Cistanche zur Behandlung von Entzündungen und Nierenerkrankungen: Was ist die Ursache für die pathogene Rolle der Entzündung bei der renalen Beteiligung bei Cystinopathie?
Mar 13, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com
Die Wechselwirkung zwischen Galectin-3 und Cystinosin deckt eine pathogene Rolle der Entzündung bei der Nierenbeteiligung der Cystinose auf
Tatjana Lobry1,2 et al
Entzündungist an der Pathogenese vieler Erkrankungen beteiligt. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch oft unbekannt. Hier testen wir, obCystinose, das Protein, das daran beteiligt istCystinose, ist ein entscheidender Regulator von Galectin-3, ein Mitglied der b-Galactosidase-bindenden Proteinfamilie, währendEntzündung. Cystinoseist eine lysosomale Speicherkrankheit und trotz der allgegenwärtigen Ausprägung der Cystinose dieNiereist das primär von der Krankheit betroffene Organ.Cystinosewurde festgestellt, dass es die lysosomale Lokalisierung und den Abbau von Galectin fördert-3. In Ctns–/–Mäuse, ein Mausmodell vonCystinose, Galectin-3 wird in überexprimiertNiere. Das Fehlen von Galectin-3 in zystinotischen Mäusen verbessert die pathologische Nierenfunktion und -struktur und verringert die Infiltration von Makrophagen/Monozyten in die Niere der Ctns–/–Gal3–/–Mäuse im Vergleich zu Ctns–/– Mäuse. Diese Daten deuten stark darauf hin, dass Galectin-3 vermitteltEntzündungbeteiligt anNiereKrankheitsverlauf bei Cystinose. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Galectin-3 mit dem entzündungsfördernden Zytokin MonocyteChemoattractant Protein-1 interagiert, das die Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen stimuliert und sich im Serum von Ctns–/–-Mäusen als signifikant erhöht herausstellte und auch Patienten mitCystinose. Somit heben unsere Ergebnisse eine neue Rolle der Interaktion von Cystinose und Galectin-3 bei Entzündungen hervor und liefern eine zusätzliche mechanistische Erklärung für dieNiereKrankheit der Cystinose. Dies kann dazu führen, dass sich die Identifizierung neuer Wirkstoffziele verzögertCystinoseFortschreiten.
SCHLÜSSELWÖRTER:chronisches Nierenleiden; Cystinose; Galectin-3;Entzündung; Chemoattraktives Monozytenprotein–1
Cistanche kann zur Behandlung von chronischer Nierenerkrankung und Cystinose eingesetzt werden
Die Hauptursache für Entzündungen ist, dass Stickstoffmonoxid zur Produktion von Entzündungszellen führen kann.Cistancheist eine wertvolle chinesische Kräutermedizin. Seine Wirkstoffe können die Ausschüttung von Stickstoffmonoxid hemmen und eine Rolle bei der Vorbeugung und Behandlung von Entzündungen und Nierenerkrankungen spielen.
Übersetzungserklärung
Trotz Behandlung entwickeln sich die Patienten immer noch bis zum Nierenversagen im Endstadium. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass das Fehlen vonCystinoseführt zu einem gestörten lysosomalen Abbau von Galectin-3 (Gal-3), was zuEntzündungund der Verlauf vonchronisches NierenleideninCystinose. Diese Ergebnisse eröffnen neue Perspektiven auf potenzielle therapeutische Ziele, die die Nierendegeneration bei Patienten mit einschränken oder verzögern könntenCystinose. Daher können entzündungshemmende Medikamente und Inhibitoren von Gal-3 wie nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente oder Indomethacin die renale Pathogenese bei Cystinose verbessern.
Entzündungist eine normale akute Reaktion eines Organismus auf eine Verletzung oder Infektion,1aber chronischEntzündungist mit Gewebeschäden verbunden. Bei chronischen Krankheiten wie Diabetes aktivieren geschädigte Gewebe das Immunsystem, was zu einer kontinuierlichen Entzündungsreaktion und schließlich zur Gewebedegeneration führt.2 Zytokine sind Schlüsselmodulatoren vonEntzündungund sind in der Lage, die zu aktivieren oder aufzulösenEntzündungProzess.3 Bei Patienten mitchronisches Nierenleiden(CKD), erhöhte Plasmakonzentration von Zytokinen (Interleukin [IL]-6 und Tumornekrosefaktor-a) undEntzündungMarker (C-reaktives Protein, IL-6, Hyaluronan und Neopterin) sind mit dem Fortschreiten zu einer Nierenerkrankung im Endstadium assoziiert.4 Das Verständnis der spezifischen Mediatoren, die Entzündungsreaktionen auslösen, erleichtert die Entdeckung geeigneter Wirkstoffziele zur Verhinderung degenerativer Schäden .
