Gesamtglykoside von Cistanche Deserticola fördern die Wiederherstellung der neurologischen Funktion, indem sie die neurovaskuläre Regeneration über den Nrf- 2/Keap-1-Weg bei MCAO/R-Ratten induzieren-Ⅰ

EINFÜHRUNG

Schlaganfälle gelten weltweit als eine der Hauptursachen für Tod und Behinderung. Fast 87 % aller Schlaganfallfälle werden durch einen ischämischen Schlaganfall ausgelöst. Derzeit das wirksamste Mittel und das einzige von der FDA zugelassene MedikamentBehandlung eines ischämischen Schlaganfallsist ein rekombinanter Gewebeplasminogenaktivator. Allerdings sprechen viele Schlaganfallpatienten aufgrund des engen therapeutischen Zeitfensters und des hohen Risikos hämorrhagischer Komplikationen nicht auf dieses Medikament an. Eine große Herausforderung der thrombolytischen Behandlung ist die Schädigung durch Ischämie/Reperfusion (I/R), die als Hauptursache für Hirnschädigung und Funktionszerstörung gilt. Eine Reperfusion nach einer zerebralen Ischämie erhöht das Risiko einer Hirnblutung, führt zu neurovaskulären Schäden und produziert übermäßig viele reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die die Blut-Hirn-Schranke schädigen. Mehrere Studien haben bestätigt, dass die Störung der BHS eine Hauptursache für die Pathogenese eines ischämischen Schlaganfalls ist.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUR BEHANDLUNG DES ISCHÄMISCHEN SCHLAGANFALLS PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Die BHS besteht hauptsächlich aus Endothelzellen, Perizyten, Astrozyten, Neuronen und den Basalmembranen. Die Kernbestandteile der BHS sind zerebrale mikrovaskuläre Endothelzellen, die durch Tight Junctions verbunden sind und so den Zutritt exogener Moleküle ins Gehirn einschränken. Die pathologischen Veränderungen der Tight Junctions – insbesondere Occludin, Claudin-5 und Zonula occludens-1 (ZO-1) – beeinträchtigen die BHS-Funktion während eines ischämischen Schlaganfalls erheblich, insbesondere die Barrierepermeabilität. Während I/R-Perioden ist übermäßige ROS einer der Hauptfaktoren, die zur direkten Schädigung von Gehirnneuronen führen. Eine Überproduktion von ROS führt zum Abbau bestimmter Verbindungen und zur Störung der Blut-Hirn-Schranke, was dazu führt, dass exogene Moleküle über die Blut-Hirn-Schranke in das Gehirn gelangen, was zu einer Verschlimmerung der Hirnschädigung führt. Daher wurde der Schutz der BHS durch Antioxidantien als potenzielle Möglichkeit zur Verhinderung von Reperfusionsschäden angesehen.

Neben dem Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke kann I/R zu neurovaskulären Schäden und zum Absterben von Neuronen führen. Während eines Schlaganfalls kann es durch oxidativen Stress zu einem verstärkten Absterben neuronaler Zellen kommen, und zahlreiche Studien haben gezeigt, dass ROS die Schwere des Schlaganfalls und neurologische Schäden verschlimmern. Obwohl klinische Studien keine zufriedenstellenden Ergebnisse erbracht haben, ist die Neuroprotektion immer noch eine vielversprechende Strategie zur Behandlung eines akuten ischämischen Schlaganfalls. Daher ist es für Schlaganfallpatienten von Vorteil, wirksame Neuroprotektionsmedikamente zur Behandlung von Schlaganfällen zu finden.

Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) greift mit Maßnahmen gegen das innere Ungleichgewicht des Körpers ein. Aufgrund der komplexen Pathogenese ischämischer Schlaganfälle spielt die multifaktorielle Wirkung der TCM und ihrer Wirkstoffe eine entscheidende Rolle bei der Behandlung von Schlaganfällen.Cistanchedeserticola YC Ma, weit verbreitet in ariden oder semi-ariden Gebieten in der gesamten Mongolei und im Nordwesten Chinas, ist in China seit mehr als 1,{2}} Jahren ein weit verbreitetes TCM-Kraut zur Behandlung verschiedener Krankheiten wie Vergesslichkeit und Depression. Moderne pharmakologische Studien zeigten, dass die Rohextrakte von C. deserticola mehrere pharmakologische Aktivitäten zeigten, wie zVerbesserung der Lern- und Gedächtnisfunktion, Neuroprotektion, Immunität, antioxidative, Anti-Aging- und Anti-Müdigkeitswirkung. Die chemische Analyse von C. deserticola ergab, dass zu seinen Hauptbestandteilen Folgendes gehört:Phenylethanoidglykoside, Iridoidglykoside, Polysaccharide und Oligosaccharide. Allerdings sind die aktiven Bestandteile von C. deserticola zum Schutz des Gehirns nicht ganz klar.

Die neuroprotektive Eigenschaft von C. deserticola impliziert sein therapeutisches Potenzial bei kognitiven Erkrankungen wie Schlaganfall und Depression sowie der Alzheimer-Krankheit. Die Forschung zum Einfluss von C. deserticola auf Schlaganfälle, einschließlich seiner aktiven Komponenten und Wirkmechanismen, ist jedoch sehr begrenzt. In der aktuellen Arbeit untersuchten wir die schützende Wirkung von drei Extrakten aus C. deserticola, Gesamtglykosiden (TGs, Phenylethanoidglykosiden und anderen Glykosiden), Polysacchariden (PSs) und Oligosacchariden (OSs) auf zerebrale I/R-Verletzungen. Unsere Ergebnisse können zur genauen klinischen Anwendung von C. deserticola beitragen und einen Wirkstoffkandidaten dafür liefernischämische Schlaganfalltherapie.

MATERIALEN UND METHODEN

Chemikalien und Reagenzien

Die Stängel von Cistanche deserticola wurden in Alashan, Innere Mongolei, gekauft und von einem der Autoren (P.-F. Tu) identifiziert. TGs, PSs und OSs wurden gemäß unserer zuvor beschriebenen Methode hergestellt. Die quantitative Analyse von TGs wurde wie zuvor beschrieben durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) durchgeführt. Das Chromatogramm ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Hauptbestandteile von TGs sind Echinacosid, Tubulosid A, Acteosid, Isoacteosid und 2'-Acetylacteosid. Ihr Gehalt beträgt 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g bzw. 12,045 mg/g. Der Gehalt an PSs und OSs beträgt 69,42 % bzw. 65,24 %, bestimmt durch HPLC bzw. Phenol-Schwefelsäure-Analyse.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUR BEHANDLUNG DES ISCHÄMISCHEN Schlaganfalls PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Die Standardreferenzen Echinacosid (A0282), Tubulosid A (A0942), Acteosid (A0280), Isoacteosid (A0281) und 2'-Acetylacteosid (A0943) wurden von Chengdu Must Biotechnology erworben. Die Reinheiten aller Standards liegen bei über 98 %. Nissl-Flecken-H&E-Sets wurden von Boster gekauft. Edaravon (T0407-1) ​​wurde von Target Mol (Shanghai, China) gekauft. Es wurden Kaninchen-Anti-Ratten-MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) und Maus-Anti-Ratten-CD31 (ab24590) gekauft von Abcam Inc. Kaninchen-Anti-Ratten-Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) und Occludin (BS72035) wurden von Bioworld Technology gekauft. Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA) war die Quelle für Kaninchen-Anti-Ratten-Synapsin-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T) und a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) wurde von Proteintech Group, Inc. gekauft. Sekundärantikörper wurden von Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Peking, China) geliefert. Hoechst 33258 wurde von Beyotime bezogen.

Tiere

Sprague-Dawley-Ratten (männlich, 250–300 g schwer) wurden von Vital River Laboratory Animal Technology bezogen und in einem klimatisierten Raum mit einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten. Alle Tierversuche wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien für Tierforschung durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee des Peking University Health Science Center genehmigt.

