Ultraschallunterstützte Extraktion von Phenolsäuren, Flavonolen und Flavan-3-olen aus Muscadine-Traubenschalen und -samen unter Verwendung natürlicher tiefeutektischer Lösungsmittel und prädiktiver Modellierung durch künstliche neuronale Netzwerke

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AbstraktDas Ziel dieser Studie war es, die Extraktionseffizienz von 9 natürlichen tiefeutektischen Lösungsmitteln (NDES) mit Hilfe von Ultraschall für zu untersuchenPhenolsäuren, Flavonoleund Flavan-3-ole in Schalen und Samen von Muscadine-Trauben (Carlos) im Vergleich zu 75-prozentigem Ethanol. Künstliche neurale Vernetzung (ANN) wurde angewendet, um den NDES-Wassergehalt, die Ultraschallzeit, das Feststoff-zu-Lösungsmittel-Verhältnis und die Extraktionstemperatur zu optimieren, um die höchsten Extraktionsausbeuten für Ellagsäure, Catechin und Epicatechin zu erzielen. Ein neu formuliertes NDES (#1) besteht aus Cholinchlorid:Lävulinsäure: Ethylenglycol 1:1:2 und 20 Prozent Wasser extrahierten mit 22,1 mg/g die höchste Menge an Ellagsäure in der Haut. Diese Ausbeute war 1,73--mal so hoch wie die von 75-prozentigem Ethanol. Ein modifiziertes NDES (#3), bestehend aus Cholinchlorid: Prolin: Apfelsäure 1:1:1 und 3 0 Prozent Wasser extrahierte die höchste Menge an Catechin (0,61 mg/g) und Epicatechin (0,89 mg/g) in der Haut und 2,77 mg/g bzw. 0,37 mg/g im Samen. Die optimale Ausbeute an Ellagsäure in der Haut unter Verwendung von NDES #1 betrug 25,3 mg/g (beobachtet) und 25,3 mg/g (vorhergesagt). Die optimale Ausbeute an (Catechin plus Epicatechin) im Samen unter Verwendung von NDES #3 betrug 9,8 mg/g (beobachtet) und 9,6 mg/g (vorhergesagt). Diese Studie zeigte die hohe Extraktionseffizienz ausgewählter NDES für Polyphenole unter optimierten Bedingungen.

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Einführung

Natürliche tiefeutektische Lösungsmittel (NDES) werden durch Mischen von Wasserstoffbrückendonoren mit Wasserstoffbrückenakzeptoren in einem geeigneten Molverhältnis hergestellt [1]. Der Schmelzpunkt einer Komponente sollte niedriger sein als der Schmelzpunkt der anderen [1]. Nach dem Erhitzen und Mischen wird dieses Medium bei Raumtemperatur flüssig. Wasser wird hinzugefügt, um die Mischung zu stabilisieren und zu polarisieren. Die Forschung auf dem Gebiet der phytochemischen Extraktion mit NDES hat sich aufgrund ihrer effektiven Extrahierbarkeit und Löslichkeit ausgeweitet. Nichtsdestotrotz spielen mehrere Faktoren eine wichtige Rolle beim Vergleich von NDES mit organischen Lösungsmitteln, einschließlich Ausbeute, Kosten, Wiederfindung und Toxizität. Frühere Forschungsarbeiten untersuchten NDES zur Extraktion verschiedener Polyphenole aus verschiedenen Lebensmittelmatrizes. Bubalo et al. (2016) verglichen 5 NDES, Wasser, 70 % Methanol (v/v) und angesäuertes 70 %iges Methanol (v/v), um Anthocyane, Catechin und Quercetin-3-O-Glucosid aus roten Traubenschalen zu extrahieren. A NDES bestehend aus Cholinchlorid: Oxalsäure (1:1) mit 25 Prozent Wasser (v/v) erwies sich als das effizienteste Extraktionslösungsmittel [2]. In einer anderen Studie stellten Pani´c et al. (2019) testeten 8 NDES und säuerten 70 Prozent Ethanol an und beobachteten Cholinchlorid: Zitronensäure (2:1) mit 30 Prozent Wasser (v/v) als das beste NDES, um Anthocyane aus Traubentrester zu extrahieren [3]. Muscadine-Trauben (Vitis rotundifolia) sind in den südöstlichen Bundesstaaten beheimatet und die erste kultivierte Wildrebe in den Vereinigten Staaten [4]. Muscadine-Trauben werden in 12 Bundesstaaten produziert und umfassen insgesamt etwa 5000 Morgen [5]. Es gibt 100 Sorten von Muscadine-Trauben und jede unterscheidet sich in physikalischen, sensorischen oder chemischen Eigenschaften [4]. Unter ihnen ist Carlos aufgrund ihrer hohen Ernteerträge und wachsenden Konsistenz eine weit verbreitete Muscadine-Traube [4]. Carlos Muscadine-Traube ist mittelgroß, bronzefarben, dicker in der Haut und enthält im Durchschnitt vier Samen [6]. Muscadine-Trauben enthalten erhebliche Mengen anPolyphenoledie bekanntermaßen Entzündungen reduzieren [7], das Wachstum von Prostatatumoren hemmen [8] und die