Cystinoseist eine autosomal-rezessiv vererbte Stoffwechselerkrankung, die zur Familie der lysosomalen Speicherkrankheiten gehört und durch eine Ansammlung von Cystin in allen Organen gekennzeichnet ist.5 Das Gen ist defektCystinose, CTNS, kodiert für den lysosomalen Cystin/Protonen-Cotransporter Cystinose.6,7 Obwohl CTNS ubiquitär exprimiert wird, ist dieNiereist das erste betroffene Organ bei Personen mitCystinose. Die Patienten stellen sich typischerweise in ihrem ersten Lebensjahr mit dem Fanconi-Syndrom vor, das durch schwere Flüssigkeits- und Elektrolytstörungen, schlechtes Wachstum und Rachitis gekennzeichnet ist.8Anschließend entwickelt sich CNE, die zu einer Nierenerkrankung im Endstadium fortschreitet und erfordertNiereTransplantation. Die Anhäufung von Cystin in allen Geweben führt schließlich zu einer Funktionsstörung mehrerer Organe; Patienten leiden unter Photophobie und Blindheit, Hypothyreose, Hypogonadismus, Diabetes, Myopathie und einer Verschlechterung des zentralen Nervensystems.9 Im C57BL/6-Hintergrund ist ein Knockout-Mausmodell (Ctns–/–) 10 repliziert den Nierenphänotyp von zystinotischen Patienten,11 sowie Ablagerung von Cystinkristallen in der Hornhaut12und Schilddrüsenfunktionsstörungen.13
In der vorliegenden Studie zeigen wir eine neue Rolle fürCystinoseinEntzündungdurch seine Wechselwirkung mit Gal-3. Gal-3 ist ein Mitglied der Lektin- und b-Galactosid-bindenden Proteinfamilie 21 und ist an mehreren biologischen Funktionen beteiligt, einschließlichEntzündung.22Im Zusammenhang mitNiereErkrankungen wurde gezeigt, dass die Hemmung von Gal-3 die entzündungsfördernde Markerexpression und Nierenfibrose reduziert und den Rückgang der glomerulären Filtrationsrate in Hyperaldosteronismus-, Bluthochdruck- oder Fettleibigkeitsmodellen verhindert.23–26Hier liefern wir den Beweis, dass inCystinose, die Abwesenheit vonCystinoseführt zu Gal-3-Überexpression inNieren, was die Infiltration von Makrophagen und das Fortschreiten der chronischen Nierenerkrankung verbessert. Darüber hinaus identifizieren wir Monozyten-Chemoattractant-Protein–1 (MCP-1) als potenziellen Mediator, der neue Genziele für die medikamentöse Therapie aufzeigt. ERGEBNISSE Gal-3 interagiert mit Cystinose über seine Kohlenhydraterkennungsdomäne, um eine spezifische Wechselwirkung zu identifizieren Partner mit quantitativer Massenspektrometrie, Madin-Darby-HundNiere(MDCK)-Zellen wurden mit einem lentiviralen Konstrukt transduziert, um das Cystinose-Grün-FL-Fluoreszenzprotein (GFP)-Fusionsprotein stabil zu exprimieren. Zusätzlich zu den 9 Untereinheiten der Hþ-Adenosintriphosphatase vom vakuolären Typ, die zuvor veröffentlicht wurden,19Gal-3 wurde als eines der Proteine identifiziert, mit denen es interagiertCystinose(Abbildung 1a). Diese Wechselwirkung wurde durch Co-Immunpräzipitation, gefolgt von Western-Blotting, weiter bestätigt (Abbildung 1b und c). Außerdem haben wir gezeigt, dass die Wechselwirkung zwischen Gal-3 undCystinosewurde durch die Gal-3-Kohlenhydraterkennungsdomäne (CRD) vermittelt, die im C-terminalen Schwanz des Proteins lokalisiert ist. Die Wechselwirkung wurde durch Thiodigalactosid gehemmt, einen potenten Inhibitor von Galectin-Kohlenhydrat-Wechselwirkungen (Abbildung 1d). Wie alle Galectine hat Gal-3 eine Affinität zu glykosylierten Proteinen,21 daher ist es wahrscheinlich, dass die Wechselwirkung mit Gal-3 über die glykosylierte Cystinoseeinheit erfolgt, die sich im intralysosomalen N-terminalen Schwanz des Proteins befindet.27
Cystinosin verstärkt die lysosomale Lokalisierung und den Abbau von Gal-3
Um die potenzielle lysosomale Lokalisierung von Gal-3 bei der Interaktion mit zu verifizierenCystinosezeigten wir, dass Gal-3 wie Cathepsin D (eine intralysosomale Protease) vor dem Verdau durch Proteinase K geschützt war, während beide Proteine verdaut wurden, wenn Lysosomen mit Triton X- 100 permeabilisiert wurden (Abbildung 2a und Ergänzung Abbildung S1). Ähnliche Daten wurden in aus Mäuseleber isolierten Lysosomen erhalten, was die lysosomale Lokalisierung von Gal-3 in vivo bestätigt (Abbildung 2b und c). Wegen des Fehlens eines zuverlässigen Antikörpers zum NachweisCystinosewurde eine Immunfärbung durchgeführtCystinose-GFP-exprimierende MDCK-Zelllinien mit einem Anti-Gal-3-Antikörper. Es bestätigte das Vorhandensein von Gal-3 im Lumen der Lysosomen, während Cystinose-GFP und Lamp-2 (ein lysosomales Transmembranprotein) nur an der Membran der Vesikel gefunden wurden (Abbildung 2d).
Um zu untersuchen, obCystinosinan Gal-3-Trafficking beteiligt war, haben wir die Dynamik beider analysiertCystinoseund Gal-3-positive Vesikel unter Verwendung von FL-Fluoreszenzmikroskopie mit zweifarbiger Lebendzelle und totaler interner Reflexion in embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) vom Wildtyp (WT) und Ctns–/–Mäuse, die sowohl CTNS-DsRed als auch Gal-3-GFP exprimieren. Unsere Analyse hat das bestätigtCystinoseund Gal-3 unterliegen einer echten Kolokalisation in Ctns–/–-MEFs, was durch die ähnliche räumlich-zeitliche Verteilung dieser Moleküle in der FL-Fluoreszenzmikroskopiezone mit totaler interner Reflexion bestätigt wird (Abbildung 2e). Die Daten in WT-MEFs waren ähnlich (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus wurde bei der Analyse von nur mit Gal- 3-GFP transfizierten MEFs Gal-3-GFP im Zytoplasma gefunden und es wurde keine ausgeprägte vesikuläre Struktur beobachtet, im Gegensatz zur Kotransfektion mit CTNS-DsRed ( Daten nicht gezeigt).
