wnt/-catenin/RAS-Signalweg lindern kann. Und SDC-0-14,16 und SDC-1-8 können die materielle Grundlage dafür sein, dass CF antirenale Seneszenz-bezogene Wirkungen ausübt.

Schlüsselwörter:Alterung, Corallodiscus flabellata, Niere, Nierenfibrose, SAMP8, Seneszenz, Wnt/-catenin/RAS

Einführung

Die weltweite Prävalenz der chronischen Nierenerkrankung (CKD) nimmt mit der Alterung der Bevölkerung zu und stellt eine erhebliche Belastung für die Gesellschaft dar [1-3]. Die häufigste pathologische Manifestation von CKD ist eine Form von Nierenfibrose[4]. Ebenso ist die Nierenfibrose eines der Zeichen der Nierenalterung [2]. Studien haben gezeigt, dass oxidativer Stress, Entzündungen, Wnt/-catenin, Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAS) und Rapamycin (mTOR)-Signale alle mit der durch Alterung induzierten CKD zusammenhängen [5]. Nierenfibrose in alternden Nieren steht in engem Zusammenhang mit der Aktivierung von Wnt/-catenin und dem RAS-Signalweg [6]. Bei der Aktivierung von Wnts wird -Catenin aus dem Zytoplasma in den Zellkern verlagert, wo es an den lymphoiden Enhancer-Bindungsfaktor (LEF)/die T-Zellfaktor(TCF)-Transkriptionsfaktorfamilie bindet und die Transkription nachgeschalteter Zielgene initiiert. Interessanterweise enthält die Promotorregion des RAS-Gens auch LEF/TCF-Bindungsstellen, wodurch -catenin die Bindung von LEF-1 an diese Stellen fördern kann[7].Cistanche-Cholesterin,Daher könnte die Ausrichtung auf den Wnt/-catenin/RAS-Signalweg eine potenzielle therapeutische Strategie für Nierenfibrose sein [8,9]. In den letzten Jahren hat die Ersatztherapie der Nierenfibrose mit Naturprodukten die Aufmerksamkeit vieler Wissenschaftler auf sich gezogen [10]. . Xiaoyan Shen et al. fanden heraus, dass Ginsenosid Rgl die glomeruläre Fibrose während der Nierenalterung verbesserte, indem es die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms bei SAMP8-Mäusen hemmte [11]. Diese Studie untersuchte die Wirkung von C.-Flabellat(CF)-Extrakt auf Nierenfibrose bei SAMP8-Mäusen aus dem Wnt/-catenin/RAS-Signalweg.

Cistanche kann Anti-Aging

CF als Heilpflanze in China wurde erstmals im "Dian Nan Ben Cao" aufgezeichnet. Die ganze Pflanze wird üblicherweise zur Behandlung von Ruhr, vorzeitiger Ejakulation, Samenbläschenerkrankung und Nierenerkrankung in Gebieten mit ethnischen Minderheiten in China verwendet [12]. Derzeit , gibt es in der modernen Forschung nur wenige Berichte über CF. Die pharmakologischen Studien in unserem Labor ergaben, dass CF-Extrakt diuretische Wirkungen hatte und das durch Lipopolysaccharid/D-Galactosamin induzierte Leberversagen und Hirnschäden bei Ratten verbesserte [13, 14]. es zeigte sich, dass Phenylethanoidglykoside und Flavonoide die chemischen Hauptbestandteile von CF waren [15,16] Das Ziel dieser Studie war es, die Wirkung von CF-Extrakt auf die Nierenfibrose bei SAMP8-Mäusen zu untersuchen und seinen möglichen Mechanismus aufzuklären, um so bereitzustellen experimentelle Beweise für die Behandlung von Nierenerkrankungen mit CF, die in alten Büchern beschrieben werden.

