Ein vielversprechendes ultrakleines unilamellares Trägersystem für eine verbesserte Hautabgabe von Mangostin als Anti-Age-Spot-Serum Teil 1

Abstrakt: Wenn es effektiv an den Wirkungsort gebracht werden kann, hat Mangostan aufgrund seiner Melanogenese-blockierenden Wirkung das Potenzial, neuartige Cosmeceuticals zu entwickeln. Ziel dieser Studie war die Entwicklung eines ultrakleinen unilamellären Trägersystems für Mangostan und die Bewertung seiner Wirksamkeit als Anti-Altersflecken-Serum beim Menschen in vivo. Die ultrakleinen unilamellaren Trägerbasen wurden mithilfe eines 25-faktoriellen Designs mit fünf Faktoren (natives Kokosnussöl, Sojalecithin, Tween 80 sowie Rührdauer und -geschwindigkeit) und zwei Stufen (niedrig und niedrig) optimiert hoch); Die Reaktion der Tröpfchengröße wurde mit Design Expert 12® analysiert. Die Anti-Flecken-Untersuchung wurde durchgeführt, indem digitale Bilder der menschlichen Haut nach topischer Anwendung eines mit Mangostan beladenen ultrakleinen unilamellären Trägers nachts über zwei aufeinanderfolgende Wochen hinweg aufgenommen wurden. Die Ergebnisse wurden mit Motic Live Imaging 3.0 und einem Standard-Rot-, Grün- und Blau-Score analysiert. Die optimierte Serumformel wurde mit einer Zusammensetzung aus 2,3 Prozent nativem Kokosnussöl, 1 Prozent Lecithin und 28,3 Prozent Tween 80 (Polysorbat 80) bei einer Rührgeschwindigkeit von 1500 Umdrehungen pro Minute für 15 Minuten bestätigt. Durch den Einbau von 3 Prozent Mangostin in die optimierte Grundformel wurden ultrakleine unilamellare Trägerkügelchen mit einer Größe von 16,5 nm, einem Zetapotential von −25,8 mV und einem Polydispersionsindex von 0,445 erzeugt. Die physikalische Charakterisierung eines mit Mangostan beladenen ultrakleinen unilamellaren Trägers umfasste eine Durchlässigkeit von 90,94 Prozent, einen pH-Wert von 6,5, eine Viskosität von 38 cP, ein spezifisches Gewicht von 1,042 g/ml und eine Einschlusseffizienz von 72,46 Prozent. Ein Transmissionselektronenmikroskop bestätigte kugelförmige Tröpfchen in Nanogröße im System. Die topische Anwendung eines mit Mangostan beladenen ultrakleinen unilamellaren Trägers über zwei aufeinanderfolgende Wochen in der Nacht zeigte eine Anti-Altersflecken-Aktivität, die sich in einer signifikanten Verringerung der Intensität und Fläche der Flecken bei menschlichen Freiwilligen zeigte (p < 0,05).

