Therapeutische Wirkung und Mechanismus von Cistanche-Phenylethanolglykosiden auf die durch Cyclophosphamid induzierte Spermatogenese bei Mäusen

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ZHAODong-hai1, ZHANGLei2, ZHANGYan3, QILing1, ZOU Xiang-ming4

[Zusammenfassung]

Zweck:Um die therapeutische Wirkung von zu erforschenCistanche-Phenylethanoidglykosidean Mäusen mit Cyclophosphamid-induzierter Spermatogenese und zur vorläufigen Klärung ihres Wirkmechanismus.Methode:Ethanol-Extraktionsmethode zum ExtrahierenCistanche-Phenylethanoidglykoside. Vierzig BALB/C-Mäuse wurden zufällig in eine Kontrollgruppe, eine Modellgruppe, eine Niedrigdosisgruppe eingeteiltCistanche PhenylethanoidglykosidGruppe (50 mg·kg-1) und eine Hochdosisgruppe (100 mg·kg-1) mit 10 Mäusen in jeder Gruppe. Mit Ausnahme der Kontrollgruppe wurde den Mäusen in den anderen Gruppen an 5 aufeinanderfolgenden Tagen täglich Cyclophosphamid (80 mg·kg-1) injiziert, um Mausmodelle von Spermatogenesestörungen herzustellen. Nach der letzten Verabreichung wurden Mäuse in den Niedrigdosis- und Hochdosisgruppen vonCistanche-Phenylethanoidglykosideerhielten die entsprechenden Dosen per Schlundsonde, und den Mäusen in der Kontrollgruppe und der Modellgruppe wurde 30 Tage lang einmal täglich das gleiche Volumen an normaler Kochsalzlösung per Schlundsonde verabreicht. 24 Stunden nach der letzten Magensonde wurde das Hodengewebe der Maus entnommen. Zur Bestimmung des Testosteronspiegels im Hodengewebehomogenat von Mäusen wurde ein enzymgekoppelter Immunadsorptionsassay verwendet. Die Spermiendichte, Spermienbeweglichkeit und Spermienabnormalitätsrate jeder Gruppe wurden verglichen. Die morphologischen Veränderungen des Hodengewebes wurden durch HE-Färbung beobachtet. Ergebnisse: Im Vergleich zur Kontrollgruppe nahm die Spermiendichte und Spermienbeweglichkeitsrate der Modellgruppe ab (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" increased=""><0.01), and="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" decreased=""><0.01). 0.01);="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" of="" mice="" in="" each="" dose="" group="" of="">Cistanche-Phenylethanoidglykosidewaren deutlich erhöht (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.01), and="" the="" testicular="" tissue="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" homogenate="" increased=""><0.05 or=""><0.01). histological="" observations="" showed="" that="" the="" seminiferous="" tubules="" in="" the="" testis="" of="" the="" model="" group="" were="" atrophied="" and="" degenerated,="" the="" seminiferous="" epithelium="" was="" significantly="" thinner,="" the="" arrangement="" of="" spermatogenic="" cells="" was="" disordered,="" and="" the="" number="" of="" sperm="" in="" the="" cavity="" decreased;="" the="" number="" of="" the="" seminiferous="" epithelium="" in="" the="" testes="" of="" the="">Cistanche PhenylethanoidglykosidGruppe signifikant zugenommen, Die Schichten sind deutlich, die Spermatogenesezellen sind sauber, dicht und regelmäßig angeordnet, und Spermien sind im Lumen zu sehen.Fazit: Cistanche-Phenylethanoidglykosidehaben eine signifikante therapeutische Wirkung auf die durch Cyclophosphamid bei Mäusen verursachte Störung der Spermatogenese, und ihr Mechanismus kann mit der Verbesserung des Testosteronspiegels im Hodengewebe zusammenhängen.