Diese Daten wurden in 293T-Zellen bestätigt, in denen ein starkes GFP-Signal im Zytoplasma in Zellen beobachtet wurde, die nur Gal-3-GFP exprimierten, während in Zellen, die sowohl Gal-3-GFP als auch exprimiertenCystinosin-DsRed, Gal-3-GFP war hauptsächlich in Cystinose-DsRed-exprimierenden Lysosomen lokalisiert (Abbildung 3a). Darüber hinaus Quantifizierung der Gal-3-Proteinexpression in Zellen, die mit Gal-3-GFP allein oder Gal- 3-GFP und CTNS-DsRed und Gal-3-GFP und DsRed transfiziert wurden als Kontrolle, zeigten signifikant weniger Gal-3-GFP-Proteine in Zellen, die mit CTNS-DsRed co-transfiziert wurden, im Vergleich zu Zellen, die nur mit Gal-3-GFP transfiziert oder mit DsRed co-transfiziert wurden (Abbildung 3b). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hinCystinosinverstärkt die lysosomale Lokalisierung und den Abbau von Gal-3. Es wurde gezeigt, dass Cystinosin an CMA beteiligt ist.28 Das Hitzeschock-70-kDa-Protein (Hsc70) ist an CMA beteiligt, indem es die Entfaltung und Translokation von Substratproteinen über die Membran in das lysosomale Lumen auf LAMP2A-abhängige Weise unterstützt.29,30 Da Gal{ {8}} wurde vorgeschlagen, durch CMA abgebaut zu werden,31 wir untersuchten die Lokalisierung von Gal-3 relativ zu Hsc70 in zystinotischen MEFs. Die konfokale Mikroskopieanalyse bestätigte die Kolokalisation von Gal-3-GFP an Hsc70--positiven Strukturen sowohl in WT (Daten nicht gezeigt) als auch in Ctns–/–Zellen (Abbildung 3c), was den Co-Transport von Gal-3 mit Hsc70 unterstützt und darauf hindeutet, dass die lysosomale Internalisierung, aber nicht die Gal-3-Erkennung durch das Chaperon defekt istCystinose.
Gal-3 ist an der Nierenentzündung bei Ctns beteiligt–/–Mäuse
Um die Rolle von Gal-3 in zu studierenCystinoseIn vivo generierten wir ein Doppel-Knockout-Mausmodell, dem beides fehlteCystinosinund Gal-3 (Ctns–/–Mädchen-3–/–Mäuse). WT, Ctns–/–, und Gal-3–/–Mäuse wurden als Kontrollpersonen verwendet. Im C57BL/6 Ctns–/–Bei Mäusen treten Nierenanomalien im Alter von etwa 10 Monaten auf.11 Daher wurden Studien im Alter von 8 bis 9 Monaten durchgeführtNiereAnomalien beginnen erkannt zu werden, und nach 12 bis 15 Monaten, wenn die Nierenanomalien fortgeschritten sind. Weil festgestellt wurde, dass der Cystingehalt bei männlichen und weiblichen Ctns unterschiedlich ist–/– Nieren, sie wurden getrennt analysiert. Wenn der Cystingehalt bei beiden Genotypen mit dem Alter zunimmt, wurde kein signifikanter Unterschied in männlichen und weiblichen Nieren zwischen den Ctns–/– Gal-3–/–-Mäusen und den Ctns beobachtet–/– Mäuse im Alter von 8 bis 9 Monaten und 12 bis 15 Monaten (Abbildung 4a).
Die Nierenfunktion wurde im Serum und Urin beurteilt und es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen WT und Ctns beobachtet–/–Mäuse mit 8 bis 9 Monaten (Daten nicht gezeigt), aber mit 12 bis 15 Monaten, Ctns–/–Mäuse zeigten im Vergleich zu WT-Mäusen signifikant höhere Kreatinin- und Harnstoffspiegel im Serum. Interessanterweise Ctns–/–Mädchen-3–/–Mäuse zeigten im Vergleich zu Ctns eine verbesserte Nierenfunktion–/–Mäuse im Alter von 12 bis 15 Monaten mit niedrigerem Serumkreatinin (P < 0.05) und Harnstoff (P < 0,05; Tabelle 1).
Histologische Studien von 8- bis 9- Monate alten und 12- bis 15- Monate alten MäusenNiereAbschnitte zeigten das Vorhandensein schwerer Anomalien in Ctns–/– Nieren, einschließlich tubulärer Atrophie, zurückgezogener Glomeruli und mononukleärer Infiltrate. Die Blindanalyse von Nierenschnitten reichte für das Ausmaß der kortikalen Schädigung von 1 (erhaltene Gewebestruktur) bis 6. Die durchschnittliche Punktzahl für Ctns–/–Mäuse betrug 2,64 - 0,36 im Alter von 9 Monaten (n=7) und 4,12 0,37 im Alter von 12 bis 15 Monaten (n=16). In den Nieren von Ctns–/–Mädchen-3–/–Mäuse im gleichen Alter waren diese Anomalien signifikant weniger umfangreich: 1.62 - 0.11 nach 9 Monaten (n ¼ 21; P < 0.05,="" mann-whitney="" t-="" test)="" und="" 3.04="" -="" 0.22="" nach="" 12="" bis="" 15="" monaten="" (n="" ¼="" 33;="" p=""><0,05, mann-whitney="" t-test)="" (abbildung="" 4b="" und="" ergänzende="" abbildung="" s2).="" darüber="" hinaus="" wurde="" jedem="" gewebe="" ein="" prozentsatz="" der="" tubulären="" atrophie="" und="" der="" durchschnitt="" für="" ctns="">–/–Mäuse und Ctns–/–Mädchen-3–/–Mäuse waren 66 Prozent bzw. 42 Prozent nach 12 bis 15 Monaten (P ¼ 0,01). Darüber hinaus ist ein auffälliger Unterschied zwischen Ctns–/–und Ctns–/– Mädchen-3–/– NiereAbschnitten war das Vorhandensein von wenigen mononukleären Infiltraten in den Ctns–/–Mädchen-3–/–Abschnitten, wohingegen starke Infiltrate in den Ctns durchweg beobachtet wurden–/– Niere(Abbildung 4b).