Glykosid von Cistanche kann auch die SOD-Aktivität im Herz- und Lebergewebe erhöhen und den Gehalt an Lipofuscin und MDA in jedem Gewebe erheblich reduzieren, wodurch verschiedene reaktive Sauerstoffradikale (OH-, H₂O₂ usw.) effektiv abgefangen und vor verursachten DNA-Schäden geschützt werden durch OH-Radikale. Cistanche-Phenylethanoidglykoside haben eine starke Fähigkeit, freie Radikale abzufangen, eine höhere Reduktionsfähigkeit als Vitamin C, verbessern die Aktivität von SOD in der Spermiensuspension, reduzieren den MDA-Gehalt und haben eine gewisse schützende Wirkung auf die Funktion der Spermienmembran. Cistanche-Polysaccharide können die durch D-Galaktose verursachte Aktivität von SOD und GSH-Px in Erythrozyten und Lungengewebe experimentell seneszierender Mäuse steigern, außerdem den Gehalt an MDA und Kollagen in Lunge und Plasma verringern und den Gehalt an Elastin erhöhen eine gute Abfangwirkung auf DPPH, verlängert die Zeit der Hypoxie bei seneszenten Mäusen, verbessert die Aktivität von SOD im Serum und verzögert die physiologische Degeneration der Lunge bei experimentell seneszenten Mäusen. Bei der zellulären morphologischen Degeneration haben Experimente gezeigt, dass Cistanche über eine gute antioxidative Fähigkeit verfügt und hat das Potenzial, ein Medikament zur Vorbeugung und Behandlung von Hautalterungskrankheiten zu sein. Gleichzeitig hat Echinacosid in Cistanche eine erhebliche Fähigkeit, freie DPPH-Radikale abzufangen, reaktive Sauerstoffspezies abzufangen und den durch freie Radikale verursachten Kollagenabbau zu verhindern. Außerdem hat es eine gute Reparaturwirkung auf Schäden durch freie Thymin-Radikalanionen.

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Schlüsselwörter: -Mangostan; Nanoträger; ultrakleiner unilamellarer Träger; Kosmezeutisches Serum; Nanoemulsion

1. Einleitung

Altersflecken (Leberflecken) sind die häufigste Form der Hauthyperpigmentierung [1]. Sie treten am häufigsten auf Haut auf, die über viele Jahre der Sonne ausgesetzt war, wie z. B. Handrücken, Fußrücken, Gesicht, Schultern und oberer Rücken, und sind oft ein unerwünschtes Zeichen der Hautalterung. Daher gibt es eine große Auswahl an Hautaufhellungsprodukten mit unterschiedlicher Wirksamkeit und Nebenwirkungen. Ein kontinuierlicher Fokus liegt auf der Entwicklung optimierter kosmezeutischer Produkte, die in kürzerer Zeit als herkömmliche Produkte eine hochkonzentrierte hautaufhellende Wirkung erzielen [2]. Ein weiterer Schwerpunkt liegt auf der Entwicklung naturbasierter Cosmeceuticals, da diese in der Öffentlichkeit häufig positiver wahrgenommen werden und somit Marketingvorteile bieten. Die Herausforderung bei der Entwicklung einer Formel auf Phytoverbindungsbasis besteht darin, den Wirkstoff effektiv durch die Barriereschicht des Stratum Corneum an seine Zielorte zu transportieren [3]. Nanokosmezeutika bieten das Potenzial für eine verbesserte Hautdurchdringung bei relativ einfachen Anwendungsverfahren und das Potenzial für eine gezielte Abgabe. Beispiele für Nano-Kosmezeutika auf Basis von Phytoverbindungen [4–7] sind Nanotopes™ für Vitamin E und D-Panthenol [8,9].

-mangostin (1,3,6,trihydroxy-7-methoxy-2,8-bis(3-methylbut-2-en-1-yl){{ 10}}H-Xanthan- 9-on hat das Potenzial, den Prozess der Melaninbildung (dunkle Flecken) zu hemmen [10]. Die Verbindung zeigte eine starke antimelanogene Aktivität gegen B16F1-Melanomzellen durch Unterdrückung der Aktivität der Tyrosinase Enzym, ein wichtiges Enzym bei der Melaninsynthese und Ausübung einer Depigmentierungswirkung auf normale menschliche epidermale Melanozyten (NHEMs) [11]. Daher kann -Mangostin als Bestandteil von Kosmetika oder Arzneimitteln zur Behandlung von Pickeln und Chloasma verwendet werden oder Melanose.

Als polyphenolische Verbindung ist Mangostan anfällig für Oxidation, was die Wirksamkeit beim Auftragen auf die Haut beeinträchtigen könnte. Ein wirksamer Formulierungsansatz muss daher sowohl die Hautdurchdringung als auch die Stabilität des Wirkstoffs verbessern. Mehrere Ansätze haben eine verbesserte Stabilität und Hautabgabe von Mangostan gezeigt [12], darunter Liposomen [13], Niosomen [14] und Proteasomen [15].