Stoffwechselreaktionen von Diabetikern verbessern [9]. Muscadine-Traubentrester, ein Nebenprodukt der Muscadine-Traubenentsaftung oder Weinherstellung, besteht aus Schalen und Samen. In einer früheren Forschungsstudie wurde eine Mischung aus Aceton: Wasser: Essigsäure (70:29,7:0,3, v/v) verwendet, um phenolische Verbindungen aus den Samen, der Haut und dem Fruchtfleisch von acht Sorten der in Florida angebauten Muscadine-Traube zu extrahieren. einschließlich Carlos [10]. Die Verwendung brennbarer organischer Lösungsmittel und ihre geringe Extraktionseffizienz behinderten jedoch praktische Anwendungen. Der größte Teil des Muscadine-Traubentresters wird immer noch als Abfall entsorgt. Artificial Neural Networking (ANN) ist ein nichtlineares Abbildungssystem, das aus verschiedenen grundlegenden Verarbeitungseinheiten besteht, die durch gewichtete Assoziationen verbunden sind. Diese Verarbeitungseinheiten werden "Neuronen" genannt [11]. Künstliche neuronale Vernetzung ist ein Ansatz des maschinellen Lernens, um eine Reaktion basierend auf mehreren Eingaben vorherzusagen oder vorherzusagen [11]. Frühere Forschungen haben Response-Surface-Methoden (RSM) zur Extraktionsoptimierung und -vorhersage angewendet. Allerdings haben nur wenige Studien KNN für den gleichen Zweck verwendet. Sinha et al. (2013) schlugen vor, dass ANN eine bessere Vorhersageleistung als RSM bei der Extraktion von natürlichem Farbstoff aus Samen von Bixa Orellana (Annatto) hat [12]. In einer ähnlichen Studie haben Ciric et al. (2020) berichteten, dass das ANN-Modell besser als RSM war, um die Extraktion von Phenolverbindungen aus Knoblauch vorherzusagen [13]. Das Ziel dieser Forschung war es, die Extraktionseffizienz von 9 NDES für Phenolsäuren, Flavonole und Flavan-3-ole im Vergleich zu 75-prozentigem Ethanol mit Hilfe von Ultraschall zu untersuchen. ANN wurde angewendet, um die Extraktionsbedingungen für die Phenolausbeute vorherzusagen und zu optimieren. Die Hypothese war, dass NDES mit spezifischen Zusammensetzungen höhere Mengen an Phenolsäuren, Flavonolen und Flavan-3-olen extrahieren als 75-prozentiges Ethanol, und dass die höchste Extraktionseffizienz durch ANN-basierte Vorhersagemodellierung erreicht werden kann.

2. Materialien und Methoden 2.1. Chemikalien und Reagenzien Cholinchlorid, Lävulinsäure, 1,2--Propandiol, DL-Äpfelsäure, Oxalsäure, Salzsäure und Ameisensäure wurden von Acros Organics (Morris Plains, NJ, USA) bezogen. Milchsäure, Ethylenglycol, Glycin, Acetonitril in HPLC-Qualität, Methanol und Ethanol wurden von Fishers Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) bezogen. L-Prolin und Betainhydrochlorid wurden von Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA) bezogen. HPLC-Standards von Ellagsäure, Gallussäure, Ferulasäure, (plus)-Catechin, (–)-Epicatechin, Myricetin, Quercetin und Kaempferol wurden von Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen.

2.2. Design von NDESNDES Nr. 1–2 in Tabelle 1 wurden in unserer vorherigen Studie entworfen [14]. Cholinchlorid in NDES Nr. 1–2 wurde als Wasserstoffakzeptor ausgewählt, während für jede neue NDES zwei verschiedene Wasserstoffdonoren ausgewählt wurden. In Vorversuchen wurden Molverhältnisse zwischen Wasserstoffdonoren und -akzeptoren sowie der Wassergehalt bestimmt. NDES Nr. 3–9 in Tabelle 1 wurden aus der Literatur ausgewählt, da frühere Studien sie als wirksame NDES bei der Extraktion von Polyphenolen bezeichnet haben. Der Wassergehalt in NDES #3 wurde aus der zitierten Literatur modifiziert. Zur Herstellung des NDES wurde eine Heizmethode angewendet [15]. Kurz gesagt wurde der Wasserstoffbindungsakzeptor mit jeder der Wasserstoffbindungsdonatorkomponenten in Erlenmeyerkolben mit einem Rührstab gemischt. Die Mischung im Kolben wurde verschlossen und auf 50 ◦C für etwa 30 min erhitzt oder bis sich eine klare Flüssigkeit bildete und bei Raumtemperatur stabil blieb. Die Wassergehalte in Tabelle 1 wurden gemäß dem Endvolumen der NDES-Mischungen berechnet. Der in Tabelle 1 aufgeführte pH-Wert von NDES wurde unter Verwendung eines pH-Meters (AB15, Accumet, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemessen. 