Wie wirkt Echinacosid, der wirksame Bestandteil von Cistanche Deserticola, dem Wachstum von Adenokarzinomzellen der Bauchspeicheldrüse?

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Echinacosid unterdrückt das Zellwachstum von Adenokarzinomen der Bauchspeicheldrüse, indem es über den mitogenaktivierten Proteinkinase-Weg Apoptose induziert

WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG und XINFENG LI

Abstrakt.

Die klinische Anwendung von Naturprodukten aus der traditionellen chinesischen Medizin hat in der Krebs-Chemotherapie Aufmerksamkeit erregt.Echinacosid(ECH), eines der Phenylethanoide, isoliert aus den Stängeln vonCistancheSalsa (ein chinesisches Kräuterarzneimittel) hat gewebeschützende und antiapoptotische Wirkungen auf das zentrale Nervensystem. Es bleibt jedoch weitgehend unklar, obEchinacosid besitzt tumorunterdrückende Aktivität. In der vorliegenden Studie wurde dies nachgewiesenEchinacosidkann die Proliferation von Pankreas-Adenokarzinomzellen deutlich hemmen, indem es die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und die Störung des mitochondrialen Membranpotentials induziert und damit triggertApoptose. Außerdem wurde das aufgeklärtEchinacosidunterdrückt das Wachstum von Tumorzellen durch Modulation der MAPK-Aktivität. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine neue Funktion von ECH bei der Verhinderung der Krebsentwicklung aufzeigt und impliziert, dass die Verwendung vonEchinacosid könnte eine mögliche chemotherapeutische Strategie für Krebs sein.

Echinacosid in Cistanche zur AbnahmePankreas-Adenokarzinom-Zellwachstum

Einführung

Krebs ist eine lebensbedrohliche Krankheit und eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Krebszellen werden dadurch gehemmtApoptose, unkontrolliertes Wachstum und Proliferation und Metastasierung (1). Die Entstehung von Krebs, die oft durch genetische Veränderungen ausgelöst wird, ist ein komplexer Prozess, bei dem Interaktionen zwischen onkogenen Proteinen und Tumorsuppressoren ein kompliziertes Signalnetzwerk bilden. Beispielsweise wurde festgestellt, dass das Onkogen Myc bei verschiedenen Krebsarten amplifiziert oder überexprimiert wird, und das Myc-codierte Onkoprotein kann die Tumorentstehung fördern, indem es das Fortschreiten des Zellzyklus vorantreibt, das Zellwachstum stimuliert und die Angiogenese induziert (2). Die durch Myc ausgelösten onkogenen Signale können jedoch den p53-Tumorsuppressorweg über die Induktion des Tumorsuppressors ARF aktivieren, der den onkogenen E3--Ligase-Maus-Double-Minute (MDM)2--vermittelten p53-Abbau abschwächt ( 3). Dies ist ein selbstregulierter Selbstschutzmechanismus, der Zellen vor einer bösartigen Transformation schützt. Bemerkenswerterweise kann p53 die Myc-Aktivität unterdrücken, indem es beispielsweise miR-145 transkriptionell aktiviert, das auf Myc-mRNA zur Translationsunterdrückung abzielt (4,5), wodurch eine negative Rückkopplungsregelschleife gebildet wird.