Materialen und Methoden

Sammlung und Extraktion des Pflanzenmaterials

„Yunnan Chinese Herbal Medicine“ berichtet, dass CF das ganze Jahr über geerntet werden kann. Die in diesem Experiment verwendeten CF-Pflanzen wurden im September im Landkreis Xixia, Provinz Henan, China, geerntet. Es wurde von Professor Suiqing Chen von der Henan University of Chinese Medicine identifiziert und die Proben wurden in der Laborprobenbibliothek aufbewahrt.Cistanche Deserticola NebenwirkungenDie Pflanzen (1 kg) wurden mit 50-prozentigem Ethanol (3 × 12 l, jeweils 1 h) unter Rückfluss erhitzt und die Mischung mit 16 Lagen Gaze filtriert. Die vereinigten Filtrate wurden durch Rotationsverdampfung unter Verwendung eines Gefriertrockners getrocknet. Schließlich betrug die prozentuale Ausbeute an 50-prozentigem Ethanol-Rohextrakt von CF 15,5 Prozent. Der getrocknete Extrakt wurde bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank aufbewahrt. Die ergänzenden Materialien listen die relevanten Daten zur Inhaltsstoffbezeichnung von CF-Extrakt auf.

Ein anderer zuvor beschriebener Trennprozess wurde in dieser Studie verwendet, um die Wasser-Elutionsfraktion, die 20-prozentige Ethanol-Elutionsfraktion, die 30-prozentige Ethanol-Elutionsfraktion und die 40-prozentige Ethanol-Elutionsfraktion von CF zu erhalten [13]. Die 40-prozentige Ethanolfraktion wurde unter Verwendung von Sephadex LH-20 und einer Kieselgelsäule getrennt und durch semipräparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt, um schließlich Verbindungen wie SDC-0-14,16, SDC{ {10}}, SDC-0-60(p-Hydroxybenzylalkohol).

Tiere und Verwaltung

In dieser Studie wurden sechs Monate alte männliche SAMP8-Mäuse und seneszenzbeschleunigte mausresistente 1(SAMR1)-Mäuse vom First Affiliated Hospital der Tianjin University of Traditional Chinese Medicine (Tianjin, China) verwendet. Die Tiere wurden unter kontrollierten Licht- (12- h Hell/Dunkel-Zyklus), Temperatur- (23-25 Grad C) und Feuchtigkeits- (45-55 Prozent) Bedingungen gehalten und erhielten eine Standarddiät und Wasserzufuhr libitum. Insgesamt 48 SAMP8-Mäuse wurden in vier experimentelle Gruppen eingeteilt (n=12/Gruppe): SAMP8-Modellmäuse (M), mit niedrig dosiertem CF-Ethanolextrakt behandelte SAMP8-Mäuse (CF-L, 387,5 mg/kg, intragastral), mit mitteldosiertem CF-Ethanolextrakt behandelte SAMP8-Mäuse (CF-M, 775 mg/kg, intragastrisch) und mit hochdosiertem CF-Ethanolextrakt behandelte SAMP8-Mäuse (CF-H, 155 0 mg/ kg, intragastrisch). Die Mäuse in den SAMRI-Kontroll- (Con, n=10) und SAMP8-Modellgruppen (M) wurden mit physiologischer Kochsalzlösung (0,9 Prozent) behandelt. Alle Mäuse wurden 1 Monat lang oral behandelt. Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission der Henan University of Chinese Medicine genehmigt und gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt (Henan, China Zulassungsnummer: HACTCM-2018009060-19). Während des Experiments gab es einen Maustod in jeder der Con- und M-Gruppen, und zwei Mäuse starben in der CF-H-Gruppe.

Beispielsammlung

Am Ende des Experiments wurden die Mäuse einzeln in Stoffwechselkäfigen gehalten, um 12- Stunden Urin zu sammeln. Die Mäuse wurden dann mit Isofluran anästhesiert und Blutproben wurden durch retroorbitale Blutung gesammelt. Die Nieren jeder Maus wurden dann chirurgisch entfernt und bis zu den Analysen bei 80 Grad gehalten.

