Renoprotektive Wirkung von AM6545- und AM4113-Behandlungen auf das metabolische Syndrom

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TEIL Ⅰ: Interferenz mit TGF 1--vermittelter Entzündung und Fibrose liegt renoprotektiven Wirkungen der neutralen CB1-Rezeptor-Antagonisten AM6545 und AM4113 in einem Rattenmodell des metabolischen Syndroms zugrunde

Basma G. Eid, Thikryat Neamatallah, Abeer Hanafy, Hany M. El-Bassossy & et al.

1. Einleitung

StoffwechselSyndrom(MetS), ist eine Kombination ausStoffwechsel-Anomalien, die sich häufig als Insulinresistenz (IR), abdominale Fettleibigkeit, Dyslipidämie und Bluthochdruck äußern [1]. Patienten mit MetS (StoffwechselSyndrom) haben ein hohes Risiko, an Diabetes, atherosklerotischen Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) und Nierenfunktionsstörungen zu erkranken [2]. Alle diese Krankheiten stellen schwerwiegende und oft tödliche Gesundheitsprobleme dar, die in den meisten Ländern weit verbreitet sind. Die Prävalenz von MetS (StoffwechselSyndrom) nimmt weltweit zu, mittlerweile sind über eine Milliarde Menschen betroffen [3]. Dieser Anstieg ist mit körperlicher Inaktivität, kalorienreichem Essen und mit Zucker ergänzten Getränken verbunden [4,5]. Die Beziehung zwischen MetS(StoffwechselSyndrom) und chronischer Nierenerkrankung (CKD) ist umstritten. Mehrere Studien haben jedoch berichtet, dass eine fruktosereiche Ernährung MetS induziert (StoffwechselSyndrom), die anschließend zu verschiedenen Manifestationen der Nephropathie fortschreitet, wie z. B. reduzierte glomeruläre Filtration, Albuminurie, Urikosurie, Proteinurie und Veränderungen der Nierenmorphologie [6-8]. Mögliche Mechanismen einer Nierenfunktionsstörung können die systemische Freisetzung von entzündungsfördernden Zytokinmediatoren, freien Radikalen und oxidativem Stress bei MetS umfassen.StoffwechselSyndrom)[9,10]. Tatsächlich ist die Inzidenz von CKD bei Patienten mit MetS(StoffwechselSyndrom) ist 2,6--mal höher als bei Personen ohne MetS (StoffwechselSyndrom) Komponenten [11].

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Therapeutische Interventionen bei MetS(StoffwechselSyndrom) umfassen die Modulation des überaktiven Endocannabinoid (EC)-Systems durch Hemmung des Cannabinoid-CB1-Rezeptor-Subtyps |12]. Es wurde gezeigt, dass die Hemmung des CB1-Rezeptors den Appetit, die Nahrungsaufnahme und die Lipogenese bei fettleibigen Ratten reguliert [13-15]. Der CB1 ist ein Rhodopsin-ähnlicher G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) der Klasse A, der hauptsächlich G i/o-Proteine ​​aktiviert [16]. Die allgegenwärtigen CB1-Rezeptoren sind im Zentralnervensystem (ZNS) weit verbreitet, was die Inzidenz neuropsychiatrischer Störungen erhöhen kann [17]. Es wurde festgestellt, dass ein vollständiges System von Endocannabinoiden in der Niere existiert und eine bedeutende Rolle bei der renalen Homöostase sowie bei der Entwicklung von diabetischer Nephropathie und Erkrankungen wie CKD[18] spielt. Es wurde berichtet, dass CB1- und CB2-Rezeptoren vorhanden sind die verschiedenen Teile des Nephrons sowie andere Nierenzellen sowohl bei Menschen als auch bei Nagetieren [19]. Darüber hinaus spielt das Endocannabinoid-System in der Niere eine vorherrschende Rolle in der renalen Hämodynamik [20].

Rimonabant (SR141716) beispielsweise ist ein inverser CB1-Rezeptor-Agonist, der im April 2006 klinisch zur Behandlung zugelassen wurdeStoffwechsel-Komplikationen und Adipositas in Europa [21]. Allerdings wurde von der Europäischen Arzneimittelagentur ein Absetzen des ZNS-penetrierenden Medikaments Rimonabant angestrebt, da es mit Angstzuständen, Depressionen und einer erhöhten Suizidneigung in Verbindung gebracht wurde [17].

