Eine neuartige homozygote KLHL3-Mutation als Ursache für den spät im Leben diagnostizierten autosomal-rezessiven Pseudohypoaldosteronismus Typ II
Nov 02, 2023
Abstrakte Einführung:
Pseudohypoaldosteronismus Typ II (PHA II) ist eine Mendelsche Erkrankung mit hyperkaliämischer Azidose und niedrigen Plasma-Reninspiegeln, die typischerweise mit Bluthochdruck einhergehen. Mutationen in WNK1, WNK4, CUL3 und KLHL3 verursachen PHA II, mit dominanten Mutationen in WNK1, WNK4 und CUL3 und entweder dominanten oder rezessiven Mutationen in KLHL3. Vierzehn Familien mit rezessiven KLHL3-Mutationen wurden gemeldet, wobei die Diagnose im Alter von 3 Monaten bis 56 Jahren erfolgte, typischerweise bei Personen mit normaler Nierenfunktion.
Methoden: Wir führten klinische und genetische Untersuchungen an einem Patienten mit hyperkaliämischer Hypertonie durch und verwendeten Molekulardynamiksimulationen, heterologe Expression in COS7-Zellen und Western Blot, um die Wirkung einer KLHL3-Kandidatenmutation auf die WNK4-Proteinexpression zu untersuchen.
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Ergebnisse: Die Patientin, eine 58-jährige Frau aus einer blutsverwandten Familie, zeigte Bluthochdruck, anhaltende hyperkaliämische Azidose in Verbindung mit starken Muskelschmerzen, Nephrolithiasis, chronische Nierenerkrankung (CKD) und koronare Herzkrankheit. Die Therapie mit Hydrochlorothiazid korrigierte Hyperkaliämie, Bluthochdruck und Muskelschmerzen. Die genetische Analyse ergab eine homozygote p.Arg431Trp-Mutation an einer hochkonservierten KLHL3-Position. Simulationen deuteten auf eine verringerte Stabilität des mutierten Proteins hin, was durch Western Blot bestätigt wurde. Verglichen mit Wildtyp-KLHL3 führte die Cotransfektion von p.Arg- 431Trp KLHL3 zu erhöhten WNK4-Proteinspiegeln, was vermutlich zu einer erhöhten NaCl-Reabsorption über den Thiazid-sensitiven Träger und PHA II führte.
Schlussfolgerungen: Selbst bei Patienten, die sich spät im Leben vorstellen und an einer chronischen Nierenerkrankung leiden, sollte PHA II vermutet werden, wenn der Reninspiegel niedrig ist und eine hyperkaliämische Azidose und Hypertonie für das Stadium einer chronischen Nierenerkrankung nicht ausreichen, insbesondere bei Vorliegen einer verdächtigen Familienanamnese.
Einführung
Systemische arterielle Hypertonie betrifft weltweit über 1,1 Milliarden Erwachsene [1] und gilt als der wichtigste modifizierbare Risikofaktor für Morbidität und Mortalität aller Ursachen weltweit [2]. Ungefähr 90 % der erwachsenen Patienten leiden an einer sogenannten primären oder essentiellen Hypertonie mit multifaktorieller Gen-Umwelt-Ätiologie [2], während bei den übrigen Patienten eine zugrunde liegende Ursache für die Hypertonie identifiziert werden kann. Häufige Ursachen für sekundären Bluthochdruck sind primärer Aldosteronismus, obstruktive Schlafapnoe, parenchymale Nierenerkrankung und Nierenarterienstenose [3]. In seltenen Fällen wird Bluthochdruck als monogenes Merkmal vererbt. Betroffene Patienten weisen typischerweise niedrige Plasma-Reninspiegel auf, wohingegen Aldosteron- und Elektrolytspiegel je nach zugrunde liegender Ätiologie variieren [4]. Mendelsche Formen der Hypertonie manifestieren sich häufig im Kindes- und Jugendalter. Erwachsene werden selten auf monogene Hypertonie untersucht; Daher ist seine Prävalenz in der Allgemeinbevölkerung weiterhin unbekannt. In einer ausgewählten Kohorte (Einschlusskriterien mindestens eines der folgenden Kriterien: Erkrankungsalter kleiner oder gleich 35 Jahre, resistenter Bluthochdruck, Bluthochdruck mit Elektrolytanomalien, hormonelle Anomalien, abnormale Bildgebungsergebnisse oder darauf hinweisende klinische Anzeichen) wurden 37 Kandidatengene gescreent. und pathogene oder wahrscheinlich pathogene Varianten wurden in 33 von 1.179 Fällen (2,8 %) identifiziert [5].
