3-adrenerger Rezeptor auf Tumor-infiltrierenden Lymphozyten erhält die IFN- -abhängige PD-L1-Expression aufrecht und beeinträchtigt die Antitumor-Immunität bei Neuroblastomen

Das Neuroblastom (NB) ist ein heterogener extrakranieller Tumor, der im Kindesalter auftritt. Ein charakteristisches Merkmal von NB-Tumoren ist ihre neuroendokrine Fähigkeit, Katecholamine abzusondern, die wiederum über die Ligation adrenerger Rezeptoren verschiedene Signalwege in der Tumormikroumgebung (TME) beeinflussen können. Es wurde zuvor gezeigt, dass ein spezifischer Antagonismus des 3-adrenergen Rezeptors (3- AR) auf NB-Tumorzellen das Tumorwachstum und die Tumorprogression beeinflusst. Hier wollten wir in einem murinen syngenen NB-Modell untersuchen, ob die 3-AR-Modulation die Reaktion des Immunsystems des Wirts gegen den Tumor beeinflusst. Die Ergebnisse zeigten, dass der 3-AR-Antagonismus zu einer Reaktivierung der Immunantwort führt, die teilweise von der Beteiligung der PD-1/PD-L1-Signalachse abhängt. Tatsächlich dämpfte die 3- AR-Blockade auf tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs) deren Fähigkeit, IFN- abzusondern, was wiederum die durch die TILs-Infiltration verursachte PD-L1-Expression auf NB-Tumorzellen verringerte. Weitere Untersuchungen durch eine Genomanalyse an NB-Patienten zeigten, dass eine hohe ADRB3-Genexpression im Vergleich zur Gruppe mit niedriger Expression mit schlechteren klinischen Ergebnissen korreliert und dass die ADRB3-Genexpression verschiedene immunbezogene Signalwege beeinflusst. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass 3-AR in NB TME in der Lage ist, die Interaktion zwischen dem Tumor und dem Immunsystem des Wirts zu modulieren und dass sein Antagonismus auf mehrere pro-tumorale Signalwege trifft.

Grafische Zusammenfassung

EINFÜHRUNG

Das Neuroblastom (NB) ist eine komplexe und heterogene Erkrankung und die häufigste Krebsart, die im ersten Lebensjahr diagnostiziert wird. NB ist ein neuroendokriner Tumor, der während der Entwicklung des sympathischen Nervensystems (SNS) aus bestimmten Vorläuferzellen der Neuralleiste entsteht. Dieser charakteristische Ursprung bestimmt die Tumorlokalisation, die normalerweise in der Nebenniere und/oder den sympathischen Ganglien auftritt [1]. Das klinische Verhalten von NB ist sehr unterschiedlich und reicht von Tumoren, die sich spontan zurückbilden, bis hin zu Tumoren, die gegenüber allen verfügbaren Therapien, einschließlich intensiver Chemotherapie, Operation, Strahlentherapie, autologer Stammzelltransplantation und der Verabreichung von Retinoiden (13-cis-Retinsäure), refraktär wurden Säure) [2]. Daher sind alternative therapeutische Ziele für diese nicht reagierenden Tumoren erforderlich. Die Immuntherapie auf Basis von Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs) stellt die vielversprechendste Strategie für mehrere solide Tumoren dar [3]. Unter anderem beeinträchtigt die Signalachse des programmierten Todesliganden-1/programmierter Tod-1 (PD-L1/PD-1) die Immunität der Effektor-T-Zellen und erhöht die Immuntoleranz von Tumorzellen, was eine entscheidende Rolle spielt Rolle bei der Abschwächung der Antitumorreaktionen sowohl bei Krebserkrankungen bei Mäusen als auch bei Menschen [4, 5]. Während zahlreiche Studien bereits die Mechanismen untersucht haben, die der PD-1/PD-L1-Signalübertragung bei erwachsenen Krebserkrankungen zugrunde liegen, ist über pädiatrische Tumoren nur wenig bekannt. Ein komplexes Zusammenspiel zwischen dem SNS und dem Immunsystem über die Katecholaminfreisetzung und die Aktivierung der -adrenergen Rezeptorsignale kann bei vielen Tumoren das Schicksal der Tumorprogression bestimmen [6]. Dies könnte insbesondere bei NB-Patienten zutreffen, bei denen tatsächlich erhöhte Katecholaminspiegel die Schwere der Malignität widerspiegeln [7]. Der Subtyp 3-adrenerger Rezeptor (3-AR) wurde kürzlich als entscheidender Regulator von Krebs identifiziert [8–10]. Insbesondere seine Expression und Aktivierung sowohl auf Tumor- als auch auf Stromazellen der Tumormikroumgebung (TME) löste in verschiedenen präklinischen Modellen protumorale Signalwege aus, die für das Fortschreiten des Tumors verantwortlich sind [11–14]. Hier haben wir in einem syngenen Mausmodell von NB gezeigt, dass 3-AR auf tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) eine IFN- --abhängige PD-L1-Hochregulation auf Tumorzellen aufrechterhält, was wiederum zu einer immunsuppressives TME, das für das Entweichen des Tumors verantwortlich ist. Darüber hinaus konnte der 3-AR-Antagonismus die Anzahl immunreaktiver CD8+, natürlicher Killerzellen (NK) und dendritischer Zellen (DCs) erhöhen und die Anzahl immunsuppressiver regulatorischer Zellen verringern T-Zellen (Treg) und Myeloid-abgeleitete Suppressorzellen (MDSC) bei TME. Darüber hinaus zeigte eine Kaplan-Meier-Analyse, dass eine hohe ADRB3-Genexpression mit einem schlechten Überleben von NB-Patienten verbunden war, und Analysen verschiedener verfügbarer öffentlicher Datensätze der NB-Expression ergaben eine signifikante Korrelation zwischen dem ADRB3-Genexpressionsniveau und Genen, die an damit verbundenen Signalwegen beteiligt sind die Interaktion zwischen Immunsystem und Tumor.

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METHODEN

Zellkultur

Neuro-2A-Maus-NB-Krebszellen wurden von ATCC (CCL-131) erhalten und in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, 100 U·ml−1 Penicillin und 100, gezüchtet ug·ml−1 Streptomycin bei 37 Grad in einer wassergesättigten Atmosphäre mit 5 % CO2. Neuro-2a-Zellen wurden routinemäßig auf Mykoplasmenkontamination getestet.

Tumorsyngenes Mausmodell

Weibliche NCI A/JCr-Mäuse im Alter von 4 Wochen wurden von Charles River Laboratories (Frederick) gekauft. Neuro-2a-Zellen (N2A) wurden subkutan in A/J-Empfängermäuse implantiert, indem 1 × 106 Zellen in 100 μl PBS in die rechte Flanke injiziert wurden. Als die N2A-Zellen einen tastbaren Tumor bildeten (ca. 8 Tage), begannen die Behandlungen. Die Behandlungen wurden zweimal täglich für SR59230A (Tocris Bioscience) und Vehikel (physiologische Lösung) und am 8. und 12. Tag für den PD-L1-Antikörper (InVivoMAb anti-mouse PD-L1 (B7-xhH1) #BE0101 durchgeführt , Bio X Cell) und Isotypkontrolle (InVivoMAb Ratten-IgG2b-Isotypkontrolle # BE0090, Bio X Cell). Die Verabreichung der IgG2b-Isotyp-Kontrolle führte zu den gleichen Ergebnissen bei den Fahrzeugen, daher wird in den Abbildungen nur der Zustand des Fahrzeugs gezeigt. SR59230A wurde mit 10 mg/kg in physiologischer Lösung intraperitoneal (ip) verabreicht; 250 µg PD-L1 wurden ip in 100 µl InVivoPure™ pH 6,5-Verdünnungspuffer (#IP0065) verabreicht; 250 µg IgG2b-Isotyp-Kontrollmaus wurden ip in 100 µl InVivoPure™ pH 7,0-Verdünnungspuffer (#IP0070) verabreicht. Die Behandlung mit FTY720 (#6176, Tocris Biotechne) wurde ab Tag 6 mit 2 mg/kg per os (po) verabreicht. Die Tumorwachstumsrate wurde durch Messung der Tumormasse mit einem Kaliber bewertet und das Tumormassenvolumen wurde als Volumen {{ 41}} [(Länge × Breite)2 /2]. Die Mäuse wurden nach 8-tägiger Behandlung getötet.