2.3. Probenvorbereitung / ultraschallunterstützte Extraktion Gefrorene Schalen und Samen von Muscadine-Trauben (Vitis rotundifolia) (Kultivar: Carlos) wurden von Paulk Vineyards (Wray, Georgia, USA) bereitgestellt. Nach dem Entfernen von Schalen, Blättern oder Blattstielen wurde der Trester in Samen und Haut getrennt. Die Proben wurden dann unter Verwendung eines Vakuumofens (Isotemp, Modell 285A, Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) bei 6 0 ◦C und einem Vakuumdruck von weniger als – 3 0 in.Hg getrocknet. Als nächstes wurden die Proben unter Verwendung einer chimären Mühle (A1{{105}}00, RRH Inc., 2800 W, Zhejiang, China) zu einem feinen Pulver homogenisiert. Unter Verwendung eines anfänglichen Feststoff-zu-Lösungsmittel-Verhältnisses von 1:20 (g:ml) wurden 0,50 g entweder Muscadine-Traubenhaut oder -samen in 10 ml NDES oder 75-prozentigem Ethanol in dreifacher Ausführung gemischt. Die Proben wurden dann in ein Wasserbad (60 ◦C) gestellt und 30 min bei 100 Prozent beschallt (VCX 1500, Sonics & Materials Inc., 1500- Watt, 50/60 Hz, Newtown, CT, USA). Amplitude für zwei Runden (15 min/Runde). Als nächstes wurden die Proben sofort bei 3.260 g zentrifugiert (Sorvall ST 8, Fisher Scientific, Suzhou, China), bis ein klarer Überstand erhalten wurde. Schließlich wurden die Überstände gesammelt und in einem –20 °C-Gefrierschrank für die HPLC-Analyse von Phenolsäuren (Ellagsäure, Gallussäure, Ferulasäure), Flavonolen (Myricetin, Quercetin und Kaempferol) und Flavan-3-olen gelagert (Catechin und Epicatechin). 2.4. HPLC-Analysen von Phenolsäuren, Flavonolen und Flavan-3-olen Phenolsäuren, Flavonole und Flavan-3-ole wurden auf einem HPLC-System (Agilent Technologies 1200, Waldbronn, Deutschland) nach der in beschriebenen Methode analysiert Sandhu und Gu (2013) [16]. Das HPLC-System besteht aus einer binären Pumpe, einem Autosampler, einem thermostatisierten Säulenfach, einem Diodenarray-Detektor und einem Fluoreszenzdetektor. Traubenschalen- oder Samenextrakte wurden vor den Analysen von Phenolsäuren und Flavonolen hydrolysiert. Die Hydrolyse wurde durchgeführt, indem 1 ml des Extrakts mit 4 ml Hydrolyselösung (1,2 M HCl mit 50 Prozent Methanol) gemischt und in ein Wasserbad (Precision, Modell 2837, 400 W, 50/60 Hz, Thermo Scientific, Marietta) gegeben wurden , OH, USA) bei 90 ◦C für 80 min. Als nächstes wurden die Proben auf 25 °C abgekühlt, gefolgt von einer 5-minütigen Beschallung. Die Hydrolyse des Extrakts wurde für die Analyse von Catechin und Epicatechin nicht benötigt. Die hydrolysierten und nicht hydrolysierten Extrakte wurden vor den HPLC-Analysen durch eine 0,45 &mgr;m Polytetrafluorethylen (PTFE)-Membran filtriert. Zur Analyse von Ellagsäure, Gallussäure, Ferulasäure, Myricetin, Quercetin, Kaempferol, Catechin und Epicatechin wurden 10 µl in eine SB-C18-Säule (4,6 × 250 mm, 5 µm, Zorbax, Agilent, Santa Clara, CA, VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA). Die mobilen Phasen waren (A) 0,5 % Ameisensäure und (B) 100 % Acetonitril. Die Flussrate betrug 1 ml/min mit einem 25-minütigen modifizierten Gradienten wie folgt: 0–5 min, 10–30 Prozent B; 5–10 min, 30–40 Prozent B; 10–20 min, 40–50 Prozent B; 20–25 min, 50–10 Prozent B; gefolgt von 5 min Äquilibrierung. Die Temperatur der Säule wurde auf 30 °C eingestellt. Die Detektionswellenlänge betrug 260 nm für Ellagsäure, Gallussäure und Ferulasäure und 360 nm für Myricetin, Quercetin und Kaempferol auf einem Photodioden-Array-Detektor. Die Anregung und Emission für Catechin und Epicatechin waren 230 nm bzw. 321 nm unter Verwendung eines Fluoreszenzdetektors. Polyphenolverbindungen wurden unter Verwendung von Standardkurven von Ellagsäure, Gallussäure, Ferulasäure, Myricetin, Quercetin, Kaempferol, Catechin und Epicatechin quantifiziert. Alle Standardkurven hatten 7 Punkte und R2 > 0,99. 