Um die neuropsychiatrischen Nebenwirkungen von Rimonabant zu umgehen, die auf die zentralen Wirkungen zurückzuführen sind, die mit seinem inversen Agonistenprofil verbunden sind, verfolgten wir zwei Strategien für die Entwicklung wirksamer Analoga, denen seine unerwünschten Nebenwirkungen fehlen. Die erste davon war die Entdeckung neutraler CB1-Antagonisten. Diese Verbindungen verhindern im Gegensatz zu ihren inversen Agonisten-Gegenstücken, die den inaktiven Zustand des Rezeptors fördern, dass die endogen vorkommenden Endocannabinoide mit CB1 interagieren. AM4113 ist ein erfolgreicher neutraler CB1-Antagonist, der die wünschenswerten Wirkungen von Rimonabant teilt, aber dessen unerwünschten Nebenwirkungen fehlen. Unsere zweite Strategie bestand darin, CB1-Rezeptorantagonisten zu entwickeln, die die Blut-Hirn-Schranke nicht überwinden können.AM6545stellt einen erfolgreichen peripher wirkenden Liganden dar, während gleichzeitig das CB1-neutrale Antagonistenprofil beibehalten wird. Es wurde berichtet, dass beide Medikamente die therapeutische Aktivität in verschiedenen Tiermodellen mit weniger Nebenwirkungen als Rimonabant [22-26] beibehalten.

In der aktuellen Studie wollten wir feststellen, ob eine Behandlung mit den CB1-Rezeptor-AntagonistenAM6545undAM4113würde die Nierenfunktion in einem High-Fructose-High-Salz-Modell verbessernStoffwechsel-Syndromund den zugrunde liegenden Mechanismus für die verbesserte Funktion zu erforschen. Eine solche Studie würde es uns ermöglichen, festzustellen, ob eine der Wirkungen dieser Verbindungen eine Komponente hat, die mit der zentral erzeugten CB1-Inaktivierung zusammenhängt.

2. Ergebnisse

2.1. Wirkung von AM6545- und AM4113-Behandlungen auf den renalen Endocannabinoid-Tonus

Die Messung von Anandamid (AEA) und 2-Arachidonoylglycerol (2-AG) in Nierenhomogenaten wurde durchgeführt, um den Endocannabinoidtonus in der Niere zu beurteilen. Wie in Tabelle 1 gezeigt, wenn Kontrollratten (C) mit beiden behandelt wurdenAM6545(C plus A65) oderAM4113(C plus A41) gab es keine signifikante Wirkung auf den Gehalt an sowohl AEA als auch 2-A Gin in der Niere. Tiere mitStoffwechsel-Syndrom(MetS) zeigten im Vergleich zu den Kontrollen (C) erhöhte Werte sowohl von AEA als auch von 2-AG. Nach der Behandlung derStoffwechsel-SyndromRatten mit beidenAM6545(M plus A65) oderAM4113(M plus A41) zeigten die Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren immer noch viel höhere Konzentrationen sowohl von AEA als auch von 2-AG in den Nieren.

Tabelle 1. Nierengehalt von Anandamid und 2-Arachidonoylglycerin.

2.2. Wirkung von AM6545- und AM4113-Behandlungen auf die Nierenfunktion bei Ratten mit MetS (metabolisches Syndrom).

MetS(StoffwechselSyndrom) aufgrund fruktosereicher, salzreicher Fütterung ist mit einer Verschlechterung der Nierenfunktion verbunden, was durch die erhöhte Albuminausscheidungsrate (AER) und Proteinurie im Vergleich zu Kontrollen angezeigt wird (S<0.05, figure="" 1a,="" b).="" both="">AM6545undAM4113stark gehemmt (s<0.05)the elevated="" proteinuria="" and="" albumin="" excretion="" rate="" to="" similar="" levels="" suggesting="" protection="" of="" renal="" function="" in="">StoffwechselSyndrom). WederAM6545NochAM4113signifikant AER oder Proteinurie beeinflusst, wenn es Kontrolltieren verabreicht wurde (Abbildung 1A, B). Die Kreatinin-Clearance wurde berechnet und war viel niedriger in derStoffwechsel-SyndromGruppe (M) im Vergleich zu Kontrollen (Abbildung ]C). Entweder administrierenAM6545(M plus A65) oder AM4113 (M plus A41) an dieStoffwechsel-Ratten hatten keine Wirkung auf die Kreatinin-Clearance (Fig. 1C).