Zellkultur und In-vitro-Studie

NRK-52E-Zellen, erworben von der Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China), wurden kultiviert, um die Wirkung von CF-Extrakt auf die durch D-Galactose verursachte Zellalterung zu untersuchen (D-gal, S11050, Yuanye, Shanghai, China). Die NRK-52E-Zellen wurden in Dulbecco's Modifikation von Eagle's Medium Dulbecco (DMEM, 12.100.046, Thermo Fisher, Massachusetts, USA) gezüchtet, das mit 10 Prozent fötalem Rinderserum in einem Inkubator bei 37 Grad C und in Gegenwart von 5 versorgt wurde Prozent , CO.Zellen wurden in 96-Well-Platten oder 6-Well-Platten bis zu 80-85 Prozent Konfluenz gezüchtet und dann mit Wachstumsmedien behandelt, die verschiedene Arzneimittelkombinationen enthielten: Medien plus D-Gal ( 20 mg/mL）, Medium plus D-gal plus CF (10, 25,50, 100 ug/mL) oder Medium plus D-gal plus monomere Verbindung (10 μM) jeweils für 48 h. Anschließend wurde das Methylthiazolyltetrazolium( MTT)-Assay wurde verwendet, um die Zelllebensfähigkeit nachzuweisen, und -Galactosidase-Färbung wurde verwendet, um die Zellalterung zu beobachten.

Seneszenz-assoziierte Galactosidase-Färbung

Gefrorene Nieren von Mäusen, die in 10- μm dicke Schnitte geschnitten wurden, und NRK-52-E-Zellen wurden mit Seneszenz-assoziierter -Galactosidase (SA- -gal, C0602, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) gefärbt. nach den Protokollen des Herstellers.

Histologische Analyse

Die Nierenschnitte wurden mit 4 % gepuffertem Paraformaldehyd fixiert, und 10- μm dicke, in Paraffin eingebettete Schnitte wurden mit Masson-Trichrom (G1006, Service, Wuhan, China) gefärbt und mikroskopisch betrachtet. Die blau gefärbten Bereiche in den Trichrom-gefärbten Schnitten von Masson wurden quantitativ aus sechs zufällig ausgewählten Feldern gemessen und mit der Software Image-Pro Plus 6.0 analysiert.

Biochemische Messungen

Die Serum- und Nierenhomogenatproben wurden auf Raumtemperatur aufgetaut und die Gehalte an Superoxiddismutase (SOD, CSB-E08556m, Wuhan Huamei, Wuhan, China), Glutathionperoxidase (GSH-Px, A005-1-2, Nanjing Jiancheng, Nanjing, China), Interleukin-1 (IL-1 , RK00006, ABclonal, Wuhan, China), Tumornekrosefaktor- (TNF- , RK00027, ABclonal, Wuhan, China), Harnstoffstickstoff (C{ {10}}, Nanjing Jiancheng, Nanjing, China), Kreatinin (Cr, C011-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing, China) im Mausserum, Gesamtprotein im Urin (C035-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing , China) im Mausurin und die Expressionsspiegel von Kollagen Typ I (Col-I, MU30364, Bio-Swamp, Wuhan, China), -Glattmuskelaktin (-SMA, MU30359, Bio-Swamp, Wuhan, China), Fibronektin (FN, MU30179, Bio-Swamp, Wuhan, China) in Maus-Nierengeweben wurden sequentiell gemäß dem Protokoll des Assay-Kit-Herstellers gemessen.

Immunhistochemische Analyse

Die immunhistochemische Analyse erfolgte nach der Routinemethode [17]. Die verwendeten Antikörper umfassten die folgenden: Wnt4 (14371-1-AP, Proteintech, Chicago, USA), -catenin(17565-1-AP, Proteintech, Chicago, USA), Typ-1-Angiotensin-II-Rezeptoren (AGTR1,{{ 7}}AP, Proteintech, Chicago, USA), p-nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (p-Nrf2, ab76026, Abcam, Cambridge, UK), pc-Fos(ab27793, Abcam, Cambridge, UK). ), Bindegewebewachstumsfaktor (CTGF, GB11078, Service, Wuhan, China). Die Schnitte wurden unter einem Mikroskop (Olympus, Tokio, Japan) betrachtet.Cistanche-Dosierung redditMessen Sie die Fläche und die integrierte optische Dichte (IOD) der Fläche mit Bräunungsausdruck mit der Software Image-Pro Plus 6.0 und berechnen Sie die mittlere optische Dichte (MOD, MOD=IOD/Fläche) für halb -quantitative Analyse.