Die einfachste und effektivste Strategie zur Behandlung von Krebs besteht darin, die Krebszellen abzutöten. Die häufig verwendeten Krebsmedikamente wie Cisplatin (6), Actinomycin D (7) und Adriamycin (8) hemmen nachweislich das Tumorwachstum, indem sie die Apoptose fördern. In jüngster Zeit wurde zunehmend nachgewiesen, dass eine Reihe von Naturstoffen und Derivaten aus Pflanzen, insbesondere aus Heilpflanzen, die in der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) verwendet werden, eine tumorunterdrückende Funktion aufweisen, indem sie die Apoptose von Krebszellen induzieren, und das Potenzial für eine klinische Anwendung haben in der Krebstherapie (9). Beispielsweise kann das aus der TCM, Radix rhizome Rhei, isolierte natürliche Anthrachinon Emodin das Wachstum zahlreicher Arten von Krebszellen unterdrücken(10,11). Camptothecin, abgeleitet vom chinesischen „Glücksbaum“, Camptotheca acuminate, ist ein wertvolles Naturprodukt, das die Ligation von DNA nach Topo-I-vermittelten Strangbrüchen hemmt (12). In einer weiteren retrospektiven populationsbasierten Kohortenstudie mit insgesamt 729 Patientinnen mit fortgeschrittenem Brustkrebs wurde vorgeschlagen, dass die TCM-Therapie zur Krebsbehandlung beitragen kann. Von dieser Kohorte waren 115 Patienten TCM-Anwender, während 614 Patienten keine TCM anwendeten. Die multivariate Analyse zeigte, dass die Anwendung von TCM im Vergleich zu Nichtanwendern mit einem signifikant verringerten Risiko für Gesamtmortalität assoziiert war (13). Alle vorgenannten Erkenntnisse weisen darauf hin, dass die TCM eine wichtige Komplementär- und Alternativmedizin ist, die bei der Behandlung von Krebs eingesetzt werden kann.

Echinacosid(ECH) ist ein Phenylethanoid, das aus den Stämmen von isoliert wirdCistanchenSalsa, eine chinesische Kräutermedizin, die eine wichtige Rohdroge ist, die als Antiserum und Mittel gegen Ermüdung verwendet wird (14). Es wurde festgestellt, dass mehrere Phenylethanoide Eigenschaften zum Abfangen freier Radikale besitzen und vor durch oxidativen Stress verursachten toxischen Verletzungen schützen (15). Darüber hinaus weitere biologische Eigenschaften vonEchinacosidwurden inzwischen aufgeklärt. Beispielsweise kann ECH die erhöhten Konzentrationen an entzündlichen Zytokinen retten und histopathologische Anomalien der Lunge bei Mäusen mit akuter Lungenschädigung verbessern (16,17). Ebenfalls,Echinacosid wurde gezeigt, dass es schützende Wirkungen auf das Nervengewebe hat und Verhaltensstörungen in Mausmodellen der Parkinson-Krankheit verbessert (18). Insbesondere wurde festgestellt, dass ECH die Zellproliferation fördert und hemmtApoptosein den epithelialen MODE-K-Zellen des Darms der Maus (19). Bisher wurde jedoch der potenziellen Rolle von ECH in der Krebsprävention weniger Aufmerksamkeit geschenkt.

In dieser Studie wurde untersucht, obEchinacosid Behandlung das Wachstum und die Proliferation von Tumorzellen beeinflusst und obEchinacosidinduziert Apoptose, erhöht die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und reduziert das mitochondriale Membranpotential (MMP) und unterdrückt folglich das Wachstum von Tumorzellen. Darüber hinaus zielte die vorliegende Studie darauf ab, die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die für die ECH-vermittelte Zellwachstumshemmung verantwortlich sind.

Materialen und Methoden

Zelllinie, Reagenz und Antikörper.

SW1990-Pankreas-Adenokarzinomzellen (ATCC, Manassas, VA, USA) wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 50 U/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin, bei 37 °C in kultiviert eine mit 5 Prozent CO2 befeuchtete Atmosphäre.Echinacosidwurde von Jrdun Biotechnology Corp. (Shanghai, China) erworben. Antikörper gegen AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 und GAPDH wurden von Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) bezogen; Anti-Bax und Anti-Bcl-2 wurden von Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) bezogen; und Anti-Caspase-3 wurde von Abcam (Shanghai, China) gekauft.

Zelllebensfähigkeitstest.

