Eine charakteristische Verteilung des Hypoxie-induzierbaren Faktors -1 in kultivierten renalen Tubularzellen mit Hypoperfusion, simuliert durch die Platzierung des Deckglases

Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com

Tomoko-Honda¹| Yosuke Hirakawa¹ | Kiichi Mizukami²| Toshitada Yoshihara²| Tetsuhiro Tanaka¹| Seiji Tobita²| Masaomi Nangaku

Abstrakt

Chronische Hypoxie im renalen Tubulointerstitium spielt eine Schlüsselrolle beim Fortschreiten der chronischenNiereErkrankung(CNI). Es ist daher wichtig, die tubuläre Hypoxie und die Aktivität des Hypoxie-induzierbaren Faktors (HIF) -1 als Reaktion auf Hypoxie zu untersuchen. Verdünnung der peritubulären Kapillare verursacht Hypoperfusion bei CKD; Die Wirkung von Hypoperfusion auf HIFs wurde jedoch selten untersucht. Wir induzierten eine Hypoperfusion, die durch die Platzierung des Deckglases beim Menschen verursacht wurdeNiere-2 Zellen und beobachtete einen Sauerstoffgradienten unter dem Deckglas. Die Immunzytochemie von HIF-1 zeigte eine ringförmige Formation am Rand eines Pimonidazol-positiven Bereichs, den wir "HIF-Ring" nannten. Die Sauerstoffspannung des HIF-Rings wurde auf etwa 4 mmHg bis 20 mmHg geschätzt. Dieses Ergebnis war nicht kompatibel mit früheren Untersuchungen, die eine Anreicherung von HIF-1 im anoxischen Bereich bei homogener Sauerstoffspannung zeigten. Wir beobachteten ferner das Vorhandensein eines pH-Gradienten unter einem Deckglas sowie eine Verschiebung des HIF-Rings aufgrund von Änderungen des pH-Werts des Kulturmediums, was darauf hindeutet, dass der HIF-Ring durch Unterdrückung von HIF -1 verwandt gebildet wurde zu niedrigem pH-Wert. Diese Forschung zeigte, dass die HIF-1-Aktivierung den physiologischen Zustand in kultivierten Zellen mit Hypoperfusion nachahmt.

SCHLÜSSELWÖRTERHypoperfusion, Hypoxie, Hypoxie-induzierbarer Faktor, Sauerstoffgradient, pH-Wert

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1|EINLEITUNG

Die Inzidenz von chronischNiereErkrankung(CNE) nimmt mit zunehmendem Alter der Gesellschaft weltweit zu (Tonelli & Riella, 2014). Das Fortschreiten der CKD ist irreversibel, sobald die Nierenschädigung ein bestimmtes Ausmaß erreicht hat, und führt schließlich zu einer terminalen Niereninsuffizienz (ESRD), unabhängig von der zugrunde liegenden Erkrankung. Dieses Ergebnis weist auf die Existenz eines „endgültigen gemeinsamen Weges“ hin. Nach bisherigen pathologischen Analysen korreliert die Abnahme der Nierenfunktion stärker mit einer tubulointerstitiellen Schädigung als mit einer glomerulären Schädigung. Es gibt mehrere Berichte, die zeigen, dass Nierenfibrose eine chronische Hypoxie im Tubulointerstitium induziert, und diese tubulointerstitielle Hypoxie verschlimmert CKD und führt zu ESRD. Diese Beweise deuten darauf hin, dass die tubulointerstitielle Hypoxie eine Rolle beim letzten gemeinsamen Weg der CKD spielt (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). DasNiereist aufgrund seines hohen Sauerstoffbedarfs und der Existenz eines Sauerstoff-Shunts zwischen den intrarenalen Arterien und Venen sehr anfällig für Hypoxie (Nangaku, 2006; Welch et al., 2001; Zhang et al., 2014). Daher halten wir es für wesentlich, Hypoxie und die Reaktion auf Hypoxie im renalen Tubulointerstitium zu untersuchen.

Die primäre biologische Reaktion auf Hypoxie in lebenden Organismen erfolgt über den Hypoxie-induzierbaren Faktor (HIF)-Weg (Hypoxie, 2011; Semenza & Wang, 1992; Zhou et al., 2003). HIF besteht aus - und -Untereinheiten. Obwohl die -Untereinheit konstitutiv aktiv ist, wird die -Untereinheit in Gegenwart von Sauerstoff abgebaut. Unter normoxischen Bedingungen wird HIF- durch die Prolylhydroxylase-Domäne (Ph.D.) hydroxyliert, wodurch es durch den von Hippel-Lindau-Tumorsuppressor (VHL) erkennbar wird. Diese Erkennung führt zur Ubiquitinierung und zum Abbau von hydroxyliertem HIF- im Proteasom. Unter hypoxischen Bedingungen reichert sich HIF- im Zytosol an, da nicht-hydroxyliertes HIF- dem Abbau entgeht. Angesammeltes HIF- wird vom Zytosol in den Kern verlagert, wo es mit HIF- dimerisiert und als Transkriptionsfaktor wirkt, der die Expression nachgeschalteter Gene fördert. Von den drei identifizierten Isoformen der HIF-Untereinheiten – HIF-1 , HIF-2 und HIF-3 – ist bekannt, dass Tubulusepithelzellen der Niere HIF-1 exprimieren (Tanaka et al ., 2016). Frühere Studien haben eine vorübergehende oder regionale Akkumulation von HIF in der Haut gezeigtNieremit CNI (Goldfarb et al., 2006; Yu et al., 2012), und dieses HIF wird in der reduzierten Sauerstoffspannung im CNI-Milieu aktiviert. Die Fehlanpassung an Hypoxie bei CKD könnte durch das Vorhandensein von Faktoren verursacht werden, die HIF-Signalwege unterdrücken (Asai et al., 2016; Tanaka et al., 2013; Thangarajah et al., 2009). Schutzwirkungen der HIF-Aktivierung wurden in mehreren Tiermodellen berichtet, einschließlich Streptozotocin-induzierter diabetischer Ratten und 5/6-Nephrektomie-Ratten (Deng et al., 2010; Nordquist et al., 2015). Ph.D. Inhibitoren haben kürzlich als neue therapeutische Ansätze für die renale Anämie bei Patienten mit CKD Aufmerksamkeit erregt (Akizawa et al., 2019; Chen et al., 2017, 2019; Coyne et al., 2017; Miyata et al., 2011; Pergola et al ., 2016; Provenzano et al., 2016). Die Einzelheiten des Fortschreitens der renalen Hypoxie und die Art und Weise, in der die HIF-Akkumulation in derNieremit CKD, bleiben im Dunkeln. Die sauerstoffabhängige Hydroxylierung von HIF- findet im Zytosol statt, und es ist daher wichtig, die intrazelluläre und extrazelluläre Sauerstoffspannung zu messen. Es gibt verschiedene Methoden zur Messung der Sauerstoffspannung, einschließlich der Verwendung von Mikroelektroden oder der vom Blutsauerstoffgehalt abhängigen Magnetresonanztomographie (BOLD-MRT). Wir verwendeten Phosphorescence Lifetime Imaging Microscopy (PLIM) zur quantitativen Messung des intrazellulären Sauerstoffstatus (Hirakawa et al., 2017; Yoshihara et al., 2015). BTPDM1 ist ein phosphoreszierender Farbstoff auf Basis des Iridium(III)-Komplexes BTP, (bp)2Ir(acc) (bp=Benzoat-Pyridin, aac=Acetylaceton) mit einer kationischen Dimethylaminogruppe, die passiv ist in intrazellulären Lysosomen verteilt. Es wurde als phosphoreszierende Sonde zur Messung des intrazellulären Sauerstoffdrucks synthetisiert (Yoshihara et al., 2015). PLIM mit BTPDM1 ermöglichte die Aufnahme hochauflösender Bilder des Sauerstoffpartialdrucks in tubulären Nierenzellen auf der Nierenoberfläche normaler Mäuse und lieferte Daten, die auf das Vorhandensein eines Sauerstoffgradienten hinweisen, sogar in normalen Nieren (Hirakawa et al., 2018 ).