Western-Blot-Analyse

Der Western-Blot-Assay wurde wie in einer früheren Studie beschrieben durchgeführt [18]. Kurz gesagt, die Nierengewebe wurden in Lysepuffer homogenisiert und unter Verwendung eines Bradford Protein Assay Kits (AR0197, Boster Biological Technology, Wuhan, China) quantifiziert. Die Homogenate wurden dann einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, auf eine Polyvinylidenfluoridmembran übertragen und in Blockierungspuffer (4 % fettfreie Trockenmilch) für 90 Minuten blockiert. Sie wurden dann mit primären Antikörpern (Wnt4; Renin; AGTR1; p-Nrf2; pc-Fos; Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keapl, GB11847, Service-bio, Wuhan, China); -actin (AC026, Abclonal, Wuhan, China); und Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH, AC033, Abclonal, Wuhan, China)) über Nacht bei 4 Grad, gefolgt von einer Inkubation mit einem geeigneten Fluorpräsenz-konjugierten Sekundärantikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur . Die interessierenden Proteine ​​wurden mit einem Odyssey-IR-Scanner (LI-COR Biosciences, Nebraska, USA) gescannt, und die Signalintensitäten wurden unter Verwendung der Image Studio-Software quantifiziert. Die Proteinspiegel wurden gegen -Actin oder GAPDH normalisiert.

UPLC-Q-TOF-MS-Analyse für Nierenproben

Die Nierengewebe wurden gewogen und in eiskalter physiologischer Kochsalzlösung (w/v=1:1) homogenisiert. Dann wurde 1 ml Acetonitril zu 200 μl Gewebehomogenatproben gegeben, gefolgt von einer 30-minütigen Ultraschallextraktion. Der Extrakt wurde bei 12,000 g und 4 Grad für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde zur Analyse in das Fläschchen gegeben. Die chromatographische Trennung wurde mit Ultraleistungsflüssigkeitschromatographie (UPLC) (Dionex UltiMate 3000 System, Thermo Scientific, Massachusetts, USA) durchgeführt, wobei das LC-System eine Acclaim RSLC 120 C18-Säule (2,2 μm, 2,1 × 100 mm); Thermo Scientific).Cistanche-Extrakt VorteileDie mobile Phase bestand aus Lösungsmittel A (Acetonitril) und Wasser mit {{0}},1 Prozent Ameisensäure (B). Die Trennung wurde durch Gradientenelution wie folgt durchgeführt: 10-70 Prozent A von 0 bis 3 min, 70-78 Prozent A von 4 bis 13 min, 78-90 Prozent A von 14 bis 15 min, 90 % -10 % A von 15 bis 16 min und 10 % A von 16 bis 20 min. Das Injektionsvolumen der Testprobe betrug 2 μl. Die Massenspektrometrie-(MS)-Analyse wurde unter Verwendung einer ESI-Quelle unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Die Kapillarspannung im positiven Modus betrug 3,5 kV und die Kapillarspannung im negativen Modus betrug 3,2 kV. Der Druck des Zerstäubers betrug 2,0 bar, die Temperatur des Trockengases 230 Grad und die Durchflussrate 8 l/min.

statistische Analyse

The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}}.05; Die Einweg-Varianzanalyse wurde zum Vergleich zwischen den Gruppen verwendet. Ein AP-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

CF verbesserte die Alterung und Fibrose der Nieren bei SAMP8-Mäusen

Um die Wirkung von CF auf die Nieren von SAMP8-Mäusen zu untersuchen, wurde die SA- -gal-Aktivität in den Nieren gemessen. In Abb. la ist die SA- -gal-Aktivität im Nierengewebe in der M-Gruppe signifikant erhöht (blaue Verstärkung). Die Verabreichung von CF-L und CF-M hemmte signifikant die -Galactosidase-Aktivität in den Nieren von SAMP8-Mäusen, während die Verbesserung durch CF-H nicht signifikant war. Auch der Nierenindex der Modellgruppe war signifikant niedriger als der der Kontrollgruppe (Abb. 1b, P<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>

CF verbesserte die Nierenfunktion, den oxidativen Stress und die Entzündungswerte bei SAMP8-Mäusen

