Ein Urinary Common Rejection Module (uCRM)-Score für die nicht-invasive Überwachung von Nierentransplantationen

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Abstrakt

Ein Common Rejection Module (CRM), das aus 11 in Allotransplantatbiopsien exprimierten Genen besteht, diente zuvor als Biomarker für die akute Abstoßung (AR), korreliert mit dem Ausmaß der Transplantatverletzung und prognostiziert zukünftige Allotransplantatschäden. Wir untersuchten die Verwendung dieses Genpanels auf dem Urinzellpellet von Nierentransplantationspatienten. Von Patienten mit durch Biopsie bestätigter akuter Abstoßung, Borderline-AR (bAR), BK-Virusnephropathie (BKVN) und stabilen Nierentransplantaten mit normalen Protokollbiopsien (STA) wurden Harnzellsedimente auf die Expression dieser 11 Gene unter Verwendung einer quantitativen Polymerasekette analysiert Reaktion (qPCR). Wir haben diese 11 CRM-Gene auf ihre Häufigkeit, Autokorrelation und individuelle Expressionsniveaus untersucht. Die Expression von 10/11-Genen war bei AR im Vergleich zu STA erhöht. Psmb9 und Cxcl10 konnten AR im Vergleich zu STA so genau wie das 11--Genmodell ( Sensitivität=93,6 Prozent, Spezifität=97,6 Prozent). Der Au-CRM-Score, basierend auf dem geometrischen Mittel der Expressionsniveaus, konnte AR mit hoher Genauigkeit (AUC= 0.9886) von STA unterscheiden und korrelierte eher mit histologischen Messungen von Tubulitis und interstitieller Entzündung als mit tubulärer Atrophie, Glomerulosklerose, Proliferation der Intima, tubuläre Vakuolisierung oder akute Glomerulitis. Dieser auf der Genexpression im Urin basierende Score kann die nicht-invasive und quantitative Überwachung von AR ermöglichen.

WIRKUNGEN VON CSITANCHE: ENTZÜNDUNGSHEMMENDE

Einführung

Die Nierentransplantation (KTx) ist die bevorzugte Modalität für die Behandlung von terminaler Niereninsuffizienz (ESRD) jeglicher Ursache [1]. Während dieser therapeutische Ansatz weltweit zu einer Routinepraxis geworden ist und die Lebensqualität und das Überleben der Patienten erheblich verbessert hat[2], haben sich die langfristigen Ergebnisse von Nieren-Allotransplantaten trotz eines besseren Verständnisses der Immunbiologie der Allotransplantat-Abstoßung und des Aufkommens neuer nicht wie erwartet verbessert und potentere Immunsuppressiva [3]. Die Hauptursache für das anhaltende und schlechte Überleben des Transplantats ist die Unfähigkeit, die Belastung durch die Immunschädigung des Transplantats nicht-invasiv zu quantifizieren und eine akute Abstoßung vor einem wesentlichen funktionellen Rückgang und einer histologischen Verletzung vorherzusagen. Obwohl bekannt ist, dass KTx-Patienten kontinuierlich immun- und nichtimmunbedingten Verletzungen ausgesetzt sind [4, 5], ist die regelmäßige KTx-Überwachung von unempfindlichen Surrogatmarkern der Allotransplantat-Dysfunktion wie Serumkreatinin (6, Z) und sporadischer KTx-Überwachung abhängig basiert auf protokollierten Allotransplantatbiopsien zum Nachweis einer subklinischen histologischen Transplantatverletzung in Abwesenheit einer Störung des Serumkreatinins.[8] Obwohl die Beurteilung der Transplantatdysfunktion nur auf der Grundlage des Serumkreatinins eine Empfindlichkeit für unspezifische, etablierte Allotransplantatschäden aufweist, Es hat eine geringe Spezifität für die Diagnose einer akuten Abstoßung (AR), da ein Anstieg des Serumkreatinins auf andere Gründe zurückzuführen sein kann, die nicht direkt mit der Allotransplantatabstoßung zusammenhängen, wie z und interstitielle Fibrose und tubuläre Atrophie (IFTA).Obwohl die Verwendung von Überwachungsbiopsien als Goldstandard für dieDiagnose von al Lograft-Läsionen, dieser Ansatz ist kostspielig, invasiv und mit einer Morbidität des Verfahrens verbunden (Blutungsrisiko; Verfahren, das eine Sedierung erfordert, insbesondere bei pädiatrischen KTx-Patienten)[9], das mit Schwankungen bei den Messwerten zwischen den Bedienern behaftet ist und oft schlecht repräsentativ für fokale histologische Verletzungen ist Immunverletzung im Allotransplantat wäre ein bedeutender Fortschritt für die präzise KTx-Überwachung [10-12].