Um die Geschwindigkeit des Tumorzellwachstums zu bestimmen, wurde das Cell Counting Kit{{0}} (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Zellsuspensionen wurden mit 5,000 Zellen pro Vertiefung mit ECH-Behandlung für 0, 12, 24, 48 oder 72 h in 96--Well-Kulturplatten ausgesät. Die Hemmung des Zellwachstums wurde durch Zugabe von WST-8-Reagenz aus dem CCK-8-Kit in einer Endkonzentration von 10 % zu jeder Vertiefung bestimmt, und die Extinktion der Proben wurde bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA).

Hoechst 33342-Färbung.

Zellen (60 % Konfluenz) wurden mit Hoechst 33342 (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China) in einer Endkonzentration von 1 µg/ml behandelt, 15 min lang in einem 37 °C-Inkubator inkubiert, zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und fixiert in 4 Prozent Paraformaldehyd für 30 min bei Raumtemperatur und auf Objektträger montiert. Die morphologischen Veränderungen der Zellkerne wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus BX51, Melville, NY, USA) beobachtet. Die normalen Kerne waren rund und hellblau gefärbt, während die apoptotischen Kerne geschrumpft und hellblau gefärbt waren.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)-Analysen.

Für die Begutachtung vonApoptose, das Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Annexin VApoptoseDas Detektionskit (BD Biosciences, Shanghai, China) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Kurz gesagt wurden 5x104 Zellen mit eiskaltem PBS gewaschen, in 0,1 ml Bindungspuffer (Beyotime Institute of Biotechnology) resuspendiert und mit 10 ml FITC-konjugiertem Annexin V (10 mg/ml) und 10 gefärbt ml Propidiumiodid (PI) (50 mg/ml). Nach 15-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln und Zugabe von 400 ml Bindungspuffer wurden die Zellen mit einem Durchflusszytometer (C6; BD Biosciences, Shanghai, China) analysiert.

Messung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS).

Um die Produktion von ROS zu bewerten, wurde das Reactive Oxygen Species Assay Kit (Vigorous Biotechnology, Peking, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Kurz gesagt, Zellen (80 Prozent Konfluenz) wurden geerntet und mit PBS gewaschen, bevor sie mit der Dihydroethidium (DHE)-Lösung (Beyotime Institute of Biotechnology) gefärbt wurden. Die Zellen wurden dann durch durchflusszytometrische Analysen analysiert.

Messung des mitochondrialen Membranpotentials (MMP).

Ein Tetramethylrhodaminmethylester (TMRM)-Assay-Kit (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, USA) wurde verwendet, um die Veränderungen in MMP nachzuweisen. Kurz gesagt, Zellen (80 Prozent Konfluenz) wurden geerntet, mit PBS gewaschen und mit TMRM für 15–20 min in einem 37 °C-Inkubator gefärbt. Die Zellen wurden dann einmal mit PBS gewaschen und durchflusszytometrischen Analysen unterzogen.

Immunoblot-Analysen.

Die Zellen (80 Prozent Konfluenz) wurden geerntet und in RIPA-Puffer (Jrdun Biotechnology) bestehend aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % NP‑40, 1 % Natriumdesoxycholsäure und 0,1 % SDS sowie frisch hinzugefügte Proteasom-Inhibitoren. Gleiche Mengen an klarem Zelllysat wurden für die Immunoblotting-Analyse verwendet, wie zuvor beschrieben (20).

Statistische Analyse.