Außerdem wurden die Nierenfunktionsindikatoren jeder Gruppe von Mäusen getestet, die Urinvolumen bei Mäusen für 12 h, Cr- und Harnstoffstickstoffspiegel im Serum und Proteinspiegel im Urin umfassten. Wie in Abb. 2a-d gezeigt, waren die Urinprotein-, Serum-Cr- und Serum-Harnstoff-Stickstoffwerte der Modellgruppe signifikant höher als die der Kontrollgruppe (Abb. 2a, P<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">Cistanche Dschingis KhanAls nächstes wurde untersucht, ob CF oxidativen Stress und Entzündungen in den Nieren schnell alternder Mäuse positiv modulierte. Wie in Abb. 2e-h gezeigt, waren die SOD- und GSH-Pxin-Spiegel in den Nieren der M-Gruppe signifikant niedriger als die der Con-Gruppe, und die IL-1-Spiegel waren signifikant höher als die von die Con-Gruppe. Nach der CF-Behandlung wurden die oben genannten Indikatoren verbessert, insbesondere die Verbesserungswirkung von CF-L und CF-M ist besser.

CF aktivierte den Nrf2-Weg in der Niere von SAMP8-Mäusen

Das Expressionsniveau von p-Nrf2 wurde in Nierengewebe gemessen, um zu untersuchen, ob der Nrf2-Signalweg an der Schutzwirkung von CF (Abb. 3a-c) in der vorliegenden Studie beteiligt war. Das Expressionsniveau von p-Nrf2 nahm allein in der SAMP8-Gruppe signifikant ab (P<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">

CF schwächte die Wnt/-catenin/RAS-Signalaktivierung in der Niere von SAMP8-Mäusen ab

Um den potenziellen Mechanismus von CF weiter zu untersuchen, der die Antifibrosewirkung ausübt. Die Lokalisierung des Proteins wurde mittels Immunhistochemie durchgeführt. Wie in Fig. 4a gezeigt, ist das Expressionsniveau von Wnt4 und

-Catenin wurde überwiegend in renalen Tubuluszellen induziert. Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, als AGTR1, die Ziele des nachgeschalteten Wegs der Wnt-Signalübertragung, untersucht wurden (Abb. 4a). Danach wurde das Proteinexpressionsniveau quantifiziert, und die Ergebnisse zeigten, dass Wnt4-, -Catenin-, Renin- und AGTR1-Proteine ​​im Nierengewebe von Mäusen in der Modellgruppe akkumuliert wurden, während CF diese Veränderungen signifikant hemmte (Abb. 4b-f ). Darüber hinaus wurde auch das Expressionsniveau von CTGF lokalisiert und quantitativ analysiert. In Übereinstimmung mit den zuvor erwähnten Ergebnissen wurde CTGF hauptsächlich in den Nierentubuli exprimiert, und CF hemmte die Aktivität von CTGF deutlich (Fig. 4d g).

CF und seine Verbindungen hemmten die durch D-gal induzierte Seneszenz von NRK-52E-Zellen

D-gal-induzierte NRK-52-E-Zellen wurden verwendet, um bestimmte Wirkstoffe in CF zu screenen, um die materielle Grundlage für die Behandlung seniler Nieren durch den Extrakt von CF zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten, dass CF die Lebensfähigkeit der Zellen dosisabhängig und die Verbindungen verbesserten

SDC-0-14,16 und SDC-1-8, isoliert aus CF, hatten bessere Wirkungen auf die Zellproliferation. Außerdem zeigten 25 ug/ml CF und die Verbindungen SDC-0-14,16 und SDC-1-8 alle die Wirkung der Hemmung der -Galactosidase-Aktivität (Fig. 5).

CF verbesserte PCA-Analyse von Nierengewebe in SAMP8-Mäusen Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde durchgeführt, um die Auswirkungen von CF auf SAMP8-Mäuse zu untersuchen. Wie in Abb. 6a gezeigt, gab es eine offensichtliche Gruppierung zwischen der Kontroll- und der Modellgruppe (R2X=0.542; Q2=0.38), was darauf hindeutet, dass die endogenen Metaboliten von SAMP8-Mäusen sich von denen von SAMR1 unterschieden Mäuse, was dazu führt, dass sie von der SAMR1-Gruppe abweichen. Wie in Abb. 6b gezeigt, gruppierten sich die verschiedenen CF-Gruppen auch in verschiedene Klassen aus den Kontroll- und Modellgruppen, und die CF-Gruppen rückten näher an die Kontrollgruppe heran, was darauf hinweist, dass die

Die endogenen Metaboliten der CF-intervenierten SAMP8-Mäuse waren denen der SAMR1-Mäuse ähnlich.