Wir charakterisierten die mononukleären Infiltrate, die durch histologische Untersuchung in 8- bis 9- Monate alten Ctns beobachtet wurden–/– Nierenals Makrophagen/Monozyten durch Co-Immunfärbung mit CD68 und CD45 und mit CD68 und Haupthistokompatibilitätsklasse II (ergänzende Abbildung S3), aber nicht mit CD68 und CD163, was darauf hindeutet, dass diese Makrophagen ein M1--ähnliches proinflammatorisches Profil haben.32 ,33 Die Quantifizierung von CD68--positiven Zellen ergab signifikant weniger Makrophagen/Monozyten in WT, Gal-3–/–, und Ctns–/–Mädchen-3–/– Nierenim Vergleich zu Ctns–/– Nieren(Abbildung 4c), was die histologischen Daten bestätigt (Abbildung 4b).
Insgesamt deuten diese Befunde darauf hin, dass Gal-3 an der Rekrutierung von Makrophagen/Monozyten bei Zystinose beteiligt istNierenund dass seine Abwesenheit Nierenerkrankungen in Ctns verbessert–/–Mäuse. Daher suggeriert es dasEntzündungist zumindest teilweise für die Nierenverschlechterung bei Ctns verantwortlich–/– Mäuse.
Ctns-defiziente Nieren weisen eine Gal-3-Überexpression auf
Mittels Western-Blot-Analyse fanden wir heraus, dass die Gal-3-Expression signifikant erhöht warNierenvon 12- Monaten alten Ctns–/–Mäuse verglichen mit WT-Mäusen (Abbildung 5a und b). Um zu untersuchen, ob diese erhöhte Expression von Gal-3 spezifisch für Ctns ist–/– Nierenhaben wir die Gal-3-Expression auf Transkript- und Proteinebene in quantifiziertNierenvon Mäusen mit CNE, die durch eine Standard-Zwischensummen-2--Stufen-Nephrektomieoperation induziert wurde, und von Tieren, die sich einer Scheinoperation unterzogen haben. WT und Ctns–/–Mäuse wurden als Kontrollpersonen verwendet. Gal-3-Transkripte waren bei Ctns–/– und Scheinnieren signifikant erhöht, bei CKD jedoch stark erhöhtNierenim Vergleich zu WT-Mäusen (Abbildung 5c). Im Gegensatz dazu wurde Gal-3 auf Proteinebene nur in Ctns nachgewiesen–/–Nieren, was stark darauf hindeutet, dass nur Ctns–/–Nieren konnten das Gal-3-Protein nicht abbauen (Abbildung 5d). Immunfluoreszenzfärbung von Gal-3 in der MausNierenach 8 bis 9 Monaten zeigte sich auch eine Überexpression von Gal-3 in den Ctns–/– Nierenim Vergleich zu WTNieren(Abbildung 5e). Darüber hinaus wurde Gal-3 von CD68þ-Makrophagen sowie von Nierenzellen in Ctns exprimiert–/– Nierennach 8 bis 9 Monaten (ergänzende Abbildung S4). Insgesamt stimmen diese Daten mit einem verringerten Gal-3-Abbau in Abwesenheit von übereinCystinosewie in vitro gezeigt (Abbildung 3a und b), was zur Akkumulation von Gal-3-Protein in Ctns führt–/– Nieren.
Das Fehlen von Cystinosin führt über Gal-3-Hochregulierung zu einem erhöhten Serum-MCP-1
Gal-3 regeltEntzündungdurch verschiedene Mechanismen.34 Um also weitere Einblicke in den Mechanismus in zu gewinnenCystinoseuntersuchten wir die Expression verschiedener entzündungsfördernder oder entzündungshemmender Zytokine im Serum von 12- bis 15- Monate alten WT, Ctns–/–, Gal-3–/–, und Ctns–/–Mädchen- 3–/–Mäuse. Sechs Zytokinspiegel wurden mit Mauszytometrie-Bead-Array, MCP-1, Interferon-g, Tumornekrosefaktor und IL-10, IL-6 und IL-12p70 gemessen. Nur die MCP-1-Expression war im Serum von Ctns–/–-Mäusen im Vergleich zu WT- und Gal-3–/–-Mäusen und auch zu Ctns signifikant erhöht–/–Mädchen-3–/–Mäuse, deren MCP-1-Serumspiegel mit WT-Mäusen vergleichbar waren (Abbildung 6a). MCP-1 wird von verschiedenen Zelltypen produziert, wobei die Hauptquelle von MCP-1 Makrophagen und Monozyten sind35, und wirkt als chemischer Lockstoff für Monozyten und Makrophagen, der ihre Migration und Infiltration reguliert. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass im gleichen Alter die Gal-3-Expression im Serum von Ctns–/–-Mäusen (44,33 9,81 ng/ml; n ¼ 5) und WT-Mäusen (40,{{12}) ähnlich war. },41 ng/ml, n ¼ 7).