Es gibt Sauerstoffgradienten in lebenden Organen, einschließlichNieren, auch unter normalen Bedingungen (Hirakawa et al., 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov et al., 2015), und solche Gradienten sind daher auch bei CKD zu erwarten. Hypoperfusion wird durch Verdünnung der Mikrovaskulatur bei CKD verursacht, bei der eine fortschreitende glomeruläre Schädigung zu einer Abnahme des peritubulären kapillaren Blutflusses führt, was die interstitielle Fibrose verschlimmert. Interstitielle Fibrose beeinträchtigt die Diffusion und Versorgung der tubulären Zellen mit Sauerstoff und führt zu einer Verdünnung der Mikrovaskulatur, was die tubulointerstitielle Hypoxie weiter verschlimmert (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Die biologischen Auswirkungen der Hypoperfusion bleiben jedoch unklar, da die meisten Studien die Auswirkungen von Hypoxie und HIF-1 auf kultivierte Zellen unter Bedingungen homogener Perfusion und Sauerstoffspannung untersucht haben (Rexius-Hall et al., 2017). Frühere Studien haben gezeigt, dass einschichtige kultivierte Zellen, die mit einem Deckglas bedeckt sind, ein gutes Modell der Hypoperfusion darstellen, die durch eine Diffusionsbarriere im Kulturmedium induziert wird. Die modellierte Hypoperfusion ist mit einem Sauerstoffgradienten verbunden, da ein Deckglas die Sauerstoffdiffusion von der Oberseite des Mediums zu den Zellen verhindert (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). In einer Monoschicht kultivierter Zellen, die mit einem Deckglas bedeckt sind, fällt die intrazelluläre Sauerstoffspannung mit der Entfernung vom Rand des Deckglases aufgrund der begrenzten Sauerstoffdiffusion in die kultivierten Zellen. Dadurch bildet sich ein Sauerstoffgradient vom Rand zur Mitte des Deckglases und die intrazelluläre Sauerstoffspannung kann in der Mitte des Deckglases in einen anoxischen Bereich abfallen (Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015) . In der aktuellen Studie konzentrierten wir uns auf die HIF-Aktivierung und untersuchten, ob es bei Hypoperfusion mit Sauerstoffgradient zu einer sauerstoffunabhängigen Veränderung der HIF-Expression kommt. Da in den Nierentubuli in vivo eine Hypoperfusion mit einem Sauerstoffgradienten besteht, kann die Beobachtung von sauerstoffunabhängigen Effekten auf die HIF-Expression im Deckglasmodell Einblicke in den Mechanismus geben, der der Insuffizienz der HIF-Akkumulation bei CKD zugrunde liegt.

Cistanche-Extraktfür Niere

2|MATERIALEN UND METHODEN

2.1|Zellkultur

Kultivierte Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator mit 5 Prozent CO2 inkubiert. Die hypoxische Inkubation wurde in einem persönlichen CO2/Multigas-Inkubator APM-30D (Astec) durchgeführt. Anoxie wurde mit einem Anoxie-Beutel, AnaeroPack und anaeroben Kultivierungssets #A-13 (Mitsubishi Gas Chemical) induziert.

HK-2-Zellen (Homo sapiens, MenschNiere, männlich, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), eine unsterblich gemachte Epithelzelllinie des proximalen Tubulus aus einer normalen erwachsenen menschlichen Niere, wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium/Nährstoffmischung F{{2} kultiviert } Schinken (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (F7524, Sigma Aldrich) und Penicillin-Streptomycin-Lösung (15070063, Thermo Fisher Scientific) in einer 10-cm-Kulturschale. Für die Passage wurden HK-2-Zellen mit Trypsin (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissoziiert und bei 300 g für 5 min zentrifugiert.

HeLa Gebärmutterhalskrebszellen und menschlichen EmbryonenNiereZellen 293 (HEK293) wurden in DMEM mit niedriger (1000 mg/l) Glucose (D6046, Sigma Aldrich), enthaltend 5 % FBS, in einer 10-cm-Kulturschale kultiviert. Diese Zellen wurden als HK-2-Zellen passagiert.

Epithelzellen des proximalen Tubulus der Nieren (RPTECs) (CC- 2553, Cambrex) wurden unter Verwendung von RenaLifeTM Comp-Kits (LRC-LL0025, Lonza Ltd.) erhalten. Für die Passage wurden RPTECs unter Verwendung von Trypsin dissoziiert, mit Trypsin-Neutralisierungslösung (CC-5002, Lonza Ltd.) neutralisiert und bei 200 g für 5 min zentrifugiert.

2.2|Etablierung eines Hypoperfusionsmodells durch eine Deckglasplatzierung

Runde Deckgläser mit 15 mm Durchmesser (C015001, Matsunami) wurden mit Ultraschall gereinigt und vor der Verwendung in 99,5-prozentigem Ethanol gelagert. Basierend auf der Beobachtung von Zellen außerhalb des Deckglases wurden zwei Methoden angewendet.

Einschichtige kultivierte Zellen wurden zwischen einem Deckglas und dem Boden einer Schale (Abbildung S1a, b) oder einer alternativen Methode (Abbildung S1c) eingelegt, wie unten beschrieben. Entweder die traditionelle oder die alternative Methode wurde ausgewählt, um unser Deckglasmodell für die Live-Bildgebung zu etablieren, ob Sauerstoffbildgebung oder PH-Bildgebung. Für die Immunzytochemie (ICC) wurde die alternative Methode gewählt, da sich bei der traditionellen Methode die Mehrheit der Zellen während der Entfernung des Deckglases zur Zellfixierung häufig vom Boden der Schale löste (Abbildung S2a).

2.2.1|Traditionelle Methode

Am Tag 1 wurden die Zellen auf den Boden einer 27-mm-Schale auf Glasbasis (3910-035, Iwaki) mit einer Konfluenz von 100 Prozent * (ungefähr 5,0 × 105/Schale) gegeben. Sie wurden in DMEM/F12 mit 10 Prozent FBS ohne Antibiotikalösung über Nacht kultiviert. An Tag 2 wurde für den angegebenen Zeitraum ein Deckglas über die kultivierten Zellen gelegt (Abbildung S1b).

2.2.2|Alternative Methode

Die Zellen wurden am Tag auf einem Deckglas in einer 35-mm-Kulturschale bei 100 Prozent Konfluenz (ungefähr 5,0 × 105/Schale) ausgesät.

1. Sie wurden in DMEM/F12 mit 10 Prozent FBS ohne Antibiotikalösung über Nacht kultiviert. An Tag 2 wurde das Deckglas umgedreht, um die Oberfläche seiner Zellen für einen bestimmten Zeitraum am Boden einer neuen 27-mm-Schale auf Glasbasis zu befestigen (Abbildung S1c).

Wir haben auch ein Deckglasmodell mit runden Deckgläsern mit einem Durchmesser von 10 mm (CS01005, Matsunami) erstellt (Abbildung S2b).

2.3|Live-Sauerstoffbildgebung mit BTPDM1

Kultivierte Zellen wurden am Tag 1 wie oben beschrieben präpariert. An Tag 2 wurden die Zellen zweimal mit Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) gespült und mit 500 nM BTPDM1, einem kationischen lipophilen Farbstoff auf Iridiumbasis, der als intrazelluläre Phosphoreszenzsonde verwendet wird, inkubiert (Yoshihara et al., 2015), in DMEM/F12 ohne Phenolrot (21041-025, Thermo Fisher Scientific) für 30 min. Nachdem die Zellen zweimal mit HBSS gewaschen worden waren, wurden sie wie oben beschrieben zwischen einem Deckglas und dem Boden einer Schale angeordnet. Die Intensität der Phosphoreszenz von BTPDM1 in mit einem Deckglas bedeckten kultivierten Zellen wurde unter Verwendung eines Anregungs- und Emissionsfilters beobachtet, und die BTPDM1-Phosphoreszenz (Hirakawa et al., 2015) wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops, BZ-X710 (Keyence Corporation), nachgewiesen. Bilder, die von dem inversen Fluoreszenzmikroskop erhalten wurden, wurden unter Verwendung der BZ-X-Analysesoftware auf Helligkeit und Kontrast eingestellt.

2.4|Immunzytochemie

Zellen auf einem Deckglas wurden mit 200 &mgr;M Pimonidazol-HCl (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) in DMEM/F12 ohne Phenolrot für 1 h kultiviert, wonach das Deckglas gedreht und an einer Deckglasschale befestigt wurde, wie vorher beschrieben. Die Zellen wurden dann für einen bestimmten Zeitraum in DMEM/F12 ohne Phenolrot kultiviert. Wenn keine Pimonidazol-Gegenfärbung verwendet wurde, wurde auf eine Vorbehandlung mit Pimonidazol verzichtet.

Nach Beendigung der Kulturperiode wurde jedes Deckglas eingesammelt und die Zellen sofort mit Methanol/Aceton (1:1) auf Eis fixiert, wo sie für 30 min verblieben. Nach zweimaligem Waschen mit Dulbecco's phosphatgepufferter Saline (PBS) (D5652, Sigma Aldrich) wurde die Zellmembran für 30 min permeabilisiert, mit 5 Prozent Rinderserumalbumin (BSA) (A3059, Sigma Aldrich) für 30 min inkubiert und anschließend mit serumfreiem Proteinblock (X0909, DAKO) für 10 min. Die Zellen wurden mit einem ersten Antikörper und anschließend mit einem zweiten, fluoreszierenden Antikörper gefärbt. Die Liste der ersten Antikörper ist in Tabelle S1 angegeben. Polyklonales FITC-Schweine-Anti-Kaninchen-Immunglobulin (F0205, 1:20-Verdünnung, DAKO) wurde als erster Antikörper verwendet, wenn der Wirt ein Kaninchen war. Der fluoreszierende Antikörper Alexa Fluor 594 Streptavidin (S11227, Verdünnung 1:500, Thermo Fisher Scientific) wurde als erster Antikörper verwendet, wenn der Wirt eine Maus war, gefolgt von biotinyliertem Anti-Maus-IgG (H plus L) (BA{{23} }, Verdünnung 1:1000, Vector Laboratories), als zweiter Antikörper. Kernfärbung wurde unter Verwendung von BisBenzimid H 33342 Trihydrochlorid (B2261, Sigma Aldrich) für jede Probe durchgeführt.