Diskussion

Das Altern spielt eine wichtige Rolle bei der Progression von CKD [19]. Mit fortschreitender CKD-Fibrose exprimieren und sezernieren seneszente Zellen pro-fibrotische Faktoren (TGF-, CTGF usw.) und pro-inflammatorische Faktoren (IL-1 , IL-6, TNF- usw.). ), die seneszenzassoziierte sekretorische Phänotypfaktoren sind und dadurch die Nierenfibrose beschleunigen [20, 21]. Gegenwärtig hat die traditionelle chinesische Medizin gute Ergebnisse bei der Behandlung von Nierenfibrose mit weniger Nebenwirkungen erzielt [22]. Diese Studie untersuchte die interventionellen Wirkungen von CF-Extrakt auf die Nierenfibrose bei SAMP8-Mäusen. Der für diese Studie ausgewählte Mausstamm war SAMP8, der basierend auf der Lebensdauer, Seneszenz und den pathologischen phänotypischen Grading-Scores von AKR/Mäusen entwickelt wurde und ein beschleunigtes Alterungsmodell ausschließlich genetischen Ursprungs war [23,24]. Studien haben gezeigt, dass die Veränderungen in der Nierenpathologie von SAMP8-Mäusen (9 Monate) tubulointerstitielle Fibrose und fokale segmentale Glomerulosklerose umfassen [25]. Und es wurde festgestellt, dass die Nierenfibrose bei SAMP8-Mäusen altersbedingt war [6]. Daher testeten wir die Aktivität von -Galactosidase und

das Niveau der Nierenfibrose bei SAMP8-Mäusen und fanden heraus, dass CF-L und CF-M die Nierenfibrose und -galactosidase-Aktivität bei SAMP8-Mäusen verbesserten (Abb. 1). Und wir haben auch die Urinausscheidung der Mäuse getestet. In Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Studien, die darauf hindeuten, dass CF, das durch zwei verschiedene Prozesse gewonnen wurde, harntreibende Wirkungen hatte [13], erhöhte der Extrakt das Urinvolumen von SAMP8-Mäusen signifikant. Die vorliegende Studie zeigte auch, dass die Supplementierung mit CF die Nierenfunktion, die Aktivität von antioxidativen Enzymen und die Konzentration von Entzündungsfaktoren bei SAMP8-Mäusen verbesserte (Abb. 2).

Das Keap1-Nrf2-System hat in den letzten Jahren aufgrund seiner antioxidativen und entzündungshemmenden Eigenschaften die Aufmerksamkeit vieler Wissenschaftler auf sich gezogen. Sein pharmakologisches Potenzial zur Behandlung von Nierenerkrankungen wurde in präklinischen und klinischen Studien umfassend untersucht [26]. Nrf2 ist ein wichtiger Transkriptionsregulator für Gene, die mit Redoxstatus und antioxidativen Wirkungen zusammenhängen [27]. Studien haben gezeigt, dass die Phosphorylierung für die Nrf2-Aktivierung und Zielgen-Induktion erforderlich ist [28]. Die Aktivierung von Nrf2 verbesserte das Fortschreiten der chronischen Nierenerkrankung, indem oxidativer Stress verhindert und die zelluläre Redox-Homöostase aufrechterhalten wurde [29]. Als wichtiger Transkriptionsfaktor spielt Nrf2 eine entscheidende Rolle bei der Abwehr von oxidativem Stress, indem es seine nachgeschalteten Antioxidantien und Entgiftungsenzyme reguliert [30]. Kimet al. berichteten, dass Resveratrol als potenter Nrf2-Aktivator die altersbedingte fortschreitende Nierenschädigung linderte [31]. In der vorliegenden Studie verbesserte CF die Abschwächung von Nrf2 in der Niere von SAMP8-Mäusen, ohne das Expressionsniveau von Keapl zu beeinflussen, was darauf hindeutet, dass CF-Rohextrakt oxidative Schäden in den Nieren durch Aktivierung des Nrf2-Signalwegs verbessern könnte (Abb. 3).