Die Abfrage von proteomischen, RNA- und mikroRNA-Biomarkern im Urin von KTx-Patienten wurde von unseren Gruppen und anderen [13-17] als optimale biologische Flüssigkeit für die serielle Überwachung des Nieren-Allografts nachgewiesen, da es sich um ein Ultrafiltrat des Niere und spiegelt die biologischen Prozesse und die entzündliche Belastung wider, die im Nierentransplantat gefunden werden [18]. Trotz einer Reihe von Studien, die zuvor Urin-Biomarker als nicht-invasiven diagnostischen Ansatz für die Analyse von AR bei Nierentransplantationen bewertet haben, ist der ausschließliche Fokus auf einzelne Biomarker wie bestimmte Chemokine und Rezeptoren wie CXCR3, CXCL9 oder CXCL10 [{{ 6}}] machen es schwierig, die molekulare Komplexität und Heterogenität von AR bei verschiedenen KTx-Patienten zu erfassen. Die Erfassung dieser Heterogenität ist unerlässlich, um die Verletzungslast in einer Weise zu quantifizieren, die für die prospektive Überwachung der AR und die Genesung der Transplantatverletzung nach therapeutischer Intervention verwendbar ist [25, 26].

In dieser Studie wenden wir die Erkenntnisse aus der Nutzung eines Common Rejection Module (CRM) von 11 Genen [27] an, das ursprünglich unter Verwendung einer umfassenden Metaanalyse von öffentlich verfügbaren Transplantatgewebe-Microarray-Datensätzen von Biopsieproben aus vier verschiedenen Arten von Feststoffen entwickelt wurde Organe. Die CRM-Gene im Gewebe (tCRM) waren bei AR-Patienten alle überexprimiert, unabhängig von der Art des Organs, Unterschieden in den Immunsuppressionsprotokollen oder Unterschieden in den Plattformen, die die Genexpression abfragen. Ein quantitativer Schwellenwert, der durch Computeranalyse eines kombinierten Gen-Scores (der tCRM-Score) bestimmt wurde, sagte das Vorhandensein von AR durch Kreuzvalidierung von Gewebe-Genexpressionssignaturen in 8 unabhängigen Kohorten (n= 236 Proben) von menschlichem Nieren-Allotransplantat genau voraus Biopsien[27]. Der tCRM-Score wurde durch qPCR in einer separaten Studie an KTx-Biopsieproben als Diagnose sowohl für AR als auch für chronische Allograft-Verletzungen (CAl) mit unterschiedlichen Gen-Set-Schwellenwerten validiert [28]. Darüber hinaus wurde dieser Satz von CRM-Genen in einem unabhängigen Satz von biopsiertem Gewebe von Lungentransplantationspatienten mit chronischer Allograft-Dysfunktion der Lunge (CLAD) validiert [29].

In dieser Studie bewerten wir das CRM-Genset für die Verwendung an Urinproben von KTx-Patienten, gepaart mit Allotransplantatbiopsien mit bekannter Histologie, für die nicht-invasive Diagnose von AR und anderen immunvermittelten Verletzungen. Darüber hinaus entwickeln wir einen Urin-CRM(uCRM)-Score, der genau zwischen STA- und AR-Patienten unterscheidet. Wir bewerten das klinische Potenzial dieses Scores beim Nachweis von bAR, indem wir diesen Score mit histologischen Scores von Tubulitis und interstitieller Entzündung korrelieren.