Unsere Studie konzentriert sich auf die ultrakleine unilamellare Trägermatrix (USUC): ein Nanoträgersystem, das auch als NanotopeTM bezeichnet wird. Dieses System zeichnet sich durch eine viel kleinere Tröpfchengröße (kleiner oder gleich 40 nm) im Vergleich zu anderen unilamellaren oder multilamellaren Liposomen (100–300 nm) aus [8]. Kleinere Tröpfchen werden durch ein festes Verhältnis einer Ölphase, eines Tensids, eines Cotensids und einer wässrigen Phase erzeugt; Verhältnisse werden aus einem Optimierungsverfahren erhalten. Bei der USUC ist eine dispergierte Phase von einer einzelnen Schicht aus Phosphatidylcholin (Tensid) umgeben, die durch ein Cotensid im Dispersionsmedium stabilisiert wird [16]. Eine kleinere Tröpfchengröße ist für ein tiefes Eindringen in das Stratum Corneum von Vorteil [8].

Wir beschreiben hier die Entwicklung eines USUC-Nanoträgersystems für Mangostan, die physikalische Charakterisierung und In-vivo-Tests an menschlichen Freiwilligen. Die Formeloptimierung erfolgte mithilfe eines 25-faktoriellen Designs [6,17] und war für die Bereitstellung eines USUC von guter Qualität mit optimaler Tröpfchengröße und Stabilität von wesentlicher Bedeutung.

2. Materialien und Methoden

2.1. Materialien

-Mangostin (Reinheit größer oder gleich 90 Prozent) wurde vom Institut Teknologi Bandung (Mark Herb, Bandung, Indonesien) gekauft. Weitere Bestandteile waren Sojalecithin (Lebensmittelqualität; Shankar Soya Products, Indore, Indien), natives Kokosnussöl (VCO; Wahana, Padang, Indonesien) und Tween 80 (Bratachem, Jakarta, Indonesien). Alle anderen Chemikalien waren für die Analyse geeignet.

2.2. Experimentelles Design

Die Optimierung wurde mithilfe eines {{0}}faktoriellen Designs durchgeführt, das aus drei Zusammensetzungsvariablen (Tween 80 (X1), Sojalecithin (X2) und VCO (X3)-Konzentrationen) und zwei Prozessvariablen bestand: Rührdauer ( X4) und Geschwindigkeit (X5) (mit zwei Stufen – hoch und niedrig) [18]. Unter Verwendung der in Tabelle 1 beschriebenen Faktoren und Mengen wurden 32 USUC-Grundformeln erstellt. Die abhängige Variable war die Tröpfchengröße des USUC. Die erforderliche Größe lag im Bereich von 0–40 nm [19]. Die Auswirkungen jeder Variablen und ihrer Wechselwirkungen wurden mithilfe einer Fakultätsgleichung in der folgenden Form bestimmt:

2.3. Optimierung der USUC-Basisformel

Die USUC-Grundformeln wurden durch spontane Titration in der wässrigen Phase hergestellt. Sojalecithin und Tween 80 wurden mit einem Magnetrührer (IKA® C-MAG HS 7, Staufen, Deutschland) bei einer Temperatur von 75 °C gerührt, wobei während des Rührens VCO zugegeben wurde. Wasser wurde langsam in die Mischung titriert, bis eine transparente Lösung entstand [8]. Die 32 Basen wurden hinsichtlich ihrer Partikelgröße (Tröpfchengröße) mit einem Partikelgrößenanalysator (Shimadzu SALD 2300, Tokio, Japan) charakterisiert.