Diese Studie konzentriert sich auf Pseudohypoaldosteronismus Typ II (PHA II), eine Form der Mendelschen Hypertonie, die durch hyperkaliämische Azidose und niedrige Plasma-Reninspiegel gekennzeichnet ist [6]. PHA II wird auch als familiäre hyperkaliämische Hypertonie bezeichnet. Es wurde erstmals 1964 von Paver und Pauline bei einem jungen Mann mit schwerer Hypertonie und Hyperkaliämie trotz ansonsten normaler Nierenfunktion beschrieben [7], der von Stokes und Kollegen [8] sowie Arnold und Healy [9] weiter charakterisiert wurde und eine niedrige Nierenfunktion aufwies Plasma-Renin. Nach dem Bericht eines {{5}jährigen Mädchens mit Kleinwuchs, Bluthochdruck, schwerer Hyperkaliämie, leichter Azidämie, periodischer Lähmung und unterdrücktem Renin im Jahr 1970 von Gordon et al. [10] wird das Syndrom gelegentlich auch als Gordon-Syndrom bezeichnet.
Im Jahr 2001 wurden Mutationen in den With-no-Lysine (WNK)-Serin-Threonin-Kinase-Genen WNK1 und WNK4 als Ursachen für PHA II identifiziert [11] sowie weitere Mutationen in KLHL3 (kodierend für Kelch-like 3) und CUL3 (kodierend). cullin 3)-Gene wurden 2012 beschrieben [12, 13]. PHA-II-Unterformen, die durch Mutationen in WNK1, WNK4 und CUL3 verursacht werden, sind autosomal-dominante Erkrankungen, wohingegen KLHL3-Mutationen entweder autosomal-dominant oder autosomal-rezessiv vererbt werden können [12]. KLHL3 verfügt über eine N-terminale BTB-Domäne, gefolgt von einer BACK-Domäne und einer C-terminalen sechsflügeligen Propellerstruktur, die aus sogenannten Kelch-ähnlichen Wiederholungen besteht (dargestellt in Abb. 1d, 2a). Dominante KLHL3-Mutationen häufen sich in oder zwischen Propellerblättern, wohingegen rezessive Mutationen über das gesamte Protein verteilt sind [12]. Rezessive Fälle sind seltener als dominante Fälle; Insgesamt wurden 21 Patienten aus 14 Familien mit rezessiven KLHL3-Mutationen veröffentlicht [12–15] (Tabelle 1).