AUSWIRKUNGEN VON CSITANCHE: VERBESSERUNG DER IMMUNITÄT

Materialen und Methoden

Urinproben und die Studienkohorte

Biobankurinproben (n=1760) von KTx-Empfängern, die zwischen 2000 und 2011 an der Stanford University und zwischen 2014 und 2016 am UCSF Medical Center eingeschrieben waren, wurden in die Studie eingeschlossen. Die Studie wurde vom Institutional Review Board und der Ethikkommission der University of California San Francisco, CA, genehmigt. Alle Patienten gaben unter vollständiger Einhaltung der Deklaration von Helsinki eine schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie ab. Die berichteten klinischen und Forschungsaktivitäten stehen im Einklang mit den Grundsätzen der Erklärung von Istanbul, wie sie in der Erklärung von Istanbul über Organhandel und Transplantationstourismus dargelegt sind. Bei Urinproben, die zur Ermittlung des uCRM-Schwellenwerts für AR verwendet wurden, wurden 178 Urinproben mit gepaarten Nieren-Allotransplantatbiopsien mit klar definierten Pathologien von entweder Banff-bewerteten AR[30,31] oder Transplantaten ohne Verletzung/stabil (STA) (Eig 1) identifiziert. Darüber hinaus haben wir auch die Signatur für den uCRM-Assay bei BK-Virusnephropathie ausgewertet, die ein wichtiger Confounder für die Diagnose von AR ist und häufig eine signifikante Entzündung bei der Allotransplantatbiopsie aufweist. Insgesamt wurden 28 Proben aufgrund von QC-Problemen im Zusammenhang mit niedrigem Gehalt und minderwertiger RNA verworfen, was zu einer endgültigen Zählung von 150 Urinproben von 150 Personen für die Querschnittsanalyse der immunvermittelten KTx-Verletzung führte. Jede Urinprobe wurde zum Zeitpunkt der Urinsammlung mit einer Biopsie abgeglichen, die von einem zentralen Pathologen an der Stanford University (Richard Sibley) oder an der UCSF (Zol-tan Laszik) ausgewertet wurde.

Patienteneigenschaften

150 unique urine samples were assessed for the uCRM assay in 150 unique kidney transplant patients. Baseline clinical and demographic variables by AR, bAR, BKVN, or STA phenotype are shown in Table1, There were no significant differences between the groups in the demographic variables, except in recipient age (p= 0.025) and in donor-source (p=0.0008). These samples were used in cross-sectional analyses for modeling of gene expression data and subsequent development and validation of the uCRM threshold for biopsy-proven AR. Samples were collected from both pediatric (n=94) and adult (n=56)patients to enable a model-independent of recipient age or baseline immunosuppression. Based on the matched biopsy diagnosis, urine samples were categorized in the following categories: AR(n=64;45 biopsies met criteria for Banff confirmed AR with >i2,t2, and infiltration by >4 mononukleäre Zellen/tubulärer Querschnitt, während 19 die Kriterien für grenzwertige AR mit il/i2 und t0/t1 und Infiltration durch 1-4 mononukleäre Zellen/tubulären Querschnitt erfüllten, STA (n { {8}}), BK-Virus-Nephritis (n =43), Die Patienten erhielten eine Calcineurin-Inhibitor-ILS-Behandlung basierend auf Tacrolimus und Mycophenolatmofetil, mit oder ohne Steroide, und eine Induktionstherapie entweder mit Thymoglobulin oder Anti-IL{{ 12}} monoklonaler Rezeptorantikörper (Daclizumab oder Basi. Infliximab)[32]. Urinproben wurden durchschnittlich 731 Tage nach der Transplantation entnommen (Bereich 169-1335 Tage).

Definition von Verletzungsphänotypen

All kidney biopsies were blindly and centrally analyzed at each institution by staff pathologists (RS and ZL)and were graded by the Banff dassification[31,33] for acute rejection.Intragraft C4d stains were performed [34] to assess for acute humoral rejection(AHR)[35]. Transplant injury was defined as>20-prozentiger Anstieg des Serumkreatinins gegenüber seinem vorherigen Steady-State-Ausgangswert und einer damit verbundenen Biopsie, die entweder als AR oder BKVN klassifiziert wurde. AR wurde gemäß dem Banff-Schema als Minimum definiert, ein Tubulitis-Score größer oder gleich 1, begleitet von einem Score für interstitielle Entzündung Größer oder gleich 1, sowohl bei Cd- als auch bei DSA-negativ. Sowohl Fälle von T-Zell-vermittelter AR (TCMR) als auch Fälle von Antikörper-vermittelter Abstoßung (ABMR) wurden induziert, obwohl alle beobachteten ABMR-Fälle einen gemischten Phänotyp aus TCMR und ABMR aufwiesen, da die Beobachtung einer reinen ABMR in nicht sensibilisierten Kohorten mit geringem Risiko selten beobachtet wird. Borderline-Veränderungen (bAR) wurden in einigen Fällen von TCMR beobachtet, die durch Infiltration mononukleärer Zellen gekennzeichnet waren (<25% of="" the="" parenchyma)or="" foci="" of="" mild="" tubulitis(1-4="" mononuclear="" cells/tubular="" cross-section),="" and="" for="" purposes="" of="" molecular="" correlation="" analysis,="" these="" have="" been="" shown="" as="" bar,="" as="" the="" burden="" of="" histological="" inflammation="" was="" overall="" lower="" for="" these="" biopsy="" samples.="" bkvn="" was="" defined="" as="" the="" positivity="" of="" polyomavirus="" pcr="" in="" peripheral=""><1000-28,800,000), together="" with="" a="" positive="" sv40="" stain="" in="" the="" concomitant="" renal="" allograft="" biopsy.="" normal="" (sta)="" allografts="" were="" defined="" by="" an="" absence="" of="" significant="" injury="" pathology="" on="" the="" 6-month="" protocol="" biopsy,="" as="" defined="" by="" banff="" schema,="" stable="" graft="" function,="" no="" proteinuria,="" and="" no="">

