Abstrakt: Polyphenole sind bekannte Antioxidantien in der Nahrung. Sie haben in letzter Zeit großes Interesse an Anwendungen zur Vorbeugung von Hautalterung und Hyperpigmentierung aufgrund von UV-Strahlung der Sonne geweckt. Prunus persica (L.)-Blätter gelten als Nebenprodukte und sollen aufgrund ihres hohen Gehalts an Polyphenolen eine bemerkenswerte antioxidative Wirkung haben. Ziel dieser Studie war die Entwicklung einer kosmezeutischen Anti-Aging- und Hautaufhellungscreme unter Verwendung von Ethanol-Blattextrakt von Prunus persica (L.) (PPEE), beladen mit festen Lipid-Nanopartikeln (SLNs), um die Hautabgabe zu verbessern. Die chemische Untersuchung von PPEE ergab einen signifikant hohen Gesamtgehalt an Phenolen und Flavonoiden mit bemerkenswerten antioxidativen Aktivitäten (DPPH-, ABTS- und -Carotin-Assays). Ein einzigartiges acyliertes Kaempferolglycosid mit einer seltenen Struktur, Kaempferol 3-O- -4C1-(600 -O-3,4-dihydroxyphenylacetyl glucopyranosid) ( KDPAG) wurde erstmals isoliert und seine Struktur vollständig aufgeklärt. Es stellt das erste Beispiel einer Acylierung mit 3,{{10}}Dihydroxyphenylessigsäure in der Flavonoidchemie dar. Die In-vitro-Zytotoxizitätsstudien an einer menschlichen Keratinozyten-Zelllinie zeigten die Nichttoxizität von PPEE und PPEE-SLNs. Darüber hinaus zeigten PPEE, PPEE-SLNs und KDPAG eine gute Anti-Elastase-Aktivität, vergleichbar mit der von N (Methoxysuccinyl)-Ala-Ala-Pro-Val-chlormethylketon. Darüber hinaus zeigten PPEE-SLNs und KDPAG im Vergleich zu EDTA bzw. Kojisäure signifikant (p < 0,001) höhere Anti-Kollagenase- und Anti-Tyrosinase-Aktivitäten. Verschiedene PPEE-SLNs-Cremeformeln (2 Prozent und 5 Prozent) wurden in einem Mausmodell mithilfe einer Faltenbewertungsmethode auf ihre mögliche Anti-Falten-Aktivität gegen UV-induzierte Lichtalterung untersucht und zeigten nachweislich eine hochsignifikante Schutzwirkung gegen UV-Strahlung durch Gewebebiomarker (SOD) und histopathologische Studien. Somit zeigt die aktuelle Studie, dass Nebenprodukte der Prunus persica-Blätter eine interessante und wertvolle Ressource für natürliche Kosmetikinhaltsstoffe darstellen. Dies liefert entsprechende Daten für die weitere Untersuchung der potenziell sicheren Verwendung von PPEE-SLNs in topischen Anti-Aging-Kosmetikformulierungen mit verbesserten Hautpermeationseigenschaften.

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1. Einleitung

Hautalterung ist ein komplexer, multifaktoriell fortschreitender Prozess, der körperliche Veränderungen in Haut und Bindegewebe katalysiert [1]. Es wird in intrinsische und extrinsische Alterung eingeteilt.

Die extrinsische Hautalterung entsteht vor allem durch Umweltfaktoren wie Schadstoffe, Rauchen und Lebensstress oder vor allem durch wiederholte Einwirkung von UV-Strahlung (Photoalterung) [2].

Übermäßige UV-Strahlung stimuliert die Überproduktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), was zu endogenem oxidativem Stress im Hautgewebe führt, der zum Abbau der Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) führt. Der ECM-Abbau steht in direktem Zusammenhang mit der Hautalterung und ist für die erhöhte Aktivität bestimmter Enzyme wie Kollagenase, Elastase und Tyrosinase verantwortlich, die an der Hautalterung beteiligt sind. Diese dermalen Enzymaktivierungen führen zu einem Rückgang des Elastin- und Kollagenspiegels, was zu einem Verlust der Elastizität und Festigkeit der Haut sowie zum Auftreten von Falten führt [3]. Außerdem führt die Induktion einer übermäßigen Melaninproduktion und Hautbräunung zu einer Hyperpigmentierung der Haut.