Western-Blot-Analyse

Die Zellen wurden gesammelt und in RIPA-Puffer, der einen Protease-Inhibitor-Cocktail enthielt, lysiert. Nach der Quantifizierung wurden 20 µg Gesamtproteine ​​zur Durchführung einer SDS-PAGE- und WB-Analyse verwendet. PVDF-Membranen wurden über Nacht mit den Primärantikörpern Anti-PD-L1 (ab238697, Abcam), Phospho-CREB (ab32096, Abcam), CREB (ab32515, Abcam), p-PKA / / (sc- 32968, Santa) inkubiert Cruz Biotechnology), -actin (sc-1615, Santa Cruz Biotechnology), 3-AR (ab94506, Abcam) bei 4 Grad und dann mit spezifischen sekundären Antikörpern für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Bindung der Antikörper an die spezifischen Proteine ​​wurde mit Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad) nachgewiesen und Bilder wurden mit dem Chemidoc Imaging System (Biorad®) aufgenommen. Zur Durchführung quantitativer Analysen wurde die ImageJ-Software verwendet, und die Signalintensität der Banden wurde als fache Zunahme im Vergleich zu den Kontrollwerten ausgedrückt.

Co-Kultur für den zytofluorimetrischen PD-L1-Assay

Tumorzellen wurden auf MW24 ausgesät (45 000 Zellen/Vertiefung) und nach 24 Stunden mit Lymphozyten kokultiviert, die aus TDLNs von Mäusen erhalten wurden, die 2 Tage lang mit Vehikel oder SR59230A (T2) vorbehandelt worden waren Aussaatverhältnis von 1:10 (Tumor/Lymphozyten). Am Ende der gesamten Inkubationszeit (48 h) wurden durch vorsichtiges Pipettieren Lymphozyten zusammen mit dem Medium der Co-Kultur entnommen und anschließend durch Trypsinierung Tumorzellen abgelöst und mit dem Anti-PD-L1-Antikörper (CD274-Antikörper) markiert. {17}}, eBioscience™) zur zytofluorimetrischen Quantifizierung. Die gefärbten Zellen wurden mit einem MACSQuant Analyzer 10 Durchflusszytometer (Miltenyi Biotec, Gladbach, Deutschland) erfasst und die Daten mit der Flowlogic-Software (Miltenyi Biotec, Gladbach, Deutschland) verarbeitet.

Co-Kultur für PD-L1-Immunfluoreszenz und IFN-Quantifizierung

Tumorzellen wurden auf Objektträgern (20 000 Zellen/Vertiefung) in Nunc Lab-Tek-Kammerobjektträger 4 ausgesät und nach 24 Stunden mit Lymphozyten kokultiviert, die aus TDLNs von Mäusen gewonnen wurden, die 2 Tage lang mit Vehikel behandelt wurden oder SR59230A (T2), in einem Aussaatverhältnis von 1:10 (Tumor/Lymphozyten). Nach 48 Stunden wurden die Lymphozyten im Kulturmedium durch vorsichtiges Pipettieren gesammelt und dann durch Zentrifugieren verworfen; Der Überstand wurde zur Quantifizierung von IFN mithilfe der Luminex xMAP-Technologie gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Kurz gesagt, die IFN-Quantifizierung im Co-Kulturmedium wurde mit dem Bio-Plex Pro Mouse Cytokine IFN-Set (#171G5017M, Bio-Rad) durchgeführt und die Daten wurden auf dem MAGPIX System (Luminex, Texas, USA) erfasst. Die Analyse wurde mit der Bio-Plex Manager™-Software (BIO-RAD, Kalifornien, USA) durchgeführt. Stattdessen wurden Tumorzellen auf Objektträgern verwendet, um den PDL1-Immunfluoreszenztest wie folgt durchzuführen. Zur Immunfluoreszenzanalyse wurden die Zellen 20 Minuten lang in 3% Paraformaldehyd in PBS fixiert. Die Permeabilisierung wurde durch 30-minütige Zugabe einer Lösung mit Tween-20 0,5 % in PBS bei Raumtemperatur erreicht. Die Zellen wurden dann 1 Stunde lang in 3 % BSA blockiert und 2 Stunden lang mit dem Primärantikörper Anti-PD-L1 (ab238697, Abcam) inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger nach dem Waschen in PBS 1 Stunde lang mit Alexafluor 488-Sekundärantikörper inkubiert. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (DMi8 - Leica Microsystems) aufgenommen.

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siRNA-Elektroporation von Lymphozyten zur 1- 2-- und 3-AR-Stummschaltung

Aus TDLNs gewonnene Lymphozyten wurden mit siRNAs für selektive 1- (SASI_Mm01_00090154, Sequenz: GUGAUCGUGGCCAUCGCCA, Merck), 2- (SASI_Mm{ {5}}, Sequenz: CCAAGUUCGAGCGACUACA, Merck) und 3-AR (SASI_Mm01_00145466, Sequenz: CAGUGGACGUGCUCUGUGU, Merck) Stummschaltung. Kurz gesagt, Lymphozyten wurden mit siRNAs (100 nM) unter Verwendung der 4D-Nucleofector X Unit (Lonza) und des P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X Kit (V4XP-3024, Lonza) elektroporiert. Das DN-100-Programm, das speziell für die Elektroporation muriner T-Zellen ist, wurde durchgeführt. Nach der Elektroporation wurden Lymphozyten 24 Stunden lang in TexMACS-Medium (130-097-196, Miltenyi Biotec) kultiviert und dann wie zuvor beschrieben 48 Stunden lang mit N2A-Tumorzellen zur PD-L1-Quantifizierung kokultiviert. -Die Effizienz der AR-Stummschaltung in Lymphozyten wurde durch digitale Tröpfchen-PCR wie folgt bewertet.

Digitale Tröpfchen-PCR zur -ARs-mRNA-Quantifizierung

Die RNA wurde mit dem iScript Advanced cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) revers transkribiert. ddPCR wurde unter Verwendung von ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) (Bio-Rad) gemäß den Herstelleranweisungen auf einem QX200-System (Bio-Rad) und einem C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad) durchgeführt. Die verwendeten Assays waren: Adrb3-FAM (dMmuCPE5088688), Adrb2-FAM (dMmuCPE5089938), Adrb1-FAM (dMmuCPE5100184), Rps18-HEX (dMmuCPE5196447). ddPCR-Daten wurden mit der QuantaSoft™-Software (Version 1.7.4, Bio-Rad) analysiert.