Quantitative Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Statistische Unterschiede wurden durch den ungepaarten Student-t-Test unter Verwendung der statistischen SPSS 15.0-Software bewertet. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Ergebnisse

Echinacosid unterdrückt das Wachstum von Tumorzellen. Obwohl es darüber berichtet wurdeEchinacosid zeigt eine schützende Rolle durch HemmungApoptoseund entzündlichen Signalen in somatischen Zellen, wie neuronalen und intestinalen Epithelzellen (16-19), bleibt es unklar, ob ECH das Wachstum und die Proliferation von Krebszellen kontrolliert. Um dies zu testen, wurde ein Zellüberlebensassay durchgeführt, indem SW1990-Zellen, die von einem Pankreas-Adenokarzinom Grad II stammten, mit titrierten Dosen von ECH behandelt wurden, wie in 1 gezeigt. Bemerkenswerterweise wurde gezeigt, dass ECH die Tumorzellproliferation in einer Dosis signifikant verzögert -abhängige Weise während einer 5--tägigen Kulturperiode (Abb. 1).

Echinacosid löst Apoptose aus. Als Verlust vonApoptoseeiner der wichtigsten ursächlichen Mechanismen ist, die der unkontrollierten Proliferation von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen zugrunde liegen (21), führte die vorliegende Studie eine Reihe von Experimenten durch, um festzustellen, ob ECH Apoptose auslöst. Erstens wurde durch Färbung der Kerne von Tumorzellen mit Hoechst 33342 gezeigt, dass ECH zu führtApoptosein dosisabhängiger Weise (Abb. 2A). Zusätzlich wurden FACS-Analysen unter Verwendung von Annexin V/PI-Färbung durchgeführt, um die apoptotische Wirkung von ty weiter zu bestätigenEchinacosid (Abb. 2B). Der durchschnittliche Prozentsatz an apoptotischen Zellen betrug unter normalen Kulturbedingungen 1,1 Prozent, während dieser Prozentsatz als Reaktion auf die ECH-Behandlung dosisabhängig signifikant auf 10,6, 21,4 und 51,3 Prozent anstieg (Abb. 2C). Diese Ergebnisse zusammen mit dem in Fig. 1 gezeigten Zelllebensfähigkeitsassay zeigen diesEchinacosidBehandlung unterdrückt die Proliferation von Tumorzellen durch TriggerungApoptose.

Echinacosid die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) anregt. Mehrere Krebs-Chemotherapeutika, wie Doxorubicin und Cisplatin, haben sich als potente Erzeuger von ROS erwiesen, die eine entscheidende Rolle bei der Apoptoseinduktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen spielen (22). Daher wurde untersucht, ob die ECH-Behandlung auch die ROS-Produktion regulieren könnte. Um dies zu testen, wurde DHE, das oxidiert werden kann, um Ethidium zu erzeugen, das mit DNA interkaliert, in dieser Studie zur Bewertung der ROS-Produktion verwendet. Es wurde festgestellt, dass, wie andere Krebsmedikamente,Echinacosid stimuliert auch dosisabhängig die ROS-Produktion, wie die erhöhte Fluoreszenzintensität nach der ECH-Behandlung zeigt (Abb. 3).

Echinacosidreduziert MMP. Es wurde gezeigt, dass mitochondriale Dysfunktion an der Induktion von Apoptose beteiligt ist. Es wurde gezeigt, dass das Öffnen der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore die Depolarisation des Transmembranpotentials und die Freisetzung von pro-apoptotischen Faktoren induziert (23). Daher wurde getestet, obEchinacosid könnten einen MMP-Verlust in Tumorzellen induzieren, indem sie einen TMRM-Assay durchführen, was ein gut etablierter Ansatz ist, da die Intensität der TMRM-Fluoreszenz proportional zum Membranpotential ist. Das wurde demonstriertEchinacosid Behandlung reduziert MMP dosisabhängig signifikant (Abb. 4).

