Verwendung des Tissue Common Rejection Module Score bei Nierentransplantation als objektives Maß für Allotransplantatentzündung

Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com

Arya Zarinsefat 1*, Jose M. Arreola Guerra2, Tara Sigdel 1, Izabella Damm1, Reuben Sarwal 1, Chitranon Chan-on1, Gyula Szabo3, Jorge L. Aguilar-Frasco4, Xicohtencatl Ixtlapale-Carmona4,

Carlos Salinas-Ramos 4, Leonardo Ramirez-Martinez 4, Claudio Ramirez 4, Mario Vilatoba 4, Luis E. Morales Buenrostro 4, Josefifina M. Alberu 5 und Minnie M. Sarwal 1

Abteilung für Chirurgie, University of California, San Francisco, CA, Vereinigte Staaten,

2 Abteilung für Innere Medizin, Krankenhaus Centenario Miguel Hidalgo, Aguascalientes, Mexiko,

3 Institut für Pathologie, University of California, San Francisco, CA, Vereinigte Staaten,

4 Instituto Nacional de Ciencias Medicas y Nutricio´n Salvador Zubira´n, Mexico City, Mexiko,

5 Medizinische Fakultät, Tecnologico de Monterrey, Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Mexiko-Stadt, Mexiko

Langfristige Nierentransplantation(KT) Allotransplantat-Ergebnisse haben sich trotz eines besseren Verständnisses der Abstoßung und einer verbesserten Immunsuppression nicht wie erwartet verbessert. Frühere Arbeiten hatten einen berechneten Abstoßungswert validiert, das Tissue Common Rejection Module (tCRM), gemessen durch amplifikationsbasierte Bewertung von 11 Genen aus Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Biopsieproben, was eine quantitative, unvoreingenommene Bewertung des Immunsystems ermöglicht Verletzung. Wir haben tCRM in einer prospektiven Studie mit 124 KT-Empfängern angewendet und die Bewertung durch tCRM und histologische Messwerte von 2 unabhängigen Pathologen zum Protokoll und zu Biopsien nach der Transplantation gegenübergestellt. Vier 10--mm-Schnitte aus FFPE-Biopsieproben wurden für die RNA-Extraktion und Amplifikation durch qPCR der 11 tCRM-Gene verwendet, aus denen der tCRM-Score berechnet wurde. Biopsiediagnosen von entweder akuter Abstoßung (AR) oder grenzwertiger Abstoßung (BL) wurden als Entzündung angesehen, während stabile Biopsien keine Entzündung aufwiesen. Von den 77 Biopsien, die von beiden Pathologen gelesen wurden, waren insgesamt 4 0 Abweichungen in der Diagnose vorhanden. Die medianen tCRM-Werte für AR, BL und stabile Diagnosen betrugen 4,87, 1,85 bzw. 1,27, mit einem insgesamt signifikanten Unterschied zwischen allen histologischen Gruppen (Kruskal-Wallis, p < 0).0{="" {34}}01).="" es="" gab="" signifikante="" unterschiede="" in="" den="" tcrm-scores="" zwischen="" pathologen,="" die="" beide="" eine="" entzündung="" vs.="" uneinigkeit="" (p="0.003)" und="" beide="" eine="" entzündung="" vs.="" beide="" keine="" entzündung="" fanden="" (p="">< 0,001),="" zusammen="" mit="" der="" gesamtsignifikanz="" zwischen="" allen="" scores="" (="" kruskal-wallis,="" p="">< 0,001).="" ein="" logistisches="" regressionsmodell="" zur="" vorhersage="" der="" transplantatentzündung="" unter="" verwendung="" verschiedener="" klinischer="" prädiktorvariablen="" und="" tcrm="" ergab,="" dass="" der="" tcrm-score="" der="" einzige="" signifikante="" prädiktor="" für="" die="" transplantatentzündung="" war="" (or:="" 1,90,="" 95-prozent-ki:="" 1,40–2,68,="" p="">< 0,0001).="" eine="" genaue,="" quantitative="" und="" unvoreingenommene="" bewertung="" der="" ablehnung="" der="" klinischen="" probe="" ist="" entscheidend.="" angesichts="" der="" unterschiedlichen="" diagnosen="" zwischen="" pathologen="" bei="" denselben="" proben="" könnten="" einzelpersonen="" den="" tcrm-score="" als="" tiebreaker="" in="" unklaren="" situationen="" verwenden.="" wir="" schlagen="" vor,="" dass="" der="" quantitative="" tcrm-score="" eine="" unvoreingenommene="" quantifizierung="" der="" transplantatentzündung="" liefern="" kann="" und="" seine="" schnelle="" bewertung="" durch="" pcr="" auf="" der="" ffpe-rasur="" zu="" einem="" entscheidenden="" hilfsmittel="" werden="" kann,="" um="" die="" klinische="" entscheidungsfindung="" und="" die="" bereitstellung="" von="" immunsuppression="">