Die Daten wurden mit der Computersoftware Design Expert® Version 12 (StatEase®, Minneapolis, MN, USA) analysiert, um die Faktorialgleichung mit zusätzlichen Interaktionen anzupassen und die Reaktion mit den untersuchten Variablen zu korrelieren [17]. Der Effekt und die Wechselwirkungen zwischen den unabhängigen Variablen wurden mit 3D-Oberflächen- und Konturdiagrammen beschrieben [19].

Zubereitung von -Mangostin USUC

-Mangostin (3 Prozent w/v) wurde vor der USUC-Herstellung wie oben beschrieben in VCO gelöst. Die Zusammensetzung von VCO, Sojalecithin und Tween 80 sowie die Bedingungen des Mischvorgangs waren dieselben wie für die optimierte USUC-Basis [8,20,23].

2.4. Charakterisierung eines mit Mangostin beladenen USUC

2.4.1. Physikochemischen Eigenschaften

Die Charakterisierung eines USUC umfasst organoleptische Untersuchung, pH-Wert, prozentuale Durchlässigkeit, physikalische Stabilität über Gefrier- und Auftauzyklen, Viskosität, spezifisches Gewicht, Tröpfchengröße, Polydispersitätsindex (PDI) und Zetapotential [21,24,25]. Der pH-Wert der USUC-Formeln wurde mit einem zuvor kalibrierten pH-Meter (Hanna Instrument, Woonsocket, RI, USA) gemessen. Diese Messung wurde einmal pro Woche während einer 8-wöchigen Lagerung bei Raumtemperatur durchgeführt [26]. Die Durchlässigkeit wurde mit einem UV-sichtbaren Spektrophotometer (SHIMADZU UV-1601, Tokio, Japan) bei einer Wellenlänge von 650 nm gemessen. Die Transmission von nahezu 100 Prozent weist auf die Transparenz flüssiger Proben hin [27,28].

Die physikalische Stabilität der USUC-Basen wurde mithilfe eines Frost-Tau-Wechseltests bewertet: Die USUCs wurden 24 Stunden lang bei einer Temperatur von −5 °C und dann weitere 24 Stunden lang bei 25 °C gelagert. Dieser Test wurde drei Zyklen lang wiederholt. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des USUC, wie pH-Wert, Viskosität, spezifisches Gewicht und Transmission, wurden nach drei Zyklen bewertet [29].

Die Viskosität der USUC-Basen wurde mit einem Cup-and-Bob-Viskosimeter (Brookfield DV2T, Middleboro, MA, USA) unter Verwendung der Spindel Nr. 3 bei einer Geschwindigkeit von 100 U/min in dreifacher Ausfertigung gemessen. Das spezifische Gewicht der USUC-Basen wurde mit einem Pyknometer bei 25 °C bestimmt [20,30].

Die Tröpfchengröße, der Polydispersitätsindex (PDI) und das Zetapotential der -Mangostin-USUCs wurden mit einem Partikelgrößenanalysator (HORIBA Scientific SZ-100, Kyoto, Japan) bei 25 °C bestimmt [31].

2.4.2. Bestimmung der Verkapselungseffizienz (EE)

Die in der USUC-Formel eingeschlossene Menge an Mangostin wurde durch Extraktion eines mit Mangostan beladenen USUC mit Ethylacetat (1:2) und anschließende 10-minütige Ultraschallbehandlung (Elmasonic S 80 (H), Singen, Deutschland) freigesetzt. . Die Konzentration von -mangostin in der Ethylacetatlösung wurde mit einer validierten spektrophotometrischen Analysemethode bei einem λ max von 314 nm gemessen [24].

Die Einschlusseffizienz (EE) wurde anhand der folgenden Gleichung berechnet:

2.4.3. Mikrokopische Analyse mittels Transmissionselektronenmikroskop (TEM)

Die Morphologie des mit Mangostan beladenen USUC wurde unter Verwendung eines TEM (JEOL JEM 1010, Tokio, Japan) bei 80,0 KV und 30,000facher Vergrößerung beobachtet. Eine 10-µL-Probe wurde auf ein Gitter getropft, mit Uranylacetat gefärbt und getrocknet. Die Beobachtung wurde bei Raumtemperatur durchgeführt [8,24,32].