Die Nierenfibrose ist durch eine übermäßige Ablagerung der extrazellulären Matrix (ECM) gekennzeichnet, die zur Bildung von Narben im Nierenparenchym führt [32]. Transforming Growth Factor- (TGF-) gilt als Schlüsselzytokin bei der Fibroblasten-Überaktivierung [33, 34]. Natürlich reicht es nicht aus, nur auf den TGF-Signalweg abzuzielen, um die Nierenfibrose zu reduzieren. Einige Studien zeigten, dass CTGF, Wnt/-catenin, das Renin-Angiotensin-System, oxidativer Stress usw. an der Nierenfibrose beteiligt sind [35-37]. Wnt/-catenin ist ein evolutionär konservierter Signalweg, der an der Regulation der Gewebehomöostase, der Organentwicklung und der Reparatur von Verletzungen beteiligt ist[38]. Cisternas et al. diskutierten die profibrotische Wirkung der Wnt-Signalgebung sowohl im Skelettmuskel als auch in der Niere [39]. Immer mehr Beweise belegen, dass der Wnt/-Catenin-Signalweg eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Entwicklung und des Fortschreitens von fibrotischen Nierenläsionen nach einer Verletzung spielt [40-42]. Das Wnt/-catenin-Signal ist in den Nieren gesunder Erwachsener relativ leise und wird aktiviert, sobald die Nieren verschiedenen Arten von Schäden ausgesetzt sind [43].

Bei Säugetieren hat die Wnt-Familie mindestens 19 Familienmitglieder, die für die Nierenentwicklung entscheidend sind. Und mindestens 15 dieser Familienmitglieder werden in der alternden Niere unterschiedlich hochreguliert, einschließlich Wnt4 [6]. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigten, dass das Expressionsniveau des Wnt4-Proteins in den Nieren von SAMP8-Mäusen signifikant höher war als das von SAMR1-Mäusen, was sowohl durch Western Blot als auch durch immunhistochemische Analysen bestätigt wurde (Abb. 4a, d und f). Zufälligerweise wurde auch das Expressionsniveau des -catenin-Proteins hochreguliert. Außerdem wurden sowohl Wnt4 als auch -catenin in renalen tubulären Epithelzellen exprimiert, wie durch die immunhistochemische Analyse gezeigt wurde (Fig. 4a und f). Wnt/-catenin löste Nierenfibrose aus, indem es mehrere fibrogene Gene wie RAS-Komponenten, Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP-7), Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1) und Snail [37 ]. Zhouet al. beschrieben Wnt/-catenin als den wichtigsten vorgeschalteten Regulator, der die Expression aller getesteten RAS-Komponenten in den Nieren steuert [44]. Zhou et al. verwendeten ein 5/6-Nephrektomie(5/6 NX)-Rattenmodell, um die Expressionsniveaus der Hauptkomponenten von RAS im Gehirn und in den Nieren zu zeigen, wie z. B. Angiotensinogen, Angiotensin-Converting-Enzym und Angiotensin II AT{{25 }}Rezeptor war signifikant hochreguliert. Das hochregulierte Expressionsniveau wurde durch einen zentralen Wnt-Blocker gehemmt, der ein Adeno-assoziierter Virusvektor war, der das DKK1-Gen überexprimiert [45]. In ähnlicher Weise fand die vorliegende Studie heraus, dass AGTR1 immer noch im renalen tubulären Epithel exprimiert wurde und die Expressionsniveaus von Renin und AGTR1 in den Nierengeweben von SAMP8-Mäusen signifikant höher waren als die von SAMR1-Mäusen ( 4a und dg ). Diese Ergebnisse zeigten, dass der Wnt/-catenin/RAS-Signalweg in den Nieren von SAMP8-Mäusen aktiviert wurde und der CF die Aktivierung dieses Wegs wirksam hemmte.