Daher kann der Hautalterung durch Antioxidantien mit freier Radikalfängeraktivität vorgebeugt werden, was bei der Abwehr und Therapie altersbedingter Krankheiten mit ROS-Beteiligung von großer Bedeutung sein kann [4]. Die andere Möglichkeit, die Alterung zu verzögern, ist die Verwendung von Elastase-, Kollagenase- und Tyrosinase-Inhibitoren, die sehr gute Kandidaten für Anti-Falten- und Hautaufhellungsaktivitäten sind, die den Erhalt der Hautelastizität unterstützen und ein gängiger Ansatz zur Behandlung von Pigmentstörungen sein können [5].

Es wurde berichtet, dass aus Pflanzen isolierte natürliche Antioxidantien das Risiko der durch UV-Bestrahlung verursachten Lichtalterung sowohl in vitro als auch in vivo abschwächen [6] und dass sie als kosmetische Inhaltsstoffe synthetischen Antioxidantien im Hinblick auf Kosten und Nebenwirkungen vorzuziehen sind. Darüber hinaus haben viele In-vitro- und In-vivo-Studien gezeigt, dass phenolische Verbindungen wie Phenolsäuren, Flavonoide und Tannine freie Radikale abfangen und die Enzyme Elastase, Kollagenase und Tyrosinase hemmen können [7].

Über die Verwendung natürlicher Antioxidantien in topischen Präparaten zum Schutz der Haut vor oxidativem Stress durch extrinsische Faktoren wurde berichtet [8]. Allerdings sind die meisten antioxidativen Moleküle von Natur aus instabil und können leicht zu inaktiven Verbindungen oxidieren, bevor sie den Wirkort erreichen, was es schwierig macht, sie in einem geeigneten und stabilen kosmetischen Produkt zu formulieren. Diese Ergebnisse belegen die Notwendigkeit einzigartiger Abgabesysteme zur Verbesserung dieser Antioxidantienformulierungen [9].

Mehrere Faktoren beeinflussen die Permeabilität topisch angewendeter Polyphenole; die phenolische Unterklasse, ihre Struktur, ihre Molekülgröße und die Glykosid- oder Aglykonform sowie die anderen Formulierungsbestandteile. Allerdings könnte die Interaktion mit Hautbestandteilen durch eine Mischung aus physikalischen und chemischen Methoden die Durchlässigkeit durch eine reversible Störung der Barrierestruktur der Stratum Corneum-Schicht verbessern. Verkapselungsansätze sind eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Erhöhung der Permeabilität, um Polyphenole während der Lagerung einfach zu stabilisieren und ihre antioxidative Wirkung, Hautabsorption und Penetration in kosmetischen und topischen Therapien zu erhöhen. Zu den neu entwickelten Verkapselungstechnologien gehören Nanoemulsionen, Transferasen, feste Lipid-Nanopartikel, Nanokristalle und Ribosomen [10].

Feste Lipid-Nanopartikel (SLNs) sind ein stabiles Abgabesystem für Hautprodukte. SLNs gelten aufgrund ihrer Photostabilität, kontrollierten Freisetzungseigenschaften, Okklusivität, geruchsmaskierenden Wirkung und der verbesserten Penetration der aktiven Bestandteile durch die Haut durch Erhöhung der Hydratation ohne Anzeichen von Hautreizungen sowie ihrer Einfachheit als vielversprechende Wirkstoffträger für topische Formulierungen von Produktion, geringer Toxizität und physikalischer Stabilität [9,11].

Weltweit gibt es etwa 2000 Pfirsichsorten [12]. Prunus (Rosaceae) ist eine berühmte Pflanzengattung, die phenolreiche Arten umfasst [13–15]. Einige Arten dieser Gattung werden in Ägypten wegen ihrer essbaren Früchte oder als Zierpflanzen angebaut [16].

Prunus persica (L.) Batch (PP) ist ein kleiner Baum mit kahlen Zweigen und einem kurzen Stamm, einer ausladenden, abgerundeten Krone [12], der häufig in Westasien, Europa, Indien und Nordafrika kultiviert wird [17]. Traditionell werden seine Blätter als Diuretika, Abführmittel, Wurmmittel, Insektizide, Beruhigungsmittel, gegen Keuchhusten, zur Behandlung von Leukodermie und als Fiebermittel eingesetzt [17]. Darüber hinaus wurden in pharmakologischen Studien an Blättern deren in vivo antidiabetische, krampflösende, entzündungshemmende, gerinnungshemmende, hepatoprotektive, antimalaria- und antiasthmatische sowie in vitro zytotoxische, antimikrobielle und stickoxidhemmende Wirkung mit signifikanten antioxidativen Aktivitäten charakterisiert [18–22].

