Lebensfähige und durch Hitze abgetötete probiotische Stämme verbessern die orale Immunität, indem sie die IgA-Konzentration in der Mundschleimhaut erhöhen

Abstrakt

Die Mund-Nasen-Schleimhautimmunität spielt eine entscheidende Rolle beim Schutz des Körpers vor bakterieller und viraler Invasion. Sichere probiotische Produkte wurden verwendet, um die menschliche Immunität und Mundgesundheit zu stärken. In dieser Studie haben wir die vorteilhaften Wirkungen gemischter lebensfähiger probiotischer Tabletten, bestehend aus Lactobacillus salivarius subsp., überprüft. salicinius AP-32, Bifdobacterium animalis subsp. lactis CP-9 und Lactobacillus paracasei ET-66 sowie hitzegetötete probiotische Tabletten, bestehend aus L. salivarius subsp. salicinius AP-32 und L. paracasei ET-66, zur oralen Immunität bei 45 gesunden Teilnehmern. Die Teilnehmer wurden nach dem Zufallsprinzip in lebensfähige Probiotika-, hitzegetötete Probiotika- und Placebogruppen eingeteilt. Die Behandlung dauerte 4 Wochen. Speichelproben wurden in den Wochen 0, 2, 4 und 6 gesammelt und die Populationen von Lactobacillus, Bifidobacterium und Streptococcus mutans sowie die IgA-Konzentration gemessen. IgA-Konzentrationen und Spiegel von TGF-beta und IL-10 in PBMC-Zellen wurden mit der ELISA-Methode quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass die IgA-Spiegel im Speichel bei Verabreichung beider lebensfähiger Substanzen (119,30 ± 12,63 %, ***P<0.001) and heat-killed (116.78±12.28%, ***P<0.001) probiotics for 4 weeks. Among three probiotic strains, AP-32 would effectively increase the levels of TGF-beta and IL-10 in PBMCs. The oral pathogen Streptococcus mutans was significantly reduced on viable probiotic tablet administration (49.60±31.01%, ***P<0.001). The in vitro antibacterial test confirmed that viable probiotics effectively limited the survival rate of oral pathogens. Thus, this clinical pilot study demonstrated that oral probiotic tablets both in viable form or heat-killed form could exert beneficial effects on oral immunity via IL-10, TGB-beta mediated IgA secretion. The effective dosage of viable probiotic content in the oral tablet was 109 CFUs/g and the heat-killed oral tablet was 1× 1010 cells/g.

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Einführung

Die Mund-Nasen-Schleimhaut, das Tor für den Kontakt mit inhalierten Antigenen, ist die vorderste Verteidigungslinie des menschlichen Immunsystems [1, 2]. Normalerweise dringen pathogene Viren oder Bakterien in die Schleimhäute der Mund-Nasen-Höhle ein, indem sie das lokale Immunsystem und die gesunde Mikrobiota bekämpfen [3]. Entzündungen und Symptome wie Husten, Halsschmerzen, laufende Nase und Fieber entstehen aufgrund der Immunantwort gegen invasive pathogene Viren und Bakterien [4]. Darüber hinaus ist Immunglobulin A (IgA) der wichtigste Immunfaktor im Speichel und reguliert die Homöostase der oralen Mikrobiota [5]. Mehrere Studien haben über die Fähigkeit von sekretorischem IgA berichtet, den Körper vor Infektionen durch virale Krankheitserreger zu schützen, darunter das Respiratory-Syncytial-Virus [6], das Rotavirus [7] und das Influenzavirus [7]. Sekretorisches IgA dient dem Schutz des Schleimhautepithels. Nicolas Millet et al. entdeckten, dass Schleimhaut-IgA eine kommensale Candida albicans-Dysbiose in der Mundhöhle verhindern kann [8]. Es verhindert auch die Ansammlung des oralen Krankheitserregers Streptococcus mutans, der Zahnbelag verursacht [9].

Darüber hinaus entdeckten Forscher, dass die orale Mikrobiota und ihre Metaboliten die Immunität an der oralen Barriere lokal beeinflussen können [10]. Frühere Studien zeigten die Wirksamkeit von Probiotika bei der Erhöhung der IgA-Konzentration in der Mundschleimhaut [11]. Ericson et al. zeigten, dass Kaugummi, der Lactobacillus reuteri enthielt, an der adaptiven Immunantwort gesunder Probanden beteiligt war, indem er die IgA-Spiegel im Speichel erhöhte [12]. Beim Menschen korrelieren die Immunzytokine TGF-beta und IL-10 mit der Produktion von IgA [13].