Schlüsselwörter:Nierentransplantation, akute Abstoßung, Biomarker, Transkriptomik, Formalin-fixiertes Paraffin-eingebettet (FFPE), Transplantatentzündung

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EINLEITUNG

Nierentransplantation(KT) bleibt die bevorzugte Behandlung für Patienten mit Nierenerkrankungen im Endstadium, mit niedrigeren Sterblichkeitsraten im Vergleich zu Patienten auf der Warteliste und verbessertem Überleben in verschiedenen demografischen Gruppen (1–3). Trotz deutlicher Verbesserungen in einem JahrNiereAllotransplantat-Überlebensrate (4), bleibt die Rate des chronischen Transplantatverlusts nach dem ersten Jahr nach der Transplantation beträchtlich. Dies wurde trotz eines besseren Verständnisses der Abstoßung von Allotransplantaten zusammen mit dem Aufkommen einer verbesserten Immunsuppression beobachtet. Gegenwärtige Klassifikationsmethoden der histologischen Abstoßung leiden unter Stichprobenfehlern und der Unfähigkeit, die entzündliche Belastung im Allotransplantat genau zu quantifizieren, ein wichtiger Prädiktor für die langfristige Funktion und das Überleben des Transplantats (5–9). Wichtig ist, dass frühere Studien gezeigt haben, dass die pathologische Korrelation der Banff-bewerteten Nieren-Allotransplantat-Pathologie wesentliche Diskrepanzen zwischen den Biopsie-Interpretationen aufweist (10, 11).

Frühere Arbeit in unserem Labor zur Analyse von Microarray-Gesamtgenomdaten von 1.030Niere, Herz-, Lungen- und Leber-Allotransplantatbiopsien identifiziert agemeinsame immunDas Response-Modul (CRM) aus 11 Genen, die die akute Abstoßung (AR) bei verschiedenen Allotransplantaten (12–14) definieren, wurde anschließend validiertNiereAllotransplantatbiopsien (15, 16). Während diese Daten den potenziellen Nutzen der Verwendung eines objektiven Maßes wie des CRM-Scores zur Unterstützung der Biopsiediagnose demonstrierten, handelte es sich dabei um retrospektive Analysen von zuvor eingelagertem Gewebe. Darüber hinaus wurden keine Vergleiche zwischen mehreren verblindeten Pathologie-Reads derselben Biopsie oder der potenziellen Fähigkeit des CRM-Scores angestellt, als objektiver Tiebreaker oder zusätzlicher Datenpunkt verwendet zu werden, um zu einer robusteren Diagnose zu gelangen.

In dieser Analyse haben wir uns Serien angesehenNiereBiopsien, die im Rahmen einer klinischen Studie bei KT gewonnen wurden. Wir wendeten unser Protokoll an, das die Genexpression der 11 CRM-Gene aus RNA misst, die aus vier 10--Mikron-Rasen eines formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Blocks mit histologisch bestätigten Phänotypen von AR, Borderline-Abstoßung (BL), und stabile Diagnosen. Aufgrund der Anwendung des CRM-Scores auf Biopsiegewebe bezeichnen wir diesen Score als Gewebe-CRM (tCRM) (15, 16). Wir verglichen dann die Diagnosen von 2 verblindeten Pathologen und verglichen sie mit dem tCRM-Score für jede Biopsie. Wir stellten die Hypothese auf, dass der tCRM-Score als Datenpunkt zur Unterstützung der Biopsiediagnose und möglicherweise als objektiver Tiebreaker bei Meinungsverschiedenheiten zwischen Pathologen verwendet werden könnte.

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METHODEN

Patientenrekrutierung und Studiendesign

Patienten und Proben wurden im Rahmen der klinischen Studie TITRATE (Testing Immunosuppression Threshold in Renal Allografts To Extend eGFR) gesammelt. Seine Methodik kann auf dem Portal ClinicalTrials.gov eingesehen werden (Kennung: NCT02581436). Kurz gesagt, dies ist eine prospektive, verblindete, kontrollierte klinische Studie mit 124 KT-Empfängern, die zwei Arten von Manövern zugewiesen wurden, um die Wirksamkeit und Sicherheit in Bezug auf die rechtzeitige Erkennung von AR, glomerulärer Filtrationsrate (GFR) und Fibrose-Indizes zu bewerten in Protokollbiopsien 12 Monate nach KT. Die Überwachung der Nierenfunktion basierte auf GFR und Transplantatbiopsien, die gemäß Protokoll 3 und 12 Monate nach der KT und für die Ursache durchgeführt wurden. Induktions-Immunsuppression (IS) wurde basierend auf dem immunologischen Risiko mit Basiliximab (niedriges Risiko), Anti-Thymozyten-Globulin (hohes Risiko) oder ohne Induktionstherapie bei Patienten zugewiesen, die zwei Haplotypen gemeinsam hatten. Die Erhaltungstherapie basierte auf Tacrolimus, Mycophenolat und Prednison.