Echinacosid steuert das Wachstum von Tumorzellen über Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK), aber nicht AKT, Signale. Um die molekularen Grundlagen weiter zu untersuchenEchinacosid-vermittelten Tumorzelltod wurde die Aktivität mehrerer lebenswichtiger Signalwege, wie MAPK und AKT (24,25), die das Zellüberleben und den Zelltod kontrollieren, untersucht. Die MAPKs sind evolutionär konservierte, auf Prolin gerichtete Ser/Thr-Proteinkinasen, einschließlich extrazellulärer signalregulierter Kinasen (ERKs), c-Jun-NH2--terminaler Kinase (JNKs) und der p38-Familienmitglieder, die durch drei aktiviert werden -Tier-Kinase-Signalkaskaden (26,27). In dieser Studie wurde die Expression von MAPKs und AKT sowie ihrer aktivierten phosphorylierten Formen bewertet und es wurde festgestellt, dassEchinacosid unterdrückt deutlich die JNK- und ERK1/2-Aktivität, verstärkt aber die p38-Aktivität (Fig. 5). Insbesondere wurde gezeigt, dass die AKT-Aktivität, die ebenfalls von entscheidender Bedeutung für die Zellproliferation ist, durch die ECH-Behandlung nicht beeinflusst wird (Abb. 5). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die ECH-Behandlung die Expression von Bax und Caspase-3 erhöht, während die Bcl-2-Expression reduziert wird (Fig. 5), was mit Fig. 2 übereinstimmt. Die Ergebnisse weisen also darauf hinEchinacosidlöst über den MAPK-Signalweg die Apoptose von Tumorzellen aus.

ZistancheEchinacosidzur Anti-Apoptose

Diskussion

Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Studie, die dies zeigtEchinacosid hat durch Triggerung eine tumorunterdrückende FunktionApoptose(Abb. 2), die Förderung der ROS-Produktion (Abb. 3) und die Induktion der mitochondrialen Membranpotentialdepolarisation (Abb. 4), was folglich zu einer Hemmung des Tumorzellwachstums führt (Abb. 1). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die molekulare Grundlage des ECH-vermittelten Tumorzelltods durch die Regulierung von MAPK-Signalwegen erfolgt (Abb. 5). Diese Befunde demonstrieren eine neue Funktion von ECH bei der Verhinderung der Tumorentstehung und legen somit nahe, dass es ein Wirkstoffkandidat für die Krebstherapie sein könnte.

Die Mehrzahl der Krebsmedikamente kann Apoptose, Seneszenz und/oder Zellzyklusarrest von Tumorzellen induzieren, was zu einer Hemmung des Wachstums und der Proliferation von Tumorzellen führt. Der Zellzyklusarrest ist eine zelluläre Reaktion auf leichte Stresssignale, die es Zellen ermöglichen, beschädigte DNA zu reparieren, bevor die replikative DNA-Synthese oder Mitose eingeleitet wird, während Apoptose und Seneszenz (permanenter Zellzyklusarrest) als Reaktion auf Stresssignale auftreten, die irreparable oder bösartige Zellen eliminieren ( 28,29). Daher nur die apoptotische Wirkung vonEchinacosid auf Tumorzellen wurde in dieser Studie bewertet, da das Abtöten von Krebszellen ein Hauptkriterium für die Bewertung der Wirksamkeit eines Antikrebsmittels ist. Bemerkenswerterweise wurde gezeigt, dass ECH die Expression von Bax ( 5 ), einem pro-apoptotischen Gen, das durch den Tumorsuppressor p53 (30) transkriptionell aktiviert wird, induziert. Es lohnt sich also zu testen, obEchinacosid kann den p53-Signalweg aktivieren. Wenn dies der Fall ist, kann ECH möglicherweise auch einen p53--abhängigen Zellzyklusarrest, Seneszenz, Apoptose oder Autophagie hervorrufen. In dieser Studie wurde die tumorunterdrückende Funktion von ECH in der Pankreas-Adenokarzinom-Zelllinie SW1990 aufgeklärt. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, in denen mehr Bauchspeicheldrüsenkrebszelllinien beobachtet werden. Es wurde gezeigt, dass Mutationen im onkogenen Protein RAS und im Tumorsuppressor p53 mit der Entstehung von Bauchspeicheldrüsenkrebs assoziiert sind (31); Die SW1990-Zelllinie enthält jedoch laut der IARC-p53-Datenbank keine p53-Mutation. Daher ist es wichtig zu untersuchen, obEchinacosid kann das Wachstum und die Proliferation anderer Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zelllinien mit anderen p53-Mutationen beeinflussen. Darüber hinaus wäre es interessant festzustellen, ob ECH in der Lage ist, die Apoptose zu fördern und das Wachstum anderer Tumorarten zu hemmen.