Die zugrunde liegende Pathophysiologie der Hypertonie bei PHA II ist eine erhöhte NaCl-Reabsorption über den Thiazid-empfindlichen Träger (Na-Cl-Cotransporter, NCCT) im distalen gewundenen Tubulus der Niere, und eine Therapie mit Thiaziden korrigiert sowohl Hypertonie als auch Elektrolytanomalien bei Patienten mit PHA II [16]. Kurz gesagt, WNK1 und WNK4 phosphorylieren OSR1 (auf oxidativen Stress reagierendes Gen 1) und SPAK (Ste20-verwandte Prolin-Alanin-reiche Kinase), die dann NCCT phosphorylieren und aktivieren [17, 18]. KLHL3 ist ein Substratadapter der Ubiquitin-Ligase CUL3; Der KLHL3-CUL3-Komplex ubiquitinyliert WNK-Kinasen und fördert so deren Abbau [19]. Der Verlust der Ubiquitin-Ligase-Funktion oder eine beeinträchtigte Bindung an WNK-Kinasen führt zu einer erhöhten WNK-Häufigkeit, einer erhöhten NCCT-Phosphorylierung [18] und einer erhöhten NaCl-Absorption im distalen gewundenen Tubulus. In späteren Abschnitten des Nephrons sind die NaCl-Reabsorption über ENaC (epithelialer Natriumkanal) und die K+-Sekretion über ROMK (renaler äußerer medullärer Kaliumkanal) reduziert [20, 21]. KLHL3-Knockout-Mäuse zeigen eine Hypoplasie des distalen gewundenen Tubulus, stark erhöhte Werte von WNK1 und WNK4 sowie eine erhöhte OSR1-, SPAK- und NCC-Phosphorylierung in der Niere. Darüber hinaus weisen sie Hyperkaliämie, Hyperchlorämie und metabolische Azidose auf [22]. Hier berichten wir über einen Patienten mit autosomal-rezessivem PHA II und charakterisieren die zugrunde liegende genetische Mutation und Pathophysiologie
Materialen und Methoden
DNA-Vorbereitung und Sanger-Sequenzierung DNA wurde aus einer periphervenösen Blutprobe mit dem QIAamp DNA Blood Maxi Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Standard-PCR und direkte bidirektionale Sanger-Sequenzierung genomischer DNA wurden unter Verwendung veröffentlichter Primer für KLHL3 [13], WNK1 und WNK4 [11] sowie des CUL3_9F (5′-AGGAGACACTTTCTCAAACCG-3′) durchgeführt. und CUL3_9R (5′-TGTTCTTCTCCAAAACAATCTACC-3′) Primer für CUL3. Die Sanger-Sequenzierung wurde bei Eurofins Genomics durchgeführt.
Sequenzausrichtung
Homologe Proteinsequenzen wurden mithilfe von NCBI Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) und der eggNOG-Datenbank (http://eggnogdb.embl.de) identifiziert. Zu den gezeigten Sequenzen gehören menschliches KLHL3 und seine Orthologen: Homo sapiens (NP_059111.2), Mus musculus (NP_001349344.2), Gallus gallus (XP_015149442.1), Danio rerio (XP_021328460.1), Ciona intestinalis (XP_009862126.1), Drosophila melanogaster (NP_724095.1) und Caenorhabditis elegans (NP_001254310.1) . Menschliche Paralogs wurden durch Literaturrecherche identifiziert und umfassen KLHL1 bis KLHL42, wie in der Online-Ergänzungstabelle 1 gezeigt (alle Online-Ergänzungsmaterialien finden Sie unter www.karger.com/doi/10.1159/000521626) [23]. Die Sequenzen wurden mit Jalview Version 2.10.5 abgeglichen [24]. Die Domänenstruktur stammt von UniProt (Q9UH77, abgerufen am 13. April 2021) und wurde mit DOG [25] visualisiert.
Plasmide und ortsgerichtete Mutagenese
Die Plasmide pTRE2hyg WNK4 und pFN21A KLHL3 waren freundliche Geschenke von Dr. Shinichi Uchida (Tokyo Medical and Dental University). Um die p.R431W-Mutation einzuführen, wurden Primer mit Primer }F) und 5′- CCACACTGCTCCACCGCGTGTTCATC -3′ (KLHL3_R431W_1R). Mutierte Rückstände sind fett dargestellt. Die ortsspezifische Mutagenese wurde unter Verwendung des QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit mit einer PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die cDNA wurde bei Eurofins Genomics Sanger-sequenziert. Plasmide wurden mit dem QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit hergestellt.