CTGF übt mehrere biologische Funktionen aus, einschließlich der Förderung der Mitose chemotaktischer Zellen, der Induktion der Adhäsion und der Förderung der Zellproliferation und der ECM-Synthese [35,46]. CCN2(CTGF) modulierte die Wnt-Signalgebung durch Bindung an Low-Density-Lipoproteinrezeptor-verwandtes Protein 5/6 (LRP5/6), um die Fibrose weiter zu vermitteln [39, 47]. Andere Studien verwendeten Gen-Silencing, um zu entdecken und zu bestätigen, dass Nrf2 den Wnt-Signalweg reguliert, indem es das Expressionsniveau von CTGF reguliert, was die interstitielle Nierenerkrankung beeinflusst. Außerdem regulierte Nrf2 das CTGF-Transkriptionsniveau hauptsächlich über den CTGF-Transkriptionsregulator c-Fos [48]. Die immunhistochemische Analyse ergab, dass CTGF und pc-Fos hauptsächlich in renalen tubulären Epithelzellen exprimiert wurden und pc-Fos auch in Glomeruli verteilt waren. Die quantitative Analyse zeigte, dass die Expressionsniveaus beider Proteine ​​durch CF gehemmt wurden (Fig. 3b und e sowie 4a und c). Schließlich wurde die PCA-Analyse verwendet, um weiter zu verifizieren, dass CF die Nierenschädigung bei SAMP8-Mäusen verbesserte (Abb. 6). Die vorliegende Studie lieferte den Beweis, dass die CF nicht nur die Nrf2-Signalübertragung aktivierte, sondern sich auch auf Nrf2 stützte, um oxidativen Stress und Entzündungen auszugleichen, die Wnt/-catenin/RAS-Signalübertragung zu hemmen und die Nierenalterung und Nierenfibrogenese zu verbessern. Allerdings fanden wir in diesem Experiment auch eine inkonsistente Verbesserung der Wirkung von CF auf die Masson- und SA- -gal-Färbung. Es wird spekuliert, dass dies auf das inkonsistente Fortschreiten der Nierenalterung und Nierenfibrose bei SAMP8-Mäusen zurückzuführen sein könnte. Der Grad der Nierenalterung bei den Mäusen in diesem Experiment kann schwerwiegender sein als Fibrose. Daher war die verbessernde Wirkung von CF-H auf die Nierenalterung bei SAMP8-Mäusen nicht so offensichtlich wie die der Nierenfibrose.

Als reduzierendes Monosaccharid wird D-Galactose bei verschiedenen altersbedingten Erkrankungen in vivo und in vitro weit verbreitet eingesetzt. Es wurde festgestellt, dass D-gal Seneszenz und Schädigung in NRK-52-E-Zellen verursacht [49], die Seneszenz von proximalen tubulären Epithelzellen der menschlichen Niere (HKC-8-Zellen) induziert und die Expressionsniveaus von zwei Nieren erhöht Fibrose-Markerproteine ​​FN und a-SMA [6].In dieser Studie wurde D-Gal verwendet, um NRK-52E-Zellen in vitro zu induzieren. Unter Verwendung des MTT-Assays und der -Galactosidase-Färbung zum Nachweis der aus CF isolierten Verbindungen wurde festgestellt, dass SDC-0-14,16 und SDC-1-8 die durch D-gal induzierte Zelllebensfähigkeit verstärkten und die durch D-gal induzierte inhibierten Zellalterung (Abb. 5). Diese legten nahe, dass SDC-0-14,16 und SDC-1-8 die materielle Grundlage für CF sein könnten, um die Nierenalterung zu verzögern. SDC-1-8 ist eines der Phenylethanoidglykoside. Es wurde festgestellt, dass Phenylethanoidglykoside die Lebensdauer von Caenorhabditis Elegans verlängern [50], mit Anti-Aging-[51] und neuroprotektiven Wirkungen [52-54]. Diese geben eine Richtung für unsere Folgestudie zu den pharmakologischen Wirkungen von CF vor.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend zeigten In-vivo-Studien, dass CF die Nierenfibrose bei älteren Mäusen reduzierte. Einige potenzielle Wirkstoffe wurden in In-vitro-Experimenten gefunden. Diese Ergebnisse lieferten eine pharmakologische Unterstützung für die Behandlung von Nierenerkrankungen mit CF und eine Richtung für die weitere Erforschung der Wirkstoffe von CF.

Dieser Artikel stammt von Cao et al. BMC Komplementärmedizin und Therapien (2022) 22:52