Abb. 1. Stichprobenauswahl und Studienschema der Studie. Zwischen 2000 und 2016 wurden 1.760 Urinproben gesammelt,

von denen 643 übereinstimmende Biopsiedaten hatten. 178 dieser 643 hatten gut definierte Phänotypen von AR, bAR, BKVN oder STA.

Nach RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und qPCR-Quantifizierung bestanden 28 Proben die QA/QC nicht, sodass 150 übrig blieben

Proben für die statistische Analyse und Modellierung.

Urinsammlung, Verarbeitung, Gesamt-RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und qPCR

Urin (50 ml; steriler Behälter) wurde von Nierentransplantationspatienten vor dem Biopsieverfahren und vor jeglicher Behandlungsintensivierung für AR gesammelt. RNA wurde aus Urinzellensediment gemäß unserem zuvor berichteten Protokoll extrahiert [36]. Kurz gesagt, Urinzellen wurden durch Zentrifugieren der 50--ml-Urinprobe bei 2000 x g für 20 Minuten gewonnen. RNA wurde aus den Urinzellenpellets unter Verwendung von extrahiert RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen, Valencia, CA). Die RNA-Qualität wurde mit dem Spektrophotometer NanoDrop ND-2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) mit einem Verhältnis von 260/280 bewertet. cDNA-Synthese wurde unter Verwendung von 50 ng extrahierter RNA unter Verwendung von SuperScript VILO" Master Mix (Invitrogen, Carlsbad, CA) durchgeführt. qPCR wurde an cDNA durchgeführt, die aus 50 ng Gesamt-RNA synthetisiert wurde, dann wurden 1,56 ng cDNA durch spezifische Zielamplifikation und Probe verarbeitet Verdünnung mit den gepoolten Taqman-Assays für die 1 l uCRM-Gene im Multiplex, mit Taqman PreAmp Master Mix (ABI) auf 5 ul Endvolumen, für 18 Zyklen in einem Thermocycler, dann verdünnt mit DNA-Suspensionspuffer (TEKnova, CA).Mikrofluidische qPCR wurde durchgeführt auf den 96,96 dynamischen Arrays (Fluidigm, South San Francisco, CA) unter Verwendung von 2,25 ul der verdünnten Probe aus der spezifischen Zielamplifikation, zusammen mit Taqman Assays (ABI) für jedes Gentranskript (S1Tabelle), Taqman Universal Mastermix (Applied Biosystems, Foster City, CA) und Laden von Reagenz (Fluidigm), indem der Chip über den HX IFC Controller geprimt und geladen wurde und qPCR im BioMark (Fluidgm)-System durchgeführt wurde. Die relative Menge der RNA-Expression wurde unter Verwendung eines Vergleichszyklus berechnet cle Schwelle (CT)-Methode. Die Expressionswerte wurden unter Verwendung von endogener ribosomaler RNA-Referenz und universeller RNA (Agilent Inc., Santa Clara, CA) auf 18 normalisiert.