ROS-Erhöhung und MMP-Reduktion, die verursacht wurden durchEchinacosid Behandlung, haben sich als wesentlich erwiesenApoptoseInduktion (22). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass ROS die Oxidation der mitochondrialen Poren induzieren kann, was zur Freisetzung von Cytochrom c, einem Zwischenprodukt bei der Apoptose, aufgrund der Störung der MMP beiträgt (22). Daher bleibt zu klären, ob ECH MMP indirekt durch die Induktion von ROS stört. Darüber hinaus wurde auch gezeigt, dass ROS-induzierter oxidativer Stress an der Modulation einer Vielzahl von Signalen zur Steuerung des Zellwachstums beteiligt ist, darunter p53, NF-κB, HIFs und PI3K (32). Ob und ggf. wie ECH diese wichtigen Signalwege reguliert, muss noch geklärt werden. Insbesondere verursacht oxidativer Stress verschiedene neurodegenerative Erkrankungen aufgrund des hohen Sauerstoffverbrauchs, schwacher antioxidativer Systeme und terminaler Differenzierungsmerkmale des zentralen Nervensystems (33). Das haben jedoch mehrere Studien gezeigtEchinacosidhat schützende und antiapoptotische Wirkungen auf das Nervengewebe. In dieser Hinsicht ist es vernünftig anzunehmen, dass ECH die ROS-Produktion in den terminal differenzierten neuralen Zellen reduzieren kann. Daher bleibt auch zu klären, ob die Regulation der ROS-Produktion durch ECH vom Zelldifferenzierungsstatus abhängt. Daher zeigen die vorliegenden Ergebnisse zusammen mit anderen Studien, dass ECH, die weit verbreitete TCM, eine wichtige chemotherapeutische Strategie nicht nur zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, sondern auch von malignen Karzinomen sein kann.

In letzter Zeit gewinnt die Anwendung der TCM in der Krebstherapie zunehmend an Aufmerksamkeit. Das Potenzial der in der TCM verwendeten Naturstoffe aus Heilpflanzen wurde auch in der westlichen Welt von der Wissenschaft erkannt (9). Es sind Anstrengungen erforderlich, um die zugrunde liegenden Wirkmechanismen dieser Naturstoffe aufzuklären, was schließlich zur Entwicklung effizienter und sicherer Medikamente für die Krebstherapie führen könnte.

Zusammenfassend zeigte die vorliegende Studie die tumorhemmende Funktion vonEchinacosid und erarbeitet auch die molekulare Basis vonEchinacosid-vermittelte Tumorsuppression, was auf die potenzielle klinische Anwendung hindeutetEchinacosid in der Krebstherapie.

Echinacosidin cistanche

Danksagungen

Diese Studie wurde vom Key Program of Scientific Research der FMU finanziert und unterstützt (Fördernummer 09ZD014). Die Autoren danken Biomedworld (Shanghai, China) für die Hilfe bei der Bearbeitung des Manuskripts.

AusEchinacosidunterdrückt das Wachstum von Adenokarzinomzellen der Bauchspeicheldrüse durch InduktionApoptoseüber den mitogenaktivierten Proteinkinaseweg von WEI WANG, JINBIN LUO, YING HUI LIANG und XINFENG LI

---MOLECULAR MEDICINE REPORTS 13: 2613-2618, 2016 DOI: 10.3892/mmr.2016.4867

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