[Schlüsselwörter]Cistanche-Phenylethanoidglykoside; Cyclophosphamid; Störung der Spermatogenese; Mäuse, BALB/C

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Aufgrund der Beschleunigung des sozialen Rhythmus, schlechter Lebensgewohnheiten und Umweltverschmutzung und anderer Faktoren ist eine abnormale Spermienqualität wie Oligospermie und Asthenospermie zur Hauptursache für männliche Unfruchtbarkeit geworden [1]. Gegenwärtig gibt es weniger Medikamente zur Behandlung von Oligospermie und Asthenospermie, und die therapeutische Wirkung ist nicht offensichtlich. Verschreibungen oder Wirkstoffe der traditionellen chinesischen Medizin haben gute Wirkungen bei der Verbesserung der männlichen Fortpflanzungsfunktion [2-6]. Aufgrund der großen Vielfalt an verschreibungspflichtigen Arzneimitteln ist die Beziehung zwischen den pharmakologischen Wirkungen und den wirksamen Bestandteilen des Arzneimittels jedoch nicht klar, was die Werbung und Anwendung von spermatogenen Arzneimitteln einschränkt. Die Erforschung und Entwicklung der wirksamen Inhaltsstoffe der chinesischen Medizin und das Studium ihrer therapeutischen Wirkungen bei reproduktiven Schäden haben einen guten Anwendungswert.Cistanche-Phenylethanoidglykosidesind einer der wichtigsten Wirkstoffe inCistanche Deserticola. Sie sind normalerweise natürliche Glykoside, die Esterbindungen und oxo-glykosidische Bindungen mit -Glucose als Kern enthalten. Sie sind in zweikeimblättrigen Pflanzen weit verbreitet [7]. Das haben Studien [8] gezeigtCistanchePhenylethanoidGlykosidekann Rattensperma vor oxidativen Schäden in vitro schützen, aber es gibt keine Berichte über seine Spermatogenese. Dieses Experiment untersucht die therapeutische Wirkung von Cistanche-Phenylethanoidglykosiden auf die spermatogene Funktion von Mäusen mit Cyclophosphamid-induzierter Spermatogenese und liefert eine experimentelle und theoretische Grundlage für die Anwendung vonCistanche-Phenylethanoidglykosidebei der Behandlung von Spermatogenesestörungen.

1. Materialien und Methoden

1.1. Labortiere, Hauptreagenzien und Instrumente

40 ausgewachsene BALB/C-Mäuse der SPF-Klasse, 6-8 Wochen alt, mit einer Körpermasse von 20-22 g, wurden vom Animal Experimental Center der Jilin University School of Basic Medicine und der Tierzertifikatsnummer gekauft : SCXK (Kirgisistan) 2008-005. Die Mäuse wurden 5 Tage vor dem Experiment adaptiv gezüchtet. Fütterungsbedingungen: 22 Grad ~ 25 Grad, zirkadianer Rhythmus (12h/12h), kostenloses Trinkwasser und Futter. Cistanche ist ein Produkt der Xinjiang Dakang Trading Company. Cyclophosphamid zur Injektion wurde von Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. bezogen (Chargennummer 11061921). Hodengewebe-Homogenat-Testosteron-Enzym-Immunoassay-Kit wurde von Tianjin Jiuding Medical Bioengineering Co., Ltd. (Chargennummer) 20120812 erworben), andere Reagenzien sind alle im Inland hergestellte Analysequalitäten. PLUS384-Mikroplattenlesegerät (MDC in den USA), TE2000U-Inversmikroskop (Nikon, Japan) und J-26XP-Zentrifuge (Nanodrop, USA).

1.2 Herstellung von Cistanche-Phenylethanolglucosid

10 g Cistanche-Pulver wurden durch Refluxieren mit 70 % Ethanol zweimal jeweils 2 h extrahiert, um das Phenethylalkohol-Glycosid-Konzentrat zu erhalten. Die konzentrierte Lösung wurde auf der makroporösen Harzsäule D101 chromatographiert und mit 70 % Ethanol eluiert, um Cistanche-Phenecosidalkohol zu erhalten. Das UV-Spektrophotometer identifizierte den Extrakt bei einer Wellenlänge von 333 nm.