Abbildung 1. Die CB1-RezeptorantagonistenAM6545undAM4113Verbesserung der Nierenfunktionsparameter bei fruktosereicher, salzreicher ErnährungStoffwechsel-SyndromRatten.

(A) zeigt die Albumin-Ausscheidungsrate (AER), (B) zeigt die Proteinurie und (C) zeigt die in der Kontrolle gemessene Kreatinin-Clearance

(C) undStoffwechsel-Syndrom(M)Ratten sowie nach 4-wöchiger intraperitonealer Injektion vonAM6545in Kontrolle (C plus A65) undStoffwechsel-Ratten (M plus A65) oder AM4113 in der Kontrolle (C plus A41) oderStoffwechsel-Ratten (M plus A41) in einer Dosis von 10 mg/kg/Tag.

Die Ergebnisse werden als Boxplots und der Mittelwert als (plus)(n=8).*p dargestellt<0.05 relative="" to="" the="" control="" group=""><0.05 relative="" to="" the="">Stoffwechsel-SyndromGruppe durch einfache ANOVA, gefolgt von Tukey's Post-Hoc-Test.

2.3. Wirkung von AM6545- und AM4113-Behandlungen auf den Blutdruck

Die Blutdruckmessung mit der nicht-invasiven Schwanzmanschettenmethode ergab, dass MetS(StoffwechselSyndrom)-Tiere (M, M plus A65, M plus A41) zeigten signifikant höhere systolische und diastolische Blutdruckwerte im Vergleich zu Kontrolltieren. Behandlung der Tiere mit beidenAM6545oderAM4113verursachten keine signifikanten Veränderungen des systolischen und diastolischen Blutdrucks (Tabelle 2).

Tabelle 2. Wirkung von AM6545 und AM4113 auf den systolischen und diastolischen Blutdruck (BP) von durch das metabolische Syndrom (MetS) induzierten Ratten.

2.4. Auswirkungen der Behandlungen mit AM6545 und AM4113 auf die renale Histopathologie bei Ratten mit MetS (metabolisches Syndrom).

Untersuchung H&E-gefärbter Schnitte von MetS(StoffwechselSyndrom)-Ratten zeigten ausgeprägte histopathologische Veränderungen, insbesondere in der Nierenrinde, wo abnormale Veränderungen hauptsächlich in den Glomeruli und proximalen gewundenen Tubuli und im Nierenstroma im Vergleich zur Kontrollgruppe zu sehen waren. Die Niere von Kontrollratten zeigte die normale Struktur der Nierenrinde (Abbildung 2A, B), die hauptsächlich Nierenkörperchen enthielt, die aus glomerulären Kapillaren bestanden, die von der Bowman-Kapsel eingeschlossen waren. Ferner gab es einen Kapselraum zwischen dem proximalen (PCT) und dem distalen gewundenen Tubulus (DCT). Hohe quaderförmige Zellen mit einem eosinophilen Zytoplasma mit zentralen abgerundeten Kernen säumten die proximalen gewundenen Tubuli. Hohe Mikrovilli füllten das Lumen der Tubuli, die einen bürstenförmigen Lumenrand zeigten. Die distalen gewundenen Tubuli waren relativ zum PCT knapp. In MetS (StoffwechselSyndrom)-Ratten zeigte die Niere unterschiedliche Grade von Veränderungen (Abbildung 2C-E), wobei einige Glomeruli mit erweiterten glomerulären Kapillaren hypertrophiert waren, während andere Glomeruli atrophisch erschienen. Darüber hinaus waren die meisten PCTs mit Verlust der Pinselränder erweitert; ihre Zellen hatten vakuolisiertes Zytoplasma und dunkle pyknotische Kerne. Darüber hinaus zeigte das DCT einige degenerative Veränderungen mit Wänden und vakuolisiertem Zytoplasma. Darüber hinaus wurden in verschiedenen Bereichen der Nierenrinde interstitielle Räume, peritubulare Blutungen und mononukleäre entzündliche Zellinfiltrationen beobachtet. Interessanterweise MetS(StoffwechselSyndrom) Ratten behandelt mitAM6545(Abbildung 3A, B) und AM4113 (Abbildung 3C, D) zeigten eine deutliche Verbesserung des histologischen Nierenprofils, das sich durch nahezu normale Glomeruli und PCT ohne Anzeichen von Degeneration und/oder Infiltration von Entzündungszellen manifestierte.