2.5. Kundenspezifisches Design für künstliche neuronale Vernetzung Vier unabhängige Extraktionsvariablen mit vier Stufen: Wassergehalt (15–60 Prozent), Ultraschallzeit (5–35 min), Feststoff-zu-Lösungsmittel-Verhältnis (1:5–1:20) und Extraktion Temperatur (30–60 ◦C) (Tabelle S1) angewendet, um die Extraktionsausbeute von Phenolsäuren, Flavonolen und Flavan-3-olen zu optimieren. Im Gegensatz zu den klassischen Designs wie dem Response-Surface-Design erfordert das ANN-basierte Design keine wiederholten Läufe und bevorzugt eine andere Datenstruktur. In unserer vorherigen Studie [14] war ANN eine zuverlässigere Methode zur Vorhersage des Extraktionsertrags als RSM. Daher wurde ANN in dieser Studie ausgewählt, um die Extraktionsausbeute von Ellagsäure, Catechin und Epicatechin vorherzusagen. Ein angepasstes Design mit 40 Durchläufen (Tabelle S2) wurde auf JMP Pro (Version 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) generiert, um Daten speziell für die ANN-Vorhersagemodellierung bereitzustellen. Die Randomisierung der 40 Läufe wurde angewendet, um jegliche Verzerrung zu beseitigen. Die Hauptgleichung von ANN wird wie folgt dargestellt:=∑jj=1 wh jpg plus bhk, k=1toK (1) wobei h die Anzahl der Neuronen in der verborgenen Schicht ist, j und k sind die Anzahl der Eingangsvariablen bzw. verborgenen Neuronen, p ist die Eingangsvariable, bh ist die Vorspannung der verborgenen Schicht und wh ist das Gewicht in der verborgenen Schicht. Extraktionsausbeuten von Ellagsäure, Catechin und Epicatechin in Bezug auf die vier unabhängigen Variablen wurden unter Verwendung von ANN analysiert, indem die Daten zuerst trainiert und dann der beste Aktivierungstyp und eine Anzahl von Neuronen ausgewählt wurden, die zu einer angemessenen Anpassung der Daten führen. Um den Erfolg von Vorhersagemodellen zu bewerten, wurden drei Werte bewertet: R-Quadrat, die Quadratwurzel des mittleren quadratischen Vorhersagefehlers (RASE) (Gleichung (2)) und der durchschnittliche absolute Fehler (AAE). RASE ist RASE=̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅ SSE/n √ (2) Wobei SSE für das Quadrat und die Summe der Vorhersagefehler (Unterschiede zwischen den tatsächlichen Antworten und den vorhergesagten Antworten) und n für eine Reihe von Beobachtungen spendet. R-Quadrat nahe 1 mit RASE und AAE nahe null bedeutet eine bessere Anpassung der Daten an das Modell. 2.6. Statistik Extraktionsausbeuten von Phenolsäuren, Flavonolen und Flavan-3-olen wurden mit einfacher ANOVA, gefolgt von Student's t-Test bei p kleiner oder gleich 0,05 unter Verwendung von JMP Pro (Version 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Jedes nde und 75 Prozent Ethanol wurden unter Verwendung von Dunnett-Tests bei p kleiner oder gleich 0,05 verglichen. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde auf JMP Pro (Version 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) für die phenolischen Verbindungen durchgeführt, die aus Schalen und Samen von Muscadine-Trauben extrahiert wurden. 3. Ergebnisse und Diskussion 3.1. Durch NDES aus Muscadine-Traubenschalen extrahierte Polyphenole Neun NDES und 75 Prozent Ethanol wurden für die Extraktion von Polyphenolen aus den Muscadine-Traubenschalen verwendet. Tabelle 2 zeigt die Extraktionsausbeute von Ellagsäure, Gallussäure, Ferulasäure, Myricetin, Quercetin, Kaempferol, Catechin und Epicatechin. Ellagsäure war das am häufigsten vorkommende extrahierbare Polyphenol in Traubenschalen, gefolgt von Gallussäure bzw. Ferulasäure. Dieser Befund stimmte mit früheren Studien überein [17,18]. NDES Nr. 1, Nr. 8, Nr. 7, Nr. 3, Nr. 2 und Nr. 9 extrahierten deutlich höhere Mengen an Ellagsäure in Traubenschalen als 75-prozentiges Ethanol. Die höchste Extraktionsausbeute an Ellagsäure wurde von NDES Nr. 1 gefolgt von NDES Nr. 8 mit 22,1 ± 2,2 mg/g bzw. 21,3 ± 2,5 mg/g erzielt (Tabelle 2). Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen NDES Nr. 1 und NDES Nr. 8 gemäß Student's t-Test. Interessanterweise wurde festgestellt, dass NDES #1 das am wenigsten wirksame NDES ist, um Anthocyane daraus zu extrahieren