2.4.4. Visuelle Bewertung eines mit Mangostin beladenen USUC bei menschlichen Freiwilligen

Ein Patch-Test wurde an der inneren Unterarmhaut von 10 Freiwilligen durchgeführt und 24 Stunden lang belassen, um mögliche Reizreaktionen, wie z. B. rote, juckende Ausschläge auf der Haut, zu überprüfen. Ein Test der Anti-Flecken-Wirkung von -mangostin USUC wurde an zwei weiblichen Freiwilligen im Alter von 57 bzw. 40 Jahren durchgeführt. Das Experiment wurde mit der ethischen Genehmigung der medizinischen Fakultät der Andalas-Universität durchgeführt (Dokument Nr. 181/UN.16.2/KEP-FK/2020 vom 23. Dezember 2020). Das mit Mangostan beladene USUC wurde zwei aufeinanderfolgende Wochen lang nachts punktuell und im gesamten Gesicht dünn aufgetragen. Beide Freiwilligen gaben eine Einverständniserklärung zur Teilnahme an dieser Studie ab und stimmten zu, während des Tests keine Gesichtsaufhellungscreme zu verwenden. Vor dem Fotografieren reinigten die Freiwilligen ihre Gesichter mit einem handelsüblichen ölfreien Make-up-Entferner. Die Gesichter der Freiwilligen wurden vor und nach der Behandlung mit einer digitalen Spiegelreflexkamera (Nikon D 810, Melville, NY, USA) fotografiert. Jedes Gesichtsbild wurde aus einer Entfernung von 30–40 cm mit einer Kamera mit 36 ​​Megapixeln und den Abmessungen 7360 × 4912 aufgenommen. Die Intensität dunkler Flecken wurde durch Messung der Werte von Rot, Grün und Blau (RGB-Farbmodell) validiert ) mit Adobe® Photoshop für Windows und OS X (Microsoft Corp, Redmond, WA, USA). Die Größe der dunklen Flecken wurde mit einem Mikroskop (Olympus, Ningbo, China) bestimmt, das mit Motic Live Imaging 3.0 ausgestattet war. [33–35].

2.5. Statistische Analyse

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Ein einfacher T-Test wurde verwendet, um die optimierte Formel anhand der vorhergesagten Reaktion zu bestätigen. Um signifikante Verbesserungen der Parameter von Hauterkrankungen zu ermitteln, wurde ein gepaarter T-Test durchgeführt. Eine Zwei-Wege-ANOVA (= 0.05) wurde verwendet, um einen signifikanten Unterschied zwischen den Mittelwerten zu ermitteln, gefolgt von einem Duncan-Mehrfachbereichstest auf dem 5-Prozent-Signifikanzniveau [18].

3. Ergebnisse

3.1. Optimierung der Basisformel

Zweiunddreißig USUC-Grundformeln wurden mit verschiedenen Faktoren erstellt, wie in Tabelle 2 beschrieben. Die Messung der Reaktionsvariablen ergab einen breiten Tröpfchengrößenbereich von 11,3 nm–184,5 µm. Nur sechs Formeln (F1, F3, F9, F12, F25 und F28) erfüllten die Kriterien eines USUC-Systems mit einer Tröpfchengröße von weniger als oder gleich 40 nm [8]. Die Daten in Tabelle 2 wurden mit der Design Expert®-Software weiter analysiert, um ein Regressionsmodell zu erhalten, gefolgt von der Bestimmung der optimierten Formel.