Fluoreszenzsignale wurden unter Verwendung eines inversen Fluoreszenzmikroskops BZ-X710 (Keyence Corporation) mit den folgenden Filtern beobachtet: Texas Red mit einer Anregungswellenlänge (Ex) von 560/40 nm, Emissionswellenlänge (Em) von 630/75 nm, GFP ( Bsp.: 470/40 nm, Em: 525/50 nm) und DAPI (Bsp.: 360/40 nm, Em: 460/50 nm). Die Bilder wurden mit der BZ-X-Analysesoftware auf Helligkeit und Kontrast eingestellt.

2.5|ICC von HIF von mit Kobaltchlorid behandelten HK-2-Zellen

Die alternative Methode wurde modifiziert, um ein Deckglasmodell von HK-2-Zellen zu erzeugen, die mit Kobaltchlorid behandelt wurden. HK-2-Zellen wurden mit halbkonfluenter Dichte (2,5 × 105/Schale) auf einem Deckglas am Tag 1 ausgesät und mit 300 µM Kobaltchlorid-Hexahydrat (C8661, Sigma Aldrich) für weitere 16 h behandelt Tag 2. Am Tag 3 wurde das Deckglas umgedreht, um die Zelloberflächen 3 h lang am Boden einer neuen 27-mm-Schale auf Glasbasis zu befestigen, und die ICC von HIF wurde durchgeführt.

2.6|Western-Blotting

Zur Untersuchung der HIF{{0}}-Akkumulation bei verschiedenen Sauerstoffspannungen und bei verschiedenen pH-Werten, 1,0 × 106 HK-2-Zellen pro 10-cm-Kulturschale wurden entweder unter Normoxie, 2 % Sauerstoff, 1 % Sauerstoff oder Anoxie für 5 h oder in DMEM/F12 bei pH 7,4, pH 6,0 oder pH 5,0 für 5 h inkubiert.

Diese Zellen wurden in RIPA-Puffer lysiert, der 50 mM Tris-Puffer (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,5 Gew./Vol.-% Natrium enthielt Desoxycholat, 0,1 Gew./Vol.-% SDS und 1,0 Gew./Vol.-% NP40.

Für Western Blotting SDS-Probenpuffer mit {{0}},35 M Tris-HCl (pH 6,8), 10 Prozent SDS, 36 Prozent Glycerin, 0,012 Prozent Bromphenolblau und 0,1 M Dithiothreitol (DTT) wurde zu den Proteinen hinzugefügt. Proteine, die SDS-Probenpuffer enthielten, wurden durch 5-minütiges Kochen bei 95 Grad eluiert.

Die Proteine ​​wurden durch Elektrophorese auf 10-Prozent-SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Die Proteine ​​wurden dann auf eine Amersham TM Hybond TM PVDF-Membran (10600023, GE Healthcare) in Transferpuffer (48 mM Tris-Basenpuffer, 39 mM Glycin, 0,04 % SDS und 20 v/v % Methanol) unter Verwendung eines Trans-Blot® transferiert TurboTM Transfersystem (Bio-Rad). Die Membranen wurden bei Raumtemperatur mit primären Antikörpern, Anti-HIF1-Antikörper (NB100-134, 1:500-Verdünnung, Novus Biologicals, RRID: AB_350071) und Anti-Aktin-Antikörper (A2066 , Verdünnung 1:2000, Sigma Aldrich, RRID: AB_476693) und anschließend im sekundären Antikörper, polyklonales Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulin/HRP (P0448, Verdünnung 1:10000, DAKO, RRID: AB{{26 }}). Für den Nachweis wurde PierceTM ECL Plus Western Blotting Substrat (32132, ThermoFisher Scientific) verwendet. Die Chemilumineszenz wurde unter Verwendung eines Luminoimage Analyzer ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare) beobachtet. Die Reproduzierbarkeit wurde bestätigt, indem mindestens drei unabhängige Experimente durchgeführt wurden. Die Intensität der Banden wurde mit der Software National Institutes of Health ImageJ (Schneider et al., 2012) quantifiziert.

2.7|Luciferase-Reporter-Assay

Ein Luciferase-Reporter-Assay wurde durchgeführt, um die HIF1-Akkumulation in einer homogenen hypoxischen Kulturinkubation zu messen. Wir haben zuvor ein markiertes Luciferase-Gen konstruiert, das von einem Hypoxie-responsiven Element (HRE) angetrieben wird, und den Hypoxie-responsiven Reportervektor (Transgene Construction) entwickelt. Diese wurde aus Tandemkopien des HRE aus dem Gen des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors der Ratte konstruiert, das in die 5'-Region der am CMV-Promotor-Luciferase-Transkriptionseinheit (Prä-Luc) subkloniert wurde (Chiang et al., 2011; Tanaka et Al., 2004).

HK{{0}}-Zellen mit einer Konzentration von 1,0 × 105 pro Well wurden in 12--Well-Kulturplatten (150628, Thermo Fisher Scientific) präpariert. Die Zellen wurden mit 500 ng pGL3-Basic HRE-Luciferase-Vektoren und 30 ng pRL-SV40-Renilla-Luciferase-Kontrollvektoren (Promega) unter Verwendung von 2 &mgr;l FuGENE ® HD-Transfektionsreagenz (E2311, Promega) pro transfiziert Gut. HK-2-Zellen, co-transfiziert mit 500 ng pGL3-Basic Glühwürmchen-Luciferase-Vektoren und 30 ng pRL-SV40 Renilla-Luciferase-Kontrollvektoren (Promega) wurden als Negativkontrolle verwendet.

Die transfizierten Zellen wurden unter Normoxie, 2 Prozent Hypoxie, 1 Prozent Hypoxie oder einem Anoxie-Beutel für 5 h inkubiert. Die Zellen wurden dann unter Verwendung von 100 &mgr;l passivem Proteinlysepuffer für den dualen Luciferase-Assay geerntet. Für die Messungen wurde ein Luminometer LB9507 (EG und Berthold) verwendet. Um die Transfektionseffizienz zu korrigieren, wurde der relative Wert der Glühwürmchen-Luciferase-Lichteinheit durch den der Renilla-Luciferase dividiert.

Cistanche für Ed

2.8|Analyse der Apoptose

Kultivierte Zellen wurden mit einem Deckglas für 0 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h und 24 h abgedeckt und dann unter Verwendung von Trypsin gesammelt. Zellen, die 30 Minuten lang mit 3 Prozent Wasserstoffperoxid (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) behandelt wurden, wurden als apoptotische Kontrolle präpariert. Die quantitative Analyse der Apoptose wurde unter Verwendung von Muse Annexin V und Dead Cell Kits (MCH100105, Millipore) in einem Muse TM Cell Analyzer (Millipore) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

2.9|Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR)

Gesamt-RNA-Extraktion und cDNA-Synthese wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers für RNAiso Plus (9109, Takara) bzw. PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara) durchgeführt. Echtzeit-PCR wurde unter Verwendung von THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (QPS- 201, Toyobo) im CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) durchgeführt. Transkriptniveaus wurden auf das Niveau der -Actin-mRNA-Expression normalisiert. qRT-PCR wurde dreifach unter Verwendung genspezifischer Primer durchgeführt. HIF-1 wurde unter Verwendung von Vorwärts-5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′- und Rückwärts-5′-TGGGTAGGAGATGAGAGATGC-3′-Primern amplifiziert. -Aktin wurde unter Verwendung von Vorwärts-, 5′-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3′- und Rückwärts-5′-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG-3′-Primern amplifiziert.

2.10|Transfektion mit siRNA

Um den RNAi-induzierten HIF-1-Knockdown in HK-2-Zellen zu untersuchen, wurden 5,0 × 104 HK-2-Zellen pro Vertiefung in Platten mit sechs Vertiefungen präpariert. Zwei Arten von RNAi – HIF-1 siRNA (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] und siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific]) – wurden mit Lipofectamine RNAiMAX verwendet Transfektionsreagenz (Thermo Fisher Scientific). Als Negativkontrolle wurde Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113) verwendet; 1,5 ul jeder siRNA und 5 ul RNAiMAX wurden gemischt. siRNA-transfizierte Zellen wurden unter normoxischen oder hypoxischen (1 Prozent O2) Bedingungen für 48 h inkubiert und RNA wurde extrahiert. Die Effizienz des Knockdowns von HIF-1 wurde mittels qRT-PCR untersucht.

2.11|Live-Bildgebung der Auswirkungen eines PH-Gradienten

Wir visualisierten den intrazellulären pH-Gradienten von lebenden Zellen unter einem Deckglas. Die Zellen wurden mit dem intrazellulären pH-Indikator pHrodo Green AM (p35373, ThermoFisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers behandelt, bevor das Deckglasmodell implementiert wurde. Ein umgekehrtes Fluoreszenzmikroskop, BZ-X710 (Keyence Corporation) mit einem GFP-Filter wurde verwendet, um den zeitlichen Übergang des Fluoreszenzintensitätsgradienten unter einem Deckglas zu beobachten.