Gewebekultur, vorübergehende Transfektion und Western Blot
COS7-Zellen wurden in DMEM + L-Glutamin, 1 0 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin (alle Gibco, Thermo Fisher) kultiviert. Für Transfektionen wurden Zellen auf 6-Well-Platten mit einer Dichte von 1,9 × 105 Zellen/Well ausgesät und auf eine Dichte von etwa 90 % gezüchtet. Die Zellen wurden mit 1 µg pTRE2hyg WNK4 und 2 µg pFN21A (leerer Vektor oder KLHL3-Wildtyp [WT]) oder KLHL3 R431W-cDNA unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Zur Transfektion wurden jeweils zwei unabhängige Klone verwendet. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen in kaltem PBS gewaschen und in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA und 1 % NP40, enthaltend einen vollständigen Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche, Merck), lysiert. Das Lysat wurde bei 20,000 g 30 Minuten lang bei 4 Grad zentrifugiert und der Überstand bei –20 Grad gelagert. Die Proteinkonzentrationen wurden in Duplikaten (Standard) oder Triplikaten (Proben) mit dem BCA-Assay (Pierce, Thermo Fisher) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Etwa 20 µg Gesamtprotein wurden durch SDSPAGE fraktioniert und auf eine PVDF-Membran übertragen (1,5 h, 100 V). Die Membranen waren in 2 % Trockenmilch in TBST blockiert. Der Western-Blot wurde mit polyklonalem Kaninchen-Anti-HaloTag (Promega #G9281, 1:500, 4 Grad über Nacht) durchgeführt, gefolgt von Waschen und Inkubation mit Esel-IgG-Anti-Kaninchen-IgG (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # {{46). }}, Dianova, 1:20, 000, 1 h bei Raumtemperatur), Waschen und verbesserte Chemilumineszenz-Detektion (Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent, GE Healthcare). Die Blots wurden mit ROTIFree Stripping Buffer 2.0 (Carl Roth) gestrippt, über Nacht bei 4 Grad in 2 % Trockenmilch in TBST blockiert und mit monoklonalem Maus-Anti-FLAG M2 (SigmaAldrich #F1804, Merck, 1:1,{{69}) inkubiert. }, 1,5 h bei Raumtemperatur), gefolgt von Esel-IgG-Anti-Maus-IgG (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # 715-035-151, dianova, 1:20,000, 1 h bei Raum Temperatur), ECL-Erkennung, Strippen und Blockieren wie oben. Die Blots wurden dann mit monoklonalem Maus-Anti-- --Actin (Sigma-Aldrich # A2228, Merck, 1:5.000, 1 Stunde bei Raumtemperatur) und Esel-IgG-Anti-Maus-IgG inkubiert, wiederum gefolgt von einem ECL-Nachweis. Die Banden wurden mit der Image Lab Software auf einem ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad) quantifiziert. Die Intensitäten der vom Anti-HaloTag-Antikörper bzw. vom Anti-FLAG-M2-Antikörper nachgewiesenen Banden wurden durch die entsprechenden Intensitäten der von den Anti-- --Actin-Antikörpern nachgewiesenen Banden dividiert. Um die Expressionsniveaus von KLHL3 zu bestimmen, wurden die Zellen wie oben beschrieben transfiziert, jedoch unter Verwendung von 0 µg, 0,5 µg, 1 µg, 2 µg, 4 µg und 8 µg pFN21A KLHL3 WT oder R431W. Gelelektrophorese und Blotting wurden wie oben durchgeführt. Für den Cycloheximid-Chase-Assay wurden Zellen wie oben ausgesät und wie oben transfiziert, jedoch mit 2 µg pFN21A KLHL3 WT oder 4 µg KLHL3 R431W. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden 100 µM Cycloheximid zugegeben und die Zellen wurden nach den angegebenen Zeitpunkten lysiert. Weitere Analyseschritte waren wie oben.