Preiselbeertrester [14]. Dies legt nahe, dass NDES #1 Ellagsäure oder Ellagitannine selektiv aus Lebensmittelmatrix extrahieren kann, die auch Anthocyanidine enthalten. Eine solche Selektivität kann auf Unterschiede in den molekularen Wechselwirkungen zwischen den NDES und spezifischen Phenolklassen zurückgeführt werden. Abbildung S1 (Tafel A) zeigt das HPLC-Chromatogramm von Gallussäure, Ellagsäure und Ferulasäure, die mit NDES #1 aus Traubenhaut extrahiert und bei 26 0 nm nachgewiesen wurden. Das 75-prozentige Ethanol extrahierte 12,7 ± 1,2 mg Ellagsäure pro Gramm Traubenhaut. Die niedrigste Extraktionsausbeute an Ellagsäure wurde in NDES Nr. 4 bei 7,44 ± 0,6 mg/g beobachtet. Die Extraktionsausbeute von Gallussäure durch NDES Nr. 9, Nr. 8, Nr. 1, Nr. 4, Nr. 7 und Nr. 3 war vergleichbar und signifikant höher als 75 Prozent Ethanol. Die höchste Menge an Gallussäure wurde von NDES #9 mit 10,4 ± 0,5 mg/g extrahiert, während die niedrigste Menge mit 5,55 ± {{40}} 0,1 mg/g wurden durch NDES #5 extrahiert. Die höchste Menge an Ferulasäure wurde von NDES Nr. 1 mit 6,32 ± 0,7 mg/g extrahiert und die niedrigste Menge wurde von NDES Nr. 5 mit 3,11 ± 0 extrahiert.{{5{{52 }}}} mg/g. Außerdem gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen NDES #1 und dem 75-prozentigen Ethanol beim Extrahieren von Ferulasäure (Tabelle 2). Die höchste Menge an Catechin und Epicatechin wurde von NDES #3 bei 0,61 ± 0,1 mg/g und 0,89 ± 0,1 mg/g extrahiert. g (Tabelle 2). In der Zwischenzeit extrahierten NDES Nr. 3 und Nr. 6 signifikant größere Mengen an Epicatechin als 75-prozentiges Ethanol. Abbildung S2 (Tafel A) zeigt das HPLC-Chromatogramm von Catechin und Epicatechin, die durch NDES #3 aus der Traubenhaut extrahiert wurden. Allerdings wurde Catechin in dem 75-prozentigen Ethanolextrakt nicht nachgewiesen. Die niedrigsten Mengen an Catechin (0.02 mg/g) und Epicatechin ({{90}}.14 mg/g) wurden von NDES #2 und NDES # extrahiert. 5 bzw. Myricetin war das am häufigsten vorkommende Flavonol und Kaempferol war das am wenigsten. Der Dunnett-Test ergab, dass NTEs und 75-prozentiges Ethanol bei der Extraktion von Myricetin, Quercetin und Kaempferol vergleichbar waren (Tabelle 2). Die höchste Myricetinmenge wurde durch NDES Nr. 1 (1,84 mg/g), gefolgt von 75 Prozent Ethanol (1,73 mg/g) und dann NDES Nr. 8 (1,67 mg/g) extrahiert. Die höchste Quercetin-Menge wurde mit 75-prozentigem Ethanol (0,41 mg/g), NDES Nr. 1 (0,40 mg/g) und NDES Nr. 8 ({ {143}},38 mg/g). Im Gegensatz dazu wurden die niedrigsten Mengen an Myricetin und Quercetin durch NDES #5 mit 0,87 mg/g bzw. 0,27 mg/g extrahiert. Dieser Befund unterstreicht weiter eine insgesamt schwache Fähigkeit von NDES #5, Polyphenole aus der Traubenhaut zu extrahieren. Die höchste Kaempferol-Menge wurde mit 75-prozentigem Ethanol extrahiert (0,05 mg/g), und die niedrigste wurde mit NDES #5 und NDES#6 (0,03 mg/g) extrahiert. Abbildung S1 (Tafel B) zeigt das HPLC-Chromatogramm von Myricetin, Quercetin und Kaempferol, extrahiert aus Traubenhaut durch NDES #1, nachgewiesen bei 360 nm. Die höchste Summenmenge an Phenolsäuren, Flavonolen und Flavan-3-olen betrug 40,7 mg/g, extrahiert mit NDES #1, gefolgt von 39,8 mg/g, extrahiert mit NDES #8, während die niedrigste Summe 18,4 mg/g extrahierte durch NDES Nr. 5 (Tabelle 2). Der pH-Wert von NDES lag im Bereich zwischen 0,3 und 3,3 (Tabelle 1). Die R²-Korrelation zwischen dem pH-Wert von NDEs und den Ausbeuten an Phenolsäuren, Flavonolen und Flavan-3-olen ist in Tabelle 2 aufgeführt. Das Fehlen einer Korrelation zwischen dem pH-Wert und den Extraktionsausbeuten deutet darauf hin, dass der pH-Wert die Extraktionseffizienz nicht beeinflusst. 3.2. Durch NDES aus Muscadine-Traubenkernen extrahierte Polyphenole Die Gesamtausbeute der Extraktion von Phenolsäuren, Flavonolen und Flavan- 3-olen aus Traubenkernen war deutlich niedriger als die aus Schalen (Tabelle 3). Die am häufigsten vorkommenden extrahierbaren Polyphenole in den Samen waren Catechin und Epicatechin, während Kaempferol nicht nachgewiesen wurde. Die komplexe ölhaltige Samenmatrix (13 Prozent, w/w Trockenbasis) ist eine mögliche Erklärung für die geringe Extrahierbarkeit von phenolischen Verbindungen aus den Traubenkernen [19]. Die höchste Menge an Catechin wurde von NDES #3 mit 2,77 mg/g extrahiert (Tabelle 3). Diese Ausbeute war signifikant höher als bei allen anderen NDES und 75 Prozent Ethanol. Abbildung S2 (Tafel B) zeigt das HPLC-Chromatogramm von Catechin und Epicatechin, die durch NDES #3 aus