Die aktuelle Studie war eine ergänzende Analyse für die tCRM-Gene (15) in allen verfügbaren KT-Biopsien. Für unsere Studie waren nach Ausschluss der Tag-Null-Biopsien insgesamt 136 Biopsien mit übereinstimmender Biopsie-Histologie verfügbar, die alle von einem Pathologen am National Institute of Medical Sciences in Mexiko interpretiert wurden. Von diesen 136 Biopsien wurden 77 auch an die UCSF geschickt, um verblindete Ablesungen zur weiteren Beurteilung der Pathologenkorrelation zu erhalten. Biopsien wurden nach den zum Zeitpunkt der Studie neuesten Banff-Kriterien interpretiert (17). Jede Form von Transplantat-AR (akut zellulär oder Antikörper-vermittelt) wurde in einer AR-Kategorie zusammengefasst. Für die UCSF-gelesenen Biopsien waren detailliertere histopathologische Diagnosedaten verfügbar, einschließlich des Antikörper-vermittelten Abstoßungstyps (ABMR) und des T-Zell-vermittelten Abstoßungstyps (TCMR).

Gesamt-RNA-Extraktion

Wir folgten dem zuvor veröffentlichten Protokoll für die Extraktion von RNA aus FFPE-Geweben (18). Basierend auf unseren bisherigen Erfahrungen haben wir 4 × 10 mm dicke Schnitte verwendet, um Gesamt-RNA aus FFPE-Proben mit dem PureLink FFPE Total RNA Isolation it (Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA) zu extrahieren. Die Qualität der RNA-Daten wurde anhand des 260/280-Absorptionssignalverhältnisses und der RIN-Nummer bewertet.

cDNA-Synthese und Quantifizierung der Genexpression mittels qPCR

Insgesamt 5 0 ng RNA wurden mit SuperScript VILO (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA) revers in komplementäre DNA (cDNA) transkribiert und dann in einem zielspezifischen Amplifikationsschritt für alle 11 Gene mit TaqMan amplifiziert PreAmp Master Mix und TaqMan Primers and Probes (Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA) für insgesamt 18 Amplifikationszyklen. qPCR-Reaktionen wurden im Fluidigm BioMark FD-System (Fluidigm, South San Francisco, CA) unter Verwendung eines 18S-Gen-Housekeeping-Gens und Human XpressRef Universal Total RNA (Qiagen, Valencia, CA) als Referenz-RNA für 40 Zyklen durchgeführt. Die resultierenden Chipdaten wurden zunächst zur Qualitätskontrolle mit der BioMark Analysis Software Version 2.0 (Fluidigm, South San Francisco, CA) analysiert und die Ct-Werte wurden in eine Tabelle exportiert. Die Normalisierung der Daten erfolgte in zwei Schritten. Ct-Werte einzelner Gene wurden gegen den Ct-Wert von 18S für jedes Gen normalisiert, um dCt-Werte zu erhalten. Die dCt-Werte jeder Probe wurden gegen die dCt-Werte der Referenzprobe normalisiert, um ddCt-Werte zu erhalten, die anschließend verwendet wurden, um die Werte für die Faltungsänderung (RQ) für jedes Gen in jeder Probe zu berechnen. Der tCRM-Score wurde berechnet, indem das geometrische Mittel der 11 CRM-Gene für jede Probe genommen wurde, wie zuvor beschrieben (12).

Statistische Analyse

Alle Daten wurden für nachfolgende Analysen in R Version 3.6.2 (R Foundation, Wien, Österreich) importiert. Die demografischen Daten der Patienten (Tabelle 1) werden basierend auf einem tCRM-Score von mehr als oder weniger als 2,2 gezeigt, unserem zuvor bestimmten Grenzwert mit optimalem AUROC zur Vorhersage von AR (15). Statistische Tests wurden mit dem Student-t-Test für kontinuierliche Variablen und dem Chi-Quadrat-Test für kategoriale Variablen durchgeführt. Blasen- und Balkendiagramme des tCRM-Scores für jede pathologische Diagnosegruppe wurden unter Verwendung des ggplot2-Pakets erstellt. Signifikante Unterschiede zwischen allen pathologischen Gruppen und paarweise Unterschiede zwischen jeder Gruppe wurden durch den Kruskal-Wallis-Test bestimmt. Unüberwachtes hierarchisches Clustering unter Verwendung der verschiedenen pathologischen Gruppen und tCRM-Gene wurde durchgeführt, mit anschließenden Heatmaps, die unter Verwendung des Heatmap-Pakets erstellt wurden. Wir betrachteten tCRM-Werte über 2,2 als molekulare Abstoßungsdiagnose. Wir definierten eine Biopsie als positiv für eine Entzündung, wenn die pathologische Diagnose entweder AR oder BL war, und als negativ für eine Entzündung, wenn die Diagnose stabil war. Wir haben dann eine Übereinstimmungsvariable zwischen Pathologen erstellt, in der beide angaben, dass eine Entzündung vorhanden war, beide sagten, dass keine Entzündung vorlag, oder sie waren sich nicht einig, ob eine Entzündung vorhanden war. Anschließend wurden wie oben beschrieben Balkendiagramme und Heatmaps für die tCRM-Scores der Übereinstimmungsvariablen erstellt.