Statistik

Alle qPCR-Assays wurden doppelt ausgeführt. Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Für Vergleiche der CRM-Gene pro Phänotyp wurde ein Modell mit gemischten Effekten mit der Geisser-Greenhouse-Korrektur verwendet, wobei mehrere Vergleichskorrekturen unter Verwendung des zweistufigen Linearschrittverfahrens von Beniamini, Krieger und Yekutieli durchgeführt wurden. Pearson-Korrelation und hierarchisches Dusting wurden in Morpheus (Broad Institute) durchgeführt. Für Vorhersagemodelle für maschinelles Lernen wurden die Daten in einen Trainingssatz (8 0 Prozent) und einen Testsatz (20 Prozent) aufgeteilt. Ein anhand des Testsets validiertes Entscheidungsbaum-Klassifizierungsmodell wurde verwendet, um den genauesten uCRM-Score-Cutoff zu bestimmen. Variable Selection Using Random Forests (VSURF) wurde verwendet, um AR ys STA zu klassifizieren sowie die Wichtigkeit einzelner Gene zu bewerten und einzustufen. Die Random-Forest-Variablenwichtigkeitsausgabe ist definiert als die mittlere prozentuale Abnahmeungenauigkeit des Modells der Variablen (Gen), die aus dem Modell ausgeschlossen (zufällig permutiert) wurden. Unüberwachtes Dusting zur Visualisierung der Phänotyptrennung wurde unter Verwendung eines verteilten stochastischen Nachbar-Einbettungsalgorithmus (t-SNE) in Mathematica 11.3 (Wolfram Research, Champaign. IL) durchgeführt. Die Netzwerkanalyse der CRM-Gene wurde mit GeneMANIA [37] durchgeführt. Statistiken zu demografischen Variablen wurden unter Verwendung von Chi-Quadrat-Analysen für diskrete und des Kruskal-Wallis-Tests für kontinuierliche Variablen in IMP 14.2 (SASInstitute, Cary, NC) durchgeführt. Wenn nicht anders angegeben. alle anderen Analysen wurden mit Prism 8.0.1 (GraphPad, Carlsbad, CA) durchgeführt und visualisiert.

Studienzulassung

Die Studie wurde von den Ethikkommissionen der Stanford University Medical School und des UCSF Medical Center genehmigt. Alle erwachsenen Patienten und Eltern/Erziehungsberechtigten von nicht erwachsenen Patienten gaben unter vollständiger Einhaltung der Deklaration von Helsinki eine schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie ab. Die berichteten klinischen und Forschungsaktivitäten stehen im Einklang mit den Grundsätzen der Erklärung von Istanbul, wie sie in der Erklärung von Istanbul über Organhandel und Transplantationstourismus dargelegt sind.

AUSWIRKUNGEN VON CSITANCHE: VERBESSERUNG DER IMMUNITÄT

Ergebnisse

Klinische und demografische Ausgangsvariablen für alle 150 KTx-Empfänger mit AR-, bAR-, BKVN- und STA-Phänotypen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Relative Häufigkeit und Korrelation der CRM-Genexpression im murinen Zellsediment

Relative Fülle. Um die relative Häufigkeit der CRM-Gentranskripte in den Urinsedimenten zu bestimmen, wurden die Zyklusschwellenwerte (Ct) als Maß für die Häufigkeit verwendet. Je niedriger der Ct-Wert, desto höher ist seine Häufigkeit unter den CRM-Genen. Unter den 11 CRM-Genen war BASP1 das am häufigsten vorkommende Transkript im Harnzellsediment. Auf BASP1 folgten TAP1, PSMB9 und ISG20 als die 4 am häufigsten vorkommenden Transkripte. LCK und CD6 gehörten zu den am wenigsten häufigen Transkripten in den Urinsedimenten im CRM-Gensatz. Da die Ct-Werte vom niedrigsten Ct-Wert von 14 bis zum höchsten Ct-Wert von 20 reichten, gab es einen 64--fachen Unterschied zwischen den BASP1- und CD6-Gentranskripten, wobei CD6 das am wenigsten häufige Transkript war.

Abb. 2. Relative Häufigkeit und Korrelation der Häufigkeit von CRM-Genen im Urin und der Expression von CRM-Genen bei verschiedenen klinischen Phänotypen der Nierentransplantation. A. Pearson-Korrelationsmatrix, die die Korrelation zwischen 11 CRM-Genen in ihrer Expression in Harnzellsedimenten zeigt. Die Größe des Quadrats dient als visueller Indikator für die Stärke der Korrelation. B. Heatmap mit überwachter Clusterbildung nach Phänotyp, die die relative Expression von CRM-Genen in AR, bAR, BKVN und STA zeigt. C. Violinplots, die die Verteilung der CRM-Gene in AR-, bAR-, BKVN- und STA-Urinzellpellets darstellen. � gibt an, dass AR vs. STA nach mehreren Vergleichen signifikant war. # gibt an, dass bAR vs. STA nach mehreren Vergleichen signifikant war. Zusätzliche Statistiken sind in Tabelle 2 verfügbar.

Korrelation der Genexpression zwischen CRM-Gengenen.