Traubenkernen extrahiert wurden. Die niedrigste Catechinmenge wurde durch NDES #5 mit 0,30 mg/g extrahiert. Alle NDES außer NDES Nr. 1, Nr. 2 und Nr. 9 extrahierten signifikant höhere Mengen an Epicatechin als 75-prozentiges Ethanol (Tabelle 3). Die höchsten Epicatechin-Konzentrationen wurden mit NDES #4 (0,71 mg/g) und NDES #5 (0,68 mg/g) extrahiert, während die niedrigsten mit 75 Prozent Ethanol (0,11 mg/g) extrahiert wurden. Gallussäure war die am häufigsten vorkommende extrahierbare Phenolsäure in den Traubenkernen, gefolgt von Ferulasäure bzw. Ellagsäure. Die höchste Gallussäuremenge wurde von NDES #4 mit 0,45 mg/g extrahiert, gefolgt von NDES #9 und NDES #8. Diese NTEs extrahierten deutlich höhere Mengen an Gallussäure als 75-prozentiges Ethanol. Die niedrigste Menge an Gallussäure (0,2 mg/g) wurde durch NDES #3 extrahiert. Die höchste Extraktion

Die Ausbeute an Ellagsäure wurde durch NDES Nr. 9 (0,26 mg/g) gefolgt von NDES Nr. 6 (0,17 mg/g) erhalten, die signifikant höher als 75 % Ethanol waren. In ähnlicher Weise extrahierten NTEs #3 die niedrigste Ellagsäuremenge bei 0,05 mg/g. Außerdem extrahierten NDES Nr. 6, Nr. 7 und Nr. 3 signifikant höhere Mengen an Ferulasäure als 75-prozentiges Ethanol. Die niedrigste Ferulasäureextraktionsausbeute betrug 0,5 mg/g gemäß NDES Nr. 5. Darüber hinaus wurde Ferulasäure im NDES #9-Extrakt nicht nachgewiesen. Dies lag wahrscheinlich daran, dass die Löslichkeit von Ferulasäure in NDES Nr. 9 geringer war als in anderen NTEs. Der höchste Myricetin-Extrakt wurde durch 75-prozentiges Ethanol und NDES Nr. 7 bei 0,18 mg/g erhalten, was höher war als bei allen NDEs. Die höchste Quercetin-Extraktionsausbeute war bei NDES #6 (0,14 mg/g) und NDES #3 (0,13 mg/g) und beide NDES waren besser als 75 % Ethanol. In ähnlicher Weise beeinflusste der pH-Wert von NDES die Extraktionsausbeute nicht, wie durch die geringe Korrelation (R-Quadrat) zwischen dem pH-Wert von NDEs und den Ausbeuten an Phenolsäuren, Flavonolen und Flavan-3-olen, die in Tabelle 3 aufgeführt sind, angezeigt wird. 3.3 . Es wurde eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) durchgeführt, um die Extraktionsausbeute verschiedener phenolischer Verbindungen in Traubenschalen und -kernen mit NDEs und 75-prozentigem Ethanol in Verbindung zu bringen (Abb. 1). Die PCA wurde an einer Korrelationsmatrix durchgeführt, um eine mögliche Selektivität einiger NDEs gegenüber der Extraktion bestimmter phenolischer Verbindungen oder Gruppen zu erkennen. Etwa 85 Prozent der Varianz der Hautdaten wurde durch die Hauptkomponenten 1 und 2 erklärt. Das Ladungsdiagramm (Abb. 1B) zeigt eine hohe Korrelation zwischen Phenolsäuren (Ellagsäure, Gallussäure, Ferulasäure) und Flavonolen (Myricetin, Quercetin, und Kämpferol). Um diese Gruppen zu extrahieren, sind die besten Lösungsmittel NDES Nr. 1, Nr. 8, Nr. 7 und 75-prozentiges Ethanol, wie im Score-Plot (Abb. 1A) gezeigt. In der Zwischenzeit schienen Catechin und Epicatechin von den übrigen Phenolgruppen getrennt zu sein. Wie in 1A gezeigt, war NDES #3 selektiv, um Catechin und Epicatechin aus Traubenschalen zu extrahieren. Dies war eine interessante Beobachtung, da NDES#3 zu den am wenigsten effektiven NDES gehörte, um Proanthocyanidine zu extrahieren, die Oligomere und Polymere von Catechin und Epicatechin sind [14]. Dies legt nahe, dass NDES #3 möglicherweise selektiv für Proanthocyanidine mit kleineren Molekülgrößen ist. Die Clusterbildung von phenolischen Verbindungen auf dem Beladungsplot der Schale (Abb. 1B) war anders als beim Samen (Abb. 1D), ungeachtet der geringen Erträge dieser Verbindungen in den Traubenkernen. Die erste und zweite Hauptkomponente erklärten etwa 73 Prozent der Varianz der Seed-Daten. Quercetin, Myricetin und Ferulasäure wurden effizienter durch NDES Nr. 6, Nr. 7 und 75-prozentiges Ethanol extrahiert, wie im Score-Plot (Fig. 1C) gezeigt. Ellagsäure und Gallussäure wurden effektiver durch NDES #9 extrahiert. Wiederum wurde Catechin mit der höchsten Effizienz durch NDES #3 extrahiert, was ähnlich war wie bei Traubenhäuten. Epicatechin wurde mit höherer Effizienz durch NDES #5, #4 und NDES #8 extrahiert.