2.12|Quantitative Analyse des HIF-Rings

2.12.1|Standort des HIF-Rings

Wir haben den Abstand der HIF-Ringe und Pimonidazol-positiven Bereiche von den Deckglasrändern mit ImageJ wie folgt gemessen. Die Flächen der äußeren und inneren Kreise des HIF-Rings und des Pimonidazol-positiven Kreises wurden bestimmt, und der Radius jedes Kreises wurde berechnet. Jeder Wert wurde von 7,5 mm subtrahiert, was dem Radius eines 15-mm-Deckglases entspricht, um seinen Abstand von einer Deckglaskante zu berechnen. Drei unabhängige Experimente von ICC von HIF in jedem Zustand wurden durchgeführt.

2.12.2|Definition des HIF-Rings

Wir verwendeten fluoreszierende Bilder, die von einem Deckglasmodell erhalten wurden, das unter Normoxie und neutralem pH-Wert inkubiert wurde. Wir haben die Stelle des HIF-Rings und seine Außenseite und Innenseite als 2,5–3,0-Maßstab (0,22–0,45 mm), 0,5 definiert –1,0 Skala (1,12–1,35 mm) und 5,0–5,5 Skala (2,24–2,47 mm) von einer Deckglaskante, jeweils mit ImageJ. Wir haben fünf Stellen mit HIF-1-Signalen pro Probe gemessen und den Durchschnitt berechnet. Drei unabhängige Experimente von ICC von HIF wurden durchgeführt.

Cistanche-Extrakt-Pulver

2.13|Messung des Sauerstoffdrucks durch PLIM-Bild

2.13.1|Aufbau einer Kalibrierstrecke zur Messung des Sauerstoffdrucks

Basierend auf der in unserem vorherigen Bericht (Yoshihara et al., 2015) beschriebenen Methode wurde eine Kalibrierungskurve von HK-2-Zellen erstellt. HK-2-Zellen, die mit 500 nM BTPDM1 für 30 min beladen wurden, wurden in einem Multigas-Inkubator mit änderbarer Sauerstoffkonzentration kultiviert, der mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop ausgestattet war, das an das Lebensdauermesssystem angeschlossen war. Eine auf Stern-Volmer-Analysen basierende Kalibrierungslinie wurde unter Verwendung der Phosphoreszenzlebensdauer (PL) von HK-2-Zellen unter mehreren verschiedenen Sauerstoffspannungen konstruiert

Gleichung (1)

wobei τp den PL in pO2 darstellt, τ0 den PL bei der Desoxygenierung darstellt, kq die Löschgeschwindigkeitskonstante darstellt und pO2 den Sauerstoffpartialdruck darstellt. Mit dieser Kalibriergerade konnte der Sauerstoffdruck aus dem PL errechnet werden.

2.13.2|PLIM-Bild eines Deckglasmodells

HK-2-Zellen, beladen mit 500 nM BTPDM1 für 30 min, wurden hergestellt. Ein Deckglasmodell wurde konstruiert und in einem Multigas-Inkubator mit änderbarer O2-Konzentration kultiviert, der mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop ausgestattet war, das mit dem Lebensdauermesssystem verbunden war.

Bilder der Phosphorescence Lifetime Imaging Microscopy (PLIM) wurden mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop aufgenommen, das mit einem konfokalen Scansystem ausgestattet war (Hirakawa et al., 2018). PLIM-Bilder wurden nach 30-minütiger Inkubation in 21 Prozent O2 oder 4 Prozent O2 erhalten. Vier PLIM-Bilder pro Probe, von den oberen, unteren, linken und rechten Regionen nahe der Kante des Deckglases, wurden aufgenommen, um den durchschnittlichen PL zu bestimmen, wobei die Variation der PLs in einem Deckglas berücksichtigt wurde.

2.13.3|Identifizierung des HIF-Rings in einem PLIM-Bild

Pimonidazol war unter 10 mmHg Sauerstoffdruck positiv. Das PL-Äquivalent von 10 mmHg Sauerstoffdruck betrug gemäß der Kalibrierungslinie 4034,6 ns, sodass die äußere Linie des Pimonidazol-Kreises im PLIM-Bild identifiziert werden konnte. Anschließend konnten die Positionen der äußeren und inneren HIF-Ringe im PLIM-Bild durch quantitative Distanzanalyse gefunden werden. Wir haben den Bereich der durchschnittlichen PLs gemessen, die dem HIF-Ring in 21 Prozent O2 und 4 Prozent O2 entsprechen.

2.13.4|Messung des Sauerstoffdrucks des HIF-Rings

Wir haben den Bereich der Sauerstoffdrücke des HIF-Rings aus den PLs unter Verwendung der Kalibrierungslinie berechnet. PLIM-Bilder wurden mit SPCImage 5.0 (Becker & Hickl GmbH) analysiert.

2.14|statistische Analyse

Der Dunnett-Test wurde verwendet, um Versuchs- und Kontrollgruppen zu vergleichen, und Werte < 0,05="" wurden="" als="" statistisch="" signifikante="" unterschiede="" angesehen.="" student's="" t-tests="" wurden="" verwendet,="" um="" drei="" oder="" mehr="" gruppen="" zu="" vergleichen,="" und="" der="" nach="" bonferroni="" angepasste="" p-wert="" wurde="" angewendet.="" alle="" statistischen="" analysen="" wurden="" mit="" jmp="" pro="" version="" 13.2.1="" (sas)="" durchgeführt.="" es="" wurde="" davon="" ausgegangen,="" dass="" die="" werte="" von="" einer="" normalverteilten="" population="" stammen,="" und="" sie="" sind="" als="" mittelwert="" ±="" standardabweichung="" (sd)="">

was ist eine cistanche

3|ERGEBNISSE

3.1|Sauerstoffgradientenbildung im Hypoperfusionsmodell

Wir bestätigten die Existenz eines Sauerstoffgradienten im Hypoperfusionsmodell, der durch die Platzierung des Deckglases induziert wurde, indem wir die Sauerstoffspannung direkt unter Verwendung von Phosphoreszenz bewerteten. Die Messung der Phosphoreszenzintensität kann einen ungefähren Trend des Sauerstoffdrucks vorhersagen (Hirakawa et al., 2015; Yoshihara et al., 2015). Wir beobachteten die Phosphoreszenzintensität eines Deckglasmodells von HK-2-Zellen, die mit BTPDM1 behandelt wurden. Bilder der Phosphoreszenzintensität zeigten Hypoxie im größten Teil des Bereichs innerhalb des Deckglases, aber keine Hypoxie in der Nähe des Randes, eine Beobachtung, die auf die Existenz eines Sauerstoffgradienten um den Rand des Deckglases in mit a bedeckten HK-2-Zellen hindeutete Deckglas (Abbildung 1a). Da die Intensität der Phosphoreszenz von der Konzentration der Sonde und der Anregungszeit abhängt, ist eine Messung der Phosphoreszenzlebensdauer (PL) für die quantitative Analyse des Sauerstoffdrucks nützlich (Yoshihara et al., 2015). So erhielten wir für die quantitative Messung der Sauerstoffspannung von kultivierten Zellen am Rand eines Deckglases PLIM-Bilder von HK-2-Zellen, die 30 min lang mit einem Deckglas bedeckt waren (Abbildung 1b). PL verlängerte sich mit zunehmendem Abstand von der Kante des Deckglases. Wir bestätigten, dass die Sauerstoffspannung, berechnet mit einer Kalibrierungslinie (Abbildung S3), mit zunehmendem Abstand vom Rand des Deckglases abnahm, was Beweise für das Vorhandensein eines Sauerstoffgradienten um den Rand des Deckglases liefert (Abbildung 1c). Die Untersuchung des zeitlichen Profils der Phosphoreszenzintensität zeigte, dass sich der Sauerstoffgradient 10 min nach dem Auflegen des Deckglases zu bilden begann

(Abbildung 1d).

3.2|Einzigartige HIF-1-Verteilung im Hypoperfusionsmodell, "HIF-Ring"

Wir haben die HIF-1-Verteilung im Hypoperfusionsmodell mit einem Sauerstoffgradienten untersucht. Die ICC von HIF-1 in HK-2-Zellen zeigte eine ringförmige Verstärkung am Rand des Pimonidazol-positiven Bereichs, den wir "HIF-Ring" nannten (Abbildung 2a). Die Intensität des HIF-1-Signals war auf dem HIF-Ring signifikant höher als in seinen inneren oder äußeren Bereichen (Abbildung 2b). Dieses Phänomen wurde unter Verwendung von ICC mit einem anderen HIF-1-Antikörper (Abbildung S4a) oder anderen tubulären Zelllinien (Abbildung S4b,c) bestätigt. Wir führten auch eine ICC-Analyse von HIF-1 in anderen Arten von kultivierten Zellen durch, wie z. B. HeLa-Zervixkrebszellen. Obwohl die schwache Haftung dieser Zellen an einem Deckglas eine detaillierte Bewertung der HIF-1-Verteilung erschwerte, beobachteten wir eine ringförmige Verstärkung von HIF-1 in HeLa-Zellen (Abbildung S4d).