Die Beziehung zwischen Gal-3 und MCP-1 wurde weiter untersucht durch Co-Immunpräzipitation unter Verwendung von Gal-3–GFP und MCP-1–DsRed– oder Gal-3– GFP und CTNS-DsRed– (als Positivkontrolle) exprimierende 293T-Zellen. Es wurde eine Wechselwirkung zwischen Gal-3 und MCP-1 beobachtet (Abbildung 6b), was auf eine direkte Induktion von MCP-1 durch Gal-3 hindeutet. Die Inkubation mit N-Acetyl-D-Lactosamin (LacNAc), einem Inhibitor von Gal-3-CRD, zeigte dies im Gegensatz zuCystinosinWechselwirkung ist die CRD nicht an der Wechselwirkung zwischen Gal-3 und MCP-1 beteiligt (Abbildung 6c).
Um zu beurteilen, ob dieser Befund für den Menschen relevant ist, haben wir die Gal-3- und MCP-1-Spiegel bei Patienten mit gemessenCystinosedie sich keiner immunsuppressiven Therapie unterziehen oder entzündungshemmende Medikamente einnehmen. Obwohl festgestellt wurde, dass der Gal-3-Spiegel im Serum von Patienten mit Cystinose im Vergleich zu gesunden Spendern leicht erhöht war, war der Unterschied nicht signifikant (Abbildung 6e), was unsere in Ctns erhaltenen Ergebnisse bestätigt–/–Mäuse. Nur 2 Patienten hatten einen hohen Gal-3-Spiegel (25,34 und 39,54 ng/ml); sie wurden als Ausreißer betrachtet und wurden daher nicht in Abbildung 6e aufgenommen. Im Gegensatz dazu wurden bei Verwendung eines enzymgebundenen Immunadsorptionsassays, der gegen menschliches MCP-1 gerichtet war (Abbildung 6d), Serum-MCP-1-Spiegel bei Patienten mit signifikant erhöht festgestelltCystinose(252,1 - 18,4 pg/ml; n ¼ 19; Altersbereich 1–23 Jahre) trotz Cysteaminbehandlung im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen (166,9 -13,5 pg/ml; n ¼ 1 0; Altersspanne 8–63 Jahre) (P < 0,001).="" bei="" beiden="" patienten="" mit="" wurde="" keine="" korrelation="" zwischen="" alter="" und="" mcp-="" 1-level="">Cystinoseund gesunde Spender (Daten nicht gezeigt).
CistanchehatAntiphlogistikumEigenschaften
DISKUSSION
Trotz der Tatsache, dass sich Cystin bei betroffenen Patienten in allen Geweben anreichertCystinose, Nieren sind die Organe, die am anfälligsten für Schäden sind. Daher glauben wir, dass die Cystinakkumulation nicht allein für die Nierendegeneration verantwortlich ist. Hier beschreiben wir eine neue Rolle fürCystinosinin der Verordnung vonEntzündungam Fortschreiten der chronischen Nierenerkrankung beteiligtCystinose. Diese Studie könnte erklären, warum sich Patienten trotz einer Cysteamin-Therapie zu einem Nierenversagen im Endstadium entwickeln.
Die Untersuchung von molekularen Cystinosepartnern ergab eine direkte Wechselwirkung mit Gal-3, die durch Inhibitoren von Gal-3-CRD gehemmt werden kann. Jüngste Studien zeigten, dass Gal-3 nach lysosomaler Schädigung wie Kristallbildung mit Glykanen interagieren kann, die sich im lysosomalen Lumen befinden.36 In unserer Studie wurde die Wechselwirkung zwischen Gal-3 undCystinosinwurde in gesunden Zellen exprimiert untersuchtCystinosinund daher kein Ansammeln von Cystein oder Cystinkristallen. Darüber hinaus veränderte die Überexpression von sowohl Gal-3 als auch Cystinosin in gesunden Zellen die subzelluläre Lokalisierung von Gal-3, das dann in den Lysosomen lokalisiert wurde, verglichen mit der Überexpression von Gal-3 allein, was befand sich im Zytoplasma. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass die Wechselwirkung zwischen Gal-3 und Cystinosin unabhängig von lysosomaler Schädigung auftritt und dass Cystinosin aktiv für die lysosomale Lokalisierung von Gal-3 verantwortlich ist. Zuvor wurde gezeigt, dass Gal-3 durch lysosomal-abhängige Proteolyse in Abwesenheit von Abl und Arg, 2 Tyrosinkinasen, abgebaut wird.31
Außerdem haben wir das gezeigtCystinoseund Gal-3 kolokalisieren an dynamischen vesikulären Strukturen und werden gemeinsam raumzeitlich mobilisiert.Cystinosinwurde zuvor mit den Transportmechanismen des lysosomalen LAMP2A in Verbindung gebracht, dem einzigen bekannten CMA-Rezeptor, der falsch lokalisiert istCystinose.28Es wurde zuvor gezeigt, dass der Gal-3-Abbau durch CMA vermittelt wird.31Die konfokale Mikroskopieanalyse bestätigte die Kolokalisation von Gal-3 an Hsc70--positiven Strukturen in beiden Ctns–/– und WT-Zellen, die den Co-Transport von Gal-3 mit Hsc70 für die Präsentation am Lysosom und den Abbau durch CMA unterstützen, da Hsc70 die Translokation von Substratproteinen durch die Membran in das lysosomale Lumen unterstützt.29,30Eine mögliche Interpretation unserer Ergebnisse ist dieCystinosinreguliert den Transport und die Lieferung von Gal-3 an die CMA-aktiven Lysosomen zum Abbau.