3.4. Extraktionsoptimierung von Phenolsäuren und Flavonolen aus Muscadine-Traubenschalen und ANN-Vorhersagemodellierung Cholinchlorid: Lävulinsäure: Ethylenglycol 1:1:2 (NDES #1) zeigte die höchste Extraktionsausbeute für Ellagsäure und wurde daher für eine weitere Optimierung ausgewählt und Vorhersage. Für die Extraktion von Phenolsäuren und Flavonolen wurden die Auswirkungen von vier Faktoren bewertet, darunter Wassergehalt, Ultraschallzeit, Feststoff-Lösungsmittel-Verhältnis und Extraktionstemperatur. Darüber hinaus wurden vier Ebenen für jeden Extraktionsfaktor in insgesamt 4 0 randomisierten Läufen angewendet. Die experimentelle Extraktionsausbeute von Ellagsäure, Gallussäure, Ferulasäure, Myricetin und Quercetin, zusammen mit der Summe dieser fünf, sind in Tabelle 4 gezeigt. Insgesamt war der Bereich der Differenz der Extraktionsausbeute zwischen dem niedrigsten und dem höchsten relativ groß für Phenolsäuren. Beispielsweise betrug die niedrigste Ausbeute für Ellagsäure 9,03 mg/g (Lauf Nr. 17) und die höchste 25,3 mg/g (Lauf Nr. 15), was zu einem Unterschied von 16,2 mg/g führte (Lauf Nr. 17). Darüber hinaus betrug die niedrigste Ausbeutesumme 20,7 mg/g und die höchste 71,5 mg/g. Dies veranschaulicht die signifikanten Auswirkungen der unterschiedlichen Niveaus jedes Extraktionsfaktors auf die Extraktionsausbeute. Durchlauf Nr. 15 extrahierte die höchste Menge an Ellagsäure. Die Extraktionsbedingungen von Durchlauf Nr. 15 waren 45 ml/10{{130}} ml Wassergehalt, 25 min Ultraschallbehandlung, 1:10 (g:ml) Feststoff-zu-Lösungsmittel-Verhältnis , und Extraktionstemperatur von 60 ◦C. Abbildung S3 zeigt das HPLC-Chromatogramm von optimierten Phenolsäuren, die von NDES #1 (Lauf Nr. 15 in Tabelle 4) aus Traubenhaut extrahiert wurden. Die höchste Gallussäure (18,7 mg/g) wurde unter Verwendung der Extraktionsbedingungen in Durchlauf Nr. 24 erreicht und die niedrigste war 6,63 mg/g unter Verwendung von Durchlauf Nr. 40. Für Ferulasäure extrahierte Lauf Nr. 22 die höchste Menge mit 19,2 mg/g, wohingegen in den Läufen Nr. 14, Nr. 17, Nr. 29 und Nr. 34 keine Ferulasäure nachgewiesen wurde. Versuch Nr. 22 wurde mit 60 ml/100 ml Wassergehalt, 5 min Ultraschallbehandlung, 1:5 für das Feststoff-zu-Lösungsmittel-Verhältnis und einer Extraktionstemperatur von 60 °C extrahiert. Durchlauf Nr. 2 extrahierte das höchste Myricetin (10,1 mg/g) und Quercetin (1,87 mg/g). Die Extraktionsbedingungen von Durchlauf Nr. 2 waren 60 ml/100 ml Wassergehalt, 35 min Ultraschallbehandlung, 1:20 für das Verhältnis von Feststoff zu Lösungsmittel und eine Extraktionstemperatur von 60 °C. Die niedrigste meiner sicheren Ausbeute (3,79 mg/g) wurde durch Lauf Nr. 40 extrahiert. Die Konturdiagramme in Fig. 2 zeigen die Wirkung der Extraktionsparameter (X1, X2, X3 und X4) auf die vorhergesagte Ausbeute an Ellagsäure, die durch NDES #1 aus der Traubenhaut extrahiert wurde. Die vorhergesagten Ausbeuten an Ellagsäure in Tabelle 4 wurden verwendet, um diese Zählkurven zu erstellen. Jede Tafel veranschaulicht die Auswirkungen von 2 Extraktionsparametern. Die Höhenlinien sind mit der Ausbeute an Ellagsäure (mg/g) beschriftet. Der optimal vorhergesagte Wassergehalt betrug etwa 35–45 ml/100 ml NDES, wie in Abb. 2B und 2C gezeigt. Eine längere Beschallungszeit erhöhte die Ausbeute an Ellagsäure (Abb. 2D und 2E), was auf eine entscheidende Rolle der Beschallung bei der NDES-Extraktion hinweist. Während der Extraktion wurden durch das Mischen von Traubenschalen oder -kernen mit NDES Partikel und Gas eingeführt, die akustische Kavitationsstellen für Ultraschall hinzufügten, um zahlreiche kleine Blasen im NDES zu erzeugen. Das Implodieren dieser Blasen führte zu extremen Temperaturen, Druckunterschieden, hoher Scherkraft, Makroturbulenzen und Mikrovermischung, die NDES effektiv bewegten, um die Massendiffusion und den Transfer zu beschleunigen. Wenn Kavitationsblasen auf der Oberfläche von Traubenkern- oder