Der HIF-Ring und der Pimonidazol-positive Bereich begannen sich mehrere Stunden nach der Platzierung des Deckglases zu bilden, und der HIF-Ring erschien nach 3 h statisch (Abbildung 2c). Der HIF-1-Knockdown führte zum Verschwinden des Signals HIF-1 , einschließlich des HIF-Rings (Abbildung 2d, Abbildung S4e), was darauf hinweist, dass der HIF-Ring von HIF-1 abhängig war.

Um die Möglichkeit zu untersuchen, dass die HIF-Ringbildung sauerstoffabhängig ist, untersuchten wir die Verteilung von HIF-1 im Deckglasmodell unter Inkubation mit unterschiedlichen Sauerstoffspannungen. Unmittelbar nach der Herstellung eines Deckglasmodells stellten wir eine Schale in hypoxische Kammern mit unterschiedlichen Sauerstoffspannungen. Während der hypoxischen Inkubation beobachteten wir, dass sich sowohl der HIF-Ring als auch der Pimonidazol-positive Bereich nach außen zu erweitern schienen (Abbildung 3a). Wir haben den Abstand jedes HIF-Rings und Pimonidazol-positiven Bereichs von einer Deckglaskante unter Inkubation mit Normoxie, 4 Prozent O2 und 1 Prozent O2 gemessen. Sowohl der HIF-Ring als auch der Pimonidazol-positive Bereich dehnten sich nach außen aus, als die umgebende Sauerstoffspannung abnahm (Abbildung 3b). Diese Ergebnisse zeigten, dass der HIF-Ring von HIF-1 und Sauerstoffspannung abhängig war.

Um zu bestätigen, dass die Donut-förmige Akkumulation ein spezifisches Phänomen von HIF ist, haben wir ICC mit Housekeeping-Genen im Deckglasmodell durchgeführt. Die GAPDH- und Actin-Signale wurden über die gesamte Fläche eines Deckglases aufrechterhalten und waren zwischen der Region des HIF-Rings und den anderen Regionen vergleichbar (Abbildung S5a,b).

3.3|Messung des Sauerstoffdruckbereichs des HIF-Rings

Wir bestätigten die ringförmige Verstärkung der HIF-1-Akkumulation in kultivierten Zellen, die mit einem Deckglas bedeckt sind, ein Phänomen, das von der Sauerstoffspannung abhängt. Um den Bereich der beteiligten Sauerstoffspannung zu bestimmen, analysierten wir den Sauerstoffdruck des HIF-Rings unter Verwendung einer Phosphoreszenz-Lebensdauertechnik. Wir erhielten PLIM-Bilder des Deckglasmodells nach 30 min Inkubation in 21 Prozent O2 oder 4 Prozent O2 (Abbildung 4a). Der HIF-Ring bildete sich am Rand des Pimonidazol-Kreises im ICC von HIF (Abbildung 3b). Wir identifizierten die Stelle im PLIM-Bild, die dem Pimonidazol-positiven Bereich im ICC von HIF entsprach, und identifizierten anschließend die Stelle, die dem HIF-Ring entspricht (Abbildung 4b), indem wir eine quantitative Analyse der Abstandsdaten vom HIF-Ring und dem verwendeten Pimonidazol-positiver Bereich (Abbildung 3b). Wir haben auch den Bereich der PLs des HIF-Rings gemessen und dann eine Kalibrierungslinie (Abbildung S3) verwendet, um den Sauerstoffdruck des HIF-Rings in 21 Prozent O2 (4,20 [3,46–4,97] ~35,9 [28,5–44,9] mmHg) zu berechnen. und 4 Prozent O2 (2,19 [0,21–4,32] ~20,4 [17,1–24,1] mmHg) (Abbildung 4c).

3.4|HIF-1-Akkumulation unter homogener Sauerstoffspannung

Während schwache Signale von HIF-1 außerhalb des HIF-Rings in einem Deckglasmodell auf unzureichende Hypoxie zurückgeführt werden können, müssen diejenigen innerhalb des Rings, wo HIF-1 durch die niedrigere Sauerstoffspannung stärker aktiviert werden sollte, dies tun durch ein sauerstoffunabhängiges Phänomen gesteuert werden. Um die Phänomene zu untersuchen, die einen Mangel an maximaler Akkumulation von HIF-1 im anoxischen Bereich verursachen, der nur im Hypoperfusionsmodell auftritt, haben wir untersucht, ob es eine umgekehrte Beziehung zwischen Sauerstoffspannung und HIF-1-Akkumulation während der Inkubation gibt mit homogener Sauerstoffspannung. Die Western-Blot-Analyse von Zelllysaten unter verschiedenen homogenen Sauerstoffspannungen zeigte eine Zunahme der HIF-1-Akkumulation während der anoxischen Inkubation (Abbildung 5a). Der HRE-Luciferase-Reporter-Assay zeigte auch, dass die HIF-1-Akkumulation mit niedrigerer Sauerstoffspannung unter Bedingungen einer homogenen Sauerstoffspannung erhöht war (Abbildung 5b). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Akkumulation von HIF-1 von der Sauerstoffspannung abhängig war, wobei die maximale Akkumulation im anoxischen Bereich beobachtet wurde. Die Eigenschaften von HIF-1 sollten zwischen einem Hypoperfusionsmodell und einem Modell mit homogener Sauerstoffspannung variieren. Wir spekulierten, dass das einzigartige Phänomen der HIF-1-Akkumulation in diesem Hypoperfusionsmodell durch einen anderen Faktor als die Sauerstoffspannung bestimmt werden könnte.

3.5|Die HIF-Ringbildung war unabhängig von der Promotion

Wir untersuchten, ob der HIF-1-Abbau, ein möglicher Mechanismus der HIF-Ringbildung, innerhalb des HIF-Rings hochreguliert wurde. Diese Idee schien ungültig, da die Hydroxylierung durch Ph.D., ein geschwindigkeitsbestimmender Prozess des HIF-Abbaus, Sauerstoff als Substrat erfordert. Kobaltchlorid wird weithin als chemischer HIF-Stabilisator verwendet. Wir konstruierten ein Deckglasmodell von HK-2-Zellen, die mit Kobaltchlorid behandelt wurden, und führten eine ICC-Analyse von HIF durch. Das HIF-1-Signal stieg innerhalb des HIF-Rings nicht an, was aufgrund des erhöhten Signals von HIF-1 außerhalb des Rings unklar wurde (Abbildung 6c). Der ICC von HK-2-Zellen mit Knockdown von PHD2, von dem angenommen wird, dass es die primäre HIF-Prolylhydroxylase in Zellkulturexperimenten ist (Strowitzki et al., 2019), lieferte ähnliche Ergebnisse (Abbildung S6). Diese Ergebnisse zeigten, dass die PHD-VHL-Achse des HIF-Abbaus nicht mit der HIF-Ringbildung in Zusammenhang stand.

3.6|Einfluss des pH-Werts auf die HIF-1-Akkumulation

Ein früherer Bericht beschrieb die Verwendung eines Deckglasmodells von Herzmuskelzellen, bei denen der pH-Wert im Deckglas abgefallen war (Pitts & Toombs, 2004). Wir untersuchten den pH-Wert unter einem Deckglas und seinen Einfluss auf die HIF-Ringbildung. Wir behandelten HK-2-Zellen mit einem intrazellulären pH-Indikator, dessen Fluoreszenzintensität die Bewertung des pH-Werts in den Zellen ermöglicht. Die Live-Bildgebung zeigte, dass der pH-Wert über den größten Teil des Innenbereichs abnahm, jedoch nicht in der Nähe des Randes des Deckglases, was auf das Vorhandensein eines pH-Gradienten um den Rand im Deckglasmodell hindeutet (Abbildung 6a). Die quantitative Analyse der Korrelation zwischen Fluoreszenzintensität und Abstand von einer Deckglaskante zeigte, dass erstere mit zunehmender Entfernung erhöht wurde, eine Beobachtung, die die Existenz von pH- und Sauerstoffgradienten um die Deckglaskante herum unterstützte (Abbildung 6b). Die Western-Blot-Analyse von Zelllysaten unter homogenen Sauerstoffkonzentrationen ergab, dass die Inkubation mit pH-5.0-Medium die HIF-1-Akkumulation unter hypoxischen Bedingungen unterdrückte (Abbildung S7a–d). Wir bestätigten auch, dass die HIF-1-Akkumulation unter Hypoxie unter verschiedenen pH-Bedingungen unter pH 6.0 abnahm (Abbildung S8a–c).