Dieser neuartige Weg vonCystinosin-abhängige lysosomale Gal-3-Lokalisierung und -Abbau wird in vivo unterstützt, da Ctns-defiziente Mäuse eine Überexpression von Gal-3 innerhalb der aufweisenNiere. Darüber hinaus war eine erhöhte Gal-3-mRNA in Ctns begrenzt–/–Nieren verglichen mit einem anderen CNE-Modell, wurde eine große Menge an Gal-3-Protein nur in Ctns nachgewiesen–/– Nieren. Diese Daten stützen nachdrücklich die Schlussfolgerung, dassCystinosinist am Abbau des Gal-3-Proteins beteiligt, das die Überexpression von Gal-3-mRNA unter Stressbedingungen wie CNE kontrollieren kann.
Gal-3 hat mehrere biologische Rollen, einschließlich Rollen bei akuten und chronischen ErkrankungenEntzündungdurch Anlocken von Monozyten und Makrophagen.37,38In Ctns–/– Mäuse beobachteten wir schwere mononukleäre Infiltrate hauptsächlich in denNierewie vorher beschrieben,11,39die als Monozyten/Makrophagen charakterisiert wurden. Im Gegensatz dazu Nieren aus dem Double Knockout Ctns–/–Mädchen-3–/–Mäuse wiesen sehr wenige Monozyten/Makrophagen-Infiltrate auf, was stark darauf hindeutet, dass Gal-3 daran beteiligt istEntzündungin den Nieren von Ctns–/–Mäuse. Im Zusammenhang mit repetitiven Gewebeverletzungen kann Gal-3 den Übergang zu chronisch auslösenEntzündungund Fibrose.34In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen zeigen unsere Daten die Beteiligung von Gal-3 an der Progression von CKD inCystinose. Tatsächlich ist der doppelte Knockout Ctns–/– Mädchen-3–/–Mäuse zeigten sich besserNiereFunktion und Struktur im Vergleich zu Ctns–/–Mäuse. In ähnlicher Weise weisen Gal-3-defiziente Mäuse weniger Nierenfibrose aufNiereim Vergleich zu WT-Mäusen nach einseitiger Ureterobstruktion,40 und Gal-3-Knockout-Mäuse, die einer Ischämie-Reperfusionsverletzung unterzogen wurden, hatten eine bessere Nierenfunktion im Vergleich zu WT-Mäusen, die einer Ischämie-Reperfusionsverletzung unterzogen wurden.41
Obwohl eine Korrelation zwischen den Gal-3-Spiegeln im Plasma und der Entwicklung von CKD gefunden wurde,42 wurde kein Unterschied in der Gal-3-Expression im Serum von betroffenen Mäusen und Menschen beobachtetCystinoseund gesunde Kontrollpersonen. Durch die Messung verschiedener Zytokinspiegel im Serum fanden wir einen signifikanten Anstieg von MCP-1 in Ctns–/–Mäuse, während Ctns–/–Mädchen-3–/–Mäuse hatten Werte, die mit denen von WT-Mäusen vergleichbar waren. MCP-1 ist ein Zytokin, das im Serum freigesetzt werden kann und einen Gradienten bildet, um Monozyten und Makrophagen an die Verletzungsstelle zu locken.35 Der Anstieg von MCP-1 in den Seren von Ctns–/–Mäuse verglichen mit Ctns–/–Mädchen-3–/–Mäuse war unabhängig von Cystin Akkumulation, weilNiereder Cystingehalt war bei beiden Genotypen ähnlich. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass MCP-1 trotz Cysteaminbehandlung, die den Austritt von Cystin aus den Lysosomen ermöglichte, in den Seren von Patienten mit signifikant erhöht warCystinoseim Vergleich zu gesunden Spendern. Diese Daten deuten stark darauf hin, dass das Fehlen vonCystinosin, eher als die Anhäufung von Cystin, für den MCP-1-Anstieg im Serum verantwortlich ist. Außerdem zeigten wir eine direkte Wechselwirkung zwischen Gal-3 und MCP-1, die kürzlich von Gordon-Alonso et al.43 vorgeschlagen, aber nicht weiter untersucht wurde. Der Mechanismus der Gal-3-vermittelten MCP-1-Aktivierung wurde hier nicht untersucht. Eine Hypothese ist das Vorhandensein eines Signalpeptids im menschlichen MCP-1, das gespalten werden kann, um seine Sekretion zu verstärken.44 Darüber hinaus kann Plasmin den C-Terminus von MCP-1 spalten, was seinen chemischen Lockstoff erhöht Potenz.45 Darüber hinaus verhinderte in Korrelation mit unseren Daten die Hemmung von MCP-1 in einem Mausmodell der diabetischen Nephropathie die Infiltration von Nierenmakrophagen und verbesserte die Nierenfunktion.46,47 InCystinose, deuten unsere Daten stark darauf hin, dass das Fehlen vonCystinosinführt zu einem Anstieg von Gal-3, was die MCP-1-Blutmobilisierung aktiviert und die Nieren verstärktEntzündungund der Verlauf vonchronisches Nierenleiden.
Diese Ergebnisse eröffnen neue Perspektiven auf potenzielle therapeutische Ziele, die die Nierendegeneration bei Patienten mit einschränken oder verzögern könntenCystinose. Tatsächlich wurde festgestellt, dass nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente wie Aspirin und Indometacin die Gal-3-Expression hemmen, indem sie ihre Transkription hemmen.48 Indomethacin wird tatsächlich verwendet, um Polyurie und Polydipsie in zu regulierenCystinose,49 und eine aktuelle Studie mit 307 europäischen Patienten mit Cystinose zeigten ein verbessertes Nierenergebnis bei mit Indomethacin behandelten PatientenCystinosePatienten können neu bewertet werden.