Als nächstes bewerteten wir die Korrelation der Genexpression zwischen 11 CRM-Genen. Die Korrelation reichte von sehr schwach (r=-0.17 für CXCL9 und NKG7 und r=-0.10 CXCL10 und RUNX3) bis sehr stark (r=0.77 für INPP5D und TAP1 und die gleicher Wert für CD6 und LCK). Obwohl CXCL9 und CXCL10 zur selben Klasse von Chemokinen gehören, war die Genexpressionskorrelation zwischen ihnen nur moderat (r=0.46). Die grafische Darstellung der Korrelationsmatrix ist in Abb. 2A dargestellt. Eine mit Supervised Clustering erstellte Heatmap zeigt den erheblichen Anstieg der Genexpressionswerte der CRM-Gene in AR, bAR und BKVN im Vergleich zum STA-Phänotyp (Abb. 2B).

uCRM-Genexpression in Urinsedimenten mit durch Biopsie bestätigter AR und BKVN

Genexpression von CRM-Genen in AR und bAR. Als nächstes werteten wir die Genexpression jedes der 11 CRM-Gene auf ihre relative Expression in AR, bAR, BKVN und STA aus. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse der Analyse ist in Tabelle 2 und Abb. 2C dargestellt. 1 0 der 11 Gene waren in AR-Urinsedimenten im Vergleich zu Urinsedimenten von STA signifikant erhöht. Allerdings waren nur fünf CRM-Gene (Cd6, Cxcll0, Cxd9, Nkg7 und Psmb9) in bAR-Proben im Vergleich zu STA signifikant hochreguliert, und ihre Expression in der bAR-Gruppe war relativ geringer als in der nach Banff abgestuften AR-Gruppe, was hervorhebt, dass die uCRM-Gene dies können spiegeln die entzündliche Belastung innerhalb des Allotransplantats Eig 2C wider.

Tabelle 2. Genexpressionsniveaus von CRM-Genen über verschiedene Phänotypen hinweg

Genexpression von CRM-Genen in BKVN. Die Expression von CD6, CXCL10, CXCL9, LCK, NKG7 und PSMB9 war in Urinproben von Patienten mit BKVN im Vergleich zu den Proben von STA-Patienten unterschiedlich reguliert. Von den sechs Genen mit statistisch unterschiedlichen Genexpressionswerten zwischen BKVN- und STA-Proben war nur die Expression von NKG7 im BKVN-Urin wesentlich niedriger.

Bestimmung eines Urin-CRM(uCRM)-Genexpressions-Scores zur Identifizierung einer Nierentransplantatabstoßung

Da die Expression des CRM-Gensets über die Transplantatphänotypen hinweg nicht homogen war und es erhebliche physiologische Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Genen gab (S1 Abb), verwendeten wir nichtlineare überwachte Methoden, um Phänotypen weiter zu differenzieren und zu klassifizieren. Unüberwachtes Clustering über t-SNE wurde durchgeführt, um Beziehungen zwischen den uCRM-Genen und Phänotypen zu bestimmen. Fig. 3A zeigt das t-SNE-Diagramm, was darauf hinweist, dass die 11 CRM-Gene AR fast vollständig von STA-Proben trennen konnten. Das VSURF-Modell, abhängig von Random Forests Wichtigkeitswerten, bestimmte, dass PSMB9 und CXCL10 die beiden wichtigsten Gene bei der Befriedigung von AR von STA waren. Fig. 3B zeigt weiter die Bedeutung dieser 2 Gene. Das Wichtigkeitsdiagramm der Gengewichte zeigt, dass eines der beiden Gene, wenn es aus dem Modell ausgeschlossen wird, einer ungefähr 20-prozentigen Abnahme der Ungenauigkeit des Modells entspricht. Diese beiden Gene konnten AR gegenüber STA mit fast so hoher Genauigkeit klassifizieren wie das 1l-Genmodell, mit einer Sensitivität von 93,6 Prozent und einer Spezifität von 97,6 Prozent. Genexpressionsschwellenwerte für diese beiden Gene wurden durch einen Entscheidungsbaum-Klassifikator bestimmt, und die logarithmischen Werte dieser beiden Gene sind in Fig. 3C dargestellt. Ein Schwellenwert von 28 für CXCL10 und 3 für PSMB9 klassifizierte 86/88 AR- und STA-Fälle korrekt für eine Gesamtgenauigkeit von 97,7 % . Bemerkenswerterweise fielen bAR-Proben zwischen den AR- und STA-Phänotypen, was auf die Abstufung dieser beiden Gene im Grad der Allotransplantat-Entzündung hindeutet.