Ein Bericht betonte die Bedeutung leicht saurer Bedingungen bei einem pH-Wert von etwa 6.0. Gemäß dieser Studie säuerte die Reoxygenierung nach Hypoxie die Medien an, was eine nukleoläre Sequestrierung von VHL verursachte. Im Gegenzug wurde der HIF-Abbau in C2C12-Myotuben, PC12-Neuronen und 786-0-Nierenkrebszellen verhindert (Mekhail et al., 2004). In unserer Studie gab es in einem Deckglasmodell mit pH-Werten von 5,0 bis 7,4 keine Veränderung der VHL-Verteilung in tubulären Zellen zwischen den Regionen mit HIF-1-Akkumulation und denen, in denen es unterdrückt war (Abbildung S9a–c). Röhrenzellen sind einer Vielzahl von pH-Bedingungen ausgesetzt (Burke et al., 1999; Pavuluri et al., 2019; Raghunand et al., 2003), daher haben wir die Variation des HIF-Rings in Medien mit unterschiedlichen pH-Werten untersucht Werte zwischen 5,0 und 8,5. Der HIF-Ring wurde deutlich in Medien mit pH 8,5 und 7,4 beobachtet (Abbildung 6c). Der HIF-Ring existierte auch bei pH 6,5, war aber verdeckt (Abbildung 6c). Das HIF-1-Signal wurde im gesamten Bereich eines Deckglases bei pH 5,0 gedämpft. (Abbildung 6c). Wir führten eine weitere quantitative Analyse der Positionsbeziehung zwischen dem HIF-Ring und dem Rand des Pimonidazol-positiven Bereichs durch (Abbildung 7a) und entdeckten, dass die Position des Rings in Abhängigkeit vom pH-Wert variierte. Der innere Kreis tendierte dazu, sich bei pH 6,5 im Vergleich zu pH 7,4 nach außen auszudehnen, während der äußere Kreis bei pH 8,5 deutlich nach innen schrumpfte, basierend auf dem Rand des Pimonidazol-positiven Bereichs (Abbildung 7b,c). Wir bestätigten auch, dass die Aktivitäten der Haushaltsgene in einem Deckglasmodell unter saurer Inkubation erhalten blieben (Abbildung S10). Daher scheint der pH-Wert eine wichtige Rolle in dem Mechanismus zu spielen, der der HIF-Ringbildung zugrunde liegt.

4|DISKUSSION

In dieser Studie identifizierten wir eine einzigartige Verteilung von HIF-1 in renalen Tubuluszellen, indem wir ein Modell der Hypoperfusion verwendeten, die durch die Platzierung des Deckglases induziert wurde. Wir fanden heraus, dass die Bildung und Aufrechterhaltung des HIF-Rings durch den Sauerstoffdruck und den pH-Wert reguliert wurden, die beide in einem Gradienten in der Deckglaskante eines Deckglasmodells vorhanden waren. Basierend auf diesen Ergebnissen schlagen wir einen möglichen Mechanismus für die HIF-Ringbildung vor, bei dem sich HIF-1 mit abnehmender Sauerstoffspannung ansammelt und die Anreicherung aufgrund des niedrigen pH-Werts innerhalb einer bestimmten Entfernung von einer Deckglaskante unterdrückt wird (Abbildung 8 ).

Hypoperfusion wird durch Verdünnung der Mikrovaskulatur bei CKD induziert (Mimura & Nangaku, 2{{2{0}}}10; Nangaku, 2006). In unserer früheren Arbeit haben wir die In-vivo-Bildgebung verwendet, um das Vorhandensein eines Sauerstoffgradienten in renalen Tubuluszellen normaler Mausnieren zu demonstrieren (Hirakawa et al., 2018). Es wird auch erwartet, dass die Sauerstoffspannung in tubulären Zellen bei CKD heterogen ist. Es bleibt jedoch unklar, ob das Vorliegen einer Hypoperfusion mit einem Sauerstoffgradienten das Abwehrsystem gegen Hypoxie, HIF, beeinflusst. In dieser Studie untersuchten wir die HIF-Verteilung in kultivierten proximalen Tubuluszellen unter einem Hypoperfusionsmodell und entdeckten, dass der Sauerstoffgradient in kultivierten renalen Tubuluszellen erfolgreich unter Verwendung eines runden Deckglases modelliert wurde. Hinweise aus Experimenten mit homogener Sauerstoffspannung deuteten darauf hin, dass sich HIF-1 anreicherte, dessen Hydroxylierung und anschließender Abbau hauptsächlich sauerstoffabhängig sind. Das heißt, die Menge an HIF-1 nimmt zu, wenn die Sauerstoffspannung abnimmt. In unserem Deckglasmodell wurde HIF-1 jedoch im anoxischen Bereich unterdrückt und hatte die höchste Akkumulation in einem bestimmten Abstand von einer Deckglaskante. Diese ringförmige HIF-Anhäufung wurde noch nie zuvor gezeigt. Wir zeigten, dass die Bildung des HIF-Rings unabhängig von der Sauerstoffspannung der Inkubationsatmosphäre beobachtet werden konnte, aber ihre Position von der Sauerstoffspannung abhängig war. Der Bereich der Sauerstoffspannung am HIF-Ring wurde unter Verwendung von PLIM mit BTPDM1 bei etwa 4–20 mmHg gemessen. Die meisten früheren Studien, die sich auf kultivierte Zellen in einer Atmosphäre mit homogener Sauerstoffspannung konzentrierten, fanden heraus, dass die Menge an HIF-1-Protein im hypoxischen oder anoxischen Bereich zunahm (Ameri et al., 2002; Carrera et al. , 2014). Somit muss in unserem Modell die HIF-Ringbildung durch einen anderen Faktor als die Sauerstoffspannung beeinflusst worden sein; es war unabhängig von Ph.D., einem geschwindigkeitsbegrenzenden Prozess des HIF-Abbaus. Ein Durchbruch bei der Aufklärung des Mechanismus der HIF-Ringbildung war unsere Entdeckung der Rolle des pH-Gradienten sowie des Sauerstoffgradienten im Decklippenmodell, der den Zufluss des Mediums ähnlich einer in vivo-Hypoperfusion begrenzte Modell. In diesem Hypoperfusionsmodell nahm der intrazelluläre pH-Wert ab, wenn der Abstand vom Rand des Deckglases zunahm, und um den Rand des Deckglases herum wurde ein pH-Gradient beobachtet. Wir haben gezeigt, dass die HIF-1-Akkumulation bei niedrigem pH-Wert, etwa pH 5,0, unterdrückt wurde, verglichen mit einer Inkubation bei etwa neutralem pH-Wert unter homogener Sauerstoffspannung. Der äußere Rand des HIF-Rings expandierte bei pH 6,5 nach außen, und der innere Rand des HIF-Rings schrumpfte bei pH 8,5 nach innen, bezogen auf den Rand des Pimonidazol-positiven Bereichs. Der HIF-Ring wurde unter sauren Bedingungen verdeckt, und das HIF-1-Signal verschwand bei pH 5,0. So haben wir die Bedeutung des pH-Werts für die HIF-Ringbildung in einem Deckglasmodell aufgeklärt. Wir demonstrierten die Möglichkeit, dass der HIF-Ring durch die Unterdrückung der HIF-1-Akkumulation durch einen niedrigen pH-Wert innerhalb des Rings gebildet wurde.

Mehrere frühere Studien mit der Deckglasmethode haben Krebszellen verwendet. Laut einem Bericht unter Verwendung der menschlichen Hepatom-Zelllinie Hep3B, die die sauerstoffabhängige Rotverschiebung des grün fluoreszierenden Proteins (AcGFP1) ausdrückt, zeigte die Live-Bildgebung von Zellen, die mit einem rechteckigen Deckglas bedeckt waren, eine Rotverschiebung, wenn der Abstand von einer Deckglaskante zunahm (Takahashi & Sato, 2010). Das Emissionsspektrum von Hepatomzellen verschob sich von der Wellenlänge der Fluoreszenz des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) zu der von rot, wenn die Sauerstoffspannung abnahm. In einer anderen Studie wurde die Sauerstoffspannung von SCC-7-Zellen mit einem runden 15--mm-Deckglas unter Verwendung einer Phosphoreszenz-Lebensdauertechnik gemessen. Die Sauerstoffspannung betrug 6,9 mmHg und 166 mmHg, berechnet aus PL, die 3,89 µs und 893 µs betrug, 0–2 mm innerhalb bzw. 0–1 mm außerhalb der Kante des Deckglases (Yoshihara et al., 2015). Die Deckglasmethode wurde auch mit Herzmyozyten verwendet, einem System, das als vielversprechendes In-vivo-Ischämie-Reperfusionsmodell Aufmerksamkeit erregt hat. Kelly et al. zeigten, dass mit einem Deckglas bedeckte Myozyten im Laufe der Zeit deutliche morphologische Veränderungen durchmachten, begleitet von Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials und der Plasmamembrandynamik, was schließlich zum Tod der Myozyten führte. Sie zeigten auch, dass der intrazelluläre pH-Wert von mit einem Deckglas bedeckten Myozyten schnell auf etwa pH 4 in der Mitte eines Deckglases abfällt (Pitts & Toombs, 2004). Ein Deckglasmodell, das die Sauerstoff- oder Nährstoffdiffusion zu kultivierten Zellen unter einem Deckglas hemmt, kann ein In-vivo-Modell von ischämischen, normalen und marginalen Zonen in der Mitte, außerhalb bzw. am Rand eines Deckglases nachahmen. Mehrere Studien haben dieses Modell als Ischämie-Reperfusionsmodell von Myozyten in vitro verwendet (Chun et al., 2015; Pitts et al., 2008; Solhjoo & O'Rourke, 2015; Wang et al., 2012). Nach unserem besten Wissen ist unsere Studie die erste, die eine Deckglasmethode auf tubuläre Zellen anwendet. In unserem System betrug der Abstand von einer Deckglaskante zu einem Bereich, der 10 mmHg Sauerstoffspannung entspricht, wo Pimonidazol positiv werden sollte, 1,22 mm, und die Sauerstoffspannung nahm innerhalb einer Entfernung von 2 mm von der Deckglaskante auf so niedrig wie null ab . Dieses Ergebnis ist möglicherweise mit früheren Berichten kompatibel, bei denen ein Deckglas von etwa 15 mm verwendet wurde, was das Vorhandensein eines Sauerstoffgradienten mindestens innerhalb von 2 mm vom Rand zeigt (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Wir untersuchten die Apoptoserate von Zellen unter Deckgläsern (Abbildung S11) und entdeckten, dass GAPDH und Aktin sogar innerhalb des HIF-Rings erhalten blieben, was darauf hinweist, dass der HIF-Ring nicht nur durch Zellapoptose oder Tod innerhalb des HIF-Rings verursacht wurde.