Wir haben ein logistisches Regressionsmodell berechnet, um das binäre Ergebnis einer Entzündung bei der Biopsie vorherzusagen. Wir geben das Alter des Empfängers, den Body-Mass-Index (BMI), die verzögerte Transplantatfunktion (DGF), das Geschlecht, das Induktionsschema, den Status des Lebendspenders, den männlichen Spender an den weiblichen Empfänger, frühere KT, Pre-KT-Dialyse und den tCRM-Score als Prädiktorvariablen ein das Model.

Wir erhielten die Delta-GFR jedes Patienten, berechnet als die Änderung der GFR zum Zeitpunkt der Biopsie von ihrer endgültigen GFR zwei Jahre nach der KT. Wir verwendeten den Pearson-Korrelationskoeffizienten, um die Delta-GFR mit dem tCRM-Score des Patienten zu korrelieren, der aus der Biopsie erhalten wurde. Dies wurde wiederholt, nachdem tCRM-Scores von weniger als 2 ausgeschlossen wurden. Wir verwendeten die höchsten spenderspezifischen Antikörper (DSA)-Spiegel, die durch andere Zytometrie für jeden Patienten gemessen wurden, dargestellt als mittlere FL-Fluoreszenzintensität (MFI), um eine Korrelation mit tCRM-Scores durchzuführen und Berechnen Sie den zugehörigen Pearson-Korrelationskoeffizienten. Diese Korrelation wurde auch im Scatterplot-Format dargestellt. Für die Analyse der seriellen Scores haben wir Patienten mit seriellen tCRM-Scores nach den Tagen nach der Transplantation aufgetragen, wobei wir uns auf die vier Patienten konzentrierten, die eine ursprüngliche AR-Diagnose hatten, behandelt wurden und denen dann eine nachfolgende Biopsie folgte. Zwei weitere Patienten mit erhöhten tCRM-Scores, die als stabile Diagnose gelesen wurden, dann aber bei ihren Folgebiopsien eine neue AR-Diagnose entwickelten, wurden ebenfalls aufgezeichnet. Das Studiendesign und die anschließende Analyse werden weiter in einer bildlichen Form zusammengefasst (Abbildung 1).

ERGEBNISSE

Nieren-Allotransplantat-Biopsiebefunde von zwei unabhängigen, verblindeten Pathologen

Patientendemographie und interessierende klinische Variablen zeigten keine wesentlichen Unterschiede zwischen Patienten mit tCRM-Werten größer oder kleiner als 2,2, mit Ausnahme des höheren Spenderalters bei Patienten mit erhöhten tCRM-Werten bei Posttransplantationsbiopsien (Tabelle 1). Insgesamt 77 Biopsien wurden von beiden Zentren untersucht, wobei Pathologe 1 (Mexiko) 16 AR, 21 BL und 40 stabile Biopsien diagnostizierte, während Pathologe 2 (UCSF) 10 AR, 39 BL und 28 stabile Biopsien diagnostizierte (Tabelle 2). . Es gab insgesamt 40 nicht übereinstimmende Diagnosen zwischen den Pathologen, wobei der Großteil dieser Nichtübereinstimmungen auf Unterschiede in der BL-Kategorie zurückzuführen war.

Tissue Common Rejection Module als Tiebreaker unterscheidet zwischen pathologischen Diagnosen

Wir untersuchten dann die Fähigkeit des tCRM-Scores, zwischen pathologischen Diagnosen für einen einzelnen Pathologen zu unterscheiden (unter Verwendung von Biopsien, die an der UCSF gelesen wurden, da wir über die detailliertesten verfügbaren histopathologischen Daten verfügten). Bei der Betrachtung der tCRM-Scores nach histologischer Diagnose sahen wir eine klare Trennung mit höheren tCRM-Scores bei Patienten mit AR im Vergleich zu BL/stabil und mit einem höheren Anteil an Scores > 2,2 bei AR-Patienten (Abbildung 2A). Die medianen tCRM-Werte und Interquartilbereiche (IQR) für AR, BL und stabile Diagnosen betrugen 4,87 (IQR: 2,44–6,99), 1,85 (IQR: 1,21–2,48) und 1,27 (IQR: 0,96– 2.14). Darüber hinaus gab es einen insgesamt signifikanten Unterschied zwischen allen histologischen Gruppen (p < 0,001),="" zusammen="" mit="" signifikanten="" unterschieden="" zwischen="" ar="" vs.="" bl="" und="" ar="" vs.="" stabilen="" paarweisen="" vergleichen="" (abbildung="" 2b).="" dies="" unterstreicht="" die="" korrelation="" von="" tcrm-scores="" mit="" banff-gradierter="">