Es wurden zahlreiche Studien durchgeführt, um das Phenolprofil von PP-Folgen, -Früchten und -Samen, ihre antioxidativen Aktivitäten sowie ihre pharmakologischen und ernährungsphysiologischen Werte zu untersuchen [13,14,23,24]. Zu den Blättern lagen jedoch nur sehr wenige Daten vor. Bisher liegt ein einziger Bericht vor, der die Isolierung von fünf Flavonolglykosiden aus einem Ethanol-Blattextrakt beschreibt [25]. Darüber hinaus wurden phenolische Verbindungen, einschließlich Phenolsäuren und Flavonoide, mittels HPLC-MS-Analyse charakterisiert, wobei Flavonole unter allen ermittelten Verbindungen die dominierenden Substanzen waren [20,26].

Darüber hinaus wurde zwar berichtet, dass PP-Samen, -Früchte, -Fänger und andere Arten in vivo eine schützende Aktivität gegen UV-induzierte Lichtalterung und in vitro Anti-Falten- und Hautaufhellungsaktivitäten aufweisen [15,23,27–32], dies ist jedoch der Fall wurde nie für PP-Blätterextrakt berichtet.

Große Mengen an PP-Blättern sind Nebenprodukte, die beim Pfirsichanbau und in der Obstkonservenindustrie anfallen [33]. Die Nebenprodukte von PP-Samen, -Früchten und anderen Blattsorten wurden in Kosmetika und als diätetische Lebensmittel im Hinblick auf eine mögliche Verwertung untersucht [32,34,35]. Nach unserem besten Wissen sind jedoch die Nebenprodukte von PP var. Florida Prince wurde nie untersucht und könnte eine interessante Quelle für sekundäre Pflanzenstoffe sein. Im Vergleich zu anderen Branchen ist der Kosmetikmarkt zugänglicher und expandierender und kann eine Quelle für die Verwertung von Nebenprodukten sein [15]. Zu den wichtigsten kosmetischen Potenzialen zählen Hautpflege- und Hautalterungsprodukte.

In Fortsetzung unserer Forschung zu Polyphenolen ägyptischer essbarer Pflanzen [36] und da PP-Blätter als Nebenprodukte gelten und Berichten zufolge vor allem aufgrund ihres hohen Flavonolgehalts eine signifikante antioxidative Aktivität aufweisen, zielt diese Studie darauf ab, PPEE einem umfassenden sekundären Pflanzenstoff zu unterziehen Analyse seines Phenolprofils und die Einbindung von PPEE in beladene SLNs als einzigartiges Hautabgabesystem. Darüber hinaus wurde das kosmetische Anti-Aging- und hautaufhellende Potenzial durch die Untersuchung der in-vitro-antioxidativen Aktivität von PPEE, PPEE-SLNs und den isolierten Bestandteilen sowie die Bewertung ihrer Hemmwirkung auf hautbezogene Enzyme bewertet. Zusätzlich zur Einarbeitung von PPEE-SLNs in eine topische kosmezeutische Anti-Aging-Creme und zum Testen der Produktsicherheit sowie zur Bewertung der möglichen In-vivo-Anti-Falten-Aktivität von PPEE-SLNs-Cremeformulierungen gegen UV-induzierte Lichtalterung in a Mausmodell. Dies könnte Daten für die weitere Untersuchung der potenziellen Verwendung von PPEE-SLN-Blättern in topischen Formulierungen mit verbesserter Hautpermeation liefern.

2. Material und Methoden

2.1. Allgemein

2.2. Pflanzenmaterialien

2.3. Herstellung von Pflanzenextrakt 

2.4. Bestimmung des Gesamtpolyphenolgehalts (TPC) 

Das von Li et al. [37] beschriebene Folin-Ciocalteu-Reagenz wurde verwendet, um die Menge des Gesamtphenolgehalts in PPEE abzuschätzen, dargestellt in mg Gallussäureäquivalent/g Trockenextrakt.