RNA-Sequenzierung

Herausgeschnittene Tumore wurden in Puffer RLT (Qiagen) gegeben und mit gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec, Gladbach, Deutschland) unter Verwendung von gentleMACS M Tubes (Miltenyi Biotec, Gladbach, Deutschland) mechanisch homogenisiert. Die vollständige RNA-Extraktion wurde mit dem RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die RNA-Quantifizierung wurde sowohl mit NanoDrop 2000/2000c-Spektrophotometern (ThermoFisher) als auch mit Qubit RNA High Sensitivity (HS) (ThermoFisher) durchgeführt. Die RNA-Integrität wurde mit dem Agilent RNA 6000 Pico Kit auf einem Agilent Bioanalyzer bewertet und alle Proben mit einer RNA-Integritätszahl (RIN) von weniger als 6,00 wurden ausgeschlossen. Die Bibliotheksvorbereitung wurde mit dem TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Gold Kit (Illumina) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, mit einer anfänglichen Eingabe von 500 ng Gesamt-RNA. Die Qualität der Bibliothek wurde mit einem Agilent DNA 7500-Kit auf einem Agilent Bioanalyzer bewertet, gefolgt von der Quantifizierung der Bibliothek mit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) (ThermoFisher). Die Bibliotheken wurden auf einem NextSeq 550-Sequenzierungssystem (Illumina) unter Verwendung von NextSeq 500/550 v2.5 (150 Zyklen) High Output Reagent Kits (Illumina) sequenziert. Die Läufe wurden mit einer 2 × 76-bp-Konfiguration durchgeführt.

mRNA-Quantifizierung und Transkriptomanalysen

Zur Quantifizierung der Transkripte und des Referenztranskriptoms GRCm38.98 des Mus musculus wurde Salmon (Version 1.5.1) im kartierungsbasierten Modus verwendet. Die resultierenden qf-Dateien wurden mit der Statistiksprache R analysiert. Das Paket tximport wurde zum Importieren der Daten in R verwendet, und die Transkripte wurden mit dem Paket AnnotationDbi und der Datenbank org.Mm.eg.db auf Gene reduziert. Abschließend führten wir die statistischen Analysen mit DESeq2 durch. Wir haben eine Überanreicherungsanalyse (ORA) durchgeführt, indem wir mit dem ClusterProfiler-Paket die GO:BP-Datenbank abgefragt haben, mit den daraus resultierenden statistischen Analysen, um veränderte Zellwege zu erkennen. Um die Gene für die Anreicherungsanalyse auszuwählen, setzen wir den log2FC-Schwellenwert auf 0,5 (| log2FC|⋝ 0,5) und den angepassten p-Wert auf 0.{ {17}}5. Nachdem wir die Ergebnisse mit einem p-Wert von 0,05 gefiltert hatten, fanden wir 45 statistisch deregulierte Prozesse unter den 15158 getesteten Prozessen anhand der GO:BP-Datenbank.

Quantifizierung der Luminex-Zytokine

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Die Mäuse wurden nach zweitägiger Behandlung (T2) mit Vehikel, SR59230A, PD-L1 und SR59230A + PD-L1 getötet, und die Tumormasse wurde mit einer Schere herausgeschnitten und unter Verwendung des Bio-Plex Cell Lyse-Kits (BIO-RAD, Kalifornien) homogenisiert , USA) und der gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec, Deutschland). Tumorlysate wurden dann mit Bio-Plex Pro™-Assays (BIO-RAD, Kalifornien, USA) basierend auf der Luminex xMAP-Technologie auf ihre Zytokinkonzentrationen getestet. IFN-, TNF-, IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IL-1 und IL-1-Spiegel (pg/ml ) wurden gemäß den Herstellerangaben gemessen. Die Daten wurden mit dem MAGPIX-System (Luminex, Texas, USA) erfasst und die Analyse mit der Bio-Plex Manager™-Software (BIO-RAD, Kalifornien, USA) durchgeführt.

Durchflusszytometrische Analyse

Die Durchflusszytometrieanalyse wurde wie folgt an Tumorzellen und Immunzellsubpopulationen der Tumormikroumgebung durchgeführt. Kurz gesagt, Tumore wurden mit der Tumordissoziationskit-Maus (#130-096-730, Miltenyi Biotec) homogenisiert und tumorinfiltrierende Lymphozyten wurden aus der gesamten Zellsuspension unter Verwendung der CD45 (TIL) MicroBeads-Maus (#130-110- 618, Miltenyi Biotec) oder CD8 (TIL) MicroBeads Maus (#130-116-478, Miltenyi Biotec) durch den automatischen Pro Separator (Miltenyi Biotec) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Anschließend wurden die Zellen inkubiert und mit verschiedenen entsprechend verdünnten Kombinationen verschiedener Fluorochrom-konjugierter Antikörper gefärbt (Ergänzungstabelle 1). Die gefärbten Zellen wurden mit einem MACSQuant Analyzer 10 Durchflusszytometer (Miltenyi Biotec®) analysiert und die Daten wurden mit der Flowlogic-Software (Miltenyi Biotec®) verarbeitet.

Immunfluoreszenz von Zellen und Geweben

Die Immunfluoreszenzanalyse der murinen Tumormasse wurde wie folgt durchgeführt. Die Proben wurden schnell herausgeschnitten, 24 Stunden lang in gepuffertem 4 % Formaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. Aus den Proben wurden histologische Schnitte mit einer Dicke von 5 μm geschnitten, entparaffiniert und 1 {7} Minute lang in Natriumcitratpuffer (10 mM, pH 6,0; Bio-Optica) zur Antigengewinnung gekocht und über Nacht bei 4 Grad mit primärem immungefärbt Antikörper (Anti-PD-L1, ab238697, Abcam; Anti-- 3-AR, ab94506, Abcam; Anti-CD4, 14-9766-82, eBioscience; Anti-CD8, 14-0808-82, eBioscience; DBH, ab209487, Abcam). Eine Immunreaktion wurde festgestellt, indem Schnitte mit Sekundärantikörpern, Alexa Fluor 488--konjugiertem IgG oder Alexa Fluor 594--konjugiertem IgG (1:350; Jackson Laboratory), inkubiert wurden. Nach der Gegenfärbung mit 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) wurden repräsentative Bilder mit einem Olympus BX63-Mikroskop aufgenommen, das mit der CellSens Dimension Imaging Software Version 1.6 (Olympus) gekoppelt war. Die Immunfluoreszenzfärbung wurde mit der ImageJ-Software (NIH, USA) ausgewertet, da die Fluoreszenzintensität des interessierenden Proteins auf DAPI-Werte normalisiert wurde.

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Kaplan-Meier- und Genkorrelationsanalyse bei Patienten mit NB

Korrelation des ADRB3-Gens mit den Immun-Checkpoint-Genen von CD80, CTLA4, CD276, CD226, CD40LG, 4-1BBL und Korrelation zwischen der Gesamtwahrscheinlichkeit (OS) und der Wahrscheinlichkeit des ereignisfreien Überlebens (EFS) von Patienten mit NB und den ARDB3-Spiegeln Die mRNA-Expression wurde anhand des Genexpressionsprofils von 649 NB-Proben durchgeführt, die mithilfe von 44-K-Oligonukleotid-Mikroarrays erstellt wurden. Profile und klinische Daten wurden von der Plattform R2: Genomanalyse und Visualisierung (http://r2.amc.nl) abgerufen (Kocak, benutzerdefinierte ag44kcwolf, n=649 Fälle). Das letzte Quartil der Verteilung wurde in der Kaplan-Meier-Analyse als Expressionsgrenzwert für eine hohe gegenüber einer niedrigen ADRB3-Genexpression verwendet.