Es ist jedoch noch unklar, ob die orale Mikrobiota die sekretorischen IgA-Spiegel durch die Zytokine TGF-beta und IL-10 erhöht. Zu den oralen Krankheitserregern zählen außerdem S. mutans, P. gingivalis und F. nucleatum subsp. Polymorphismus und A. actinomycetemcomitans zeigten eine hohe Korrelation mit Parodontitis und Mundgeruch [14]. Probiotische Produkte könnten eine mögliche alternative Therapie zur Parodontitis sein, indem sie die oralen Krankheitserreger Fusobacterium nucleatum hemmen, aber Porphyromonas gingivalis und Aggregatibacter actinomycetemcomitans zeigten keinen signifikanten Rückgang [15]. Eine probiotische Nahrungsergänzung kann auch pathogene Infektionen verhindern [16]. Es wurde berichtet, dass wichtige Arten der Mikrobiota das Wachstum der pathogenen Streptococcus-Pneumonie begrenzten [17]. Daher kann die Aufrechterhaltung eines ausgewogenen mikrobiellen Ökosystems durch die Aufnahme probiotischer Stämme eine alternative Möglichkeit sein, die orale Immunität zu regulieren und die Mundgesundheit zu verbessern. Frühere Erkenntnisse zur Hemmung oraler Krankheitserreger durch probiotische Stämme haben gezeigt, dass Lactobacillus salivarius subsp. salicinius AP-32, Bifdobacterium animalis subsp. Lactis CP-9 und Lactobacillus paracasei ET-66 üben in vitro hervorragende antibakterielle Wirkungen aus; jedoch nicht durch den Mechanismus der Erhöhung des H2O2-Spiegels [18]. Die wichtigsten Strategien probiotischer Stämme zur Begrenzung des oralen pathogenen Wachstums waren die orale Co-Aggregation von Krankheitserregern, die Produktion von Biotensiden, die Veränderung der Mundumgebung und die Erzeugung antimikrobieller Substanzen [19]. Darüber hinaus zeigte eine In-vitro-Studie, dass L. salicinius AP-32 die inflammatorische Zytokin-Expression [Interleukin (IL)-8, IL-10] in menschlichen Epithelzellen vermittelt [20]. Daher haben wir in dieser Studie überprüft, ob gemischte lebensfähige probiotische Tabletten, bestehend aus L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. lactis CP-9 und L. paracasei ET-66 sowie hitzegetötete probiotische Tabletten, bestehend aus L. salivarius subsp. Salicinius AP-32 und L. paracasei ET-66 verbesserten die Immunfunktion über TGF-beta, IL-10 oder erhöhten die IgA-Konzentration im Speichel. Die antibakterielle Funktion der probiotischen Produktaufnahme in der Mundhöhle wurde getestet.

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Material und Methoden

Teilnehmer

Insgesamt wurden 45 gesunde Teilnehmer im Alter von 2 bis 40 Jahren rekrutiert und nach dem Zufallsprinzip in drei Untergruppen eingeteilt: die lebensfähige probiotische orale Tablette, die durch Hitze abgetötete probiotische orale Tablette und die Placebo-Gruppe. Jede Gruppe bestand aus 15 Teilnehmern. Teilnehmer mit Raucher- und Betelnuss-Essgewohnheiten wurden ausgeschlossen. Den Teilnehmern wurden orale Tabletten blind zugewiesen. Alle Teilnehmer nahmen die oralen Tabletten vier Wochen lang dreimal täglich (morgens, mittags und abends) ein. Speichelproben (2 ml) wurden gesammelt, um die IgA-Konzentration und die Mikroorganismenpopulationen in den Wochen 0, 2, 4 und 6 zu messen. Die Einverständniserklärung aller an dieser Studie beteiligten Teilnehmer wurde eingeholt. Das Protokoll wurde vom Institutional Review Board der Chung Shan Medical University, Taiwan (CS19052) genehmigt.