2.5. Bestimmung des Gesamtflavonoidgehalts (TFC)

Zur Abschätzung des Gesamtflavonoidgehalts wurde die von Bahromun et al. [38] beschriebene kolorimetrische Methode mit Aluminiumchlorid verwendet. Die Ergebnisse werden als mg-Äquivalent Quercetin/g Trockenextrakt angegeben.

2.6. Fraktionierung von PPEE und Isolierung von Verbindung 1

2.7. Identifizierung von Kaempferol 3-O- -4C1-(6"-O-3,4-dihydroxyphenylacetyl glucopyranosid) (1)

2.8. In-vitro-Studien

Die menschliche Keratinozyten-Zelllinie wurde von VACSERA CO. (The Egyptian Company for the Production of Vaccines, Sera, and Drugs, Gizeh, Ägypten) bezogen. Der MTT-Assay wurde für PPEE und PPEE-SLNs nach der Methode von Mostafa et al. durchgeführt. [36].

Der DPPH-Assay wurde nach der Methode von Yardpiroon et al. durchgeführt. [39] und Vitamin C wurde als Positivkontrolle verwendet. Der ABTS-Assay folgte der Methode von Re et al., [40], Vitamin C wurde als Standard verwendet. Der -Carotin-Bleichtest verwendete die von Soulef et al. [14] beschriebene Methode in Gegenwart der Positivkontrolle BHT. Der Wert für jede Testprobe wurde als Hemmkurve bei 50 Prozent oder IC50 dargestellt.

Die Anti-Aging- und Hautaufhellungsaktivitäten wurden nach den von Mostafa et al. beschriebenen Methoden bewertet. [41]. Für den Anti-Elastase-Assay wurden 1 µg/ml menschliche Leukozyten-Elastase mit HEPES-Puffer pH 7,5 und jedem der getesteten Extrakte oder 1,4 mg/ml N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-chlormethylketon (Standardinhibitor) inkubiert Eine 96-Well-Platte für 20 Minuten bei Raumtemperatur vor der Zugabe von 100 µL 1 mM N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-Nitroanilid als Substrat. Nach 40-minütiger Inkubation wurde die Absorption bei 405 nm gemessen, wobei eine Vertiefung ohne Extrakt/Inhibitor als Blindwert diente. Die getesteten Proben wurden in einem Konzentrationsbereich von 25–300 µg/ml eingesetzt.

2.9. Formulierung und Charakterisierung von PPEE-SLNs

Die Formulierung erfolgte nach der Methode von Choubey et al. [11]. Zuerst wurde Glycerylmonostearat in einer Chloroform-Methanol-Mischung (1:1) gelöst und dann der ethanolische Extrakt in dieser Lösung dispergiert. Später wurden die organischen Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer entfernt und die Lösung erhitzt. Dann wurde Tween 80 hinzugefügt und die Mischung 30 Minuten lang bei 3000 U/min gerührt und dann 4 Stunden lang homogenisiert, bevor filtriert und getrocknet wurde. Die Charakterisierung von PPEE-SLNs wurde durch Schätzung der Form- und Oberflächenmorphologie, der Partikelgröße, des Polydispersitätsindex (PDI), der Zetapotentialanalyse, der prozentualen Einschlusseffizienz (PEE) und Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR) untersucht.

2.10. Zubereitung von topischen Cremeformeln von PPEE

Zwei Cremeformulierungen (2 Prozent und 5 Prozent PPEE-SLNs) wurden wie in Tabelle 1 gezeigt nach der Methode von Mahawar et al. hergestellt. [42].

Organoleptische Eigenschaften, pH-Wert der Creme, Verteilbarkeitsstudien, Viskositätstest, Homogenitätstest, Patch-Test (Burchard-Test), In-vitro-Hautpermeationsuntersuchung und Stabilitätsstudien (ICH-Richtlinien) wurden gemäß Matangi et al. bewertet. [43]. Es wurde ein mikrobieller Grenztest nach Sekar et al. durchgeführt. [44].