Bei der Durchführung einer unbeaufsichtigten hierarchischen Clusterbildung der tCRM-Gene sehen wir eine relativ genaue Clusterbildung durch die pathologische Diagnose (Abbildung 2C). Bei genauer Untersuchung jeder Biopsie korreliert der entsprechende tCRM-Score (dargestellt als Farbverlauf) tendenziell mit der Diagnose, selbst wenn die Gruppierung nach Diagnose Heterogenität in den geclusterten Gruppen zeigt. Wir sehen höhere Werte bei Diagnosen, die ein höheres Maß an Entzündung widerspiegeln, was die Fähigkeit von tCRM anzeigt, Entzündungen im Allotransplantat ohne Voreingenommenheit zu unterscheiden und objektiv zu quantifizieren. Wenn wir unseren tCRM-Grenzwert von 2,2 (molekulare Entzündungsdiagnose) verwendet haben, sehen wir eine starke Häufung durch molekulare Diagnose. Ungeachtet dessen häufen sich die meisten AR und BL zusammen mit hoher Genexpression und hohen tCRM-Scores, mit dem Gegenteil für die meisten histologisch bewerteten stabilen Biopsien.

Tissue Common Rejection Module unterscheidet zwischen spezifischen Arten von Transplantatabstoßung

Anschließend untersuchten wir die Fähigkeit des tCRM-Scores, zwischen verschiedenen Arten der Abstoßung zu unterscheiden: C4d-positiv (n=9) und negativ ABMR (n=4), TCMR (n=3) , BL (n=21) und stabile (n=40) Biopsien. Die medianen tCRM-Scores und IQR für C4d-positive ABMR, C4d-negative ABMR, TCMR, BL und stabile Diagnosen waren 4,22 (IQR: 3,80–5,98), 3,47 (IQR: 1,71–6,51), 2.{ {23}} (IQR: 2,58–3,05), 1,91 (IQR: 1,32–2,88) bzw. 1,37 (IQR: 0,99–2,00). Darüber hinaus gab es einen insgesamt signifikanten Unterschied zwischen allen histologischen Gruppen (p < 0,001),="" zusammen="" mit="" signifikanten="" unterschieden="" zwischen="" paarweisen="" vergleichen,="" die="" c4d-positive="" abmr="" vs.="" tcmr,="" c4d-positive="" abmr="" vs.="" bl,="" c4d-positive="" abmr="" vs.="" stabil="" betrachteten="" ,="" tcmr="" vs.="" stabile="" und="" bl="" vs.="" stabile="" gruppen="" (abbildung="" 3a).="" dies="" unterstreicht="" einmal="" mehr="" die="" korrelation="" von="" tcrm-scores="" mit="" spezifischer="" banff-gradierter="">

Bei der Durchführung einer unbeaufsichtigten hierarchischen Clusterbildung der tCRM-Gene sehen wir ähnliche Clusterbildungsmuster basierend auf einer Transplantatentzündung wie zuvor beschrieben (Abbildung 3B). Bei den spezifischeren diagnostischen Kategorien C4d-positive und negative ABMR und TCMR sehen wir die bemerkenswerteste homogene Häufung zwischen ABMR-Gruppen. Wie zuvor, wenn jede Biopsie genau untersucht wird, korreliert der entsprechende tCRM-Score (dargestellt als Farbverlauf) tendenziell mit der Diagnose, selbst wenn die Gruppierung nach Diagnose Heterogenität in den geclusterten Gruppen zeigt. Wir sehen höhere Werte bei Diagnosen, die ein höheres Maß an Entzündung widerspiegeln, was die Fähigkeit von tCRM anzeigt, Entzündungen im Allotransplantat ohne Voreingenommenheit zu unterscheiden und objektiv zu quantifizieren. Letztendlich enthielt der erste Zweig unserer nicht überwachten Clusterbildung die Mehrheit der Proben, die irgendeinen Grad an Transplantatentzündung aufwiesen, insbesondere alle ABMR-, TCMR- oder BL-Fälle (Abbildung 3B).