1.3 Vorbereitung des Tiermodells und Arzneimittelverabreichungsverfahren

Nachdem 40 männliche BALB/C-Mäuse 5 Tage lang adaptiv gefüttert wurden, wurden die Mäuse zufällig in 4 Gruppen (10 Mäuse in jeder Gruppe) eingeteilt: Kontrollgruppe, Modellgruppe, CistancheCistanche-PhenylethanoidglykosideNiedrigdosisgruppe undCistanche-PhenylethanoidglykosideGruppe mit hoher Dosis. Mit Ausnahme der Kontrollgruppe erhielten die anderen drei Gruppen von Mäusen eine intraperitoneale Injektion von Cyclophosphamid 80 mg·kg-1 für jede Maus an 5 aufeinanderfolgenden Tagen, um Tiermodelle von Spermatogenesestörungen vorzubereiten. Nachdem das Modell vorbereitet wurde, wurden Mäuse in den Niedrig- und Hochdosisgruppen vonCistanchePhenylethanoid erhielten 50 bzw. 100 mg·kg-1·d-1. Den Mäusen in der Kontrollgruppe und der Modellgruppe wurden gleiche Mengen normaler Kochsalzlösung verabreicht. Einmal täglich für 30 Tage. Alle Mäuse wurden 24 Stunden nach der letzten Arzneimittelverabreichung getötet und es wurden bilaterale Tests durchgeführt. Der rechte Hoden wurde mit Formaldehyd fixiert. Die Nebenhoden und Hoden wurden von der linken Seite entnommen. Die Hoden wurden homogenisiert und bei 3,000 min für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde entnommen und zum Testen in einer Eisbox bei -20 Grad gelagert. Der linke Nebenhoden wurde auf Spermiendichte, Spermienbeweglichkeit und Deformationsrate getestet.

1.4 Bestimmung der Spermiendichte, Spermienbeweglichkeit und Deformationsrate

Stellen Sie ein Reagenzglas mit 10 ml Spermien-Nährlösung [9] in ein Wasserbad mit konstanter Temperatur, um es auf 37 Grad vorzuheizen, nehmen Sie einen einseitigen Nebenhoden, um Bindegewebe und Fett zu entfernen, schneiden Sie das Gewebe ab und geben Sie es in ein Reagenzglas 37 Grad für 10 Minuten Nachdem die Spermien vollständig frei sind, nehmen Sie 1 Tropfen auf die Blutzellenzählplatte und berechnen Sie die Spermiendichte gemäß der Zellzählmethode. Das Ergebnis wird als Anzahl Spermien pro Milliliter ausgedrückt; zusätzlich 5 μL Spermiensuspension und die gleiche Menge Eosin-Y aus dem Reagenzglas entnehmen Gut mischen, 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, Deckglas zugeben und lichtmikroskopisch beobachten. Tote Spermien sind rosa gefärbt, lebende Spermien sind nicht gefärbt und das Zytoplasma ist transparent. Jede Probe zählt 200 Spermien, berechnet die Lebensfähigkeit der Spermien, das Ergebnis wird als Prozentsatz ausgedrückt, Lebensfähigkeit der Spermien=eine Anzahl lebender Spermien / die Gesamtzahl der Spermien × 100 Prozent. Weitere 5 &mgr;l Spermiensuspension wurden 5 Minuten lang in Methanol fixiert, getrocknet und 1 Stunde lang mit 2-prozentiger wässriger Eosinlösung gefärbt, gespült und geföhnt. Suchen Sie nach Teilen mit weniger Spermienüberlappung unter einer Linse mit geringer Vergrößerung und verwenden Sie eine Linse mit hoher Vergrößerung, um die Spermienmorphologie der Reihe nach zu überprüfen. Jede Maus inspizierte 1,000 vollständiges Sperma. Als Missbildungen wurden die Spermienköpfe ohne Haken, bananenförmige, amorphe, fette Köpfe und Doppelköpfe beurteilt. Die Spermiendeformierungsrate wurde berechnet und die Ergebnisse wurden in Prozent ausgedrückt. Spermiendeformitätsrate=eine Anzahl deformierter Spermien / Gesamtzahl der Spermienzahl × 100 Prozent .

1.5 Bestimmung der Fortpflanzungshormone

Der Hoden wurde von der Membran abgezogen und in eine Röhrchenschale gegeben, und das vorgekühlte Homogenisierungsmedium (0.01mol·L-1 Saccharose, 0.01mol ·L-1 Tris- HCl, 0,1mmol·L-1 EDTA-Na2-Lösung, pH 7,4), das Hodengewebe mit einer ophthalmologischen Schere schneiden, in ein Glashomogenisierungsröhrchen gießen und bei 4 zentrifugieren, 000×g für 10 Minuten bei niedriger Temperatur und nehmen Sie den Überstand. Verwenden Sie das enzymgebundene Immunosorbent-Assay-Kit, um den Testosteronspiegel im Hodengewebehomogenat zu messen, und testen Sie 3 parallele Proben für jede Probe. Die experimentellen Schritte und Methoden wurden gemäß den Anweisungen des Kits durchgeführt.