Lebensfähige probiotische orale Tabletten

Die lebensfähige probiotische orale Tablette (1 g) enthielt drei lebensfähige probiotische Stämme, L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. lactis CP-9 und L. paracasei ET-66. Wir haben 0.01 g von 1011 Koloniebildungseinheiten (KBE) eines einzelnen Probiotikums in die orale Tablette gemischt. Für jeden einzelnen probiotischen Stamm wurden etwa 0,33 * 109 KBE/g gemessen. Der gesamte probiotische Gehalt in der oralen Tablette betrug 109 Kolonie-KBE/g. Die aktive Dosierung der probiotischen Tablette zum Einnehmen entsprach früheren veröffentlichten Arbeiten [18]. Alle probiotischen Stämme wurden aus dem Labor von Biofag Biotech Co., Ltd. (Tainan, Taiwan) bezogen. L. salivarius subsp. salicinius AP-32 wurde aus einem gesunden menschlichen Darm isoliert und beim Food Industry Research and Development Institute, Taiwan (ID: BCRC 910437) und an der Wuhan University, China (ID: CCTCC-M2011127) hinterlegt; B. animalis subsp. Milchsäure-CP-9 wurde aus gesunder menschlicher Muttermilch isoliert und beim Food Industry Research and Development Institute, Taiwan (ID: BCRC 910645) und an der Universität Wuhan (ID: CCTCC-M2014588) hinterlegt; L. paracasei ET-66 wurde aus gesunder menschlicher Muttermilch isoliert und im Food Industry Research and Development Institute, Taiwan (ID: BCRC 910753) und im China General Microbiological Culture Collection Center, Peking, China (ID: CGMCC{) hinterlegt. {22}}). Lactobacillus. salivarius subsp. salicinius AP-32 und L. paracasei ET-66 wurden auf Agarplatten von de Man, Rogosa und Sharpe (MRS) (110.660, Merck, Darmstadt, Deutschland) kultiviert und unter fakultativ anaeroben Bedingungen bei 37 Grad inkubiert für 48 Std. B. animalis subsp. Lactis CP-9 wurde auf MRS-Agar, ergänzt mit 0,05 % Cystein, kultiviert und 48 Stunden lang bei 37 Grad anaerob inkubiert. Zur Quantifizierung der bakteriellen CFU nach der Kultivierung probiotischer Stämme wurde eine Zählung der Kolonien durchgeführt [18].

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Hitzegetötete probiotische orale Tabletten

Die hitzegetöteten probiotischen oralen Tabletten (1 g) bestanden aus inaktiviertem L. salivarius subsp. salicinius AP-32 und L. paracasei ET-66. Die lebensfähigen Stämme wurden wie zuvor beschrieben kultiviert und inkubiert. Anschließend wurden AP-32 und ET-66 durch einstündige Inkubation der lebensfähigen Stämme in MRS-Medien bei 100 Grad inaktiviert. Der probiotische Gehalt in der oralen Tablette betrug 1× 1010 Zellen/g. Die aktive Dosierung hitzegetöteter probiotischer oraler Tabletten erfolgte nach zuvor veröffentlichten In-vitro-Tests [11]. Alle experimentellen Verfahren wurden im Labor von Biofag Biotech Co., Ltd. (Tainan, Taiwan) durchgeführt.

Messung der Lactobacillus- und Bifidobacterium-Populationen in Speichelproben

Speichelproben (2 ml) wurden von jedem Teilnehmer in den Wochen 0, 2, 4 und 6 entnommen. Die Speichelproben (100 µL) wurden seriell verdünnt und zu MRS hinzugefügt Platten. Um die Lactobacillus-Populationen zu messen, wurde Lactobacillus auf den MRS-Agarplatten unter fakultativ anaeroben Bedingungen bei 37 Grad 48 Stunden lang kultiviert und inkubiert. Um die Bifdobacterium-Populationen zu messen, wurde Bifdobacterium 48 Stunden lang bei 37 Grad kultiviert und anaerob auf MRS-Agar, ergänzt mit 0,05 % Cystein, inkubiert. Zur Quantifizierung der bakteriellen CFU nach der Kultivierung probiotischer Stämme wurde eine Zählung der Kolonien durchgeführt. Die Lactobacillus- und Bifidobacterium-Populationsraten wurden auf die probiotische Populationszahl in Woche 0 normalisiert. Die in Woche 0 gesammelte Populationsrate von Lactobacillus und Bifidobacterium wurde als 100 % angesehen. Die experimentelle Methode orientierte sich an zuvor veröffentlichten Arbeiten [18].

Messung der IgA-Konzentration in der Mundschleimhaut

Speichelproben (2 ml) wurden von jedem Teilnehmer in den Wochen 0, 2, 4 und 6 entnommen und bei 2{14}} Grad gehalten. Zur Analyse der IgA-Konzentration wurde das IgA Human Uncoated ELISA Kit (Katalog-Nr. 88-50600-88; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) verwendet. Zuerst haben wir Anti-Human-IgA-Antikörper auf eine 96-Well-Platte aufgetragen. In der Probe oder im Standard vorhandenes Speichel-IgA wurde in die Mikrovertiefung gegeben, und dann wurde HRP-konjugierter Anti-Human-IgA-Antikörper 1 Stunde lang bei Raumtemperatur zugegeben. 30 Minuten lang TMB-Substrat in jede Vertiefung pipettieren. Abschließend wurde die IgA-Konzertierung mit einem Spektrophotometer bei 450 nm gemessen. Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Die Konzentrationsrate des in Woche 0 gesammelten IgA wurde als 100 % angesehen. Die experimentelle Methode orientierte sich an zuvor veröffentlichten Arbeiten [18].