Statistiken

Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism (GraphPad, San Diego, CA, USA) durch ein- oder zweiseitige Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, gefolgt vom Bonferroni-Post-hoc-Test oder dem ungepaarten Studenten-T-Test. Für die In-vivo-Experimente waren nach früheren Studien am gleichen Tiermodell [12] mindestens 6 Mäuse pro Gruppe erforderlich, um eine Leistung von 80 % zu gewährleisten. Die Werte werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Bedeutung wurde berücksichtigt, als P war<0.05 and described in each figure legend. Allocation concealment was performed using a randomization procedure (http:// www.randomizer.org/).

ERGEBNISSE

3-AR-Antagonismus reduziert die PD-L1-Expression in Tumorzellen von NB-tragenden A/J-Mäusen

Aktuelle Studien zeigten, dass die PD-1/PD-L1-Signalübertragung in NB einen entscheidenden Mechanismus zur Einschränkung der Immunüberwachung darstellt und dass die PD-L1-Expression mit hohen Konzentrationen an Tumormarkern korreliert [15, 16]. Unter Berücksichtigung dieser und unserer früheren Daten, die die Fähigkeit der 3-AR-Blockade zeigen, bei Melanom-tragenden Mäusen eine immunkompetente TME auszulösen [13], fragten wir uns, ob bei NB-Tumoren die 3-AR Der Antagonismus könnte zu einer Aktivierung der Immunantwort führen, abhängig von der Beteiligung der PD-L1-Signalübertragung. Die Verabreichung des 3-AR-Antagonisten SR59230A in einem syngenen Mausmodell von NB reduzierte das Tumorwachstum stärker als eine Behandlung mit Anti-PD-L1-Antikörper-mAb (PD-L1), es wurde jedoch kein synergistischer Effekt beobachtet als Mäuse mit beiden Medikamenten behandelt wurden (Abb. 1A, B). Um zu untersuchen, ob die durch die Verabreichung von SR59230A hervorgerufene antitumorale Wirkung teilweise auf der Modulation der PD-L1-Expression beruht, haben wir das PD-L1-Expressionsniveau in TME von NB-tragenden Mäusen untersucht. Interessanterweise zeigten Immunfluoreszenz (Abb. 1C) und Western-Blot-Analyse (Abb. 1D) der murinen Tumormasse, dass die PD-L1-Expression bei TME von Mäusen, die mit dem 3-AR-Antagonisten behandelt wurden, im Vergleich zum Vehikelzustand verringert war. Da umfangreiche Literaturdaten zeigten, dass bei TME neben Krebszellen auch Stromazellen wie die Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) MDSC, DCs und Makrophagen die Hauptquellen für PD-L1 sind [17–20], führen wir weiter aus untersuchten, wo im TME das PD-L1-Expressionsniveau nach einer 3-AR-Blockade beeinträchtigt wurde. Der zytofluorometrische Test ergab, dass der 3-AR-Antagonismus die PD-L1-Expression in Tumorzellen verringerte (Abb. 1E), während er gleichzeitig das Expressionsniveau in DCs und Makrophagen erhöhte (Abb. 1F, G). In der MDSC-Population wurden keine Veränderungen beobachtet (Abb. 1H). Diese ersten Ergebnisse zeigen, dass die 3-AR-Blockade in einem syngenen Modell von NB-tragenden Mäusen eine signifikante antitumorale Aktivität ausübte und dass die gleichzeitige Verabreichung von PDL1-Antikörpern keine antitumorale synergistische Wirkung hervorrief. Interessanterweise modulierte der pharmakologische Antagonismus von 3-AR das PDL1-Expressionsniveau bei TME, was auf eine Beteiligung der PD-L1-Signalübertragung an der durch die 3-AR-Blockade hervorgerufenen antitumoralen Wirkung schließen lässt.

Abb. 1 Wirkung von SR59230A- und PD-L1-Behandlungen auf das Tumorwachstum und die PD-L1-Expression bei NB-tumortragenden Mäusen

3-AR-Antagonismus und die Verabreichung von PD-L1 stimulieren ein immunreaktives TME in NB

Um zu untersuchen, ob die verringerte PD-L1-Expression, die in NB-Tumorzellen nach 3-AR-Antagonismus beobachtet wurde, zu einer Immunreaktivierung bei TME führte, haben wir zunächst die Anzahl der Perforine durch PD-1+CD{ ausgewertet. {4}}-Zellen in der Tumormasse von SR59230A-, PD-L1-- oder SR59203A + PD-L1--behandelten Mäusen im Vergleich zum Vehikel (Abb. 4A, B). Darüber hinaus zeigte ein Ki67-Färbungstest einen Trend, der auf eine erhöhte Proliferation von CD8+-T-Zellen in NB-Tumoren von Mäusen hindeutet, die mit dem 3-AR-Antagonisten oder PD-L1-Antikörper behandelt wurden, auch wenn dieser keine signifikante Steigerung erreichte Unterschiede (Abb. 4C). Schließlich zeigte die Zytokinmessung in der Tumormasse von PDL1--behandelten Mäusen einen erhöhten Spiegel an Zytokinen, von denen bekannt ist, dass sie antitumorale Wirkungen wie TNF-, IFN- und IL-6 ausüben, und eine damit einhergehende Abnahme des immunsuppressiven Zytokins IL-10. Überraschenderweise beobachteten wir bei NB-tragenden Mäusen, die mit dem 3-AR-Antagonisten behandelt wurden, einen Anstieg der TNF- und IL-6-Spiegel und eine Abnahme der IL-10-Spiegel, entsprechend der Immunantwort. Reaktiver Status, der durch T-Zellen-Merkmale nahegelegt wird, aber ein verringerter IFN-Spiegel (Abb. 4D). Bei anderen untersuchten Zytokinen (GMCSF, IL-2, IL-1 und IL-1 wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass der 3-AR-Antagonismus die Immunantwort des Wirts im TME von NB-tragenden Mäusen auslöst, was die gleichen Effekte nachzeichnet, die nach der Verabreichung von PD-L1-Antikörpern beobachtet wurden. Insbesondere die zytotoxischen Funktionen von CD8+ wurden sowohl durch SR59230A als auch durch PD-L1 gestärkt. Bei gleichzeitiger Verabreichung des 3-AR-Antagonisten mit dem PD-L1-Antikörper wurden keine synergistischen Effekte beobachtet, was bestätigt, dass die durch die 3-AR-Blockade hervorgerufene Immunreaktivierung zumindest teilweise auf der PD-L1-Signalübertragung beruht Beteiligung des Signalwegs.

Abb. 2 SR59230A und PD-L1 stimulieren ein immunreaktives TME in NB

Abb. 3 Expression von Immun-Checkpoints auf Lymphozyten in TME und TDLNs nach 3-AR-Antagonismus und Verabreichung von PD-L1

Abb. 4 3-AR-Blockade löst CD8-Funktionen aus und reguliert die Sekretion von Immunzytokinen bei TME.

