Ein auf die Niere gerichtetes Nanopartikel zur Erhöhung der renalen Lymphdichte senkt den Blutdruck bei hypertensiven Mäusen

1. Einleitung

Die Identifizierung von Lebensmittelinhaltsstoffen mit immunmodulatorischen Eigenschaften zusammen mit ihren jeweiligen molekularen Zielen hat in den letzten Jahren zunehmendes Interesse geweckt. Aufgrund ihrer hohen Ligandenvielfalt stellt die transiente Rezeptorpotential-Superfamilie der Ionenkanäle (TRP-Kanäle) eine sehr interessante Klasse potenzieller Zielstrukturen dar.

Die TRP-Kanal-Superfamilie der Säugetiere umfasst sechs verwandte Proteinfamilien, nämlich die Ankyrin- (TRPA), die kanonische (TRPC), die Melastatin- (TRPM), die Mucolipin- (TRPML), die Polycystin- (TRPP) und die Vanilloid- (TRPV) Familie die sich typischerweise sechs Transmembransegmente teilen, die sich als Tetramere zusammensetzen, um kationendurchlässige Poren mit unterschiedlicher Kationenselektivität zu bilden.[1]Der TRPV1-Kanal ist möglicherweise bei weitem das am intensivsten untersuchte Mitglied der TRP-Superfamilie. TRPV1 wurde ursprünglich als Rezeptor für Capsaicin, den scharfen Bestandteil von Chilischoten, identifiziert.[2] Später wurde auch gezeigt, dass die scharfen Inhaltsstoffe des Ingwers, die Gingerole, TRPV1 aktivieren.[3]

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Die biologische Rolle von TRPV1 in nicht-neuronalen Zelltypen wird noch umfassend untersucht, doch die verfügbaren Ergebnisse deuten auf Funktionen hin, die weit über die sensorische und thermische Wahrnehmung hinausgehen. Beispielsweise könnte eine 12-wöchige Intervention mit einer täglichen Dosis von 0 0,15 mg des TRPV1-Agonisten Nonivamid, ein strukturelles Capsaicin-Analogon, verhinderten eine ernährungsbedingte Zunahme der Körperfettmasse und erhöhten den Plasma-Serotoninspiegel bei gesunden übergewichtigen Probanden.[4]

In 3T3-L1-Adipozyten verringerte die Aktivierung von TRPV1 durch Nonivamid die Lipidansammlung während der Differenzierung und Reifung durch Unterdrückung der PPAR𝛾-Expression.[5] In Makrophagen schwächten Capsaicin und Nonivamid eine LPS-induzierte Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen wie IL6, CXCL8 und TNF-alpha in TRPV1-abhängiger Weise ab.[6] Die besonderen Funktionen von TRPV1 in menschlichen Blutleukozyten bleiben jedoch unklar. In menschlichen NK-Zellen induzierten 10 und 50 μM Capsaicin einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentrationen, was auf einen funktionellen TRPV1-Kanal hinweist.[7]

Allerdings waren gedämpfte NK-Zell-Effektorfunktionen wie zytotoxische Degranulation und Zytokinsekretion, die durch eine einstündige Vorbehandlung der Zellen mit Capsaicin in einem Konzentrationsbereich von 10–100 μM induziert wurden, weitgehend TRPV1-unabhängig.[7] Es wurde dokumentiert, dass TRPV1 in T-Zellen an den Prozessen der T-Zell-Rezeptor-Signalübertragung, der T-Zell-Proliferation und -Differenzierung sowie der Zytokinproduktion beteiligt ist.[8] Frühere Arbeiten unserer Gruppe zeigten auch die funktionelle Expression von TRPV1 in menschlichen primären T-Zellen.[9] Darüber hinaus ergaben Dosis-Wirkungs-Analysen in Konzentrationen von 0,03 bis 300 μmol L−1, dass [6]-Gingerol die Zytokinsekretion durch primäre menschliche Leukozyten mit einem IC50-Wert von 82,2 μmol L−1 hemmt.

Allerdings ergab die Quantifizierung von [6]-Gingerol in Plasmaproben gesunder Probanden eine mittlere maximale Plasmakonzentration von nur 42,0 ±16,3 nmol L−1 nach der Einnahme von 1 L Ingwertee. Da diese [6]-Gingerol-Konzentrationen in früheren Studien keinen signifikanten Einfluss auf die Zytokinsekretion hatten,[9] ist unklar, ob nach dem Verzehr von 1 L Ingwertee eine ernährungsrelevante Konzentration von 50 nmol L−1 im Blutplasma erreicht wird ist ausreichend, um zelluläre Immunantworten in anderen menschlichen primären Leukozyten zu modulieren.