Um die Klassifizierungsleistung des uCRM-Scores bei AR-, Borderline-AR- und STA-Fällen zu untersuchen, wurde ein Entscheidungsbaum-Klassifikator erstellt (Abb. 4A). Der Entscheidungsbaum bestimmte optimale uCRM-Score-Schwellenwerte für jeden Phänotyp. Eine Punktzahl von mehr als 4 korrekt klassifizierte 44/49 AR-Fälle; ein Score von weniger als 1,8 klassifizierte 33/35 STA-Fälle korrekt. 14/23 Grenzfälle lagen zwischen diesen beiden Schwellenwerten. Die Verteilung der uCRM-Werte nach Phänotyp ist in Abb. 4B dargestellt. Die mittleren uCRM-Werte (SEM) für AR, bAR und STA betrugen 8,195 (0,631), 3,265 (0,412{{21). }}) bzw. 1,404 (0,162) und alle Vergleiche waren nach der Korrektur mehrerer Vergleiche signifikant. Der uCRM-Score konnte mit hoher Genauigkeit zwischen AR und STA unterscheiden – bei einem Schwellenwert von 3,63 betrug die Sensitivität und Spezifität 95,35 Prozent bzw. 97,78 Prozent (Eig 4C). Bei der Unterscheidung zwischen AR und der Kombination aus bAR und STA blieb der uCRM-Score erhalten eine hohe Genauigkeit bei gleicher Schwelle, die Sensitivität und Spezifität betrugen 87,10 Prozent bzw. 97,78 Prozent (S2A Abb.).

Bei Einbeziehung der BKVN-Proben waren alle Phänotypen nach mehrfacher Vergleichskorrektur außer bAR und BKVN (S2BFig) signifikant voneinander verschieden. Bei der Unterscheidung zwischen AR und der Kombination aus bAR, STA und BKVN behielt der uCRM-Score immer noch eine hohe, aber geringere Genauigkeit. Unter Verwendung derselben Schwellenwerte von 3,63 betrugen die Sensitivität und Spezifität 76,92 Prozent bzw. 97,78 Prozent (S2CFig).

Der ComScore korreliert mit AR-spezifischen bioptischen histologischen Läsionen. Insbesondere der Trend, den uCRM-Score von STA zu bAR zu AR zu erhöhen, deutete darauf hin, dass der uCRM-Score klinisch relevante Gradationen von Entzündungen erkennen könnte. Daher bewerteten wir, ob der uCRM-Score mit dem Ausmaß der histologischen AR-Läsionen assoziiert war, die in übereinstimmenden Biopsien desselben Patienten beobachtet wurden, die gleichzeitig entnommen wurden. Wie in Abb. 5A und 5B zu sehen ist, korrelierten die uCRM-Scores mit dem Ausmaß der Tubulitis (t) und den Biopsie-Scores der interstitiellen Entzündung (i) in AR(R=0.5479, P<0.0001 and="" r="0.4420,"><0.0001 for="" the="" ucrm="" score="" regarding="" t="" and="" ii,="" respectively).="" there="" was="" no="" correlation="" between="" the="" ucrm="" score="" and="" measures="" of="" tubular="" atrophy="" (ta),glomerulosclerosis="" (gs),mesangial="" matrix="" (mm),="" intimal="" proliferation="" (cv),="" medial="" arteriolar="" hyaline="" (ah),="" tubular="" vacuolization(tv),="" arteritis="" (v),="" or="" acute="" glomerulitis="">

WIRKUNGEN VON CSITANCHE: ANTI-MÜDIGKEIT

Diskussion

In der Transplantationsmedizin besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung zuverlässiger und nicht-invasiver Überwachungsinstrumente, die Transplantationsmedizinern helfen können, das Risiko einer Verletzung durch Allotransplantate vorherzusagen, vorzugsweise bevor eine Schädigung durch Allotransplantate bereits festgestellt wurde. Während eine Reihe von Transkriptionsbiomarkern mit AR in Verbindung gebracht wurden, konzentrierten sich die meisten Studien im Wesentlichen auf einen einzigartigen oder einzelnen Transkriptionsfaktor und spiegeln nicht die gesamte molekulare Komplexität des biologischen Prozesses der Allotransplantatabstoßung wider [11,38]. Obwohl der derzeitige Goldstandard für die Diagnose des Vorhandenseins einer immunvermittelten Allotransplantatverletzung die Allotransplantatbiopsie ist, ist bekannt, dass das Verfahren wesentliche Einschränkungen hinsichtlich der häufig unregelmäßigen Probendarstellung, seiner hohen Kosten und der Unpraktikabilität für Wiederholungen aufweist Screening aufgrund der invasiven Natur der Technik.