Mehrere Studien haben die Sauerstoffspannung in den Nieren mit unterschiedlichen Methoden gemessen. Einige Beispiele für die Sauerstoffspannungsmessung normaler Nieren waren wie folgt: 50 mmHg und 30 mmHg in der Rinde und der Medulla unter Verwendung von Mikroelektroden; und 49 mmHg und 41 mmHg in den S1- und S2-Segmenten der tubulären Zellen des Cortex unter Verwendung von PLIM (Hirakawa et al., 2017, 2018; Zhang et al., 2014). Die Sauerstoffspannung erkrankter Nieren wäre geringer. Laut einem früheren Bericht, bei dem Sauerstoff-Mikroelektroden verwendet wurden, hatten diabetische Ratten eine niedrigere Sauerstoffspannung im Nierenparenchym: 36 mmHg und 11 mmHg in der Rinde bzw. im Medulla (Heyman et al., 2013; Palm et al., 2003). Da Sauerstoff-Mikroelektroden die durchschnittliche parenchymale Sauerstoffspannung messen, ist bei kranken Nieren ein größerer Bereich zu erwarten. In einem Modell einer ischämischen Niere, deren seitliche Nierenarterie und -vene abgeklemmt wurden, sank die intrazelluläre Sauerstoffspannung auf null mmHg (Hirakawa et al., 2015). In Anbetracht dieser Ergebnisse schien der Bereich der Sauerstoffspannung am HIF-Ring von etwa 4–20 mmHg in vivo plausibel zu sein.

Wir entdeckten ferner, dass der pH-Wert die HIF-Ringbildung sowie die Sauerstoffspannung beeinflusste. Da tubuläre Epithelzellen in der Niere ständig Harnflüssigkeit ausgesetzt sind, sollte der pH-Wert der tubulären Zellen durch den des Urins beeinflusst werden. In Anbetracht des breiten pH-Bereichs im Urin entschieden wir uns, Zellen zu untersuchen, die in einem pH-Bereich von 5,0–8,5 inkubiert wurden. Es wurden Studien über den pH-Bereich in normalen Nieren durchgeführt. Eine Studie ergab, dass der pH-Wert der Rinde 7,39 ± 0.{{10}}8 betrug und der der Medulla 7,20 ± {{20 }}}.09, gemessen mit Mikroelektroden (Burke et al., 1999). Eine andere Studie, die MRT-basierte pH-Bildgebung verwendete, zeigte pH-Werte von 7,3 ± 0,13 bzw. 7,0 ± 0,29 (Raghunand et al., 2003). Es wurde berichtet, dass der Nieren-pH-Wert in einem CNE-Mausmodell mit Azidose von 6,5 auf 6,32 und in einem schweren Fall auf bis zu 5,83 sank (Pavuluri et al., 2019). Diese Beobachtungen haben Hinweise auf einen Abfall des pH-Werts und Schwankungen bei CNE geliefert. Der Einfluss des pH-Werts auf HIF-1, der durch chronische Hypoxie bei CNE induziert wird, wurde jedoch nicht ausreichend untersucht. In der vorliegenden Studie wurde eine Verschiebung des HIF-Rings zwischen pH 6,5 und pH 7,4 beobachtet, einem pH-Bereich, der bei CKD plausibel ist. Dieses Ergebnis stützte die Hypothese, dass eine leichte Abnahme des pH-Werts die HIF-1-Akkumulation bei CNE beeinflusst. Basierend auf dem Nachweis eines pH-Abfalls unter 6,0 in schweren Fällen von CNE ist es auch notwendig, den physiologischen Zustand von HIF-1 bei niedrigerem pH-Wert zu beurteilen. Obwohl es Berichte gibt, dass eine saure Umgebung, selbst bei Normoxie, HIF-1 stabilisiert, untersuchten die meisten dieser Berichte Bedingungen mit milder Säure über pH 6,0 (Filatova et al., 2016; Mekhail et al., 2004). . In dieser Arbeit zeigten wir die Unterdrückung der HIF-1-Akkumulation in tubulären Zellen bei pH 5,0 und die Abschwächung von HIF-1-Signalen in einem Deckglasmodell, das bei pH 5,0 inkubiert wurde. Daher könnte eine Abnahme des renalen pH-Werts bei CKD in vivo mit einer unzureichenden HIF-Aktivierung sowie mit urämischen Toxinen in der hypoxischen Niere korrelieren, was das Fortschreiten der CKD verschlimmert (Tanaka et al., 2013).

Unsere Studie hat mehrere Einschränkungen. Erstens sollten die Kulturmedien im Bereich der Hypoperfusion zusätzlich zum Vorhandensein von Sauerstoffmangel und verringertem pH-Wert nährstoffarm sein. Es ist jedoch schwierig, die Wirkungen von pH, Sauerstoffspannung und anderen durch Hypoperfusion induzierten Faktoren zu beschreiben. Im Körper kommt es in Organen und Zellen zu Ischämie, einer pathologischen Minderdurchblutung des Blutes, die durch eine Kombination aus niedrigem Sauerstoff- und Nährstoffmangel verursacht wird. Es ist wichtig, die Unterschiede zwischen der Hypoxie-Erkennung und der Ischämie-Erkennung zu verstehen. Trotz der Schwierigkeit, die biologische Wirkung jedes Faktors aufzuklären, ist unser Hypoperfusionsmodell physiologisch plausibel und ahmt den pathologischen Zustand in vivo nach. Zweitens erfordert die Herstellung eines Deckglasmodells Geschick und Übung, da sich die meisten Zellen beim Entfernen eines Deckglases gelegentlich ablösten, insbesondere bei Verwendung der traditionellen Methode (Abbildung S2a). Dieses Problem hing von der verwendeten Zelllinie ab. Zum Beispiel war es für uns schwierig, ein Deckglasmodell auf HEK 293-Zellen aufzubringen, da ihre Haftung auf einem Deckglas relativ schwach war. Drittens war es wünschenswert, Schäden an kultivierten Zellen unter einem Deckglas zu minimieren. Die Anzahl geschädigter Zellen nahm mit zunehmender Bedeckungsdauer zu, wie die Analyse der Apoptose zeigt. Wir stellten fest, dass 3 h für die Schätzung des HIF-Rings geeignet waren, wenn er statisch zu sein schien und nur etwa 10 Prozent der Zellen apoptotisch wurden (Abbildung S11). Die vierte Einschränkung war die Schwierigkeit, kultivierte Zellen in jeder Probe einheitlich auf einem Deckglas zu befestigen (Abbildung S2b,c). Der Unterschied in der Befestigung zwischen einer traditionellen und einer alternativen Methode zur Herstellung eines Decklippenmodells könnte die Studie ebenfalls beeinflusst haben. Wir haben den Bereich der Sauerstoffspannung, der dem HIF-Ring entspricht, durch eine Phosphoreszenz-Lebensdauertechnik gemessen, bei der wir ein Deckglasmodell mit einer traditionellen Methode erstellt haben. Da der HIF-Ring während der Immunzytochemie mit einer alternativen Methode sichtbar gemacht wurde, kann die wahre Sauerstoffspannung anders sein. Wir minimierten diese Fehler, indem wir den Nachweis nutzten, dass Pimonidazol bei 10 mmHg oder weniger Sauerstoffspannung positiv war. Die fünfte Einschränkung besteht darin, dass der intrazelluläre pH-Wert nicht notwendigerweise derselbe wie der pH-Wert des Kulturmediums ist. Mehrere frühere Berichte haben gezeigt, dass der intrazelluläre pH-Wert in kultivierten Zellen bis zu einem gewissen Grad mit dem mittleren pH-Wert übereinstimmt (Michl et al., 2019), wir konnten nur den Trend des intrazellulären pH-Werts durch Änderung des mittleren pH-Werts beurteilen. In vivo ist die Beziehung zwischen dem pH-Wert von intrazellulären und extrazellulären Bereichen, wie Urin oder Körperflüssigkeit, komplizierter als in kultivierten Zellen. Daher werden weitere Studien darüber, wie die pH-Verschiebung die Akkumulation von HIF-1-Protein in vivo reguliert, für die Zukunft notwendig sein.