Für menschliche Neutrophile ist das Wissen über die funktionelle Rolle von TRPV1 begrenzt. Während Köse und Nazıroglu˘ [10] zeigten, dass Ca2+--Flüsse in Neutrophilen als Reaktion auf 10 μM Capsaicin durch den TRPV1-Antagonisten Capsazepin verringert werden, zeigten andere Ergebnisse nicht, dass Capsaicin einen Ca2+-Einstrom induziert, wenn es in einer bestimmten Konzentration getestet wird Bereich von 1–100 μM, trotz einer nachweisbaren TRPV1RNA-Expression.[11]

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im menschlichen Blut und machen 60–70 % aller zirkulierenden weißen Blutkörperchen aus. Sie sind die ersten Immunzellen, die an den Infektionsherden rekrutiert werden; Sie werden daher oft als erste Verteidigungslinie bezeichnet.[12] Die Rekrutierung von Neutrophilen wird unter anderem durch das bakterielle oder aus Mitochondrien stammende Peptid N-Formylmethionin-Leucyl-Phenylalanin (fMLF) oder Chemokine wie CXCL8 (IL-8) ​​ausgelöst.[13]

Zu den Abwehrmechanismen von Neutrophilen gehören Phagozytose,[14] die Freisetzung antimikrobieller Enzyme durch Degranulation,[15] die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)[16] und die Bildung von extrazellulären Neutrophilenfallen.[17]Neben diesen direkten Abwehrmechanismen gibt es auch Neutrophile tragen außerdem über die Freisetzung verschiedener Zytokine und Chemokine zu nachfolgenden Immunantworten bei.[18] Außerdem können Neutrophile einen Priming-Prozess durchlaufen, der es ihnen ermöglicht, stärker auf die anschließende vollständige Aktivierung zu reagieren.[16b]

In den letzten Jahren mehren sich die Hinweise darauf, dass Inhaltsstoffe aus Nahrungsmitteln und/oder Heilpflanzen eine oder mehrere der genannten Abwehrreaktionen menschlicher Neutrophilen verändern können. Zu diesen Modifikationen gehören eine erhöhte phagozytotische Aktivität[19] und ROS-Erzeugung,[20] eine verstärkte Chemotaxis gegenüber fMLF[21] und die Bildung extrazellulärer Neutrophilenfallen.[20] Die aktive(n) Verbindung(en) wurden jedoch nicht identifiziert. Bestandteile von Ferula akitschkensis (𝛽-Pinen, Sabinen, 𝛾-Terpinen, Geranylaceton, Andisobornylacetat) desensibilisierten Neutrophile gegenüber dem fMLF- und CXCL8-induzierten Ca2+-Einstrom und hemmten die durch fMLF induzierte Chemotaxis, wobei die Geranylaceton-induzierte Die Effekte wurden über TRPV1 vermittelt.[22]

Basierend auf den verfügbaren Daten stellten wir die Hypothese auf, dass die ligandeninduzierte Aktivierung von TRPV1 durch [6]-Gingerol die allgemeinen Funktionen von Neutrophilen beeinflussen kann, entweder direkt oder über die Verstärkung ihrer Reaktionen auf aktivierende Reize. Im Rahmen dieser Hypothese wollten wir insbesondere klären, ob eine nachgewiesene ernährungsphysiologisch relevante Konzentration ausreicht, um zelluläre Immunantworten in humanen primären Neutrophilen als Teil der Leukozytenpopulation zu modulieren. '

Darüber hinaus wollten wir die RNA-Expressionsniveaus aller Mitglieder der TRP-Superfamilie von Säugetieren in fünf der bekanntesten Zelltypen im menschlichen Blut vergleichen, um einen qualitativ und quantitativ umfassenden Überblick über die TRP-Kanalexpression in menschlichen Leukozyten zu erhalten.

2. Ergebnisse

2.1. Häufigkeit und relative Transkriptmengen von TRP-Kanälen in menschlichen Leukozyten

Um die TRP-Kanal-RNA-Expression in Blutleukozyten zu bewerten, wurden fünf der bekanntesten Leukozyten-Zelltypen aus dem Blut gesunder Spender isoliert und die RNA-Expression von TRP-Kanälen mittels quantitativer RT-PCR analysiert (Abbildung 1).

Spezifische Transkripte der TRPV- und TRPM-Familie wurden in allen analysierten Zelltypen mit einer hohen Häufigkeit von 75–100 % nachgewiesen. Die mittlere Gesamthäufigkeit unter Berücksichtigung aller Zelltypen betrug 96 % für die TRPV-Familie und 98 % für die TRPM-Familie. TRPC-spezifische Transkripte waren viel seltener und reichten von 0 % in Monozyten, NK-Zellen, T-Zellen und B-Zellen bis zu 100 % in NK-Zellen und T-Zellen mit einer durchschnittlichen Gesamthäufigkeit von nur 53 % (Abbildung 1A). Das TRPC5--spezifische Transkript wurde mit einer Häufigkeit von 70 % nur in Neutrophilen nachgewiesen.