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Messung der TGF-Beta- und IL-10-Konzentration in PBMC

Die Prüfung der durch Probiotika induzierten Erhöhung der TGF-beta- und IL-10-Spiegel im Anschluss an die vorherige Studie [20]. Die mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) wurden aus Blutproben gesunder Spender gewonnen (Tainan Blood Center, Taiwan Blood Services Foundation). Durch Zentrifugieren von Vollblut durch einen Ficoll-Hypaque-Gradienten (Pharmacia, Schweden) wurde die Fraktion mit leichter Dichte aus der 42,5 %-50 %-Grenzfläche eluiert. Aussaat von 4 * 105 zellextrahierten PBMC-Zellen in 100 µl RPMI-1640 mit 1 % FBS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) in jede Vertiefung von 96-Well-Platten. Anschließend 5 * 105 KBE/20 µl probiotische Behandlung zu jeder ausgesäten PBMC-Vertiefung hinzufügen (Zellen: probiotische Stämme=1:10). Die Positivkontrollen bestanden aus der Zugabe von 10 µg/ml Phytohämagglutinin (PHA) (Sigma-Aldrich, München, Deutschland) zu mit PBMCs besäten Vertiefungen zur Produktion von TGF- bzw. IL-10 [21]. Co-Kultivierung von Probiotika mit PBMCs für 48 Stunden. Messung des Überstands, der die Zytokine IL-10 und TGF- enthält, mittels ELISA-Analyse (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) (Thermo Scientific, Carlsbad, CA, USA). Alle Experimente wurden mindestens dreifach gemessen und folgten dem kommerziellen Protokoll.

Bewertung der antibakteriellen Funktion in der Mundhöhle

Streptococcus mutans ist eine häufige Bedrohung für die Mundgesundheit, die Zahnkaries durch die Bildung von Plaque oder Biofilm verursacht [22]. Streptococcus mutans-Proben wurden aus den Abstrichen entnommen, mit denen wir S. mutans auf dem supragingivalen Teil, der Gingiva und der Mundschleimhaut in den Wochen 0, 2, 4 und 6 sammelten. S. mutans wurde in Trypsin gehalten Sojabrühe (TSB, 5 ml), ergänzt mit 50 % Glycerin. Das S. mutans-Medium wurde seriell verdünnt und zur Mitis Salivarius-Bacitracin-Agar-Platte (MSBA, 0,2 U/ml) gegeben, die 2 Tage lang bei 37 Grad inkubiert wurde. Schließlich wurde die Anzahl der S. mutans-Kolonien in jeder Teilnehmerprobe gezählt, um die Überlebensraten der Krankheitserreger zu berechnen; Die Überlebensrate der in Woche 0 gesammelten S. mutans wurde als 100 % angesehen. Die experimentelle Methode orientierte sich an zuvor veröffentlichten Arbeiten [18].

Antibakterielle In-vitro-Aktivität der oralen Tabletten

Oral tablets (1 g) that contained viable (AP-32, CP-9, and ET-66; > 109 CFUs) and heat-killed (AP-32 and ET-66,>1010 KBE) probiotische Stämme wurden in TSB bzw. Gehirn-Herz-Infusionsmedium gelöst, um eine Endkonzentration von 0,1 g/ml zu erhalten. Für die Blindgruppe wurde nur das Medium verwendet, während für die Placebogruppe Tabletten (1 g) ohne probiotische Bestandteile in den jeweiligen Medien gelöst wurden. Dann wurden orale Krankheitserreger (106 KBE) in die Tablettenlösungen gegeben und bei 37 Grad für 2 (S. mutans) oder 3 (Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum und Aggregatibacter actinomy cetemcomitans) co-inkubiert. d. Krankheitserreger wurden vom BCRC bezogen. Die orale Pathogenhemmungsrate (%) wurde wie folgt berechnet: (CFU-Blank-Kontrolle – CFU-Versuchsgruppe)/CFU-Blank-Kontrolle. Die experimentelle Methode folgte zuvor veröffentlichten Tests [11].