3-AR auf Tumor-infiltrierenden Lymphozyten moduliert die IFN-Sekretion und beeinflusst die PD-L1-Expression auf NB-Tumorzellen

Die Expression von PD-L1 auf Tumorzellen kann durch mehrere Faktoren hervorgerufen werden, aber unter anderem stellen TNF- und IFN- die wichtigsten Zytokine dar, die in der Lage sind, die PD-L1-Spiegel in verschiedenen Tumoren zu erhöhen [23]. Um die Signalübertragung, die dem 3-AR/PD-L1-Übersprechen in unserem NB-Tumormodell zugrunde liegt, weiter aufzuklären, haben wir zunächst in vitro die Expression von PD-L1 auf N2A-Tumorzellen nach TNF- und IFN-Behandlung untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die PD-L1-Expression in NB-Zellen, die 48 Stunden lang mit IFN-, jedoch nicht mit TNF- behandelt wurden, hochreguliert war. Darüber hinaus konnte die Vorbehandlung von N2A-Tumorzellen mit dem 3-AR-Antagonisten SR59230A die durch die IFN-Behandlung erhöhte PDL1-Expression nicht aufheben (Abb. 5A). In Anbetracht der Tatsache, dass Literaturdaten TILs als die wichtigste zelluläre Quelle von IFN- während der adaptiven Immunantwort erkennen [24] und dass unsere Ergebnisse zeigten, dass die 3-AR-Modulation auf N2A-Tumorzellen keinen Einfluss auf die IFN- -abhängige Parkinson-Krankheit hatte -L1-Expression haben wir uns gefragt, ob eine 3-AR-Modulation auf TILs für eine veränderte IFN-Sekretion verantwortlich ist, die wiederum die PD-L1-Expression auf Tumorzellen beeinflusst. Um unsere Hypothese zu beweisen, wurden Lymphozyten, die aus TDLNs von NB-tragenden Mäusen gewonnen wurden, die mit Vehikel oder SR59230A behandelt wurden, isoliert und in vitro mit Tumorzellen kokultiviert. Immunfluoreszenz- und Durchflusszytometrieanalyse bestätigten, dass Lymphozyten, die von NB-tragenden Mäusen gesammelt wurden, die mit dem 3- AR-Antagonisten behandelt wurden, ihre Fähigkeit, die PD-L1-Expression auf N2A-Zellen auszulösen, im Vergleich zu unbehandelten Lymphozyten verringerten (Abb. 5B, D). Darüber hinaus bestätigte die Messung des IFN-Spiegels in Co-Kulturmedien, dass Lymphozyten, die von mit SR50230A behandelten Mäusen gesammelt wurden, teilweise ihre Fähigkeit zur Sekretion von IFN- verloren, wenn sie zusammen mit NB-Tumorzellen kultiviert wurden (Abb. 5C). Es wurde bereits gezeigt, dass 3-AR in mehreren Geweben an Gs-Protein gekoppelt sein kann und seine Aktivierung zur Aktivierung des cAMP/PKA-Signalwegs führt [25]. Gleichzeitig bewiesen Studien die entscheidende Rolle der zyklischen AMP-responsiven Elementbindung (CREB) als positiver Transkriptionsregulator von IFN- in T-Zellen [25–27]. Ausgehend von diesen Beobachtungen haben wir untersucht, ob der cAMP/PKA/CREB-Signalweg an der 3-AR-abhängigen IFN-Sekretion in TILs beteiligt ist. Die Ergebnisse zeigten, dass der 3-AR-Antagonismus von CD8+-TILs die Phosphorylierung von PKA/PKA-Untereinheiten und von CREB verringerte, was zu einer Verringerung der IFN-Expression in CD8+-TILs führte (ergänzende Abbildung 1A). , B). Diese Ergebnisse bestätigten, dass 3-AR in der Lage ist, die IFN-Transkription in TILs von NB aufrechtzuerhalten, indem es den cAMP/PKA/CREB-Signalweg auslöst. Andererseits war das immunsuppressive Zytokin IL-10 im Treg von mit SR59230A behandelten Mäusen im Vergleich zum Vehikel verringert (ergänzende Abbildung 1C), was die Immunreaktivität des NB TME nach der Behandlung mit 3-AR-Antagonisten bestätigt von NB-tragenden Mäusen. Um die selektive Wirkung des SR59230A-Antagonismus auf den 3-AR-Subtyp zu bestätigen, führten wir einen Co-Kulturtest mit Lymphozyten durch, die mit siRNAs für 1-, 2- und 3-AR zum Schweigen gebracht wurden Untertypen. Die Ergebnisse zeigten, dass Lymphozyten, die unter den -AR-Subtypen für 3-AR stummgeschaltet wurden, im Vergleich zur Kontrollbedingung teilweise ihre Fähigkeit verloren, die PD-L1-Expression auf N2A-Tumorzellen zu induzieren (Abb. 5E und ergänzende Abb. 1D). Darüber hinaus wurde die Proteinexpression von 3-AR auf murinen Lymphozyten von NB-tragenden Mäusen durch Western-Blot-Analyse von aus TDLNs erhaltenen Lymphozyten (ergänzende Abbildung 2A) und Immunfluoreszenz von CD4+ und CD{{ bestätigt. 90}} T-Zellen wurden auf Tumormasseschnitten auf 3-AR gefärbt (ergänzende Abbildung 2B). Wir haben zuvor gezeigt, dass der spezifische Antagonismus von 3- AR auf N2A-Tumorzellen durch SR59230A das NB-Wachstum und die Tumorprogression hemmt, indem es von Stammzellen- zu Differenzierungsmerkmalen von Tumorzellen wechselt [12]. Hier deuteten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die antitumorale Wirkung der Verabreichung des 3-AR-Antagonisten auch auf der 3-AR-Signalmodulation auf TILs beruhte, was wiederum zu einer Wiederbelebung der Immunantworten gegen Tumore führte. Um unsere These in vivo zu untermauern, verabreichten wir daher FTY720, um T-Zellen in TDLNs zurückzuhalten und ihre Infiltration in die Tumormasse zu reduzieren. FTY720 ist ein Analogon von Sphingosin-1-phosphat (S1P), und seine Verabreichung induziert die Internalisierung und den Abbau des S1P-Rezeptors und verhindert so, dass Lymphozyten aus den Lymphknoten austreten [28]. Wie angenommen, verringerte die Vorbehandlung mit FTY720 die antitumorale Wirkung, die durch die Verabreichung des 3-AR-Antagonisten hervorgerufen wurde (Abb. 5F–H). Um die Wirksamkeit von FTY720 bei der Hemmung von T-Zellen in TDLNs zu validieren, haben wir die T-Zellzahl in TDLNs nach acht Tagen (T8) der Behandlung gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl CD4+- als auch CD{114}}-Zellen in TDLNs von mit FTY720 vorbehandelten Mäusen im Vergleich zu unbehandelten Mäusen (Vehikel) erhöht waren (ergänzende Abbildung 2C). Nach unseren und anderen früheren Ergebnissen, die zeigen, dass die S1P-Signalübertragung für das Überleben von NB-Tumorzellen von entscheidender Bedeutung ist [12, 29], konnte die Behandlung mit FTY720 allein auch das Tumorwachstum signifikant verringern (Abb. 5F–H). Die RNA-Sequenzierungsanalyse von NB-Tumormassen, die aus Vehikel- und SR59230A-behandelten Mäusen isoliert wurden, identifizierte 5607 Gene, von denen 267 differentiell exprimierte Gene (DEGs) waren, 127 in SR59230A-behandelten Tumoren hochreguliert und 140 herunterreguliert waren (Abb. 6A). Insbesondere gehörten mehrere Gene, die statistisch unterschiedlich exprimiert wurden, zu immunbezogenen Signalwegen gemäß der GO: BP-Datenbank (Abb. 6B). Darüber hinaus bestätigte die Herunterregulierung der PD-L1-mRNA (CD274-Gen) in SR59230A-behandelten Tumoren im Vergleich zum Vehikelzustand und die Hochregulierung verschiedener anderer Gene, die an immunbezogenen Prozessen beteiligt sind (Abb. 6C), die Korrelation zwischen 3-AR und der auf Proteinebene beobachtete Immun-Checkpoint PD-L1. Schließlich bestätigte die differenzielle Genexpressionsanalyse an einem öffentlichen Datensatz (GSE14880 aus dem GEO-Archiv), der aus 34 von NBs betroffenen Patienten bestand, dass NB-Tumormassen mit einer geringen Expression von ADRB3 eine positive Regulierung der Immunantworten, der T-Zell-Aktivierung und des Immuneffektors zeigten Signalwege im Vergleich zur Tumormasse mit hohen ADRB3-Spiegeln (Abb. 6D). Zu beachten ist, dass Katecholamine bei verschiedenen Krebsarten über krebsassoziierte Neuronen freigesetzt werden oder einfach über den Blutkreislauf in den Tumor gelangen. Bei NB kommt es jedoch zu übermäßigen Mengen an Katecholaminen und ihren Metaboliten (HVA, VMA, Dopamin), einem einzigartigen Merkmal dieser bösartigen Erkrankung aus einer anderen Quelle. Tatsächlich sind diese Tumoren aufgrund der besonderen Herkunft der NB-Zellen (aus defekten sympathischen neuronalen Differenzierungszellen der Neuronenleiste) normalerweise in der Lage, selbst Katecholamine abzusondern. In unserem NB-Mausmodell zeigte die Immunfluoreszenz an Tumormassen tatsächlich, dass NB-Tumorzellen positiv für die Dopamin-Hydroxylase (DBH) waren (ergänzende Abbildung 3A), ein Enzym, das für die Noradrenalinsynthese verantwortlich ist, unabhängig von 3- AR-Expression auf den Tumor oder seinen Antagonismus. Zusammengenommen verdeutlichen diese Daten die entscheidende Rolle, die die -adrenerge Signalübertragung bei der Regulierung verschiedener biologischer Prozesse spielt, die an der Interaktion zwischen dem Immunsystem des Wirts und der Tumormikroumgebung in NB-Tumoren beteiligt sind. Die nach der Verabreichung des 3-AR-Antagonisten in unserem syngenen Mäusemodell beobachteten Antitumorwirkungen beruhen zumindest teilweise auf der Modulation des 3-AR, das auf Lymphozyten exprimiert wird, die die Tumormasse infiltrieren. Insbesondere haben wir gezeigt, dass die selektive Blockade von 3-AR auf TILs die IFN-Sekretion reduziert, was wiederum die PD-L1-Expression auf NB-Tumorzellen verringert und ein immunreaktives TME fördert.