1.6 Morphologische Beobachtung der Hoden

Nehmen Sie Paraffinschnitte von Maushoden, gefärbt mit HE, und beobachten Sie die Verteilung von Spermatogonien und spermatogenen Zellen im Hodengewebe unter einem Lichtmikroskop.

1.7 Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit der statistischen Software SPSS17.0 durchgeführt. Spermiendichte, Spermienbeweglichkeitsrate, Spermiendeformitätsrate und Hodentestosteronspiegel von Mäusen in jeder Gruppe wurden als x ± s ausgedrückt, und der Vergleich zwischen den Gruppen wurde durch Einzelfaktor-Varianzanalyse durchgeführt.

2. Ergebnisse

2.1. Spermiendichte, Spermienbeweglichkeit und Spermiendeformitätsrate jeder Gruppe von Mäusen

Im Vergleich zur Kontrollgruppe nahm die Spermiendichte und Spermienlebensfähigkeit der Modellgruppe ab (P<0.01), and="" the="" sperm="" deformity="" rate="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" rate="" of="" mice="" in="" each="" dose="" of="">Cistanche-Phenoxyethanol-Glycosiderhöht (s<0.05 or=""><0.01), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05 and=""><0). .01).="" compared="" with="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group,="" the="" high-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" had="" higher="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility=""><0.05), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05). see="" table="">

2.2 Testosteronspiegel in Hodengeweben von Mäusen in jeder Gruppe

Die Testosteronspiegel in den Hodengewebehomogenaten der Kontrollgruppe und der Modellgruppe betrugen (10,26±0,57) und (5,33±0,84) nmol·L-1, beziehungsweise. Der Testosteronspiegel der Modellgruppe war signifikant niedriger als der der Kontrollgruppe (P<0.01). the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" were="" (7.55±1.21)="" and="" (10.35±0.94)="" nmol·l-1.="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" low="" and="" high-dose="" groups="" of="" cistanche="" cistanche="" ethanol="" glycosides="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" model="" group=""><0.05 or=""><0.01). the="" testosterone="" level="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="">CistancheCistanche-Phenethylglycosid-Hochdosis-Gruppe war signifikant höher als die der Niedrigdosis-Gruppe (P<>

2.3 Morphologie der Maushoden in jeder Gruppe

Unter dem Lichtmikroskop beobachtet, waren die Samenkanälchen in den Hoden der normalen Gruppe dicht angeordnet, das Niveau und die Anzahl der Keimzellen waren groß, das Samenepithel war sauber angeordnet und die Samenkanälchen waren alle mit Spermienbildung zu sehen. In der Modellgruppe waren die Samenkanälchen in den Hoden von Mäusen atrophiert und degeneriert, das Samenepithel war deutlich verdünnt, die Anzahl der Epithelschichten war reduziert, die Anordnung war ungeordnet und die Anzahl der Spermien in der Höhle war reduziert. Verglichen mit der Modellgruppe ist die geringe Dosis vonCistanche-Phenethylalkohol-Glykosid.

In der Gruppe nahm die Anzahl der Samenepithelschichten der Samenkanälchen zu, die Anordnung des Epithels war regelmäßiger und die Schädigung der Samenkanälchen wurde offensichtlich verbessert; die Struktur der Hodenkanälchen in der HochdosisCistanche PhenylethanoidglykosidGruppe verbesserte sich deutlicher, und die Anzahl und Anzahl der Samenepithelschichten nahm signifikant zu. Ordentlich angeordnet, befinden sich reife Spermien in den Samenkanälchen, und die Struktur ist im Grunde wieder normal. Siehe Abbildung 1 (Einsatz 6).

3 Diskussion

Cyclophosphamid ist ein häufig verwendetes Antitumor-Medikament und Immunsuppressivum, das hauptsächlich durch die Alkylierung von DNA in eine Vielzahl von intrazellulären biologischen Funktionen eingreift. Reproduktionstoxizität ist eine der Hauptnebenwirkungen von Cyclophosphamid [3], die leicht zu DNA-Schäden der Spermien und abnormaler Spermienentwicklung führen kann. Klinische Studien [10-11] weisen darauf hin, dass die Reproduktionstoxizität von Cyclophosphamid Azoospermie oder Oligospermie verursachen kann. , die zu Unfruchtbarkeit oder dem Auftreten genetischer Defekte oder Fehlbildungen bei den Nachkommen führen.