Statistische Analyse

Die GraphPad Prism-Software wurde zur statistischen Analyse der Ergebnisse des zweiseitigen T-Tests verwendet. Die Daten wurden als mittlere Standardabweichung (SD) oder als Mittelwert der Ergebnisse von zwei oder drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Statistische Unterschiede wurden beim P-Wert als signifikant angesehen<0.05.

Ergebnisse

Probiotische Tabletten erhöhten die Bifidobakterienpopulation in der Mundhöhle

Die Bifidobacterium-Population war nach der Verabreichung probiotischer Tabletten in der Mundhöhle stabil erhöht. Die Bakterienpopulationen nach den Behandlungen wurden durch die Bakterienpopulationen vor den Behandlungen normalisiert (Bevölkerungsrate %=KBE nach der Behandlung/KBE vor der Behandlung). In der Gruppe mit lebensfähigen Probiotika stieg die Populationsrate signifikant auf 244,14 ± 164,96 % in Woche 2 (**P<0.01, Fig. 1a) and 438.41±308.58 at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population rate remained high at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 550.16±448.19%, ***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (**P<0.01). In the heat-killed probiotic group, the Bifidobacterium population was increased at Weeks 2 (149.92±60.47%, **P<0.01) and 4 (199.87±148.64%, *P<0.05), but was decreased at Week 6 after administration of the heat-killed probiotic tablets was stopped for 2 weeks (182.98±163.73%, Fig. 1a).

Probiotische Tabletten erhöhten die Lactobacillus-Population in der Mundhöhle

Die Veränderung der oralen Lactobacillus-Population aufgrund der Verabreichung probiotischer Tabletten zeigte ein ähnliches Muster wie die Veränderung der oralen Bifidobacterium-Population. Die Bakterienpopulationen nach den Behandlungen wurden durch die Bakterienpopulationen vor den Behandlungen normalisiert. In der lebensfähigen Probiotikagruppe stieg die Lactobacillus-Populationsrate signifikant auf 447,74 ± 337,89 % in Woche 2 (**P<0.01, Fig. 1b) and 982.27±726.66% at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Lactobacillus population rate was higher at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 727.57±539.76%, ***P<0.001) than at Week 0. The Lactobacillus population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (***P<0.001). In the heat-killed probiotic group, the Lactobacillus population was increased at Weeks 2 (256.66±183.78%, **P<0.01) and 4 (312.85 ± 279.71%, *P < 0.05). Additionally, the Lactobacillus number remained but showed no significant difference at Week 6 after the administration of heat-killed probiotics was stopped for 2 weeks (208.00±199.50%, Fig. 1b).

Abb. 1 a Messung der Bifidobacterium-Populationen auf den Mundschleimhautoberflächen. V lebensfähige probiotische Tabletten; H hitzegetötete inaktivierte probiotische Tabletten; C Placebotabletten (Kontrolle); und LAB-Milchsäurebakterien. Die Sammlung und Analyse von Speichelproben wurde in den Wochen 0, 2, 4 und 6 durchgeführt. Die Daten wurden als mittlere Standardabweichung (SD) dargestellt. Zur Analyse statistischer Unterschiede wurde ein zweiseitiger T-Test verwendet. Statistische Signifikanzen wurden mit *P gekennzeichnet<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. b Measurement of Lactobacillus populations on the oral mucosal surfaces. V viable probiotic tablets; H heat-killed inactivated probiotic tablets; C placebo tablets (control); and LAB lactic acid bacteria. Collection and analysis of salivary samples at Weeks 0, 2, 4, and 6 were performed. Data were presented as the mean standard deviation (SD). A two-tailed t-test was used to analyze statistical differences. Statistical significances were marked with *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Probiotische Tabletten mit AP-32, ET-66 und CP-9 erhöhten die IgA-Konzentration in der Mundschleimhaut signifikant

Da der Verzehr probiotischer Tabletten (lebensfähig oder durch Hitze abgetötet) nachweislich die Bifidobacterium- und Lactobacillus-Konzentration in der Mundhöhle erhöht, haben wir die Veränderungen der IgA-Konzentration im Speichel weiter analysiert, die aufgrund der Aufnahme probiotischer Produkte auftraten. Die IgA-Werte nach den Behandlungen wurden durch die IgA-Werte vor den Behandlungen normalisiert. In der lebensfähigen probiotischen Gruppe stieg die IgA-Konzentration im Speichel leicht auf 103,24 ± 8,10 % in Woche 2 (Abb. 2) und 104,81 ± 13,26 in Woche 4, jedoch ohne statistisch signifikante Unterschiede. Allerdings war die Speichel-IgA-Konzentration in der Gruppe mit lebensfähigen Probiotika im Vergleich zur Placebogruppe in Woche 6 (keine Verabreichung lebensfähiger Probiotika-Tabletten für 2 Wochen nach Woche 4) im Vergleich zu Woche 0 signifikant auf 119,30 ± 12,63 % erhöht ( ***P<0.001). Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the salivary IgA concentration was slightly increased at Weeks 2 (102.51± 7.20%) and 4 (104.35 ± 10.27%). The saliva IgA concentration was increased at Week 6 (116.78 ± 12.28%, ***P < 0.001, Fig. 2), compared to Week 0.