Tierversuchsprotokolle

Die Ratten wurden wie zuvor beschrieben MCAO/R ausgesetzt (Wang et al., 2018). Kurz gesagt, die linke Arteria carotis communis (CCA), die Arteria carotis externa (ECA) und die Arteria carotis interna (ICA) wurden freigelegt und ein 3-0-Nylon-Monofilament-Nahtmaterial wurde von der ECA in die ICA bis zur Mitte eingeführt Hirnarterie (MCA). Nach 1,5 Stunden MCA-Okklusion wurde die Reperfusion durch Entfernen des Filaments simuliert. Während des chirurgischen Eingriffs wurde die Körpertemperatur aller Ratten auf 37,0 Grad gehalten. Arzneimittel

Verwaltung

Die Ratten wurden mithilfe der SPSS-Softwareversion 22.0 wie beschrieben zufällig in sechs Gruppen eingeteilt: normale Gruppe (NOR); Modellgruppe (MOD); Edaravon-Gruppe (positives Medikament, 6 ml/kg, EDI); TGs-Gruppe (280 mg/kg, TGs); PS-Gruppe (280 mg/kg, PS) und OS-Gruppe (280 mg/kg, OS). TGs, PSs und OSs wurden 14 Tage lang einmal täglich nach MCAO/R verabreicht. Die NOR- und MOD-Gruppen wurden mit normaler Kochsalzlösung behandelt. Die Tierzahlen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Messung des Gewichts und des modifizierten neurologischen Defizit-Scores (mNSS)

Das Körpergewicht wurde am 14. Tag mit einer ADVENTURE™ Digitalwaage (OHAUS, New Jersey, USA) überwacht. Der mNSS wurde gemäß der von FJ Wang (Wang et al., 2018) beschriebenen Methode mit geringfügigen Überarbeitungen bewertet.

2, 3, 5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung

Das Infarktvolumen wurde wie zuvor beschrieben gemessen. Kurz gesagt, die Gehirne wurden in sieben gleichmäßig beabstandete koronale Blöcke (2 mm) unterteilt. Diese Schnitte wurden 15 Minuten lang bei 37 Grad mit 2 % TTC gefärbt. Infarktvolumen (%)=(ipsilaterales ischämisches Hemisphärenvolumen − kontralaterales ischämisches Hemisphärenvolumen)/kontralaterales ischämisches Hemisphärenvolumen × 100.

Nissl- und H&E-Färbung

Die Ratten wurden tief betäubt, und das gesamte Gehirn wurde dann schnell vom Schädel entfernt, mit 4 % Paraformaldehyd, eingebettet in Paraffinwachs, fixiert und in Scheiben von 7 µm Dicke geschnitten. Die Schnitte wurden mit Nissl und H&E gefärbt. In dieser Studie wurden in jeder Gewebeprobe sechs zufällige 200 × 200 µm große Felder mit einem Lichtmikroskop erfasst. Die Anzahl der Nissl-Leichen wurde mit der IPP-Softwareversion 6.0 gezählt.

Evans-Blau-Assay

Den Ratten wurde 2 % EB nach MCAO/R injiziert. Zwei Stunden später wurden die Ratten betäubt und das gesamte Gehirn schnell entnommen und in Aceton homogenisiert. Die Überstände wurden bei 620 nm mit einem 800 TS-Absorptionslesegerät analysiert.

Messung der Aktivitäten von Katalase (CAT), Superoxiddismutase (SOD), Malondialdehyd (MDA) und Glutathionperoxidase (GSH-Px)

Alle Serumproben wurden 15 Minuten lang bei 4 Grad mit 4,000 × U/min zentrifugiert und dann gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert, um die Aktivitäten von MDA, CAT, SOD und GSH-Px festzustellen.

Western-Blot-Analyse

Von jeder Ratte gesammeltes Gehirngewebe (100 mg) wurde homogenisiert und in RIPA-Lysepuffer lysiert und dann analysiert, um die Proteinkonzentration mithilfe eines BCA-Kits zu ermitteln. Die Gesamtproteine ​​des Gewebes wurden auf 10 % SDS-PAGE-Gele geladen und auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Membran wurde mit 5 %iger Magermilch blockiert und dann über Nacht mit Primärantikörpern bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurde die Membran mit einem sekundären Antikörper inkubiert. Die Western-Blot-Analyse wurde mit dem Kodak Digital Imaging System analysiert.