Hautpartikeln implodierten, führten die resultierenden Mikrostrahlen und Kollisionen zwischen den Partikeln zu Oberflächenablösung, Erosion, Partikelzerfall, Sonoporation und Zellzerstörung [20]. All diese mechanischen Effekte der ultraschallinduzierten Kavitation verstärkten das Eindringen von NDEs in das Zellinnere, so dass interzelluläre Phenole aus der Lebensmittelmatrix in Lösungsmittel überführt wurden. Das optimale Feststoff-zu-Lösungsmittel-Verhältnis war 1:10, wie durch Fig. 2B, 2D und 2F angezeigt. Schließlich scheinen höhere Extraktionstemperaturen bis zu 60 ◦C einen positiven Effekt auf die Ellagsäure-Extrahierbarkeit zu haben, wie in Abb. 2C, 2E und 2F gezeigt. Dies deutet auf eine direkte Beziehung zwischen der Extraktionstemperatur und der Ausbeute an aus der Traubenschale extrahierter Ellagsäure hin. Ellagsäure-Extraktionsausbeuten (Tabelle 4) wurden für die Vorhersagemodellierung unter Verwendung künstlicher neuraler Vernetzung analysiert. Die experimentellen Daten wurden zufällig in einen Trainingssatz und einen Validierungssatz aufgeteilt. Der Grund für die Einbeziehung eines Validierungssatzes durch die Statistiksoftware besteht darin, eine Überanpassung zu unterdrücken. Um die Ellagsäureausbeute (Y) vorherzusagen, wurden die gleichen vier unabhängigen Extraktionsfaktoren (X1, X2, X3 und X4), 1–2 verborgene Schichten mit einer unterschiedlichen Anzahl von Neuronen und drei Aktivierungsfunktionen bewertet. Die angewandten Aktivierungsfunktionen waren Tangente hyperbolisch, linear und Gauß. Als nächstes wurden die Datensätze trainiert, bis sowohl für das Training als auch für die Validierung ein hoher R-Quadrat-Wert erreicht wurde. Die Vorhersagedaten und ein Modell wurden generiert. Die beste KNN-Struktur wurde ausgewählt, indem die vier Eingaben (X1, X2, X3 und X4) mit einer verborgenen Schicht unter Verwendung der Gaußschen Funktion mit zehn Neuronen analysiert wurden (Abbildung S5). Das R-Quadrat der Trainings- und Validierungssätze betrug 0,99, während RASE und AAE des Modells 0,062 bzw. 0,044 betrugen. Das R-Quadrat der ANN-Validierung von Ellagsäure in dieser Studie (0,99) war höher als die ANN-Validierung von Procyanidinen (0,95) und Anthocyanen (0,91) in einer früheren Studie [14]. Dieser Anstieg von R2 kann jedoch auf die besser generierte Modellanpassung der Daten in dieser Studie zurückgeführt werden, was auf die kleineren experimentellen Fehler zurückzuführen sein könnte. Die prädiktiven ANN-Modelle für die Extraktion von Ellagsäure unter Verwendung von NDES #1 wurden als Gleichung 3–13 gezeigt:

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Fazit

Aktuelle Ergebnisse lieferten weitere Beweise für die Wirksamkeit der NDES-Fähigkeiten zur Extraktion von Polyphenolen aus Nebenprodukten der Lebensmittelindustrie. Die Ergebnisse unterstützten die Hypothese einer überlegenen ultraschallgestützten Extraktion von NDES über 75 Prozent Ethanol. NDES extrahierte effektiv drei Phenolsäuren, zwei Flavonole und drei Flavan-3-ole aus Traubenschalen und -kernen. NDES #1 war das effektivste NDES zum Extrahieren von Ellagsäure, während NDES #3 besonders selektiv zum Extrahieren von Catechin und Epicatechin war. Ein spürbarer Nachteil von NDES ist ihre hohe Viskosität, die bei der Handhabung und Rückgewinnung Herausforderungen mit sich bringt. In der vorliegenden Studie demonstrierte die künstliche neuronale Vernetzung ungeachtet ihrer Ergebnisbeschränkungen einen praktischen Ansatz für die Vorhersagemodellierung. NDEs sind robuste Medien, um sekundäre Pflanzenstoffe aus Lebensmittelsystemen zurückzugewinnen. Einige NTEs bieten auch ein weniger toxisches Lösungsmittel, um diese sekundären Pflanzenstoffe in lebenden Zellen zu untersuchen [21,22]. Endlich sind natürliche tiefeutektische Lösungsmittel wirksame alternative Extraktionsmedien zu organischen Lösungsmitteln.

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