Cistanche-Vorteil: verbessern NiereFunktion

Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass der pH-Wert einen Einfluss auf den Hypoxiemarker Pimonidazol haben sollte. Wir haben den Abstand der Kante des Pimonidazol-positiven Bereichs von der Mitte eines Deckglases unter verschiedenen pH-Bedingungen in unserem Deckglasmodell verglichen. Der Rand des Pimonidazol-positiven Bereichs war zwischen pH 6,5, 7,4 und 8,5 vergleichbar (Abbildung S12a,b). Eine frühere Studie zeigte auch die Beibehaltung der Pimonidazol-Bindung bei unterschiedlichen pH-Werten (Kleiter et al., 2006). Basierend auf diesen Beweisen schlossen wir, dass Pimonidazol ein geeigneter Hypoxie-Marker für unsere Deckglas-Experimente ist. Die letzte Einschränkung besteht darin, dass bei einem Sauerstoffspannungsbereich zwischen etwa 4 mmHg und 20 mmHg (0,52 % O2 bis 2,6 % O2) des HIF-Rings Pt(II)- und Pd(II)-Porphyrine, die als Biologika weit verbreitet sind, verwendet werden B. Sauerstoffsonden, haben Vorteile bei der Messung sehr niedriger Sauerstoffkonzentrationen aufgrund ihrer deutlich längeren Phosphoreszenzlebensdauer im Vergleich zu denen, die Ir(III)-Komplexe verwenden (Yoshihara et al., 2017). Im Allgemeinen ist jedoch eine quantitative Sauerstoffmessung basierend auf Phosphoreszenz, berechnet mit der Stern-Volmer-Gleichung, bei niedrigen O2-Bereichen leistungsstärker (Papkovsky & Zhdanov, 2016). Mehrere frühere Studien haben die Ir(III)-Komplex-basierte Messung von Sauerstoffspannungen von nur etwa 10 mmHg gezeigt (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Daher glauben wir, dass der Bereich der Sauerstoffspannung des HIF-Rings ein präzises Ergebnis sein sollte.

5|SCHLUSSFOLGERUNGEN

Zusammenfassend stellten wir fest, dass das Verständnis der Rolle von Sauerstoff und pH-Wert für das Verständnis des physiologischen Zustands von HIF-1 bei CKD unerlässlich ist und durch die Untersuchung tubulärer Zellen mit Hypoperfusion gewonnen werden kann. Das Deckglasmodell mit seinen Einschränkungen des Medieneinflusses war ein gutes Modell für Hypoperfusion in vivo, insbesondere in den Tubuli bei CNE, da die Verdünnung der peritubulären Kapillaren ein Hauptmerkmal von CNE ist (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Dieses Hypoperfusionsmodell kann auch die Sauerstoff- und pH-Gradienten in vivo nachahmen, wie z. B. Tumore und ischämische Läsionen. Das Modell bietet einen vielversprechenden Ansatz zur Aufklärung dieser biologischen Mechanismen.

INTERESSENKONFLIKT

Alle Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

AUTORENBEITRÄGE

Alle Autoren haben zur Bildung des Gesamtkonzepts beigetragen. TH führte die gesamten Experimente durch. TH und YH analysierten die Ergebnisse und erstellten die Zahlen. TH schrieb das Originalmanuskript. KM, TY und ST führten das Experiment unter Verwendung einer Phosphoreszenz-Lebensdauertechnik durch und redigierten den Teil des Manuskripts. YH, TT und MN bearbeiteten das gesamte Manuskript. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

HINWEIS

Akiyama, H., Takahashi, I., Shimoda, Y., Mukai, R., Yoshihara, T., & Tobita, S. (2018). Ir(iii)-Komplex-basierte Sauerstoffbildgebung von lebenden Zellen und Augenhintergrund mit einer gegateten ICCD-Kamera. Photochemische und photobiologische Wissenschaften, 17(6), 846–853.

Akizawa, T., Nangaku, M., Yamaguchi, T., Arai, M., Koretomo, R., Maeda, K., Miyazawa, Y., & Hirakata, H. (2019). Enarodustat, Konversions- und Erhaltungstherapie für Anämie bei Hämodialysepatienten: Eine randomisierte, placebokontrollierte Phase-2b-Studie, gefolgt von einer Langzeitstudie. Nephron, 143(2), 77–85.

Ameri, K., Burke, B., Lewis, CE, & Harris, AL (2002). Regulierung eines Ratten-VL30-Elements in menschlichen Brustkrebszellen bei Hypoxie und Anoxie: Rolle von HIF-1. British Journal of Cancer, 87(10), 1173–1181.

Asai, H., Hirata, J., Hirano, A., Hirai, K., Seki, S., & Watanabe-Akanuma, M. (2016). Die Aktivierung des Arylkohlenwasserstoffrezeptors vermittelt die Unterdrückung der Hypoxie-induzierbaren Faktor-abhängigen Erythropoietin-Expression durch Indoxylsulfat. Amerikanisches Journal für Physiologie. Zellphysiologie, 310 (2), C142–C150.

Burke, TJ, Malhotra, D., & Shapiro, JI (1999). Faktoren, die einen pH-Gradienten in der Niere aufrechterhalten: Rolle der Gefäßarchitektur. Kidney International, 56(5), 1826–1837.

Carrera, S., Senra, J., Acosta, MI, Althubiti, M., Hammond, EM, de Verdier, PJ, & Macip, S. (2014). Die Rolle des HIF-1alpha-Transkriptionsfaktors bei erhöhter Zellteilung bei physiologischen Sauerstoffspannungen. PLoS One, 9(5), e97938.

Chen, N., Hao, C., Peng, X., Lin, H., Yin, A., Hao, L., Tao, Y., Liang, X., Liu, Z., Xing, C., Chen, J., Luo, L., Zuo, L., Liao, Y., Liu, BC, Leong, R., Wang, C., Liu, C., Neff, T., … Yu, KHP (2019 ).

Roxadustat zur Behandlung von Anämie bei Patienten mit Nierenerkrankungen, die keine Dialyse erhalten. New England Journal of Medicine, 381(11), 1001–1010.

Chen, N., Qian, J., Chen, J., Yu, X., Mei, C., Hao, C., Jiang, G., Lin, H., Zhang, X., Zuo, L., He, Q., Fu, P., Li, X., Ni, D., Hemmerich, S., Liu, C., Szczech, L., Besarab, A., Neff, TB, … Valone, F.

H. (2017). Phase-2-Studien zum oralen Hypoxie-induzierbaren Faktor Prolylhydroxylase-Inhibitor FG-4592 zur Behandlung von Anämie in China. Nephrologie, Dialyse, Transplantation, 32(8), 1373–1386.

Chiang, CK, Tanaka, T., Inagi, R., Fujita, T., & Nangaku, M. (2011). Indoxylsulfat, ein repräsentatives urämisches Toxin, unterdrückt die Erythropoietin-Produktion auf HIF-abhängige Weise. Laboruntersuchung, 91 (11), 1564–1571.

Chun, WJ, Nah, DY, Bae, JH, Chung, JW, Lee, H., & Moon, IS (2015). Glucose-Insulin-Kalium-Lösung schützt ventrikuläre Myozyten von neugeborenen Ratten in einem In-vitro-Deckglas-Ischämie/Reperfusionsmodell. Korean Circulation Journal, 45(3), 234–241.

Coyne, DW, Goldsmith, D., & Macdougall, IC (2017). Neue Optionen für die Anämie bei chronischer Nierenerkrankung. Kidney International Supplement, 7(3), 157–163. Kuss.2017.09.002

Deng, A., Arndt, MA, Satriano, J., Singh, P., Rieg, T., Thomson, S. et al. (2010). Nierenschutz bei chronischer Nierenerkrankung: Hypoxie-induzierbare Faktoraktivierung vs. Angiotensin-II-Blockade. Amerikanisches Journal für Physiologie. Nierenphysiologie, 299(6), F1365–F1373.

Filatova, A., Seidel, S., Bogurcu, N., Graf, S., Garvalov, BK, & Acker, T. (2016). Die Azidose wirkt durch HSP90 auf Ph.D./VHL-unabhängige Weise, um die HIF-Funktion und den Stammzellerhalt bei Gliomen zu fördern. Krebsforschung, 76(19), 5845–5856. KANN-15-2630

Goldfarb, M., Rosenberger, C., Abassi, Z., Shina, A., Zilbersat, F., Eckardt, KU, Rosen, S., & Heyman, SN (2006). Akut-auf-chronisches Nierenversagen bei der Ratte: funktionelle Kompensation und Hypoxietoleranz. American Journal of Nephrology, 26(1), 22–33.

Heyman, SN, Rosenberger, C., Rosen, S., & Khamaisi, M. (2013). Warum ist Diabetes mellitus ein Risikofaktor für eine kontrastmittelinduzierte Nephropathie? BioMed Research International, 2013, 123589.

Hirakawa, Y., Mizukami, K., Yoshihara, T., Takahashi, I., Khulan, P., Honda, T., Mimura, I., Tanaka, T., Tobita, S., & Nangaku, M. (2018). Die intravitale Phosphoreszenzlebensdauer-Bildgebung der Nierenrinde misst genau die renale Hypoxie. Kidney International, 93(6), 1483–1489.

Hirakawa, Y., Tanaka, T., & Nangaku, M. (2017). Nierenhypoxie bei CKD; Pathophysiologie und Nachweisverfahren. Grenzen in der Physiologie, 8, 99.