Abb. 2. MD-Simulationen der Kelch-Domänen WT und p.Arg431Trp (R431W) KLHL3. eine Draufsicht auf die Kelch-Domäne (PDBID: 4CH9), gefärbt durch -Propellerblätter (K1–K6). Die Mutationsstelle wird durch einen gelben Stern angezeigt, und der interessierende Bereich ist grau gefärbt (Reste 425–465), und das WNK4-Peptid (nicht in den Simulationen enthalten) ist transparent und grau gefärbt. b Unterschied in den MSFs der Kelch-Domäne, die auf dem Proteinrückgrat abgebildet sind. Die Mutationsstelle wird durch einen gelben Stern angezeigt. Die rote Farbe weist auf dynamischere (weniger stabile) Teile des Proteins hin. c RMSD des gesamten Proteins (oben), der Reste 425–465 (Mitte) und der WNK4--Bindungstasche (unten) aus der Kristallstruktur für drei unabhängige Simulationsreplikate (fette Linien, laufende Durchschnittswerte). d Violindiagramme der Hbonds (links) und des COM-Abstands (Mitte) zwischen K3 (Reste 425–441) und K4 (442–465) – Propellerblätter und Bindungstaschenelektrostatik (rechts). e Strukturelle Überlagerung der K3-K4-Schnittstelle aus dem letzten Frame (1,1 μs) jedes Replikats (WT, blau; R431W, grau) mit den experimentellen/anfänglichen Modellen (schwarz). Das Proteinrückgrat wird als Cartoon dargestellt, wobei der Rest 431 als Stäbchen dargestellt wird. MSF, mittlere quadratische Fluktuation.
Molekulardynamiksimulation
Das WT-Modell basierte auf der Röntgenkristallstruktur (PDBID: 4CH9) der menschlichen Kelch-Domäne im Komplex mit dem WNK4-Peptidfragment [26]. Fehlende Atome und Endkappen wurden mit dem Dienstprogramm psfgen in Visual Molecular Dynamics Version 1.9.3 hinzugefügt [27]. Das mutierte (R431W) KLHL3-Modell wurde mit Modeller Version 9.18 generiert (28). Der endgültige Restbereich für jedes System betrug 300–585. Die N- und C-Termini der WT- und R431W-Modelle wurden durch Acetylierung bzw. N-Methylamidierung neutralisiert. Gemäß der Analyse mit PROPKA Version 3.0 wurden jedem titrierbaren Rest Standardprotonierungszustände zugewiesen [29]. Das WNK4-Peptid wurde aufgrund der Dissoziation von KLHL3 nach anfänglichen Gleichgewichtssimulationen aus den Produktionssimulationen entfernt.
Alle Simulationen wurden mit dem GROMACS-Softwarepaket Version 2021 [30] durchgeführt. Für Proteinatome wurden CHARMM36m-Kraftfeldparameter verwendet [31]. Ionen wurden mit Standard-CHARMM-Parametern beschrieben und für Wasser wurde das TIP3P-Modell verwendet [32]. Für den anfänglichen Äquilibrierungsschritt wurde ein Integrationszeitschritt von 1 fs verwendet, für alle nachfolgenden Simulationen wurden 2 fs verwendet. Alle Bindungen, an denen Wasserstoff beteiligt ist, wurden mithilfe von LINCS eingeschränkt [33]. Nichtgebundene Van-der-Waals-Wechselwirkungen wurden unter Verwendung des Lennard-Jones-Potentials mit einem Cutoff-Radius von 1,2 nm berechnet; Kräfte wurden im Bereich von 1,2–1,0 nm sanft abgeschaltet. Die gesamte Elektrostatik wurde mit der Methode des geglätteten Partikelnetzes nach Ewald [34] mit einem Realraum-Grenzabstand von 1,2 nm berechnet. Nach einer ersten Simulation im isochorisch-isothermen Ensemble (NVT) wurden alle nachfolgenden Simulationen im isobarisch-isothermen Ensemble (NPT) bei einer Temperatur von 310,15 K unter Verwendung des Geschwindigkeitsreskalierungsthermostaten [35] mit einer Zeitkonstante von 0,5 ps durchgeführt. Der Thermostat wurde getrennt auf das Protein und das Lösungsmittel (dh Wasser und Ionen) angewendet; Dieselben Gruppen wurden für die Entfernung der Schwerpunktbewegung (COM) verwendet. Ein Druck von 1 bar wurde entweder mit einem Barostat von Berendsen [36] oder Parrinello-Rahman [37] auf isotrope Weise mit einer Zeitkonstante von 5 ps ausgeübt.