Mehrere Berichte haben den Wert der Untersuchung verschiedener Biomarker gezeigt, die AR in Urinproben von Empfängern einer Nierentransplantation vorhersagen [20-22]. Erhöhte Urinspiegel von Immuneffektormolekülen und Transkripten wie Granzym B. CXCL10.CXCL9.IFN-y und CXCR3. haben gezeigt, dass sie stark mit AR assoziiert sind und in einigen Fällen sogar das Aufkommen von AR im Voraus vorhersagen [19,24,39-43]. Unter Ausnutzung kürzlich gemeldeter Daten unserer Gruppe [2Z, 29,44], die unabhängig von der Art des Gewebeorgans ein gemeinsames Abstoßungsmodul der Genexpression in Allotransplantatbiopsien während AR zeigten, war das Hauptziel dieser Studie zu untersuchen, ob die Bewertung des CRM im Urin von Nierentransplantationspatienten könnte als idealer nicht-invasiver Biomarker nützlich sein, der das Auftreten von AR vorhersagt.

Während viele der einzelnen CRM-Gene und Genprodukte einzeln bewertet wurden, ist dies der erste Bericht über die kollektive, nichtinvasive Verwendung der CRM-Gene bei der Vorhersage von AR bei KTx. Beispielsweise wurden CXCL9-mRNA und -Protein aus dem Urin und CXCL10-mRNA zuvor in multizentrischen Studien zur Diagnose von AR untersucht[13,45,46. 47].

Wir haben Genexpressionsdaten von Urinsedimenten von KTx-Patienten auf die relative Häufigkeit von CRM-Transkripten und ihre Korrelation der Expression zwischen CRM-Genen analysiert (Abb. 2A). die CRM-Gene zeigten eine erhöhte Expression bei AR und anderen Transplantatverletzungen wie AR und BKVN (Fig. 2B und 2C). In diesem Bericht beobachteten wir auch eine starke Korrelation zwischen dem neu entwickelten uCRM-Score und histologischen Entzündungsscores (t- und ii-Scores von Nierenbiopsien). Da die meisten dieser CRM-Gene fast ausschließlich in infiltrierenden Immunzellen exprimiert werden, legt die erhöhte Expression von CRM-Genen in Urinsedimenten nahe, dass es zu einer erhöhten Freisetzung von infiltrierenden Immunzellen im Urin von Empfängern von Nierentransplantaten kommt, die sich einer Transplantatverletzung unterziehen.

Als nächstes verwendeten wir einen kombinierten Score, der aus individuellen Genexpressionswerten einzelner CRM-Gene berechnet wurde, den ComScore, als Metrik, um Nierentransplantationspatienten entweder in Patienten mit akuter Abstoßung oder ohne Verletzung zu klassifizieren, und bestimmten einen Schwellenwert für AR. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass der uCRM-Assay nicht nur Patienten mit AR identifiziert, sondern auch den Grad der Verletzung im Allotransplantat quantifiziert, da die Punktzahl von niedrigen Werten bei STA-Patienten auf mittlere Werte bei bAR-Patienten ansteigt. und zu hohen Werten bei AR-Patienten, wie sich in den histologischen Werten für Tubulitis und interstitielle Entzündung widerspiegelt. Wir glauben, dass der uCRM-Score bei der Transplantationsüberwachung von Nutzen sein kann und als Ergänzung oder Referenztest für Biopsien dienen kann. Ein Patient mit einem niedrigen uCRM-Score kann möglicherweise unnötige Protokollbiopsien vermeiden, während ein Patient mit einem hohen uCRM-Score möglicherweise eine serielle Überwachung oder eine Biopsie aus ursächlichen Gründen benötigt, um den Transplantatstatus zu beurteilen.

Wir erkennen mehrere Einschränkungen dieser Studie an, darunter (i) die begrenzte Stichprobengröße der Studie, (ii) das Fehlen anderer Phänotypen von Transplantatverletzungen wie chronische Transplantatverletzungen oder Arzneimitteltoxizität und (i) das Fehlen einer Bewertung des uCRM-Scores in einem Längsschnitt Stichprobe in größerer Kohortengröße. Diese vielversprechenden Ergebnisse legen nahe, dass weitere prospektive Studien erforderlich sind, um den potenziellen Nutzen des uCRM-Scores im klinischen Umfeld zu validieren und vollständig zu bewerten. Zusammenfassend präsentieren wir einen nicht-invasiven, urinbasierten Biomarker, der aus einem gemeinsamen Abstoßungsmodul entwickelt wurde, das aus 11 Genen besteht, die Transplantationsverletzungen und Abstoßungsreaktionen bei Nierentransplantationspatienten identifizieren können.

AUSWIRKUNGEN VON CSITANCHE: VERBESSERN SIE DAS GEDÄCHTNIS

Verweise

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