Abb. 5 3-AR auf TILs erhält die IFN- -abhängige PD-L1-Expression in NB-Tumorzellen aufrecht. A

Die ADRB3-Genexpression korreliert mit einer schlechten Prognose bei NB-Patienten

Einige Studien deuten darauf hin, dass {{0}}AR-mRNA und/oder -Protein überexprimiert werden und in einigen Fällen mit neoplastischer Proliferation und Transformation bei verschiedenen menschlichen Krebsarten korrelieren [10, 30–32]. Dementsprechend zeigten unsere präklinischen Ergebnisse, die in einem syngenen Mausmodell von NB erzielt wurden, dass die 3-AR-Signalisierung verschiedene protumorale Prozesse aufrechterhalten kann, die das Tumorwachstum begünstigen. Um zu testen, ob die ADRB3-Genexpression mit dem Überleben von NB-Patienten korreliert, haben wir daher eine Kaplan-Meier-Analyse über die R2: Genomics Analysis and Visualization Platform (http://r2.amc.nl) durchgeführt und dabei die Kocak-Datenbank verwendet, die Folgendes umfasst: Vollständige Informationen über klinische Daten von 649 NB-Patienten. Die Ergebnisse zeigten, dass die ADRB3-Genexpression bei Patienten mit NB mit schlechten Ergebnissen verbunden war. Eine hohe Expression des ADRB3-Gens war tatsächlich signifikant mit einer verringerten ereignisfreien (p=3.2e−05) (Abb. 7A) und Gesamtüberlebenszeit (p=8.4e−0,5) verbunden ( Abb. 7B) von NB-Patienten. Darüber hinaus zeigte eine Genkorrelationsanalyse in einigen Kohorten eine positive Korrelation zwischen ADRB3 und Genen für inhibitorische Immun-Checkpoints wie CD80, CTLA4 und CD276 und eine negative Korrelation mit Genen für Immun-Checkpoints, die das Immunsystem aktivieren, wie CD266. CD40-Ligand (CD40LG) und 4-1BB-Ligand (4-1BBL) (Abb. 7C). Insgesamt unterstreichen die erhaltenen Daten die negative Korrelation der ADRB3-Genexpression mit dem Ergebnis von NB-Patienten und bestätigen und stärken die Rolle des 3-AR als molekularer Akteur, der in der Lage ist, Antitumor-Immunreaktionen durch Beeinflussung mehrerer Immun-Checkpoints zu dämpfen Signalwege.

DISKUSSION

Aufgrund seines besonderen neurogenen Ursprungs charakterisieren hohe Konzentrationen an Katecholamin-Metaboliten den Zustand des NB-Tumors [7, 33]. In früheren Arbeiten haben wir spekuliert, dass die Katecholaminfreisetzung bei TME durch die Aktivierung von -ARs auf Krebszellen abzielen und eine Feedforward-Schleife von Wachstum und Malignität bei NB-Krebs auslösen könnte. Tatsächlich zeigten experimentelle Daten, dass 3-AR auf verschiedenen NB-Tumorzelllinien und Biopsien von Patienten exprimiert wird und dass seine Modulation das Tumorwachstum in einem syngenen Mausmodell von NB signifikant beeinflusst [12]. Zusätzlich zur Expression von -ARs auf Tumorzellen ist allgemein bekannt, dass -ARs auf der Oberfläche der meisten Zellen bei TME, einschließlich Immunzellen, lokalisiert sind und dass die Ligation von Katecholaminen an -ARs in Immunzellen sowohl die angeborene als auch die adaptive Immunität reguliert [34]. Zu beachten ist, dass unter physiologischen Bedingungen die Modulation des Immunsystems durch -adrenerge Signale eine normale Immunantwort fördert, bei veränderten Prozessen die SNS/Katecholamine/-ARs-verlängerte Stimulation jedoch schädliche Auswirkungen auf verschiedene Immunzellen, einschließlich Lymphozyten, haben kann [35, 36]. ]. Unter diesen veränderten Bedingungen fördert eine anhaltende Stimulation der adrenergen Signalübertragung pathologische Prozesse und unter anderem das Fortschreiten von Krebs [37]. Ausgehend von den oben genannten Beobachtungen soll in unserer Studie untersucht werden, ob die durch den 3-AR-Antagonismus bei NB-Tumoren hervorgerufenen antitumoralen Wirkungen teilweise auf der Wiederbelebung der Antitumorimmunität beruhen könnten und ob dies eine Rolle spielen könnte die Modulation der Signalwege von Immun-Checkpoints. Präklinische Studien legen nahe, dass die PD-L1-Expression in metastasiertem NB einen entscheidenden Mechanismus zur Einschränkung der Immunüberwachung darstellt [15] und dass eine kombinierte Immuntherapie mit Anti-PD-L1/PD-1- und Anti-CD4-Antikörpern syngen disseminiertes NB heilt [ 38]. Kürzlich wurde die PD-L1-Expression in mehreren pädiatrischen Tumoren untersucht, und vor allem war die PD-L1-Färbung mit einer geringeren Überlebensrate bei Patienten mit NB verbunden [16, 39]. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass PD-L1-positive Tumoren häufiger in der Nebenniere lokalisiert waren als PD-L1-negative Tumore und dass dies auch bei Katecholaminmetaboliten (NSE, VMA und HVA) der Fall war höher in der PD-L1-positiven Gruppe als in der PD-L1-negativen Gruppe [16].