Tissue Common Rejection Module diskriminiert durch Zustimmung/Ablehnung des Pathologen

Anschließend untersuchten wir die tCRM-Scores auf Zustimmung und Ablehnung unter den Pathologen, die wie zuvor erläutert definiert wurden. Von den 77 Biopsien nach der Transplantation, die von beiden Pathologen gelesen wurden, gaben beide an, dass bei 33,8 Prozent eine Entzündung bestand, bei 22,1 Prozent keine Entzündung, und sie stimmten dem Vorhandensein einer Entzündung bei 44,2 Prozent der Proben nicht zu. Bei der Untersuchung der tCRM-Scores stellten wir einen Anstieg der Scores fest, wenn die Zustimmungsvariable von keiner Entzündung, Ablehnung und Zustimmung zum Vorhandensein einer Entzündung fortschritt (Abbildung 4A). Es gab signifikante Unterschiede in den tCRM-Scores zwischen Pathologen, die sowohl eine Entzündung als auch keine Meinungsverschiedenheit fanden (p=0.003) und beide eine Entzündung fanden und beide keine Entzündung fanden (p < 0,001="" ),="" zusammen="" mit="" der="" gesamtsignifikanz="" zwischen="" allen="" werten="" (p=""><>

Bei der Durchführung einer unbeaufsichtigten hierarchischen Clusterung der tCRM-Gene sahen wir die Clusterung von Biopsieproben basierend auf der Übereinstimmungsvariablen (Abbildung 4B). Wir können sehen, dass die Cluster hoher Genexpression damit übereinstimmen, dass sich beide Pathologen auf das Vorhandensein einer Entzündung einigen, während im Gegensatz dazu eine niedrige Genexpression darauf hinweist, dass sich beide Pathologen darauf einigen, dass keine Entzündung oder Meinungsverschiedenheiten zwischen ihnen bestehen. Darüber hinaus sehen wir, dass der entsprechende tCRM-Score für jede Biopsie tendenziell höhere und niedrigere Scores bevorzugt, wenn sich die Pathologen auf eine Entzündung bzw. keine Entzündung geeinigt haben. Obwohl die Clusterbildung nicht perfekt ist, ist ein klarer Trend erkennbar.

Tissue Common Rejection Module als Prädiktor für Abstoßung und Transplantatfunktion Oben zeigen wir den klinischen Nutzen von tCRM in Bezug auf die Erstellung genauer pathologischer Diagnosen. Obwohl sich seine Anwendung dort auf eine traditionell durch Biopsie bestätigte Diagnose bezieht, wollten wir die Verwendung von tCRM in einem Modell zur Vorhersage von Abstoßung/Entzündung untersuchen. Unter Verwendung unserer binären Entzündungsvariablen (AR- und BL-Biopsien) haben wir ein logistisches Regressionsmodell erstellt, um das binäre Ergebnis der Entzündung bei der Biopsie vorherzusagen. Die verwendeten klinischen Variablen wurden zuvor beschrieben (Tabelle 3). Interessanterweise war der tCRM-Score (OR: 1,90, 95 Prozent-KI: 1,40–2,68, p < 0)="" der="" einzige="" signifikante="" prädiktor="" für="" eine="" pathologisch="" diagnostizierte="" entzündung.{{16="" }}01),="" während="" die="" anwesenheit="" eines="" männlichen="" spenders="" gegenüber="" der="" weiblichen="" empfängerin="" einen="" schutz="" mit="" grenzwertiger="" signifikanz="" darstellte="" (or:="" 0,27,="" 95-prozent-ki:="" 0,07–0,98,="" p="">

Anschließend untersuchten wir die Fähigkeit von tCRM, langfristige Veränderungen der GFR vorherzusagen. Wir korrelierten die Delta-GFR (von der GFR zum Zeitpunkt der Biopsie bis zur endgültigen GFR) mit dem tCRM-Score des Patienten aus dieser Biopsie (Pearson-Korrelationskoeffizient=0.21, p=0.{{6} }25). Wir haben dies dann wiederholt, nachdem wir tCRM-Scores von weniger als 2 ausgeschlossen hatten, sodass wir nur die höchsten tCRM-Werte betrachteten, um die Wirkung auf die Delta-GFR zu sehen, was zu einem Anstieg des Korrelationskoeffizienten auf 0,32 (p=0 führte. 05). Wir haben uns auch die Korrelation des höchsten DSA-Werts jedes Patienten mit dem zugehörigen tCRM-Wert (ergänzende Abbildung 1) angesehen, um festzustellen, ob es einen Zusammenhang zwischen den DSA-Werten und den tCRM-Werten gibt, die wir nicht als korreliert festgestellt haben (Pearson-Korrelationskoeffizient { {11}}, p=0.99).