METHODEN
Tierversuche
Der C57BL/6 Ctns–/–Mäuse wurden von Dr. Antignac (Inserm U1163, Paris, Frankreich) bereitgestellt. C57BL/6 Galectin-3 null (Gal-3–/–)-Mäuse wurden von Dr. Fu-Tong Liu (University of California, Davis) und Dr. Jerrold M. Olefsky (University of California, San Diego) bereitgestellt. Die Zuchtstrategie zur Erzeugung von WT, Ctns–/–, Gal-3–/–, Ctns–/– und Gal- 3–/–Mäusen ist in Ergänzende Methoden beschrieben.
Zelllinien
Das Durcheinander wurde durch Hautbiopsien von Neugeborenen von WT und Ctns erzeugt–/–Mäuse. MEF-, 293T- und MDCK-Typ-II-Zelllinien (ATCC, Manassas, VA) wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium gezüchtet, das 1 0 Prozent fötales Kälberserum oder fötales Rinderserum, 100 Einheiten/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin enthielt und 2 mM L-Glutamin.
Co-Immunpräzipitation und Massenspektrometrie-Analyse
Um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, wurden MDCK-Zellen unter Verwendung des lentiviralen pRRL.SIN.cPPT.PGK/WPRE-Vektorrückgrats transduziert, um sie stabil zu exprimierenCystinosin-GFP.51Die Co-Immunpräzipitation wurde wie in Ergänzende Methoden beschrieben durchgeführt. Co-immunpräzipitierte Proteine wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt und durch Massenspektrometrie, LTQ Orbitrap, wie bereits beschrieben, analysiert.19
293T-Zellen, die Gal-3-GFP und MCP-1-DsRed oder Gal-3-GFP und CTNS-DsRed exprimieren, wurden für die Co-Immunpräzipitation verwendet, wie in Ergänzende Methoden beschrieben. Co-immunpräzipitierte Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgelöst, und Gal-3-bindendes MCP-1 wurde unter Verwendung eines Anti-DsRed-Antikörpers nachgewiesen (Clontech Laboratories, Mountain View, CA).
Subzelluläre Fraktionierung
Acht Lebern wurden von C57BL/6-Mäusen erhalten und wie zuvor beschrieben präpariert.52 Die Bedingungen des Gradienten waren im Wesentlichen die gleichen wie in der Originalveröffentlichung beschrieben,52 außer dass Nycodenz anstelle von Metrizamid verwendet wurde.
Behandlungen mit Gal-3-Inhibitor und Proteinase K
Lysate ausCystinosin-GFP MDCK-Zellen und 293T, die Gal-3-GFP und CTNS-DsRed oder Gal-3-GFP und MCP-1-DsRed exprimieren, wurden mit oder ohne 5 mM Thiodigalactosid oder 5 mM N inkubiert -Acetyl-D-Lactosamin bzw. 2 Inhibitoren von Gal-3 CRD. Nach 30-minütiger Inkubation bei 4 - C unter konstantem Schütteln wurden die Lysate mit 50 ml Anti-GFP-Mikroperlen inkubiert und die Immunpräzipitation wurde wie zuvor erwähnt durchgeführt. Präzipitierte Proteine wurden durch SDS-PAGE auf 10 % Gel aufgelöst.
Lysate ausCystinosin-GFP-MDCK-Zellen und Mausleber-Lysosomen-angereicherte Fraktionen wurden mit oder ohne 2 Prozent Triton X-100 für 10 Minuten bei 4 - C inkubiert und dann 30 Minuten mit oder ohne 2,5 mg/ml und 25 mg inkubiert /ml Proteinase K. Nach Enzyminaktivierung mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid für 5 Minuten bei 4 - C wurden Proteine durch SDS-PAGE auf 10 % Gel aufgelöst.
Immunfluoreszenzanalyse
Fixierte MDCK-Zellen wurden mit Anti-Lamp-2 (OriGeneTechnologies, Rockville, MD) und Anti-Gal-3-Antikörper (CedarlaneLaboratories, Burlington, Ontario, Kanada) 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von Alexa Fluor 555 sekundärer Antikörper (Invitrogen, Carlsbad, CA) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Konfokale Bilder wurden unter Verwendung eines Zeiss LSM 700-Mikroskops (Carl Zeiss Microscopy, Jena, Deutschland) aufgenommen.
293T-Zellen, die Gal-3-GFP allein, Gal-3-GFP und DsRed oder Gal-3-GFP und exprimierenCystinosin-DsRed wurden auf einem Deckglas kultiviert, bevor sie auf einen Objektträger montiert wurden. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Keyence BZ-X700-Instruments (Keyence Corp., Osaka, Japan) abgebildet.
FestNiereSchnitte wurden über Nacht bei 4 - C mit Anti-CD68 (BioLegend, San Diego, CA) oder Anti-Gal-3-Antikörper (BioLegend) inkubiert, gefolgt von Alexa Fluor 488 sekundärem Antikörper (Invitrogen), 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Bilder wurden unter Verwendung eines Keyence BZ-X700-Instruments erfasst. Die Quantifizierung der CD68-Expression ist in Ergänzende Methoden beschrieben.
MEFs, die Gal-3-GFP exprimieren, wurden mit einem Anti-Hsc70-Antikörper (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) gefärbt und wie zuvor beschrieben abgebildet.53
FL-Fluoreszenzmikroskopie mit Totalreflexion
WT und Ctns–/–MEF, das Gal-3-GFP exprimiert, und CTNS-DsRed wurden auf einer Bodenschale aus 4--Kammer 35- mm Borosilikat (Cellvis, Mountain View, CA) ausgesät. Nach 2 Tagen in Kultur wurden MEFs durch FL-Fluoreszenzmikroskopie mit totaler interner Reflexion wie zuvor beschrieben analysiert54und in Ergänzende Methoden. Die Bilder wurden mit der ImageJ-Software analysiert.