Außerdem zeigte das TRPA1-spezifische Transkript im Allgemeinen eine eher geringe Häufigkeit in den analysierten Zelltypen mit einer Häufigkeit von 100 % bei Neutrophilen, 25 % bei Monozyten, 80 % bei NK-Zellen, 100 % bei T-Zellen und 60 % bei Bcells. Ebenso zeigte das TRPML3--spezifische Transkript eine geringe Häufigkeit bei Neutrophilen (50 %), Monozyten (25 %), NK-Zellen (40 %) und B-Zellen (20 %), aber eine Häufigkeit von 100 % bei T-Zellen. Das TRPV1--spezifische Transkript wurde in allen Zelltypen nachgewiesen und zeigte eine Häufigkeit von 100 % in Monozyten, NK-Zellen und T-Zellen sowie eine Häufigkeit von 90 % in Neutrophilen und 80 % in B-Zellen.

Bezüglich der relativen RNA-Expression zeigten die TRP-Kanäle im Vergleich zu den jeweiligen Häufigkeiten ein zelltypspezifischeres Expressionsmuster, wie aus dem Vergleich der jeweiligen Δct-Werte in den verschiedenen analysierten Zelltypen hervorgeht (Abbildung 1B). Beispielsweise wurde TRPP3 in allen Zelltypen mit einer Häufigkeit von 100 % nachgewiesen, zeigte jedoch eindeutig das höchste Expressionsniveau in Monozyten.

Im Gegensatz dazu wurde der TRPV2-Kanal in allen untersuchten Zelltypen mit einem vergleichsweise hohen RNA-Expressionsniveau sowie einer hohen Häufigkeit nachgewiesen. Ebenso waren die Transkriptniveaus von TRPV1 in allen untersuchten Zelltypen ähnlich (Abbildung 1B).

2.2. TRPV1-Oberflächenexpression auf Neutrophilen

Der aktuelle Kenntnisstand über die Funktion von TRPV1 in humanen Neutrophilen ist noch unklar. Um die Rolle von TRPV1 in menschlichen Neutrophilen weiter zu untersuchen, untersuchten wir als Nächstes mithilfe der Lebendzell-Durchflusszytometrie, ob der TRPV1-Kanal auf der Oberfläche primärer menschlicher Neutrophilen exprimiert wird (Abbildung 2).

Die isolierten Neutrophilen wurden auf CD15 als Oberflächenmarker für Neutrophile gefärbt (Abbildung 2A,B) und gleichzeitig entweder mit einem Antikörper gegen ein Epitop in der ersten extrazellulären Schleife des TRPV1-Proteins (Abbildung 2B) oder mit der entsprechenden Isotypkontrolle gefärbt, wobei letztere als Kontrolle diente ein Ersatz für die Messung unspezifischer Bindung (Abbildung 2A). Innerhalb der CD15+-Population wurde die Fluoreszenzintensität für FITC analysiert. Die Färbung der Neutrophilen mit dem TRPV1-Antikörper führte zu einem deutlich unterscheidbaren Fluoreszenzsignal im Vergleich zur Isotypkontrolle und bestätigte damit die Oberflächenexpression von TRPV1 in primären menschlichen Neutrophilen (Abbildung 2C). Die Analyse von Neutrophilen von vier einzelnen Spendern ergab eine vergleichbare Oberflächenexpression von TRPV1 (Abbildung 2D).

2.3. [6]-Gingerol-induzierter Anstieg des intrazellulären Ca2+

Da die ligandeninduzierte Aktivierung von TRPV1 zu einem Einstrom von Ca2+ führt,[23] wurden intrazelluläre Ca2+-Konzentrationen von Neutrophilen über den Ca2+-empfindlichen Farbstoff Fura-2 bestimmt. Basierend auf unseren bisherigen Erkenntnissen[9] wurden eine Konzentration von 50 nM des bekannten TRPV1-Liganden [6]-Gingerol und eine Inkubationszeit von 2 Stunden gewählt. Die Analysen zeigten, dass die Inkubation von Neutrophilen mit 50 nM [6]-Gingerol zu erhöhten intrazellulären Ca2+-Konzentrationen führte, die im Durchschnitt 18,4 % ± 1,0 % des Maximalwerts betrugen, bestimmt durch Anwendung von 1 μM Ionophorionomycin. Der durch DMSO induzierte Anstieg lag bei 4,7 % ± 1,2 % (Abbildung 3).

2.4. Einfluss von [6]-Gingerol auf die TRPV1-Expression

Als nächstes wollten wir den Einfluss der TRPV1-Stimulation durch [6]-Gingerol auf die TRPV1-Expression auf Transkriptebene über q-RTPCR sowie auf Oberflächenproteinebene über Lebendzellfärbung analysieren. Zu diesem Zweck wurden menschliche Neutrophile mit 50 nM [6]-Gingerol für 2 Stunden inkubiert und die jeweiligen Expressionsniveaus quantifiziert.

Diese zweistündige Inkubation hatte keinen Einfluss auf die TRPV1-Transkript- oder Proteinspiegel (Abbildung 4) und veränderte auch nicht die RNA-Expression der untersuchten gemeinsamen Zytokin- und Chemokin-Gene, mit Ausnahme von IL6, IL17A, IL24, C5 und GDF5 (Abbildung S1, Tabelle S2). ,Zusätzliche Informationen).

2.5. Einfluss von [6]-Gingerol auf die Expression neutrophiler Oberflächenmarker

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