2.11. In-vivo-Anti-Falten-Studie der PPEE-SLNs-Creme

Fünfzig männliche haarlose Mäuse (HR{{0}} (4-Wochen alt), 17–24 g, wurden von VACSERA erhalten. Das Experiment wurde nach Genehmigung durch die Ethikkommission der October University for Modern Sciences and Arts (MSA) durchgeführt. Die Probengröße gemäß Protokollnummer (PG1/EC1/2020PD) wurde mithilfe der Software (G. Power) bestimmt. Eine Woche vor der In-vivo-Anti-Falten-Studie hatten die Mäuse freien Zugang zu Nahrung und Wasser und konnten sich an den klimatisierten Raum (23 ± 2 °C) gewöhnen. Mäuse (50) wurden zufällig in fünf Gruppen eingeteilt (n=10), wie in Tabelle 2 gezeigt. Die Behandlung erfolgte über 40 Tage, dreimal wöchentlich, mit 0,5 g PPEE-SLNs-Creme oder einer anderen Behandlung und angewendet auf die Rückenhaut von Mäusen aufgetragen und anschließend UV-Strahlung (365 nm) ausgesetzt.

Vor und nach topischen Behandlungen wurden zweimal pro Woche Fotos von der Haut der Mäuse auf dem Rücken gemacht. Die Einstufung der Hautfalten wurde anhand der visuellen Faltenskala von Bissett [45] bewertet. Die Grundlage für die Bewertungsskala war die Textur von Falten (fein oder grob) und Keratose, unterteilt in fünf Stufen: schlechter (−2), etwas schlechter (−1), keine Veränderung (0), leicht verbessert ( plus 1) und verbessert (plus 2).

Die histologische Auswertung erfolgte nach der Methode von Elder et al. [46].

2.11.4. Superoxiddismutase (SOD)-Aktivität

Die SOD-Aktivität wurde nach der Methode von Ukeda et al. geschätzt. [47].

2.12. Statistische Analyse

3. Ergebnisse

3.1. Gesamtgehalt an Phenolen und Flavonoiden

TPC wurde spektrophotometrisch in PPEE mit 387,5 ± 4,28 mg GAE/g Extrakt bestimmt. Außerdem wurde TFC auf 241,7 ± 3,25 mg QE/g Extrakt geschätzt. PPEE zeigte hohe Konzentrationen an Phenol- und Flavonoidverbindungen. Beide Ergebnisse folgen den zuvor für PP-Blattextrakte berichteten Werten und bestätigen, dass Flavonoide die wichtigsten chemischen Bestandteile in PP-Blättern sind [20].