3.2. Reaktion (Y): Auswirkung unabhängiger Variablen auf die Partikelgröße

Es wurde eine Bewertung der Tröpfchengröße als Reaktion (Y) durchgeführt. In der experimentellen Entwurfsphase wurden fünf Faktoren oder unabhängige Variablen modelliert, gefolgt von der Generierung einer Reaktionsoberfläche für die Tröpfchengröße. Abbildung 1 zeigt 3D-Antwortflächendiagramme der Auswirkungen unabhängiger Variablen auf die Partikelgröße. Die erhaltene Fakultätsgleichung ist in Gleichung (3) angegeben:

Die Tröpfchengrößenreaktion nahm zu, wenn die Zusammensetzung von Tween 80 und Sojalecithin höher war (Abbildung 1a). Eine Verringerung des VCO-Gehalts und eine Erhöhung des Tween 80-Gehalts führten zu einer Tröpfchengrößenreaktion von 20–70 nm (Abbildung 1b). Der Einfluss der Beziehung zwischen Tween 80 und Rührzeit auf die Tröpfchengrößenreaktion zeigte, dass eine längere Rührzeit zu einer Tröpfchengrößenreaktion von 20–100 nm führte (Abbildung 1c). Bei einer Rührgeschwindigkeit von 1200–1350 U/min und einem Tween 80-Gehalt von 20 Prozent wurde eine Tröpfchengrößenreaktion von 20,000 nm erreicht. Eine Erhöhung des Tween 80-Werts bei geringerer Rührgeschwindigkeit erhöhte die Tröpfchengrößenreaktion um bis zu 80 000 nm, angezeigt durch den blauen bis grünen Bereich (Abbildung 1d). Ein zunehmender Gehalt an Sojalecithin und VCO führte zu größeren Werten der Tröpfchengröße, markiert durch den blauen bis grünen Bereich (50,000–100,000 nm) (Abbildung 1e). Ein erhöhter Lecithingehalt und eine längere Rührzeit führten zu einer größeren Tröpfchengröße, wie durch den blauen bis grünen Bereich (50,000–100,000 nm) angezeigt (Abbildung 1f). Ein steigender Sojalecithingehalt bei hoher Rührgeschwindigkeit erhöhte die Tröpfchengröße, was durch den grünen bis gelben Bereich (50,000–150,000 nm) gekennzeichnet ist (Abbildung 1g). Die Auswertung des VCO-Gehalts und der Rührzeit anhand der Tröpfchengrößenreaktion ergab, dass eine Rührzeit von 15 Minuten und ein VCO-Gehalt von<1.5% resulted in a droplet size of 40 nm (Figure 1h). The droplet-size profiles were varied,  with different levels of combination for both VCO versus stirring speed and stirring speed versus stirring time (Figure 1i,j).

3.3. Bestimmung der optimalen Formel durch Software Design Expert®

Die Analyse wurde mit Design Expert® durchgeführt, um überlagerte Konturdiagramme zu erstellen. In Abbildung 2 stellt der gelbe Bereich den Vorhersagebereich der optimalen Basisformel mit der Reaktion auf die Tröpfchengröße dar. Eine geschätzte optimale Grundformel wurde bei einer Konzentration von 28,2 Tween 80 Prozent und 1 Prozent Sojalecithin gefunden, mit einem Erwünschtheitswert von 1,00. Ein Erwünschtheitswert näher bei 1 gibt die Fähigkeit des Modells an, die optimierte Formel zu erstellen. Die optimierten Bedingungen zur Herstellung der USUC-Basis waren eine Rührgeschwindigkeit von 1500 U/min für 15 Minuten. Mit dieser Zusammensetzung und diesen Bedingungen wurde die vorhergesagte Reaktion von 34,04 nm erzielt. Die Vorbereitung der optimierten Formel zur Bestätigung (Tabelle 3) führte zu einer Tröpfchengröße von 36 nm, die sich nicht wesentlich von der vorhergesagten Reaktion unterscheidet (p größer oder gleich 0,05).

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