Schließlich untersuchten wir Patienten mit seriellen Biopsien und tCRM-Scores. Serielle tCRM-Scores wurden pro Patient nach Tagen nach der Transplantation aufgetragen (Abbildung 4C). Es gab vier Patienten, die eine ursprüngliche AR-Diagnose hatten und behandelt wurden, gefolgt von einer anschließenden Biopsie (Abbildung 4C, rote Linien). Wir stellten fest, dass alle vier Patienten anfangs einen erhöhten tCRM-Score hatten und nach der Behandlung einen Rückgang ihres Scores aufwiesen, wobei nur bei einem Patienten bei der zweiten Biopsie AR diagnostiziert wurde. Bemerkenswert ist, dass zwei Patienten mit erhöhten tCRM-Scores, die vom Pathologen als stabile Diagnose gelesen wurden, einen Anstieg ihres tCRM-Scores und eine neue AR-Diagnose bei ihren Folgebiopsien entwickelten (Abbildung 4C, blaue Linien).

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DISKUSSION

Wir stellten die Hypothese auf, dass der tCRM-Score als Datenpunkt zur Unterstützung der Biopsiediagnose und möglicherweise als objektiver Tiebreaker bei Meinungsverschiedenheiten zwischen Pathologen verwendet werden könnte. Oben zeigen wir, dass der tCRM-Score zwischen pathologischen Diagnosen unterscheiden kann. tCRM ist in der Lage, zwischen kombinierten AR vs. BL vs. stabilen Proben zu unterscheiden und ist auch in der Lage, zwischen spezifischeren AR-Diagnosen wie ABMR vs. TCMR und ABMR vs. BL zu unterscheiden, wie wir oben gezeigt haben. Einer der bekannten Nachteile der kombinierten subjektiven/objektiven Natur der Banff-Kriterien besteht darin, dass Diskrepanzen zwischen Pathologen bestehen können, die identische Biopsieproben betrachten. Wir haben oben gezeigt, dass Meinungsverschiedenheiten zwischen Pathologen bezüglich der entzündlichen Belastung bei Nierenbiopsien weit verbreitet sind. Wir zeigen, dass, wenn sich Pathologen über das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer Entzündung einigen, dies tendenziell an den Extremen des tCRM-Scores liegt. Ein Teil des Nutzens des tCRM-Scores kann hier liegen, in seiner Fähigkeit, ein objektives Maß für Entzündungen bereitzustellen, aber auch als Entscheidungshilfe in Fällen dienen, in denen die Diagnose nicht klar ist, der tCRM-Score jedoch eindeutig auf die eine oder andere Weise weist. Zum Beispiel könnte ein Pathologe, der eine Biopsie liest, die nicht sicher ist, ob er sie als AR oder BL klassifizieren kann, aber einen sehr hohen tCRM-Score aufweist, objektiver und genauer bei der Diagnose von AR sein.

Darüber hinaus weist diese Studie darauf hin, dass der tCRM-Score verwendet werden kann, um langfristigere klinische Ergebnisse vorherzusagen. Obwohl die Korrelation zwischen Änderungen der GFR und höheren tCRM-Werten schwach ist, zeigten wir eine statistisch signifikante positive Korrelation zwischen ihnen, mit einer noch größeren Korrelation, wenn wir nach tCRM-Werten von mehr als 2 filterten, was darauf hindeutet, dass höhere Werte auf einen höheren Grad an Allotransplantat hindeuten Verletzung, die eine langfristig reduzierte Transplantatfunktion (größere Delta-GFR) vorhersagen kann. Interessanterweise fanden wir keine Korrelation zwischen den DSA-Werten der Patienten und den tCRM-Werten. Dies kann zum Teil auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass viele Patienten mit DSAs nicht unbedingt ABMR entwickeln, zusammen mit dem Wissen, dass verschiedene DSAs unterschiedliche Risiken für die tatsächliche Entwicklung von ABMR mit sich bringen können. Darüber hinaus haben wir durch die Verfolgung von Patienten mit seriellen Biopsien und tCRM-Scores gezeigt, dass die Mehrheit der Patienten mit erhöhten tCRM-Scores und AR eine anschließende Abnahme ihrer Scores aufwies, zusammen mit einer Verbesserung der Transplantatentzündung bei nachfolgenden Biopsien (die nachfolgende Histologie ging von AR zu stabil ). Bemerkenswerterweise gab es 2 Fälle, in denen die tCRM-Scores deutlich erhöht waren, die pathologische Diagnose jedoch bei der Biopsie stabil war. Beide Fälle führten zu einem noch stärker erhöhten tCRM-Score bei der anschließenden Biopsie mit einer entsprechenden pathologischen Diagnose von AR. Dies deutet auf die Möglichkeit einer Fehldiagnose aufgrund der subjektiven Art der histologischen Klassifizierung hin oder darauf, dass die erhöhte Expression der tCRM-Gene, die mit einer Transplantatentzündung korrelieren, möglicherweise vor den tatsächlichen pathologischen Befunden liegen, die zu einer Diagnose von AR führen würden. Unabhängig davon deutet dies auf die Nützlichkeit des objektiveren tCRM-Scores hin, um die Diagnose von AR zu erleichtern.