Gal-3-Ausdrucksanalyse
293T-Zellen, die Gal-3-GFP, Gal-3-GFP und DsRed oder Gal-3-GFP und CTNS-DsRed exprimieren, und explantiertNierenwurden in Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer lysiert, der einen Proteinase-Inhibitor-Cocktail enthielt. Die Proteine wurden auf einem 4- bis 15-prozentigen Gel aufgetrennt und unter Verwendung von Anti-Gal-3- (Abcam, Cambridge, UK) oder Anti-Glycerinaldehyd-3--Phosphat-Dehydrogenase- (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) Antikörpern nachgewiesen .
Nierenwurden in b-Mercaptoethanol enthaltendem RLT-Puffer unter Verwendung von Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, Frankreich) homogenisiert. RNA wurde isoliert und eine Gal-3–-spezifische Tröpfchen-Digital-Polymerase-Kettenreaktion wurde durchgeführt, wie in Ergänzende Methoden beschrieben. Die Gal-3-Transkriptexpression wurde als Verhältnis im Vergleich zur endogenen Kontrolle 18S ausgedrückt. Ein enzymgekoppelter Immunadsorptionsassay (Abcam) wurde verwendet, um den Gal-3-Spiegel in Mäusen und menschlichen Seren gemäß den Anweisungen des Herstellers nachzuweisen.
Nierenfunktion
Serum- und Urinphosphat-, Serumkreatinin- und Harnstoffspiegel wurden unter Verwendung des QuantiChrom-Phosphat-Assay-Kits, des QuantiChrom-Kreatinin-Kits und des QuantiChrom-Urea-Assay-Kits (BioassaySystems, Hayward, CA) geschätzt. Proteinspiegel im Urin wurden unter Verwendung des Pierce BCA Protein Assay Kit (Rockford, IL) gemessen.
Histologie
Als die Mäuse getötet wurden,Nierenwurden gesammelt, in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Mit Hämatoxylin und Eosin gefärbte Schnitte wurden verblindet von Dr. Marie Claire Gubler überprüft, wie in den ergänzenden Methoden beschrieben.
Messung des Cystingehalts
Die Gewebecystinmessung wurde durch Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS) wie zuvor beschrieben durchgeführt.39
Standard-Nephrektomie und Scheinoperation
CNE bei Mäusen wurde durch die standardmäßige Zwischensummen-Nephrektomie-Operation im 2--Stadium wie zuvor beschrieben induziert.55,56Die Schein-Mäusegruppe wurde dem gleichen Verfahren unterzogen, jedoch ohne sie zu schneidenNiereGewebe.
Zytokinspiegel im Serum
Zur Messung der Zytokinspiegel im Mausserum, einer MausEntzündungKit Cytometric Bead Array (BD Biosciences, San Jose, CA) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die MCP-1-Konzentration in menschlichem Serum wurde unter Verwendung eines gegen MCP-1 (Abcam, Cambridge, UK) gerichteten enzymgekoppelten Immunosorbent-Assays gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.
statistische Analyse
Die Werte werden als Mittelwert – SEM ausgedrückt. Die Signifikanz des Ergebnisses wurde durch den ungepaarten 2-schwänzigen t-Test oder den ungepaarten 2-schwänzigen t-Test mit Welch-Korrektur bewertet. Gruppenvergleiche von 3 Bedingungen oder mehr wurden mit parametrischen Varianzanalysen durchgeführt, gefolgt von Tukey-Mehrfachvergleichstests für paarweise Vergleiche. Histologische Werte wurden unter Verwendung des Mann-Whitney-Tests verglichen. Die Analysen wurden unter Verwendung der Software Prism 6 (GraphPad, San Diego, CA) durchgeführt. Ein P-Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant angesehen.
Studienzulassung
Mäuseexperimente wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen des Institutional Animal Use Committee durchgeführt. Die Verwendung von menschlichem Gewebe in dieser Studie wurde von der University of California, San Diego, HumanResearch Protections Program genehmigt.
OFFENLEGUNG
SC ist Mitglied des Scientific Board und Mitglied des Kuratoriums derCystinoseForschungsstiftung. SC ist Mitbegründer, Aktionär und Mitglied sowohl des wissenschaftlichen Beirats als auch des Vorstands von GenStem TherapeuticsInc. Die Bedingungen dieser Vereinbarung wurden von der University of California-San Diego in Übereinstimmung mit ihren Richtlinien zu Interessenkonflikten überprüft und genehmigt. Alle anderen Autoren erklärten keine konkurrierenden Interessen.
Bereitstellen des Gal-3–/–Mäuse. Wir danken Lou Devanneaux und NicholeFlerchinger für ihre technische Hilfe und Elizabeth Souter für die Durchsicht des Manuskripts. Wir danken Christopher Alfonso von BDBioscience für die Bereitstellung der MausEntzündungCytometric Bead Array und für seine Hilfe bei der Interpretation der Ergebnisse. Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse RO1-DK090058 und R01-DK110162 der National Institutes of Health unterstütztCystinoseResearch Foundation und dem California Institute of Regenerative Medicine (CIRM, CLIN-09230). TL wird durch ein Graduiertenstipendium der Vaincre Les MaladiesLysosomales unterstützt. AB und JZ werden durch ein Stipendium der gefördertCystinoseForschungsstiftung. Die UCSD Neuroscience MicroscopyShared Facility wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Grant P30-NS047101 finanziert.
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