Abbildung 2. Repräsentative Mikrofotografien der histologischen Struktur der Nierenrinde in Kontrolle undStoffwechsel-SyndromRatten.

Die Kontrollgruppe (A, B) zeigt normale Nierenglomeruli (G) und Tubuli (PCT, DCT), während in derStoffwechsel-SyndromGruppe (CE) einige Glomeruli erschienen atrophiert (G1), während andere hypertrophiert (G2) mit erweiterten Kapillaren erschienen ().

Der größte Teil des PCT erschien degeneriert mit erweitertem Lumen, Verlust des Bürstensaums und pyknotischen Kernen (innerhalb eines Kreises).

Beachten Sie das Vorhandensein von weiten Zwischenräumen (*), Blutextravasation (*) und Infiltration mit Entzündungszellen (ICI). (H&E – A, C × 200 – B, D, E × 400).

Abbildung 3. Repräsentative Mikrofotografien der histologischen Struktur der Nierenrinde in den Rattengruppen vonStoffwechsel-Syndrombehandelt mitAM6545(Eine BandAM4113(C, D) CB1-Rezeptorantagonisten.

Beachten Sie die Wiederherstellung des nahezu normalen Aussehens im Vergleich zur Kontrollgruppe in Bezug auf die Glomeruli (G) und Tubuli (PCT, DCT). (H&E – A, C × 200 – B, D × 400)

2.5. Wirkung von AM6545- und AM4113-Behandlungen auf UIric-Säurespiegel bei MetS(Metabolic-Syndrom)-Ratten

Angesichts der Bedeutung von Harnsäure bei Nierenentzündungen und dem Fortschreiten zu einer chronischen Nierenerkrankung zeigt Abbildung 4, dass MetS(StoffwechselSyndrom) Tiere hatten einen zehnfach erhöhten Harnsäuregehalt im Urin im Vergleich zu den Kontrolltieren (S<0.05). however,="" both="" cb1="" antagonists,="">AM6545undAM4113, erheblich (S<0.05) inhibited="" this="" increased="" uric="" acid="" content="" while="" restoring="" it="" to="" near="" normal="" values.="" meanwhile,="" neither="">AM6545NochAM4113signifikant den Uringehalt von Harnsäure bei Kontrolltieren beeinflusst.

2.6. Wirkung vonAM6545undAM4113Behandlungen auf TGF 1-Spiegeln in MetS(StoffwechselSyndrom) Ratten

Die Studie untersuchte weiter die Rolle von TGF 1 als Hauptmediator von Entzündungen und Fibrose. Wie in Abbildung 5 gezeigt, ist die Gewebekonzentration von TGF 1 in aus MetS(StoffwechselSyndrom) Ratten war deutlich (S<0.05) increased="" than="" in="" normal="" animals.="" however,="" the="" four="" weeks="" of="" treatment="" with="">AM6545undAM4113führte zu einem erheblichen (S<0.05)reduction of="" tgfβ1="" concentrations,="" restoring="" it="" to="" normal="" values.="" while="" neither="">AM6545NochAM4113beeinflusste die TGF 1 -Gewebekonzentrationen in Kontrollnieren signifikant. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass der CB1-Rezeptor eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung von Entzündungen und Nierenfibrose spielt.

Der Korrelationskoeffizient wurde berechnet, um die Korrelation zwischen der Albuminausscheidungsrate und dem Nierenspiegel von TGF 1 auszuwerten (Tabelle 3). Eine starke Korrelation war zwischen der AER und TGF 1 in der Kontrolle und vorhandenStoffwechsel-SyndromTiere. Die Korrelation war auch bei den behandelten Tieren vorhandenAM6545, aber nicht mitAM4113.

Abbildung 4. Die CB1-RezeptorantagonistenAM6545undAM4113blockiert die zehnfache Erhöhung des Harnsäuregehalts im Urin bei hohem Fruktose- und hohem SalzgehaltStoffwechsel-SyndromRatten.