Lebensfähige Stämme erhöhten die IL-10- und TGF-Beta-Spiegel in PBMCs

Die Positivkontrolle von 10 µg/ml Phytohämagglutinin (PHA) erhöhte erfolgreich die Spiegel von IL-10 (58,2 ± 7,9 pg/ml, ***P < 0,001, Abb. 3a) und TGF- (53,4 ± 8 pg/ml, ***P<0.001, Fig. 3b) in PBMCs by comparing to the negative control (PBMCs treated with medium only). Viable strains of CP-9, AP-32 and ET-66 signifcantly increased the levels of IL-10 in PBMCs to 84.2±9 pg/ml (***P<0.001, ##P<0.01), 303.1±170.9 pg/ml (*P<0.05, ##P<0.01) and 98.2±17.5 pg/ml (***P<0.01, ##P<0.01), respectively. Symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated a significant difference by comparing to the PHA control (Fig. 3a). Besides, viable strains of CP-9, AP-32, and ET-66 significantly increased the levels of TGF-beta in PBMCs to 23.2 ± 4.7 pg/ml (***P < 0.001), 130.9 ± 16 pg/ ml (***P < 0.001, ###P < 0.001) and 31.4 ± 5.5 pg/ml (***P<0.01), respectively (Fig. 3b).

Abb. 2 Immunglobulin A (IgA)-Konzentration in den Speichelproben. V lebensfähige probiotische Tabletten; H hitzegetötete inaktivierte probiotische Tabletten; C Placebotabletten (Kontrolle); und LAB-Milchsäurebakterien. Die Sammlung und Analyse von Speichelproben wurde in den Wochen 0, 2, 4 und 6 durchgeführt. Die Daten wurden als mittlere Standardabweichung (SD) dargestellt. Zur Analyse statistischer Unterschiede wurde ein zweiseitiger T-Test verwendet. Statistisch

Probiotische Tabletten, die AP-32, ET-66 und CP-9 enthielten, verhinderten die Verbreitung von S. mutans im Speichel

Erhöhte Bifidobacterium- und Lactobacillus-Populationen sowie eine erhöhte IgA-Konzentration im Speichel könnten zur Bekämpfung oraler pathogener Mikroorganismen beitragen. Im anschließenden Experiment testeten wir die Veränderung der Population des oralen Krankheitserregers S. mutans aufgrund einer probiotischen Intervention. Die Bakterienpopulationen nach den Behandlungen wurden durch die Bakterienpopulationen vor den Behandlungen normalisiert. In der lebensfähigen Probiotikagruppe war die S. mutans-Population in Woche 2 signifikant reduziert (53,55 ± 31,60 %, ***P<0.001), 4 (49.60±31.01%, ***P<0.001), and 6 (55.19±42.72%, **P<0.01, Fig. 4). At week 6, S. mutans was significantly inhibited in the viable probiotic group (55.19±42.72%, ***P<0.001), compared to in the placebo group. Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the S. mutans population was slightly decreased at Week 2 (85.81±49.87%) and significantly reduced at Week 4 (58.35 ± 33.17%, ***P<0.001). The S. mutans population level in the heat-killed probiotic group (202.81±167.99%) reverted to that in the placebo group (225.05±127.01%) at Week 6 (no administration of heat-killed probiotic tablets for 2 weeks from Week 4) (Fig. 4).

Abb. 3 Lebensfähige Stämme erhöhten die IL-10- und TGF-beta-Spiegel in PBMCs. Der Gehalt an IL-10 und bTGF-beta in PBMCs wurde durch die Behandlung probiotischer Stämme getestet. Zugabe von 5 * 105 KBE/20 µl lebensfähigen Stämmen von CP-9, AP-32 und ET-66 zu PMBCs 10 µg/ml. Als Positivkontrolle wurde Phytohämagglutinin (PHA) verwendet. Die Negativkontrolle bestand aus PBMCs, die nur mit RMPI-1640-Medium behandelt wurden. Es wurden dreifache Tests durchgeführt. Die Daten wurden als mittlere Standardabweichung (SD) dargestellt. Zur Analyse statistischer Unterschiede wurde ein zweiseitiger T-Test verwendet. Statistische Signifikanzen wurden mit P gekennzeichnet<0.05, P<0.01, P<0.001. The symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated significant difference by comparing to the PHA control