Die Modelle WT und R431W wurden in einer kubischen Box mit anfänglichen Abmessungen von 1,2 × 1,2 × 1,2 nm3 solvatisiert. Jedes System wurde mit 150 mM NaCl neutralisiert. Nach einer anfänglichen Minimierung der steilsten Abstiegsenergie wurde jedes System im NVT-Ensemble für 5 ns mit Positionsbeschränkungen für alle Proteinatome äquilibriert. Ein anschließender Äquilibrierungsschritt wurde im NPT-Ensemble für 5 ns mit den gleichen Einschränkungen wie im vorherigen Schritt durchgeführt. Für die abschließende 5-ns-Gleichgewichtssimulation wurden Positionsbeschränkungen von allen Seitenketten entfernt. Aus der Endphase der Äquilibrierung wurden drei Anfangsstrukturen für unabhängige Produktionssimulationen der WT- und R431W-Systeme generiert, wobei alle Positionsbeschränkungen entfernt wurden. Jede Produktionsreplikation wurde 1,1 µs lang simuliert; Die ersten 0,1 µs wurden aus der Analyse entfernt.
Um die strukturelle Stabilität im Verlauf der Simulationen zu beurteilen, wurden quadratische Mittelabweichungen (RMSDs) von der Kristallstruktur für die C-Atome des gesamten Proteins sowie für die K3-K4-Grenzfläche (Reste 425–465) und die berechnet WNK4--Bindungstasche (Reste 339, 355, 360, 386, 402, 407, 432, 449, 451, 481, 498, 528 und 577). Laufende Mittelwerte der RMSD-Spuren wurden berechnet und mit den Rohdaten überlagert.
Die Auswirkung der Mutation auf die Strukturstabilität wurde durch Berechnung der Differenz der mittleren quadratischen Fluktuationen der Protein-C-Atome, gemittelt über Frames und Replikate und Zuordnung zur WT-Proteinstruktur visualisiert. Alle Proteinvisualisierungen wurden mit ChimeraX erstellt [38]. Die Auswirkung der R431W-Mutation auf die Grenzfläche zwischen K3 (Reste 425–441) und K4 (Reste 442–465) wurde durch Wasserstoffbrückenanalyse (H-Brücke) und COM-Abstand zwischen den beiden Gruppen charakterisiert. H-Bindungen wurden an jedem Frame mit dem GROMACS-Tool gmx hbond mit Abstands- und Winkelgrenzen von 3,5 Å bzw. 30 Grad bewertet. Die COM-Abstände wurden in jedem Frame auf ähnliche Weise bewertet – die Verteilungen sowohl der Hbonds als auch der COM-Abstände wurden als Geigendiagramme visualisiert. Durchschnittswerte wurden über Flugbahnen und Replikate berechnet.
Die Elektrostatik der WNK4--Bindungstasche wurde mit g_elpot [39] berechnet. Der zeitliche Verlauf des elektrostatischen Potentials in der Bindungstasche wurde ausgewertet, indem ein kugelförmiges Volumen mit einem Radius von 8 Å definiert wurde, das im geometrischen Zentrum der Reste, aus denen die Bindungstasche besteht, zentriert war. Um die Varianz in der Elektrostatik zu bewerten, wurden Blockdurchschnitte von 50-ns berechnet. Die Verteilung des elektrostatischen Potentials innerhalb der Bindungstasche für die WT- und R431W-Mutante wurde als Violindiagramme visualisiert, wobei Durchschnittswerte über Blöcke und Trajektorien von 50-ns berechnet wurden.
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