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

Diese Beweise deuten darauf hin, dass die PD-1/PD-L1-Signalachse in der Lage ist, die Immunflucht des Tumors bei primären und metastasierten NB zu kontrollieren. Sie untersuchten jedoch nicht die genauen Mechanismen, die der PD-1/PD-L1-Signalachse zugrunde liegen. L1-Signalisierungsregulierung. Um zu untersuchen, ob die 3-AR-Modulation die PD-L1-Expression im NB und die daraus resultierende Immunreaktivität im TME beeinflussen könnte, behandelten wir A/J-Mäuse, die mit den syngenen N2A-NB-Zellen geimpft wurden, mit dem 3- AR-Antagonist SR59230A, ein monoklonaler PD-L1-Antikörper ( PD-L1) oder eine Kombination daraus. Zunächst beobachteten wir, dass der 3-AR-Antagonismus das NB-Tumorwachstum reduzieren und gleichzeitig die PD-L1-Expression im TME von NB-tragenden Mäusen verringern konnte. Die Durchflusszytometrie ergab, dass die verringerte Menge an PD-L1, die in der Tumormasse von SR59230A-behandelten Mäusen beobachtet wurde, hauptsächlich die verringerte Expression von Tumorzellen widerspiegelte. Im krassen Gegensatz dazu war die PD-L1-Expression auf DCs und Makrophagen hochreguliert. Mehrere wissenschaftliche Belege weisen darauf hin, dass PD-L1 sowohl auf Tumorzellen als auch auf APCs die Fähigkeit besitzt, die T-Zell-Aktivierung zu dämpfen und so teilweise eine wirksame Immunreaktion gegen den Tumor zu behindern [40]. Jüngste Studien haben jedoch gezeigt, dass DCs und Makrophagen während der Antigenaufnahme und Kreuzpräsentation von Tumorantigenen auf T-Zellen, einem entscheidenden Schritt in der adaptiven Immunität, PD-L1 hochregulieren und so eine übermäßige Aktivierung von T-Zellen begrenzen und sie vor zytotoxischen Aktivitäten schützen T-Zellen [41, 42]. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die verringerte Expression von PD-L1 auf Tumorzellen und der damit einhergehende Anstieg von APCs in der mit SR59230A behandelten Tumormasse wahrscheinlich eine Wiederbelebung des Immunsystems bei TME widerspiegeln. Die Ergebnisse bestätigten eine erhöhte Anzahl tumorinfiltrierender immunreaktiver Zellen (NK, DCs und CD8+) und eine Verringerung tumorinfiltrierender immunsuppressiver Zellen (Treg und MDSC). Die Expressionsanalyse des Immun-Checkpoints PD-1 auf TILs zeigte eine signifikant erhöhte Anzahl von PD-1+CD4+- und PD- 1+CD8+-T-Zellen in TDLNs ein frühes Stadium der Tumorentwicklung (T2) und von PD-1+CD8+ im Tumor nach den 8 Tagen (T8) von SR59230A, PD-L1 oder ihrer Kombinationsbehandlung im Vergleich zur Kontrolle. Ein zunehmender Trend wurde auch bei der Anzahl der auf TIM3 oder LAG3 gefärbten CD4+-T-Zellen in Tumoren von SR59230A, PD-L1-Behandlungen und deren Kombination festgestellt, diese erreichten jedoch keine statistische Signifikanz. Bei CD8+-T-Zellen, die auf TIM3 oder LAG3 gefärbt waren, beobachteten wir stattdessen eine große Variabilität. Während einige Literaturdaten darauf hindeuten, dass PD-1-, LAG-3- und TIM-3-exprimierende T-Zellen erschöpft und dysfunktional sind [43–45], zeigten andere, dass diese Immun-Checkpoints, insbesondere PD -1 werden nach Aktivierung und Effektor-T-Zelldifferenzierung ebenfalls hochreguliert [46–48], und daher spiegelt die Expression per se keinen erschöpften Status wider, sondern diese Marker identifizieren das autologe tumorreaktive Repertoire, das verschiedene Tumoren infiltriert [46– 49]. In Übereinstimmung damit bestätigten tiefergehende Untersuchungen in unserem Tumormodell, dass der 3-AR-Antagonismus, wie die Behandlung mit dem Anti-PD-L1-mAb, zytotoxische Funktionen von CD8+ auslöste, wie durch die erhöhte Anzahl von PD gezeigt Auf Perforin oder Granzym B gefärbte 1+CD8+-Zellen, was bestätigt, dass in der Tumormasse gefundene PD1+-TILs funktionell aktiv sind. Es wurde gezeigt, dass eine hohe Infiltration von zytotoxischen CD8+-T-Zellen im Tumor mit einer positiven Prognose bei Patienten mit mehreren bösartigen Erkrankungen korreliert, darunter Melanom, Kopf-Hals-, Brust-, Darm-, Eierstock-, Prostata- und andere Krebsarten [50]. In NB zeigte eine aktuelle Studie, dass Tumore, die mit tumorinfiltrierenden T-Zellen angereichert sind, unabhängig von anderen aktuellen Indikatoren für das Tumorstadium ein besseres klinisches Ergebnis erzielten [51]. Darüber hinaus zeigten neuere Erkenntnisse, dass das Vorhandensein von DC- und NK-Zellen in der Tumormasse positiv sowohl mit der T-Zell-Infiltration als auch dem positiven klinischen Ergebnis von NB-Patienten korreliert [52]. Alle diese klinischen Beweise stimmen mit unseren präklinischen Ergebnissen überein, bei denen ein mit NK-, DC- und CD{89}}-T-Zellen angereichertes TME, das nach dem 3--AR-Antagonismus oder der Verabreichung von PD-L1 beobachtet wurde, funktionell dazu in der Lage war Kontrollieren Sie das NB-Tumorwachstum. Ein grundlegender Aspekt der Herausforderung des Immunsystems des Wirts gegen Tumore ist die Freisetzung verschiedener Zytokine bei TME, die die antitumoralen Aktivitäten aufrechterhalten oder abschwächen können. Die Messung von Zytokinen im Tumor bestätigte bei mit SR59230A und PD-L1-behandelten Mäusen eine Verschiebung des Zustands in Richtung eines immunreaktiven TME. Während jedoch bei den antitumoralen Zytokinen sowohl die TNF- als auch die IL{101}}-Spiegel anstiegen, sank der IFN-Spiegel in der Tumormasse von mit 3-AR-Antagonisten behandelten Mäusen. Ausgehend von dieser Beobachtung stellten wir die Hypothese auf, dass die Modulation des 3-AR-Signals auf tumorinfiltrierenden T-Zellen, insbesondere auf CD4+ und CD8+, für einen veränderten IFN-Wert verantwortlich sein könnte. Sekretion, die wiederum die PD-L1-Expression auf Tumorzellen beeinflusste. Die Ergebnisse bestätigten unsere Hypothese. Der selektive 3-AR-Antagonismus auf TILs machte diese Zellen tatsächlich ineffizient bei der Induktion der PD-L1-Expression auf NB-Tumorzellen aufgrund einer veränderten Sekretion von IFN- und verhinderte de facto die Etablierung einer adaptiven Immunresistenz. Bei TME orchestriert IFN- sowohl protumorigene als auch antitumorale Immunantworten, indem es zusammen mit Granzym B und Perforin als zytotoxisches Zytokin auf Tumorzellen wirkt, aber auch die Synthese hemmender Immun-Checkpoints auslöst und so immunsuppressive Mechanismen stimuliert [53]. Diese