Die Konzentration von Harnsäure wurde im Urin der Kontrolle (C) und gemessenStoffwechsel-Syndrom(M) Ratten sowie Kontroll- uStoffwechsel-Ratten behandelt mitAM6545(C plus A65) bzw. (M plus A65) bzwAM4113(C plus A41) bzw. (M plus A41) in einer Dosis von 10 mg/kg/Tag. Die Ergebnisse werden als Boxplots und der Mittelwert als ( plus )(n=8).*p angezeigt<0.05relative to="" the="" control="" group="" and=""><0.05 relative="" to="" the="">Stoffwechsel-SyndromGruppe durch einfache ANOVA, gefolgt von Tukey's Post-Hoc-Test.

Abbildung 5. Die CB1-RezeptorantagonistenAM6545undAM4113reduzieren die TGF-1-Produktion bei Fruktose-induziertenStoffwechsel-SyndromRatten.

Die Konzentration von TGF 1 wurde in der Kontrolle (C) und gemessenStoffwechsel-Syndrom(M) Ratten sowie Kontroll- uStoffwechsel-Ratten behandelt mitAM6545(C plus A65) bzw. (M plus A65) oder AM4113 (C plus A41) bzw. (M plus A41) in einer Dosis von 10 mg/kg/Tag. Die Ergebnisse werden als Boxplots und der Mittelwert als (plus)(n=8).*p angezeigt<0.05 relative="" to="" the="" control="" group=""><0.05 relative="" to="" the="">Stoffwechsel-SyndromGruppe durch einfache ANOVA, gefolgt von Tukey's Post-Hoc-Test.

Tabelle 3. Die Wirkungen von AM6545 und AM113 auf die Korrelation zwischen der Albuminausscheidungsrate (AER) und dem Nierenspiegel des transformierenden Wachstumsfaktors Beta 1 (TGF1).

2.7.Wirkung vonAM6545undAM4113Behandlungen bei Nierenfibrose bei MetS(StoffwechselSyndrom) Ratten

Abbildung 6 zeigt die mit Masson's Trichrome gefärbten Nierenschnitte verschiedener Gruppen zur Beurteilung der kollagenen Fasern, die als bläuliche Färbung erschienen. Die Nierenrinde zeigte eine deutliche Zunahme von Kollagenfasern in Nieren, die MetS entnommen wurden (StoffwechselSyndrom) Ratten (Abbildung 6B) im Vergleich zu den Kontrollratten (Abbildung 6A). Im Interstitium und in den Glomeruli gab es einen Überschuss an Kollagenfaserablagerung. Im Gegensatz dazu kam es zu einer verminderten Ablagerung von Kollagenfasern in der Nierenrinde mitAM6545(Abbildung 6C) und AM4113 (Abbildung 6D) Behandlungen. Die Quantifizierung der Masson-Trichrom-Färbung ergab einen höheren Prozentsatz in derStoffwechsel-Syndrom(M) sowie in derStoffwechsel-behandelte Gruppen (M plus A65, M plus A41) im Vergleich zu Kontrollen. Allerdings ist die Behandlung von MetS(StoffwechselSyndrom) Tiere mitAM6545undAM4113verursachte eine signifikante Verringerung der Masson-Färbung relativ zu den nicht behandeltenStoffwechsel-Gruppe.

Abbildung 6. Repräsentative Mikrofotografien der Nierenrinde verschiedener Gruppen, gefärbt mit Masson's Trichrome. Beachten Sie die deutliche Zunahme von Kollagenfasern.

(A) in der Niere vonStoffwechsel-Syndrom(B) um die Glomeruli (G) und Tubuli (PCT, DCT) im Vergleich zur Kontrolle (A). Im Gegensatz,AM6545-behandeltStoffwechsel-Syndrom

(C) und AM4113-behandeltStoffwechsel-Syndrom(D) zeigte eine merkliche Verringerung der kollagenen Fasern. (Massons Trichrom, A, B, C& D×200).

(E) zeigt die Quantifizierung der Masson-Trichrom-Färbung, ausgedrückt in Prozent. Die Ergebnisse werden als Boxplots und der Mittelwert als ( plus )(n=8) angezeigt.*Erheblich unterschiedlich von "C" auf S<0.05,# significantly="" different="" from"m"="" at="" p=""><>

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