3.2. Isolierung und Strukturaufklärung von Kaempferol

3-O- - 4C1-(600 -O-3,4-dihydroxyphenylacetyl glucopyranosid), Verbindung 1

Nachdem alle bekannten Strukturen in diesem Extrakt aussortiert wurden, wurde die Suche nach einzigartigen, potenziell biologisch aktiven Verbindungen effizienter. Den erhaltenen 2-DPC-Analysedaten zufolge ließen sich die Phenole von PPEE am besten über eine MCI-Gelsäule fraktionieren, die mit MeOH/H2O-Mischungen abnehmender Polarität eluiert wurde, ein Prozess, der vier Hauptsäulenfraktionen ergab. Ein amorphes Material wurde aus einem heißen Konzentrat der Fraktion III (von der Säule durch 70-prozentiges wässriges MeOH desorbiert) durch Stehenlassen über Nacht bei Raumtemperatur abgetrennt. Die zweimalige Kristallisation dieses Materials aus kochendem EtOH ergab ein chromatographisch reines bräunlich-gelbes amorphes Pulver 1. Es zeigte chromatographische Eigenschaften (dunkelviolettes Spot-on-PC unter UV-Licht, zitronengelb, wenn es mit Ammoniakdampf mit mäßiger Migration in wässrigen und organischen Lösungsmitteln geraucht wird). ) und Farbreaktionen (eine zitronengelbe Farbe mit Naturstoff-Reagens), was auf ein Kaempferol-Derivat mit einer freien 40-Hydroxylgruppe und einer O-substituierten 3-O-Position schließen ließ. Die UV-Spektren von 1 in MeOH (268 nm, 316 nm, 360 nm) und nach Zugabe der diagnostischen Verschiebungsreagenzien [48] waren typisch für die von 3-O-glykosyliertem Kaempferol (positive Verschiebung mit NaOAc, stabile Verschiebung). mit NaOMe). Die normale saure Hydrolyse von 1 (2 N wässrige HCl, 3 h, 100 ◦C) ergab Glucose (vergleichende Papierchromatographie, Co-PC), Kaempferol und 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (UV). Absorptions- und 1H-NMR-Spektren für einzelne Proben, isoliert durch präparative Papierchromatogramme des Ethylacetatextrakts des Hydrolysats). Folglich ist 1 Kaempferol 3-O-(3,4-Dihydroxyphenylacetylglucosid). Die Verbindung wird nach 24-stündiger Inkubation mit dem Enzym -Glucosidase unverändert zurückgewonnen, was beweist, dass die Glucosyleinheit acyliert ist. Aus seinem negativen HRESI-Massenspektrum, das ein [MH]−-Ion bei m/z=597.5302 zeigte (berechnet für C29H25O14, 597.5015), wurde geschlossen, dass die Summenformel von 1 C29H26O14 ist. Das ESI-MS-Experiment (Negativionenmodus) ergab einen quasi-molekularen Ionenpeak [MH]− bei m/z: 597, was auf ein Molekulargewicht von 598 für 1 hinweist. Weitere Fragmentionenpeaks im ESI-MS-MS-Spektrum waren beobachtet bei m/z: [MH]−: 447, 167 und 285, was dem Verlust von Dihydroxyphenylacetat aus der Ausgangsverbindung 1 entspricht, während die Fragmentionen bei m/z 285 und m/z 167 dem Kaempferol und zugeschrieben wurden Dihydroxyphenylessigsäure-Einheiten. Um die Bindungsstelle aller Einheiten im Molekül von 1 zu bestimmen und die vollständige Zuordnung aller Kohlenstoff- und Protonenresonanzen zu ermöglichen, NMR-spektroskopische Analyse von 1, einschließlich 1D- 1H und 13C sowie 2D-HSQC und HMBC , wurde dann durchgeführt. Aus den fünf Signalen im Zuckerbereich zwischen δ ppm 62,25 und 76,9 und aus dem anomeren Kohlenstoffsignal bei 99,13 ppm wurde bewiesen, dass die Zuckereinheit aufgrund dieses C-3-Kohlenstoffsignals an Position 3 von Kaempferol gebunden sein muss wurde nach oben verschoben und die entsprechenden ortho- und para-Kohlenstoffsignale wurden nach unten verschoben (siehe Experiment). Ähnliche Verschiebungen sind aus der Arbeit von Nawwar et al. bekannt. [48]. Dies wurde durch die im HMBC-Spektrum erkannten 3 J-Fernkorrelationen weiter bestätigt, wobei ein Kreuzsignal gefunden wurde, das das anomere Glucoseprotonen-H-100-Signal bei δ 5,42 mit dem Flavonol-C-3-Kohlenstoff korreliert Signal bei δ 133,5. Die -Konfiguration der Glucoseeinheit wurde aus der chemischen Verschiebung von C-100 bei 99,13 ppm abgeleitet. Die chemischen Verschiebungswerte der Zuckerkohlenstoffe bestätigten die Pyranoseform dieser Einheit [48]. Das 1H-NMR-Spektrum von 1 entsprach ebenfalls der vorgeschlagenen Struktur. Die chemische Verschiebung des anomeren Protonensignals bei δ 5,42 ppm (d, J=8 Hz) deutete darauf hin, dass der anomere Kohlenstoff bei C-3 (δppm 133,5) und der ermittelten Kopplungskonstante an die Kaempferol-Einheit gebunden ist 8 Hz, beweisen Sie die -Konfiguration der Glucose-Einheit. Die Konformation der Zuckereinheit ist 4C1, gefolgt von den oben diskutierten -Konfigurationen.

Auch die Bindung der 3,4--Dihydroxyphenylessigsäure-Einheit an die C-600-Methylenglucopyranose-Einheit folgte aus der Tieffeldverschiebung des Signals dieses Kohlenstoffs auf δ ppm 62,25 im 13C-NMR-Spektrum. Dies wurde durch den Kreuzpeak im HMBC-Spektrum weiter bestätigt, der die Signale der Methylenglucose-Protonen bei δ 4,04 (H-600 a) und δ 4,2 ppm (H-600 b) mit dem Carbonylkohlenstoff korreliert 3,4-Dihroxyphenylessigsäureeinheit bei δ 176,26 ppm. Diese und die oben angegebenen Daten bestätigten schließlich die Struktur der Verbindung 1 als das neue Kaempferol 3-O- - 4C1-(600 -O-3,{ {24}}Dihydroxyphenylacetylglucopyranosid) (KDPAG), erstmals in der Natur beschrieben, da es die erste Acylierung mit 3,4-Hydroxyphenylessigsäure in Verbindung mit der Flavonoidchemie darstellt (Abbildung 1).

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