bimodale Rolle von IFN- bei der Verursachung entgegengesetzter Wirkungen hängt von komplexen Mechanismen ab, die noch nicht vollständig verstanden sind. Allerdings scheint die Menge des sezernierten IFN- für die Definition der von diesem Zytokin hervorgerufenen Wirkungen entscheidend zu sein [54]. Dementsprechend nehmen wir an, dass in unserem Modell die verringerte Menge an IFN-, die durch den 3--AR-Antagonismus auf TILs verursacht wird, die Immunreaktionen im Vergleich zur Kontrollbedingung begünstigt, bei der eine chronische Exposition gegenüber IFN- stärkere immunsuppressive Mechanismen erzwingt. Unter den -AR-Subtypen scheint 2-AR auf der Oberfläche verschiedener Immunzellen am häufigsten exprimiert zu werden. Es sollte jedoch beachtet werden, dass 3-AR, das letzte identifizierte Mitglied der -ARs, bisher am wenigsten untersucht wurde. Um zu bestätigen, dass die Verabreichung von SR59230A hauptsächlich den 3-AR-Subtyp blockiert, untersuchten und bestätigten wir zunächst die 3-AR-Proteinexpression auf Lymphozyten von TDLNs und auf tumorinfiltrierenden T-Zellen. Wir haben die Expression des 3-AR-Proteins in tumorinfiltrierenden CD4+ und CD8+ und dann durch selektive 1-, 2- und {{ 140}}ARs-Stummschaltung bestätigten wir die herausragende Rolle des 3-AR-Subtyps, der sich auf Lymphozyten befindet, bei der Kontrolle der IFN- -abhängigen PD-L1-Expression auf NB-Tumorzellen. Zu beachten ist, dass umfangreiche Daten zu verschiedenen Geweben und Zellmodellen gezeigt haben, dass die 1-- und 2--ARs beide anfälliger für das Phänomen der homologen Desensibilisierung nach längerer Exposition gegenüber endogenen Katecholaminen sind, die {{147} Es wurde gezeigt, dass der Subtyp }AR nicht vorhanden ist, und obwohl in einigen Zellen dennoch eine Desensibilisierung der 3-ARs auftrat, war diese weniger ausgeprägt im Vergleich zu der der 1-- und 2-ARs [ 55]. Wir spekulieren dann, dass bei NB-Tumoren, einem Zustand, der durch chronische Katecholamin-Exposition gekennzeichnet ist, der 2-AR-Subtyp auf TILs, der physiologisch am stärksten exprimiert wird, nach der Desensibilisierung einer Herunterregulierung unterliegen kann und umgekehrt der 3-AR dies verdient eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der durch Katecholamin induzierten protumoralen Wirkung. Um die protumorale Neigung der 3- AR-Expression beim Menschen zu untersuchen, führten wir schließlich eine genetische Analyse an 649 NB-Patienten mithilfe der Open-Access-Plattform R2: Genomics Analysis and Visualization durch. Eine hohe ADRB3-Genexpression korrelierte mit dem schlechtesten klinischen Ergebnis (Gesamtüberleben und ereignisfreies Überleben) von NB-Patienten im Vergleich zu einer niedrigeren Expression; Darüber hinaus besteht die positive ADRB3-Genkorrelation mit verschiedenen immunsuppressiven Checkpoints wie CD80, CTLA4 und B7-H3 (CD276) und die negative Korrelation mit immunaktivierenden Checkpoints wie CD266, CD40LG und 4-1 BBL bestätigte die negative Rolle, die 3-AR bei der komplexen Regulierung der Immunreaktivität in NB spielt. Insbesondere die positive Korrelation der ADRB3-Genexpression mit immunsuppressiven Checkpoints wie CD276, einem NB-assoziierten Molekül, das in nicht reagierenden NB-Varianten vorkommt und eine Schutzfunktion vor einer NK-Zell-vermittelten Lyse ausübt [56, 57], oder mit CTLA4, dessen Hemmung sich als nicht-redundant bei der Verstärkung der Abtötung von Antitumor-T-Zellen in NB erwiesen hat [58], unterstrich die Fähigkeit des 3-AR-Signals, verschiedene Mechanismen aufrechtzuerhalten, die das Entweichen des Tumorimmuns begünstigen. Wir können spekulieren, dass die Korrelation zwischen einer hohen ADRB3-Genexpression und der erhöhten Expression verschiedener Immun-Checkpoints auf der 3-AR-Fähigkeit beruhen könnte, jene Mechanismen aufrechtzuerhalten, deren Überaktivierung das Auftreten von Tumorresistenz fördert, wie z. B. die chronische Exposition gegenüber einigen Pro -entzündliche Zytokine. Frühe Studien zur Checkpoint-Hemmung bei NB waren nicht immer erfolgreich. Insbesondere sowohl in präklinischen Studienmodellen als auch am Menschen deuteten die besseren Reaktionen, die bei Therapiestrategien mit mehreren ICIs erzielt wurden, darauf hin, dass die gezielte Behandlung verschiedener Immunkontrollpunkte einen nicht redundanten wirksamen antitumoralen Ansatz bei NB darstellt [58, 59]. Dann könnte die gezielte Behandlung verschiedener immunsuppressiver Signalwege die beste Therapieoption darstellen, um die Tumorresistenz einer zielgerichteten Therapie zu vermeiden. Allerdings ist die Verabreichung mehrerer Medikamente aufgrund starker Nebenwirkungen und Toxizität immer problematisch und hat nicht immer zu den gewünschten Ergebnissen geführt. Für die Entwicklung neuer immunonkologischer Ansätze ist daher ein tieferes Wissen über die molekularen Mechanismen erforderlich, die an der Regulierung des komplexen Netzwerks des Immungegenstücks des TME beteiligt sind. In diesem Zusammenhang deuten die präsentierten Ergebnisse darauf hin, dass die gezielte Ausrichtung auf den 3-AR bei NB-TME einen möglichen Ansatz darstellen könnte, um mehrere nicht-redundante protumorale Signalwege anzusprechen. Insbesondere durch die Beeinflussung sowohl des Immunsystems des Wirts durch die Beseitigung der durch die Zusammenarbeit der Immun-Checkpoints induzierten Barriere als auch der überlebensfördernden Pfade der Tumorzellen könnte der 3-AR-Antagonismus eine vielversprechende Strategie mit hoffentlich therapeutischer Wirkung darstellen Potenzial für Patienten, die von malignen NB-Erkrankungen betroffen sind. Weitere Studien sind noch erforderlich, um weitere Mechanismen zu vertiefen, die der komplexen Interaktion zwischen dem Immunsystem des Wirts und dem Gegenstück zum Tumor bei NB zugrunde liegen. Dennoch verdient es angesichts unserer Beobachtungen, die Untersuchung der -adrenergen Signalübertragung im TME von NB-Tumoren in Betracht zu ziehen.

Abb. 6 Transkriptomanalysen der NB-Tumormasse bestätigen die herausragende Rolle von 3-AR bei der Beeinflussung immunbezogener Prozesse

Abb. 7 Kaplan-Meier-Überlebensanalyse und Korrelation der Immun-Checkpoints mit der ADRB3-Genexpression bei NB-Patienten.

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