Es ist wichtig, zum Zeitpunkt einer invasiven Biopsie eine molekulare Quantifizierung der gesamten entzündlichen Belastung im Nieren-Allotransplantat zu erstellen (5, 6, 9). Unsere Methode erleichtert die Verwendung bereits verfügbarer Biopsieproben auf effiziente Weise (Gesamtexperimentzeiten betragen 4–6 h für die gezeigten Assays). Während nicht-invasive Tests, wie z. B. Spender-abgeleitete zellfreie DNA (dd-cfDNA), für die Frühdiagnose von AR vorgeschlagen werden (19–23), besteht ein Nachteil dieser Tests darin, dass sie das Zielgewebe nicht direkt abfragen Interesse, selbst wenn die dd-cfDNA aus dem Allotransplantat freigesetzt wird. Mit tCRM kann bereits entnommenes Biopsiegewebe unter Verwendung von minimalem Gewebe aus entweder frischen Biopsien oder archivierten FFPE-Blöcken verarbeitet werden, wobei der größte Teil des ursprünglichen FFPE-Blocks für zusätzliche histologische Analysen erhalten bleibt.

Unsere Studie ist teilweise durch die invasive Natur von tCRM begrenzt. Biopsien bleiben der Goldstandard und werden häufig entnommen, was eine molekulare Profilerstellung mit tCRM ermöglicht, aber letztendlich wäre ein Übergang zu nicht-invasiven Tests am Blut oder Urin für Patienten am idealsten. Unser Labor arbeitet derzeit an der Verwendung der CRM-Gene im Urin zur Unterstützung der Diagnose einer Transplantatabstoßung (14). Obwohl es sich bei dieser Studie um eine prospektive Studie handelte, wurde die Anwendung von tCRM außerdem nicht für die klinische Entscheidungsfindung verwendet, sondern war stattdessen eine explorative Analyse. Unsere zukünftige Arbeit würde davon profitieren, den tCRM-Score als möglichen Endpunkt zu betrachten oder den Score bei der Entscheidung über die endgültige pathologische Diagnose für eine Biopsieprobe tatsächlich zu berücksichtigen. Obwohl unsere Studienproben TCMR-Diagnosen enthielten, waren die meisten unserer verfügbaren Proben für die Analyse ABMR-Proben. Während wir zeigen, dass der tCRM-Score unabhängig von der Art der vorhandenen AR erhöht ist, müssen zukünftige Arbeiten eine größere Anzahl von Proben innerhalb jeder Kategorie spezifischer AR-Typen verwenden.

Wir haben gezeigt, dass der tCRM-Score in der Lage ist, zwischen pathologischen Diagnosen zu unterscheiden, indem wir bereits verfügbare FFPE-Proben verwenden. Wichtig ist, dass zwischen verschiedenen Pathologen Variabilität besteht, was in unseren Daten basierend auf zwei verblindeten Pathologen, die Diagnosen stellten, gezeigt wurde. Als solches zeigen wir, dass tCRM nicht nur bei der pathologischen Diagnose helfen kann, sondern insbesondere wenn Meinungsverschiedenheiten oder Unsicherheiten bestehen, der Score verwendet werden kann, um zu einer endgültigen, robusteren Schlussfolgerung zu gelangen.

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DATENVERFÜGBARKEITSERKLÄRUNG

Die Rohdaten, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels stützen, werden von den Autoren ohne unangemessenen Vorbehalt zur Verfügung gestellt.

ETHIK-ERKLÄRUNG

Die Studien mit menschlichen Teilnehmern wurden von UCSF IRB überprüft und genehmigt. Die Patienten/Teilnehmer gaben ihr schriftliches Einverständnis zur Teilnahme an dieser Studie.

AUTORENBEITRÄGE

AZ trug zum Analysedesign, zur Datenanalyse, Interpretation, zum Manuskriptschreiben und Manuskriptredaktion bei. JG trug zum Studiendesign, zur Datensammlung und zur Überprüfung des Manuskripts bei. TS trug zur Datenanalyse und Manuskriptbearbeitung bei. ID zur Probenverarbeitung beigetragen. RS und GS trugen zur Probenverarbeitung bei. CC trug zur Probenverarbeitung und -prüfung bei. JF, XC, CSR, LM und CR trugen zur Proben- und Datenbanksammlung bei. MV trug zur Patientenrekrutierung und Transplantation bei. LB trug zur Patientenrekrutierung bei. JA trug zum Studiendesign, zur Datensammlung und zur Überprüfung des Manuskripts bei. MS trug zum Studiendesign, zur Datenerhebung, zum Analysedesign und zur Überprüfung des Manuskripts bei. Alle Autoren haben zum Artikel beigetragen und die eingereichte Version genehmigt.

Verbesserung der Nierenfunktion cistanche tubulosa

VERWEISE

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