Cistanche tubulosaist eine mehrjährige höhere parasitäre Pflanze in der Leiden-Familie. Es ist eine bekannte chinesische Medizin, die die Niere und das Yang nährt, das Blut nährt und den Darm nährt. Es ist ein häufig verwendetes verschreibungspflichtiges Medikament zur traditionellen Behandlung der männlichen Fortpflanzungsstörung [12].Phenylethanoidglykosidesind einer der wichtigsten Wirkstoffe vonCistanche[13] und haben ein breites Spektrum an pharmakologischen Wirkungen, wie z. B. Antioxidation, Anti-Aging und Anti-Tumor [14].

In dieser Studie wurde Cyclophosphamid verwendet, um ein Mausmodell einer Spermatogenesestörung herzustellen, und die therapeutische Wirkung von Cistanche-Phenylethanoidglykosiden auf eine durch Cyclophosphamid verursachte Spermatogenesestörung wurde untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass im Vergleich zur Normalgruppe die Spermiendichte der Modellgruppe abnahm, die Überlebensrate abnahm und die Missbildungsrate zunahm. Verglichen mit der Modellgruppe können alle Dosisgruppen von Cistanche-Phenoxyethanolglykosiden die Spermiendichte effektiv erhöhen, die Beweglichkeit der Spermien verbessern und die Deformierungsrate der Spermien verringern. Die obigen Ergebnisse zeigen, dass die Cistanche-Phenoxyethanol-Glykoside die Spermatogenese fördern und die geschädigten Hoden schützen können. Die Ergebnisse der Hodenmorphologie zeigten, dass nach der Behandlung mitCistanche Phenylethanoidglykosid, die Anzahl des Samenepithels in den Hoden der Modellmäuse war signifikant erhöht, die Schichten waren deutlich, die spermatogenen Zellen waren sauber, dicht und regelmäßig angeordnet, und Spermien sind im Lumen zu sehen, was darauf hindeutetCistanche-PhenylethanoidShanhe kann die Struktur und Morphologie des Samenepithels nach einer reproduktiven Verletzung wiederherstellen.

Testosteron reguliert die Differenzierung männlicher Keimzellen und ist eine notwendige Voraussetzung für die normale Entwicklung der Hoden und das normale Auftreten von Spermien. Einige Studien [15] berichteten, dass der selektive Knockout von Androgenrezeptoren in Sertoli-Zellen des Hodens Störungen der Spermienentwicklung und männliche Sterilität verursachte. In dieser Studie wurde Cyclophosphamid zur Herstellung von Spermatogenese verwendet.

Nach dem Hindernisverletzungsmodell war der Testosteronspiegel im Hodengewebe der Mäuse signifikant niedriger als in der Normalgruppe. Nach der Einwirkung von Cistanche-Phenylethanoidglykosiden stiegen die Testosteronspiegel in jeder Dosisgruppe an, und der Testosteronspiegel in der Hochdosisgruppe war signifikant höher als in der Niedrigdosisgruppe. Es wird vermutet, dass die Cistanche-Phenoxyethanol-Glykoside die Spermatogenese fördern können, indem sie den Testosteronspiegel im Hodengewebe erhöhen, um eine spermatogene Dysfunktion zu behandeln, aber der Mechanismus seiner Wirkung auf Testosteron bedarf weiterer Forschung und Diskussion.

Testosteron reguliert die Differenzierung männlicher Keimzellen und ist eine notwendige Voraussetzung für die normale Entwicklung der Hoden und das normale Auftreten von Spermien. Einige Studien [15] berichteten, dass der selektive Knockout von Androgenrezeptoren in Sertoli-Zellen des Hodens Störungen der Spermienentwicklung und männliche Sterilität verursachte. In dieser Studie wurde Cyclophosphamid zur Herstellung von Spermatogenese verwendet.

Nach dem Hindernisverletzungsmodell war der Testosteronspiegel im Hodengewebe der Mäuse signifikant niedriger als in der Normalgruppe. Nach der Aktion vonCistanche-Phenylethanoidglykosidestiegen die Testosteronspiegel in jeder Dosisgruppe an und der Testosteronspiegel in der Hochdosisgruppe war signifikant höher als in der Niedrigdosisgruppe. Es wird vermutet, dass die Cistanche-Phenoxyethanol-Glykoside die Spermatogenese fördern können, indem sie den Testosteronspiegel im Hodengewebe erhöhen, um eine spermatogene Dysfunktion zu behandeln, aber der Mechanismus seiner Wirkung auf Testosteron bedarf weiterer Forschung und Diskussion.

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