Immunfluoreszenzanalyse

Es wurde eine Immunfluoreszenzfärbung für CD31, a-SMA, ZO-1, Claudin5, Occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 und Keap-1 durchgeführt. Primärantikörper gegen Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, Claudin5, Occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 und Keap{15}} wurden auf 1 verdünnt :200 bzw. 1:100. Die Sekundärantikörper Alexa Flur 488 Maus-Anti-Kaninchen-IgG und Rhodamin (TRITC) Ziege-Anti-Kaninchen-IgG wurden beide auf 1:200 verdünnt. Die Kerne wurden mit Hoechst 33258 gefärbt. Die Bilder wurden mit dem Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, USA) aufgenommen. Die Proteinexpression wurde mit der IPP-Softwareversion 6.0 analysiert. Statistische Analyse

Alle Daten wurden als Mittelwert ± SD beschrieben. Für die statistische Analyse wurde die SPSS-Softwareversion 22.0 verwendet. Beim Vergleich verschiedener Gruppen wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet. P < 0.05 wurde als statistischer Unterschied angesehen.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA FÜR ANTI-ISCHÄMISCHE KRANKHEIT PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

ERGEBNISSE

TGs erhöhen das Körpergewicht und reduzieren Hirnschäden bei MCAO/R-Ratten

Nach 14-tägiger Heilung mit TGs, PSs, Oss und EDI wurden das Körpergewicht, die neurologischen Defizite und das Infarktvolumen der I/R-Ratten bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Körpergewichte in der MOD-Gruppe stark verringert waren, während die verringerten Gewichte in den TG-, PS- und EDI-Gruppen zunahmen (Abbildung 2A). Die Werte für neurologische Defizite wurden durch EDI und TGs erheblich gesenkt (Abbildung 2B). Die Gehirnschnitte der Ratten der NOR-Gruppe waren tiefrot und es gab keine Infarkte, während die Ratten der MOD-Gruppe einen großen ipsilateralen Hirninfarkt aufwiesen. Nach der TG-Behandlung waren die Infarktvolumina deutlich reduziert (Abbildungen 2C, D). Die PSs- und OSs-Behandlung zeigte keine offensichtliche Wirkung auf die oben genannten Indizes. Die obigen Daten zeigten, dass TGs die I/R-induzierte Hirnschädigung deutlich lindern konnten, PSs und OSs jedoch nicht.

TGs verbessern histopathologische Schäden bei MCAO/R-Ratten

Um einige der Auswirkungen der Behandlung mit TGs, PSs und OSs auf histopathologische Schäden zu bestimmen, wurde eine H&E-Färbung durchgeführt, um pathologische Schäden aufzudecken. Die histomorphologischen Strukturen der Gehirne in der NOR-Gruppe waren regelmäßig angeordnet. Die morphologischen Veränderungen in den TGs-Gruppen waren geringer als in der MOD-Gruppe. Allerdings zeigten die PS- und OS-Behandlungsgruppen keine signifikante Verbesserung der morphologischen Veränderungen (Abbildung 3).

TGs schwächen neuronale Verletzungen nach I/R-induzierten Ratten ab

Die Nissl-Färbung zeigte die histopathologischen Veränderungen von Neuronen im Halbschatten des ischämischen Bereichs. Wie in Abbildung 4 dargestellt, hatten die normalen Neuronen einen klaren Nukleolus und eine intakte Struktur. In der MOD-Gruppe hatten die Neuronen vergrößerte Interzellularräume. Die Nissl-Körper verschwanden, geschrumpft und tief fleckig. Diese Veränderungen wurden jedoch in den EDI-, TG- und PS-Gruppen selten beobachtet. Diese Ergebnisse zeigten, dass TGs und PSs einen erheblichen Einfluss hattendie durch Ischämie/Reperfusion verursachte neuronale Schädigung abschwächen.