Abb. 4 Messung pathogener Streptococcus mutans-Populationen auf den Mundschleimhautoberflächen. V lebensfähige probiotische Tabletten; H hitzegetötete inaktivierte probiotische Tabletten; C Placebotabletten (Kontrolle); und LAB-Milchsäurebakterien. Die Sammlung und Analyse von Speichelproben wurde in den Wochen 0, 2, 4 und 6 durchgeführt. Die Daten wurden als mittlere Standardabweichung (SD) dargestellt. Zur Analyse statistischer Unterschiede wurde ein zweiseitiger T-Test verwendet. Statistische Signifikanzen wurden mit *P gekennzeichnet<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Bestätigung der Fähigkeit probiotischer Tabletten, das Wachstum oraler Krankheitserreger zu hemmen, durch einen In-vitro-Test

Die In-vitro-Studie ergab, dass lebensfähige probiotische Tabletten die Überlebensrate oraler Krankheitserreger signifikant hemmten (Abb. 5a). Die Bakterienpopulationen nach den Behandlungen wurden durch die Bakterienpopulationen vor den Behandlungen normalisiert. Die Überlebensrate von S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum und A. actinomy cetemcomitans in der Gruppe mit lebensfähigen Probiotika war im Vergleich zur Placebogruppe auf 4,23 % verringert (***P < 0 .001, Placebo=91 %), 8,64 % (***P < 0,001, Placebo=89 %), 5,77 % (**P<0.01, placebo=98%), and 6.23% (**P<0.01, placebo=87%), respectively. However, the heat-killed probiotic tablet exerted weaker antibacterial effects than the viable probiotic tablet (Fig. 5b). The survival rate of S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum, and A. antinomy cetemcomitans in the heat-killed probiotic group, compared to in the placebo group, was slightly decreased without statistical significance (82%, placebo=91%), significantly reduced to 53% (*P<0.05, placebo=89%), not inhibited (96.88%, placebo=98%), and significantly reduced to 80% (**P<0.01, placebo=87%), respectively.

Diskussion

Verglichen mit der Placebo-Gruppe würden die oralen Populationen von Lactobacillus und Bifidobacterium deutlich ansteigen, wenn über einen Zeitraum von 4 Wochen lebensfähige probiotische Tabletten oder hitzegetötete probiotische Tabletten verabreicht würden. Darüber hinaus blieben die Lactobacillus- und Bifidobacterium-Zahlen zwei Wochen lang auf einem signifikant hohen Niveau, nachdem der Konsum lebensfähiger Probiotika eingestellt wurde (Abb. 1a und b). In ähnlicher Weise haben Camila Casuccio Almeida et al. zeigten, dass eine vierwöchige Verabreichung einer probiotischen Behandlung die Symptome bei Patienten mit Laktoseintoleranz noch mindestens drei Monate nach Beendigung des probiotischen Konsums lindern könnte [23]. Allerdings sollte die anhaltende Wirkung von Probiotika bei Langzeitbehandlungen in Zukunft evaluiert werden. Darüber hinaus war die IgA-Konzentration im Speichel bei der Verabreichung lebensfähiger und durch Hitze abgetöteter probiotischer Tabletten signifikant erhöht. Sowohl die hitzegetöteten als auch die lebensfähigen Probiotika-Gruppen erhöhten das IgA im Speichel durch die vierwöchige Verabreichung oraler Tabletten, jedoch ohne statistischen Unterschied zum Placebo. Die IgA-Konzentration in durch Hitze abgetöteten und lebensfähigen probiotischen Gruppen zeigte in Woche 6 einen signifikanten Anstieg. Der Mechanismus der IgA-Erhöhung nach zweiwöchiger Unterbrechung der probiotischen Verabreichung sollte jedoch weiter untersucht werden (Abb. 2). Braathen et al. berichteten über ähnliche Ergebnisse zur immunmodulierenden Rolle probiotischer Stämme in der Mundhöhle [24]. Darüber hinaus wurde berichtet, dass probiotische Stämme die fäkale IgA-Konzentration bei Sauen und Ferkeln deutlich erhöhen [25]. Allerdings liegen noch keine ausreichenden Studien zur IgA-lindernden Symptomatik bei Infektionen der oberen Atemwege vor. Der detaillierte molekulare Mechanismus der Hemmung und Prävention von Infektionen der oberen Atemwege durch die probiotischen Stämme CP-9, AP-32 und ET-66 könnte in zukünftigen Studien untersucht werden. In der vorliegenden Studie würden die lebensfähigen Stämme CP-9, AP-32 und ET-66 den IL-10- und TFG-beta-Spiegel in PBMC-Zellen erhöhen. AP-32 zeigte eine wirksame Fähigkeit zur Erhöhung von IL-10 und TFG-beta in PBMCs, indem es sie mit der PHA-Positivkontrolle verglich (Abb. 3a und b). Es wurde angenommen, dass die lebensfähigen Stämme CP-9, AP-32 und ET-66 die Sekretion von IL-10 und TFG-beta durch B-Zellen induzieren könnten, um die IgA-Spiegel im Speichel zu erhöhen. Allerdings sollte die Korrelation zwischen Speichel-IL-10, TFG-beta und Speichel-IgA weiter getestet werden [26]. Darüber hinaus ist noch unklar, ob durch Hitze abgetötete Probiotika IgA durch die Induktion von IL-10 und TFG-beta erhöhten. Ein In-vitro-Test zeigte, dass durch Hitze abgetötetes AP-32 die Sekretion von Interferon und IL-12p70 förderte und die IL-13-Spiegel senkte [27]. Daher wurde in dieser klinischen Studie die Fähigkeit der probiotischen CP-9-, AP-32- und ET{51}}-Stämme sowie der durch Hitze abgetöteten AP-32- und ET-66-Stämme untersucht. Stämme zur Hemmung pathogener Bakterien in der Mundhöhle wurde weiter validiert (Abb. 4). Lebensfähige probiotische Lutschtabletten zeigten durch die Sekretion organischer Säuren, antimikrobieller Peptide [28], Exopolysaccharide (EPSs) [29] und Bakteriozine [30] eine bessere antipathogene Wirkung als hitzegetötete Lutschtabletten (Abb. 5a und b). Die funktionellen antimikrobiellen Komponenten, die von lebensfähigen probiotischen Stämmen produziert werden, sollten in Zukunft durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Flüssigkeitschromatographie (LC)-Massenspektrometrie nachgewiesen werden [31]. Es wird berichtet, dass die durch Hitze abgetöteten Probiotika wesentliche Vorteile lebensfähiger Probiotika besaßen, jedoch nicht die gewissen Sicherheitsbedenken lebensfähiger probiotischer Stämme hatten [32]. Allerdings sollten die antimikrobiellen Bestandteile hitzegetöteter Probiotika weiter überprüft werden.

Abb. 5 Bestätigung der Fähigkeit probiotischer Tabletten, das Wachstum oraler Krankheitserreger zu hemmen, durch einen In-vitro-Test. Die Fähigkeit lebensfähiger und durch Hitze abgetöteter probiotischer Tabletten, die Überlebensrate oraler Krankheitserreger, einschließlich Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum und Aggregatibacter actinomycetemcomitans, zu hemmen, wurde validiert. Leere Gruppe, nur mittel; Placebogruppe, Tabletten (1 g) ohne probiotische Bestandteile. Es wurden dreifache Tests durchgeführt. Die Daten wurden als mittlere Standardabweichung (SD) dargestellt. Zur Analyse statistischer Unterschiede wurde ein zweiseitiger T-Test verwendet. Statistische Signifikanzen wurden mit *P gekennzeichnet<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Abschluss

Gemischte lebensfähige probiotische Tabletten, bestehend aus L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. Milch-CP-9 und L. paracasei ET-66 sowie durch Hitze abgetötete Probiotika, einschließlich L. salivarius subsp. salicinius AP-32 und L. paracasei ET-66 übten ihre vorteilhaften Funktionen aus, indem sie die oralen Populationen von Lactobacillus und Bifdobacterium erhöhten, S. mutans in der Mundhöhle reduzierten und die IgA-Konzentration im Speichel bei gesunden Teilnehmern erhöhten. In-vitro-Testergebnisse bestätigten, dass lebensfähige Probiotika orale Krankheitserreger, einschließlich S. mutans, P. gingivalis und F. nucleatum subsp., wirksam hemmten. Polymorphismus und A. actinomycetemcomitans. Die Immunität der Mund-Nasen-Schleimhaut ist die vorderste Verteidigung gegen eindringende Mikroorganismen, und dies ist zu einem entscheidenden Thema geworden. Daher bietet diese Studie eine alternative Strategie (probiotische Nahrungsergänzung) zur Aufrechterhaltung der oralen Immunität und Mundgesundheit.

Vorteile von Cistanche-Ergänzungsmitteln – wie man das Immunsystem stärkt

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