TGs mildern die BHS-Störung nach I/R-behandelten Ratten

Der Evans-Blue-Assay ist eine klassische Methode zur Untersuchung der Veränderung der BHS-Permeabilität. Die Versuchsergebnisse zeigten, dass in der MOD-Gruppe ein erhöhter Evans-Blau-Anteil beobachtet wurde, während bei den mit TGs und EDI behandelten Ratten ein signifikant verringerter Evans-Blau-Anteil beobachtet wurde. Darüber hinaus gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen PS- und OS-Therapiegruppen (Abbildung 5). Diese Ergebnisse legen nahe, dass TGs die Störung der Blut-Hirn-Schranke erheblich abschwächen könnten.

TGs fördern die Angiogenese bei I/R-verletzten Ratten

Neuere Studien zeigen, dass die Angiogenese eine entscheidende Rolle bei der Wiederherstellung der neurologischen Funktion und den prognostischen Ergebnissen nach einem akuten ischämischen Schlaganfall spielt (Yuen et al., 2015). Um die Auswirkungen von TGs, PSs und OSs auf die Angiogenese zu bewerten, wurden CD31 und a-SMA zur Quantifizierung der Kapillarzahlen verwendet. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass die MOD-Gruppe im Vergleich zu normalen Ratten einen bemerkenswerten Rückgang der Expression von CD31 (Abbildungen 6A, B) und a-SMA (Abbildungen 6C, D) im Halbschatten ischämischer Bereiche von I/R-Ratten verursachte . Dieses Ergebnis verdeutlicht, dass I/R Gefäßschäden im Kortex-Halbschatten ischämischer Hemisphären verursachen kann. Die TGs- und EDI-Behandlung erhöhte jedoch die Kapillardichte, Angiogenese und Arteriogenese deutlich, was durch eine erhöhte Expression von CD31 und a-SMA angezeigt wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass TGs die Angiogenese im ischämischen Halbschatten von I/R-Ratten fördern könnten, PSs und OSs jedoch nicht.

TGs erhöhen die Expression von Tight-Junction-Proteinen bei Ratten mit I/R-Verletzung

Eine Störung der Blut-Hirn-Schranke kann den Wassergehalt im Gehirn erhöhen und zu einer Schwellung des Gewebes führen, was zu einer Hirnschädigung führen kann. Tight-Junction-Proteine ​​sind wichtige Strukturbestandteile der BHS. Um zu testen, ob die Behandlung mit TGs, PSs und OSs nach einem Schlaganfall die BHS-Integrität beeinflussen könnte, wurden die Expressionen von ZO-1, Claudin-5 und Occludin mittels Immunfluoreszenzanalyse durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression von Claudin-5, Occludin und ZO-1 in der MOD-Gruppe sichtbar verringert war. Sie stiegen jedoch 14 Tage nach der Verabreichung deutlich an. PSs- und OSs-Gruppen zeigten keine signifikanten Veränderungen in diesen Proteinexpressionen (Abbildung 7). Diese Daten deuten darauf hin, dass die TGs die Expression von Tight-Junction-Proteinen regulieren und wahrscheinlich die BHS-Integrität nach einer I/R-Verletzung aufrechterhalten können.

TGs erhöhen die Perizytenbedeckung der Kapillaren bei Ratten mit I/R-Verletzung

Die Perizytenbedeckung der Kapillaren spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der BHS-Integrität. Daher haben wir getestet, ob die Perizytenabdeckung durch die Behandlung mit TGs, PSs und OSs erhöht werden kann. Die Ergebnisse der Immunfluoreszenz-Intensitätsanalyse zeigten, dass sowohl die PDGFRb- als auch die CD31-Expression in der MOD-Gruppe dramatisch verringert waren. Die Verabreichung von TGs an die I/R-Ratten erholte sich signifikant oder steigerte sogar die Expressionsintensitäten von PDGFRb und CD31, es wurde jedoch kein Unterschied in den PSs- und OSs-Behandlungsgruppen beobachtet (Abbildung 8). Somit könnte die Behandlung von TGs die Perizytenabdeckung erheblich erhöhen. Diese Ergebnisse bestätigten weiter, dass TGs die Integrität der BHS nach I/R aufrechterhalten können.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUR VERHINDERUNG DES ISCHÄMISCHEN SCHLAGANFALLS PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %