Alginat-Oligosaccharid lindert D-Galactose-induzierte kardiale Alterung durch Regulierung der myokardialen Mitochondrien-Funktion und -Integrität bei Mäusen

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Abstrakt

Das Altern ist ein entscheidender Risikofaktor für die Entstehung altersbedingter Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Daher müssen die molekularen Mechanismen des Alterns und neuartige Anti-Aging-Interventionen gründlich untersucht werden. Alginat-Oligosaccharid (AOS) besitzt hohe pharmakologische Aktivitäten und vorteilhafte Wirkungen. Unsere Studie wurde durchgeführt, um zu untersuchen, ob AOS als Anti-Aging-Medikament zur Linderung der Herzalterung eingesetzt werden kann. D-Galactose (D-gal)-induzierte alternde C57BL/6J-Mäuse wurden durch subkutane Injektion von D-gal (200 mg-kg'-d') für 8 Wochen etabliert. AOS (50.100 und 150 mg; kg'l.d') wurden in den letzten 4 Wochen intragastrisch verabreicht. Als Ergebnis verhinderte AOS eine kardiale Dysfunktion bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen, einschließlich teilweise erhaltener Ejektionsfraktion (EF Prozent) und fraktionierter Verkürzung (FS Prozent).cistanche benefíciosAOS hemmte dosisabhängig die D-gal-induzierte Hochregulierung der natriuretischen Peptide A (ANP), des natriuretischen Peptids (BNP) und der Alterungsmarker p53 und p21. Um die potenziellen Mechanismen, die zur Anti-Aging-Schutzwirkung von AOS beitragen, weiter zu untersuchen, wurde die altersbedingte mitochondriale Beeinträchtigung analysiert. Unsere Daten zeigten, dass AOS die D-Gal-induzierte Herzalterung linderte, indem es die mitochondriale Biogenese verbesserte, die mitochondriale Integrität aufrechterhielt und die effiziente Entfernung von beeinträchtigten Mitochondrien verbesserte. AOS verringerte auch die ROS-Produktion und den oxidativen Stressstatus, was wiederum die Zerstörung der Herzmitochondrien weiter verhindert. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass AOS ein wirksames therapeutisches Mittel sein kann, um die Herzalterung zu lindern.

SCHLÜSSELWÖRTER

Alginat-Oligosaccharid, Herzalterung, D-Galactose, Mitochondrien, oxidativer Stress

1|EINLEITUNG

Altern kann allgemein als zeitabhängige Akkumulation von Zellschäden definiert werden, die den fortschreitenden Funktionsabfall von Geweben und Organen verursachen.¹ Im Allgemeinen umfassen altersbedingte Veränderungen des Herzens hauptsächlich linksventrikuläre Hypertrophie, erhöhte Myokardfibrose und Herzinsuffizienz.Cistanche-Extrakt gegen StrahlungDas Altern ist ein entscheidender Risikofaktor für die Entstehung altersbedingter Herz-Kreislauf-Erkrankungen, was zu einer deutlich erhöhten Prävalenz von Herz-Kreislauf-Erkrankungen in der alternden Bevölkerung führt.23 Daher werden wirksamere Behandlungsstrategien zur Behandlung der altersbedingten Herzinsuffizienz dringend benötigt .

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Alginat ist ein natürliches, aus Algen gewonnenes Polysaccharid, das aus Braunalgen gewonnen wird. Alginat-Oligosaccharid (AOS) wird durch Depolymerisation von Alginat hergestellt, das mehrere einzigartige Vorteile hat, wie z. B. wasserlöslich, ungiftig, nicht immunogen und biologisch abbaubar. AOS übt vielversprechende biologische Aktivitäten aus. Dieses Oligosaccharid besitzt neuroprotektive, hypolipidämische, antioxidative, „entzündungshemmende,“ antiaggregatorische, „tumorhemmende,10 antibakterielle und immunregulatorische Eigenschaften“ und unterdrückt Fettleibigkeit¹ und fortgeschrittene Glycation-Endprodukt (AGE)-Aktivitäten .4 Bemerkenswert ist, dass keine Studien die Fähigkeit von AOS zum Schutz vor Herzalterung untersucht haben.

Mitochondrien sind doppelmembranige Organellen und erfüllen mehrere Funktionen in der zellulären Bioenergetik und im Stoffwechsel.14 Das Herz ist ein Organ mit hohem Energiebedarf und hohem Anteil an Mitochondrien. Herz-Mitochondrien erzeugen 90 Prozent des ATP und spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung eines gesunden Herzens.cistanche herbaMitochondriale Dysfunktion, die den Alterungsprozess bei Säugetieren beschleunigen kann, ist einer der wichtigsten Mechanismen des Alterns.15;16 Altersbedingte mitochondriale Dysfunktion zeigt verschiedene Merkmale, darunter Verlust der mitochondrialen Integrität, verringerte Effizienz der mitochondrialen Biogenese, mangelhafte Qualität Kontrolle durch Autophagie, verringertes mitochondriales Membranpotential (MMP), Veränderungen in der mitochondrialen Dynamik, erhöhte Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und Akkumulation von Mutationen in mitochondrialer DNA (mtDNA).17 Die Kombination aus erhöhter Schädigung und verringerter Erneuerung der Mitochondrien kann schließlich zum Alterungsprozess beitragen.18,17 Darüber hinaus führt die fortschreitende mitochondriale Dysfunktion zu einer erhöhten Produktion von ROS und oxidativem Stress, die wiederum eine weitere Verschlechterung der Mitochondrien und Zellschäden verursachen und letztendlich dazu beitragen zu altersbedingter Herzfunktionsstörung.20

Cistanche kann Anti-Aging

D-Galactose (D-Gal)-induzierte Alterungs-Tiermodelle wurden häufig verwendet, um Alterungsmechanismen und Anti-Aging-Wirkungen von Arzneimitteln zu untersuchen Alterungsprozess und schließlich zu strukturellen und funktionellen Veränderungen im kardiovaskulären System führen.22 Daher haben wir in der aktuellen Studie das D-Gal-induzierte Maus-Alterungsmodell etabliert, um die antikardiale Alterungsaktivität von AOS systemisch zu evaluieren und weiter zu untersuchen der mögliche zugrunde liegende Mechanismus.

2|MATERIALEN UND METHODEN

2.1|Medikamente und Reagenzien

D-Galactose wurde von Sigma-Aldrich bezogen. AOS wurde von Qingdao BZ Oligo Biotech Co., Ltd. bezogen. Malondialdehyd (MDA)-Assay-Kit wurde vom Jiancheng Bioengineering Institute bezogen. Polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen BNP, PGC-1a, p67-phox und gp91-phox wurden von Abcam Inc. erhalten. Kaninchen-monoklonale Antikörper gegen natriuretische Peptide A (ANP) und SIRT3 und monoklonale Maus-Antikörper gegen p53 wurden von Abcam Inc. erhalten. Polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen beclin-1 und p-mTOR wurden von Cell Signaling Technology erworben. Polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen p21 und monoklonaler Maus-Antikörper gegen p47-phox wurden von Santa Cruz Biotechnology, Inc. bezogen. Polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen mTOR wurden von Proteintech Group, Inc. bezogen. Mitochondrien-Extraktionskit und JC{{14} } Mitochondrienmembranpotential-Assay-Kit wurde von Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. erworben. TIANamp Genomic DNA Kit wurde von Tiangen Biotech (Beijing) CO., LTD. erhalten.Wachstum des Cistanche-PenisMaus-mtDNA-Sonden-PCR-Kit wurde von Beijing Tiandz Gene Technology CO., Ltd. gekauft. Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H＋L) (Peroxidase/HRP-konjugiert) und Ziegen-Anti-Maus-IgG (H plus L) (Peroxidase/HRP-konjugiert) wurden gekauft von Elabscience Biotechnology Co., Ltd. Alle anderen Chemikalien und Reagenzien wurden von handelsüblichen Standardlieferanten bezogen, sofern nicht anders angegeben.

2.2|Tiere

Männliche 8-Wochen alte C57BL/6J-Mäuse (20 ± 2 g Körpergewicht, n=40) wurden von Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co, LTD. erhalten. Alle Mäuse wurden mit normaler Nahrung gefüttert und in einem Zyklus von 12- Stunden Licht/12- Stunden Dunkelheit unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen im Labortierzentrum der medizinischen Fakultät der Universität Qingdao gehalten . Alle tierexperimentellen Verfahren entsprachen dem „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals“, herausgegeben von den US National Institutes of Health und der Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals. Die Studienprotokolle wurden vom Ausschuss für Ethik bei Tierversuchen der Universität Qingdao genehmigt (Genehmigungsnummer: QYFYWZLL25840).

2.3|D-Gal-induziertes Alterungsmodell und Arzneimittelverabreichung

Die Mäuse wurden zufällig in fünf Gruppen eingeteilt (n =8 jede Gruppe): Kontrolle, D-Gal, D-Gal plus niedrig dosiertes AOS (D-Gal plus AOS-50), D-Gal plus Mitteldosis-AOS (D-gal plus AOS-100) und D-gal plus Hochdosis-AOS (D-gal plus AOS-150) Gruppen. Das Altern wurde in C57BL/6J-Mäusen durch subkutane Injektion von D-Gal (200 mg/kg, Sigma-Aldrich) für 8 Wochen induziert.23,24 Den Kontrollmäusen wurde eine subkutane Injektion von gleichwertigem sterilem Wasser verabreicht. Vier Wochen nach der Injektion von D-gal wurde den Gruppen D-gal plus AOS-50, D-gal plus AOS-100 und D-gal plus AOS-150 intragastrisch AOS verabreicht ( 50, 100 und 150 mg-kg2-d'l) jeweils für weitere 4 Wochen. Die Mäuse der Kontrollgruppe und der D-Gal-Gruppe erhielten eine intragastrale Verabreichung einer äquivalenten Kochsalzlösung.

2.4|Echokardiographie

Echokardiographie wurde an anästhesierten Mäusen unter Verwendung eines Vevo2100 (VisualSonics) mit einem 30- MHz-Wandler am Ende des Experiments durchgeführt. Die folgenden Parameter wurden wie zuvor beschrieben gemessen: linksventrikuläre Ejektionsfraktion (EF) und linksventrikuläre fraktionale Verkürzung (FS).25

2.5|Histologische Analyse

Die Herzproben wurden mit 4 Prozent Paraformaldehyd für 24 Stunden fixiert und dann in Paraffin eingebettet und in 4- µm dicke Schnitte geschnitten. H&E- und Masson-Trichrom-Färbung wurden verwendet, um die Herzarchitektur bzw. Herzfibrose sichtbar zu machen. Die Schnitte wurden unter einem Umkehrlichtmikroskop (TE 200, Nikon) untersucht. Entsprechende Daten wurden von Prüfärzten analysiert und berechnet, die gegenüber der Behandlungsgruppenzuordnung verblindet waren.

2.6|Transmissionselektronenmikroskopie

Die Ultrastruktur der Mitochondrien wurde mittels Transmissionselektronenmikroskopie-Analyse bestimmt. Nach der vorherigen Studie wurden 26 frische linksventrikuläre Gewebe in 1-mm³-Blöcke geschnitten und 2 Stunden lang bei 4 Grad in 2,5-prozentigem Glutaraldehyd fixiert. Nach einer Nachfixierung in 1 Prozent Osmiumtetroxid für 2 Stunden bei Raumtemperatur wurden die linksventrikulären Gewebe dehydriert und dann in Harz eingebettet. Serielle Ultradünnschnitte (30-40 nm) wurden auf Kupfergittern gesammelt und schließlich mit 0,5 % Uranylacetat, gefolgt von 1 % Bleicitrat, gefärbt. Die Ultrastrukturanalyse der gefärbten Schnitte wurde unter einem Tecnai G2 12-Transmissionselektronenmikroskop (FEI Co.) durchgeführt.

2.7|Bestimmung des Mitochondrienmembranpotentials (MMP).

Mitochondrienmembranpotential wurde unter Verwendung der JC-1-Immunfluoreszenzfärbung und Durchflusszytometrie gemessen. Frisches Herzgewebe wurde verwendet, um Gefrierschnitte herzustellen oder Mitochondrien zu extrahieren. Gefrorene Schnitte wurden für die JC-1-Immunfluoreszenzfärbung gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet.Cistanche-Salsa-VorteileDie Fluoreszenz wurde bei Anregung/Emission 485/580 nm (rot) und Anregung/Emission 485/530 nm (grün) unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops bestimmt.

Darüber hinaus wurden Mitochondrien aus frischem Herzgewebe unter Verwendung des mitochondrialen Extraktionskits gemäß dem von Peng et al. {2}}. Kurz gesagt, Mitochondrien wurden mit JC-1 in JC-1 Assay Buffer für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazon wurde aufgetragen, um MMP aufzubrechen, und diente gemäß den Anweisungen des Herstellers als positive Kontrolle. Die Proben wurden bei 488 und 575 nm durch Durchflusscytometrie unter Verwendung der CellQuest Software (Becton Dickinson) analysiert.

2.8|Messung der mtDNA-Kopienzahl

Mitochondriale DNA-Kopienzahl wurde durch quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) gemessen. Kurz gesagt, Herzgewebe wurden homogenisiert und Proteine ​​und RNAs unter Verwendung von Proteinase K und RNaseA entfernt. Die Gesamt-DNAs wurden mit dem TIANamp Genomic DNA Kit extrahiert und dann mit dem QuickDrop Spectrophotometer von Molecular Devices (Holliston, MA) quantifiziert. Maus-mtDNA-Sonden-PCR-Kit wurde verwendet, um die mtDNA der Probe durch das Fluoreszenz-PCR-Detektionssystem (Hangzhou Bioer Technology Co. Ltd.) zu amplifizieren. Die mtDNA-Kopienzahl wurde aus der qPCR-Positivkontrollkurve gemäß dem Protokoll des Herstellers berechnet.

2.9|In-situ-Nachweis der ROS-Produktion

Wie zuvor beschrieben, wurde eine DHE-Fluoreszenzfärbung durchgeführt, um das In-situ-Niveau der ROS-Produktion zu bewerten.2³ Kurz gesagt, frisches Herzgewebe wurde in eine OCT-Verbindung eingebettet und dann sofort unter Verwendung eines Kryostaten bei -20 Grad eingefroren. Das gefrorene Herzgewebe wurde in 6- um dicke histologische Objektträger geschnitten. Herzschnitte wurden mit 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und dann mit DHE-Lösung (5 &mgr;mol/l) in einer lichtgeschützten befeuchteten Kammer bei 37 Grad für 30 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurden Herzquerschnitte mit 1 × PBS gespült. Schließlich wurden Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop erhalten, und die Fluoreszenzintensität wurde von einem Blindtester mit der ImageJ-Software quantifiziert.

2.10|Messung der Lipidperoxidation

Als die wichtigsten sekundären Oxidationsprodukte der Lipidperoxidation wurde die Konzentration von Malondialdehyd (MDA) in Serum- und Herzhomogenaten gemäß den Anweisungen des MDA-Assay-Kits (Jiancheng Bioengineering Institute) gemessen.

2.11|Western-Blot-Analyse

Herzgewebe wurden in RIPA-Puffer homogenisiert, der Phosphatase- und Protease-Inhibitoren enthielt, und bei 12 00 U/min bei 4 Grad für 20 Minuten zentrifugiert. Dann wurde der Überstand für nachfolgende Experimente gesammelt. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung eines BCA-Protein-Assay-Kits bestimmt. Gleiche Proteinmengen wurden in 10 % SDS-PAGE-Gel gegeben und auf PVDF-Membranen (Roche) übertragen. Die Membranen wurden mit der Versiegelungslösung für 1 Stunde blockiert und mit entsprechenden Primärantikörpern über Nacht bei 4 Grad inkubiert. Dann wurden die Membranen in TBS-T gewaschen und mit den geeigneten sekundären Antikörpern inkubiert. Anschließend wurden die Membranen in TBS-T gewaschen und unter Verwendung der ECL-Western-Blotting-Nachweisreagenzien (Bio-Rad) sichtbar gemacht. Die Proteinexpression wurde durch Densitometrie-Analyse von Banden unter Verwendung der ImageJ-Software quantifiziert. Als Ladekontrolle wurde das Haushaltsprotein GAPDH verwendet. Die Verdünnungsverhältnisse der primären und sekundären Antikörper wurden wie folgt gezeigt:ANP(1:1000),BNP(1:2000),p53(1:1000),p21 (1:1000),PGC-1 a (1:1000),SIRT3(1:1000),beclin-1(1:1000),p-mTOR(1:1000),mTOR (1:1000),p47-phox( 1:500),p67-phox(1:1000),gp91-phox(1:2000), GAPDH (1:2000), Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H ＋ L)(Peroxidase /HRP-konjugiert) (1:5000) und Ziegen-Anti-Maus-IgG (H＋L) (Peroxidase/HRP-konjugiert) (1:5000).

2.12|statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wurde mit der einfachen ANOVA, gefolgt von dem Post-hoc-Test von Student-Newman Keuls (SNK), bestimmt<.05 was="" considered="" to="" be="" statistically="">

3|ERGEBNISSE

3.1|Auswirkungen von AOS auf die Herzfunktion und die Expression von Alterungsmarkern bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen

Echokardiographie wurde verwendet, um die Herzfunktion von Mäusen zu analysieren. D-Gal-induzierte alternde Mäuse zeigten eine signifikante Abnahme des EF-Prozentsatzes und des FS-Prozentsatzes. AOS verhinderte jedoch signifikant Herzfunktionsstörungen bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen, einschließlich teilweise erhaltener EF-Prozent und FS-Prozent (Abbildung 1A-C). Wie in Abbildung 1D-G gezeigt, gab es keinen statistischen Unterschied in der Herzfrequenz zwischen jede Gruppe. D-Galactose-Mäuse hatten eine Tendenz, LVEDD (linker ventrikulärer enddiastolischer Durchmesser) und LVPWd (linke ventrikuläre hintere Wanddicke am Ende der Diastole) zu erhöhen, aber es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied im Vergleich zu den Kontrollmäusen. LVESD (linksventrikulärer endsystolischer Durchmesser) war jedoch bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen signifikant erhöht, und AOS verringerte LVESD in dosisabhängiger Weise. Die Expression von ANP und BNP im Herzgewebe wurde durch Western Blot bestimmt, um die Herzfunktion von Mäusen in jeder Gruppe weiter zu verifizieren. Wie in Abbildung 1H-I gezeigt, waren die ANP- und BNP-Spiegel bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen signifikant erhöht, und AOS verringerte die ANP- und BNP-Spiegel in dosisabhängiger Weise signifikant. Diese Daten zeigten, dass AOS Herzfunktionsstörungen bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen verhinderte. Darüber hinaus haben wir die Proteinexpression der Alterungsmarker p53 und p21 nachgewiesen. Wie erwartet war die p53- und p21-Proteinexpression in Herzgeweben von D-Gal-induzierten alternden Mäusen signifikant erhöht, und AOS verringerte die p53- und p21-Expression dosisabhängig signifikant (Abbildung 1J-K).

3.2|Wirkung von AOS auf kardiale histopathologische Veränderungen bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen

Um die Veränderungen der myokardialen Architektur von Mäusen zu untersuchen, wurden Herzgewebeschnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Wie in 2A gezeigt, zeigten D-Gal-induzierte alternde Mäuse im Vergleich zu den Kontrollmäusen eine anormale myokardiale Architektur, die hauptsächlich durch eine ungeordnete Anordnung von Kardiomyozyten und einen vergrößerten interzellulären Raum zwischen Zellen gekennzeichnet war. Die AOS-Verabreichung reduzierte signifikant die ungeordnete Anordnung und den Zwischenraum zwischen Kardiomyozyten. Die H&E-Färbung zeigte auch, dass die linke ventrikuläre Kardiomyozytenfläche bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen signifikant erhöht war und die AOS-Behandlung die Kardiomyozytenfläche dosisabhängig signifikant verringerte (Abbildung 2B,D).

Um den Grad der Herzfibrose zu klären, wurde Masson's Tri-Chrom-Färbung von Herzquerschnitten durchgeführt. Wie in Abbildung 2C,E gezeigt, war die Kollagenakkumulation in interstitiellen und perivaskulären Regionen des Myokards bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen dramatisch erhöht. Im Vergleich zur D-Gal-Gruppe verringerte die AOS-Behandlung jedoch den Prozentsatz der Kollagenfläche dosisabhängig signifikant (Abbildung 2C, E). Diese Daten legten nahe, dass AOS D-Gal-induzierte morphologische Veränderungen und Herzfibrose bei C57BL/6J-Mäusen verhinderte.

3.3|Wirkung von AOS auf die kardiale mitochondriale Ultrastruktur von D-Gal-induzierten alternden Mäusen

Als nächstes verwendeten wir Transmissionselektronenmikroskopie, um die Veränderung der kardialen mitochondrialen Ultrastruktur nachzuweisen. Wie in Fig. 3 gezeigt, waren die Kardiomyozyten-Mitochondrien von Kontrollmäusen strukturell normal und zeigten deutlich erkennbare Cristae und eine elektronendurchlässige Matrix. Einige Kardiomyozyten-Mitochondrien von D-Gal-Mäusen waren jedoch vergrößert, Schwellungen und teilweiser Verlust von Cristae, und die AOS-Behandlung verhinderte die Zerstörung der kardialen mitochondrialen Ultrastruktur bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen.

3.4|Wirkung von AOS auf die kardiale MMP von D-Gal-induzierten alternden Mäusen

Als wichtige Determinante des funktionellen Zustands von Mitochondrien wurde MMP mittels JC-1-Fluoreszenzfärbung und Durchflusszytometrie gemessen. Wenn das Membranpotential der Mitochondrien hoch ist, aggregiert JC-1 im Allgemeinen in Mitochondrien und emittiert rote Fluoreszenz, während JC-1 als Monomer im Cytosol existiert und grüne Fluoreszenz emittiert, wenn Mitochondrien ein niedriges Membranpotential aufweisen.29 So das Verhältnis von roter Fluoreszenz zu grüner Fluoreszenz könnte die Intensität von MMP widerspiegeln. Wie in Abbildung 4A-B gezeigt, zeigte das Ergebnis der JC-1-Fluoreszenzfärbung, dass die Menge an kardialem MMP in D-Gal-induzierten alternden Mäusen dramatisch niedriger war als die in Kontrollmäusen, und die AOS-Verabreichung schützte vor D- Galactose-vermittelter Rückgang von MMP. Im

3.5|Wirkung von AOS auf die mitochondriale Biogenese und Autophagie-Proteinexpression in den Herzen von D-Gal-induzierten alternden Mäusen

Wir verwendeten Western Blot, um die Proteinexpression des mitochondrialen Biogenesemarkers PGC-1a zu bestimmen. Wie erwartet wurde eine signifikante Abnahme der PGC-1o-Proteinexpression in Herzgeweben von D-gal-induzierten alternden Mäusen beobachtet, und AOS erhöhte die PGC-1a-Expression dosisabhängig signifikant Weise (Abbildung 5A-B). Studien haben gezeigt, dass SIRT3 eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der mitochondrialen Bioenergetik spielt. Daher haben wir weiterhin die SIRT3-Expression in Herzgeweben nachgewiesen. Unser Ergebnis zeigte, dass eine signifikante Abnahme der SIRT3-Proteinexpression bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen und AOS die SIRT3-Proteinexpression dosisabhängig signifikant erhöhten (Abbildung 5C-D). Darüber hinaus zeigte das mtDNA-Sonden-PCR-Ergebnis, dass die mtDNA-Kopienzahl bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen signifikant verringert war und AOS die mtDNA-Kopienzahl dosisabhängig signifikant erhöhte (Abbildung 5E). Diese Daten zeigten, dass AOS die mitochondriale Biogenese in D-gal-induzierten alternden Mäusen hochregulierte.

Als nächstes verwendeten wir Western Blot, um die Expression und Phosphorylierung kritischer Autophagie-Regulatoren in Herzgeweben zu bestimmen. Wie in Abbildung 5F-I gezeigt, wurden eine signifikante Abnahme der beclin-1-Proteinexpression und eine signifikante Zunahme der mTOR-Phosphorylierung in Herzgeweben von D-gal-induzierten alternden Mäusen beobachtet. Wie erwartet erhöhte AOS die beclin-1-Expression signifikant und verringerte die mTOR-Phosphorylierung dosisabhängig.

3.6|Wirkung von AOS auf die ROS-Produktion und oxidativen Stress in den Herzen von D-Gal-induzierten alternden Mäusen

Wir bestimmten die ROS-Produktion in den Herzen mittels DHE-Fluoreszenzfärbung. Wie in 6A –B gezeigt, fanden wir heraus, dass die linksventrikuläre Kardiomyozyten-DHE-Fluoreszenzintensität bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen signifikant erhöht war und AOS die linksventrikuläre Kardiomyozyten-DHE-Fluoreszenzintensität signifikant verringerte.

Um die Wirkung von AOS auf den oxidativen Stressstatus in den Herzen von D-Gal-induzierten alternden Mäusen zu untersuchen, verwendeten wir Western Blot, um die Proteinexpression von NADPH-Oxidase in Herzgeweben zu bestimmen. Die Expression der NADPH-Oxidase-Untereinheit p47-phox, p67-phox und gp91-phox war bei D-gal-induzierten alternden Mäusen signifikant erhöht. AOS verringerte jedoch die Expression dieser NADPH-Oxidase-Untereinheiten in dosisabhängiger Weise (Fig. 6C-D).

Da MDA als mutmaßlicher Biomarker für die Lipidperoxidation in lebenden Organismen gilt, haben wir außerdem die MDA-Konzentration nachgewiesen, um den oxidativen Stressstatus in vivo zu bewerten. Wie in Abbildung 6E-F gezeigt, wurde ein erhöhter oxidativer Stressstatus bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen durch eine höhere Konzentration von MDA in Serum- und Herzhomogenaten bestätigt. Die Verabreichung von AOS verringerte die MDA-Spiegel dosisabhängig im Vergleich zur D-Gal-Gruppe. Zusammengenommen zeigten diese Daten, dass AOS die ROS-Produktion und den oxidativen Stressstatus bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen signifikant verringerte.

4|DISKUSSION

Altern ist eine chronische und multiorganbezogene systemische Veränderung des Organismus. Die zunehmenden altersbedingten Herz-Kreislauf-Erkrankungen und die daraus resultierende finanzielle Belastung sind zu einer vorherrschenden weltweiten Herausforderung geworden.30,31 Daher müssen die molekularen Mechanismen der Herzalterung eingehend untersucht werden, und neuartige Anti-Aging-Interventionen werden von großer Bedeutung sein Verbesserung der Gesundheitsspanne sowie Verzögerung einer altersbedingten Herzinsuffizienz.

Alginat ist ein lineares Copolymer aus Polysacchariden, das aus Braunmeeralgen extrahiert wird. Aufgrund seines hohen Molekulargewichts und seiner Viskosität ist es für Alginat schwierig, Zellmembranen und biologische Barrieren zu überwinden, was seine Verwendung einschränkt. AOS, das aus der Hydrolyse von Alginat stammt, hat aufgrund seines niedrigeren Molekulargewichts und seiner niedrigeren Viskosität zunehmende Aufmerksamkeit auf sich gezogen. AOS ist eine wasserlösliche, ungiftige, nicht immunogene und biologisch abbaubare Verbindung und hat viel bessere biologische Aktivitäten als Alginat.' Es gibt Hinweise darauf, dass AOS als antioxidatives Oligosaccharid die Fähigkeit hat, neurodegenerativen Erkrankungen und akuter Kardiotoxizität von Doxorubicin vorzubeugen, indem es den Stress des endoplasmatischen Retikulums und oxidativen Stress hemmt Hyperlipidämie, Hyperglykämie und Bluthochdruck und die Unterdrückung von Fettleibigkeit.27 Die Fähigkeit von AOS, vor Alterung zu schützen, wurde jedoch nicht nachgewiesen.

Frühere Studien weisen darauf hin, dass das alternde Herz einzigartige histologische und funktionelle Merkmale aufweist, darunter eine fortschreitende Remodellierung des Herzens und eine Verschlechterung der Herzreserve.25,32 Die intrinsische Alterung des Herzens kann schließlich zu einer erhöhten Anfälligkeit für verschiedene Stressoren führen und die Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen begünstigen . D-Gal-induzierte vorzeitige Alterungsmodelle zeigen ähnliche Phänotypen von Herzveränderungen im Vergleich zur natürlichen Alterung bei Nagetieren.*4 In dieser Studie zeigten wir, dass D-Gal-induzierte alternde Mäuse eine abnormale Myokardarchitektur und eine erhöhte Kollagenansammlung im Myokardinterstitial aufwiesen und perivaskulären Regionen, und die AOS-Verabreichung hemmte den durch D-gal in C57BL/6J-Mäusen induzierten Herzumbau. Unterdessen fanden wir heraus, dass AOS Herzfunktionsstörungen bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen verhinderte, einschließlich teilweise erhaltenem EF-Prozent und FS-Prozent, und die Expression von ANP und BNP verringerte. Echokardiographie wurde auch verwendet, um die Veränderungen der Herzstruktur von Mäusen zu analysieren. D-Galactose-Mäuse hatten eine Tendenz, LVEDD und LVPWd zu erhöhen, aber es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied im Vergleich zu den Kontrollmäusen. LVESD war jedoch bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen signifikant erhöht, und AOS verringerte LVESD in dosisabhängiger Weise. Der Grund für dieses Phänomen kann darin liegen, dass das D-Galactose-Mimic-Accelerated-Ageing-Modell eine relativ kurze Modellierungszeit hat, was hauptsächlich die mitochondriale Funktion beeinflusst, wie unten gezeigt, und zu Herzdysfunktion führt. Es traten größere Herzstrukturveränderungen auf, die jedoch nicht zu statistisch signifikanten Unterschieden führten. Darüber hinaus zeigten unsere Daten auch, dass die AOS-Verabreichung die Expression der Alterungsmarker p53 und p21 dosisabhängig signifikant verringerte. Um die möglichen Mechanismen, die zur Anti-Aging-Schutzfähigkeit von AOS beitragen, weiter zu untersuchen, wurde die altersbedingte mitochondriale Beeinträchtigung analysiert.

Das Herz enthält aufgrund seines außerordentlichen Bedarfs an ATP zahlreiche Mitochondrien. Mitochondrien erzeugen ATP durch oxidative Phosphorylierung von Fettsäuren und Kohlenhydraten. Außerdem entstehen bei diesem Vorgang auch ständig freie Radikale. Es ist erwähnenswert, dass die mitochondriale Homöostase für die Aufrechterhaltung der Funktion und Lebensfähigkeit von Kardiomyozyten von entscheidender Bedeutung ist. 3 Grad Tatsächlich haben unabhängige Studien am alternden Herzen gezeigt, dass die Mitochondrien der Kardiomyozyten während des Alterns beeinträchtigt werden.3738 Die ultrastrukturelle morphometrische Analyse alter Nagetiere Myokard zeigt das Vorhandensein von vergrößerten und anschwellenden Mitochondrien mit Matrixstörung und Verlust von Cristae." In dieser Studie waren im Vergleich zu den Kontrollmäusen einige Kardiomyozyten-Mitochondrien von D-Gal-Mäusen vergrößert, geschwollen und ein teilweiser Verlust von Cristae. Die AOS-Behandlung linderte die Zerstörung der kardialen mitochondrialen Ultrastruktur in D-Gal-induzierten alternden Mäusen.Parallel dazu induzierte D-Gal eine signifikante Abnahme des kardialen MMP-Spiegels,und die AOS-Verabreichung schützte vor D-Gal-vermittelten Abnahme von MMP.Diese Ergebnisse zeigten, dass AOS die Zerstörung der Mitochondrien des Herzensin D-Gal-induzierten alternden Mäusen verhinderte.

Es wurde festgestellt, dass mehrere beeinträchtigte mitochondriale Prozesse an der Pathogenese des gealterten Herzens beteiligt sind, einschließlich der Veränderung der mitochondrialen Biogenese und Entfernung. Unterdessen erhöhen die mitochondriale Dysfunktion und die beeinträchtigte Entfernung zerstörter Mitochondrien wiederum die Anfälligkeit des gealterten Herzens für Stressverletzungen.“ Die mitochondriale Biogenese wird hauptsächlich durch eine Reihe von nukleär kodierten Koaktivatoren und Transkriptionsfaktoren reguliert. Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor y Coaktivator 1a (PGC-1a), der entscheidend für die Aufrechterhaltung der Energiehomöostase ist, spielt nachweislich eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der mitochondrialen Biogenese und Funktion.4 Verringerte PGC-1a-Expression und -Aktivität wurden in Verbindung gebracht auf die Alterung des Herzens und die Entwicklung einer Herzinsuffizienz.“2 Eine frühere Studie zeigt, dass die altersbedingte p53-Aktivierung direkt zu einer Beeinträchtigung der Mitochondrien führt, indem mehrere Hauptregulatoren der mitochondrialen Biogenese, einschließlich PGC-1a, unterdrückt werden. 43 Sich häufende Beweise deuten auch darauf hin, dass die Aktivierung von PGC-1o durch pharmakologische oder genetische Intervention die altersbedingten Veränderungen im Herzen verhindert.“ Sirtuine (SIRTs) sind als unverzichtbare Regulatoren des Alterungsprozesses anerkannt. SIRT3, lokalisiert in der mitochondrialen Matrix, spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der mitochondrialen Bioenergetik, der Modulation des mitochondrialen Stoffwechsels und der Regulierung der Lebensdauer. Es wurde gezeigt, dass ein Sirt3-Mangel zu Herzanomalien führt und die mitochondriale Bioenergetik bei Mäusen beeinträchtigt. 45 In dieser Studie zeigten wir, dass eine signifikante Abnahme der PGC-1a- und SIRT3-Proteinexpression im Herzgewebe von D-gal-induzierten alternden Mäusen beobachtet wurde und AOS die PGC-1a signifikant erhöhte und SIRT3-Proteinexpression in dosisabhängiger Weise. Darüber hinaus zeigte das mtDNA-Sonden-PCR-Ergebnis, dass die mtDNA-Kopienzahl bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen signifikant abnahm und AOS die mtDNA-Kopienzahl dosisabhängig signifikant erhöhte. Zusammengenommen zeigten diese Daten, dass AOS die mitochondriale Biogenese in D-Gal-induzierten alternden Mäusen hochregulierte.

Wie oben erwähnt, ist die effiziente Entfernung von beeinträchtigten Mitochondrien entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase der Kardiomyozyten. Der bekannte Mechanismus, durch den Mitochondrien umgesetzt werden, ist die Autophagie. Es wird vermutet, dass die Autophagie eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der kardialen Homöostase im Grundzustand sowie als Reaktion auf Stress spielt.46,47 Allerdings ist die Autophagie im alternden Herzen im Allgemeinen herunterreguliert. Eine geringere Autophagie während des Alterungsprozesses reduziert den Abbau zerstörter Organellen und toxischer Proteine ​​und induziert die Anhäufung von dysfunktionalen und abnormalen Mitochondrien, die schließlich zu einer globalen Herzfunktionsstörung führen. Es wurde gezeigt, dass die Stimulation der Autophagie die Herzfunktion in Nagetiermodellen verbessert, indem dysfunktionale Mitochondrien entfernt werden, wodurch die gesamte zelluläre Umgebung optimiert und schließlich altersbedingte Pathologien im Herzen gelindert werden.48 In dieser Studie haben wir gezeigt, dass das Autophagieniveau im Herzen signifikant abnahm Gewebe von D-Gal-induzierten alternden Mäusen und AOS verbesserten das Autophagie-Niveau dosisabhängig signifikant. Diese Veränderungen zeigten, dass AOS die effiziente Entfernung von altersbedingt beeinträchtigten Mitochondrien durch Hochregulierung der Autophagie verbesserte. Wie bereits erwähnt, tritt der Großteil der ROS-Produktion, die von Komplexen der mitochondrialen Elektronentransportkette (ETC) erzeugt wird, als Nebenprodukt der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung auf.4 Experimentelle Beweise deuten darauf hin, dass die geschädigten Mitochondrien im Laufe des Alterns erhöhte Mengen erzeugen von ROS, verstärken den durch freie Radikale verursachten Schaden und führen schließlich zu einer fortschreitenden Vorwärts-Feedback-Spirale des mitochondrialen Zerfalls.4 Dies wiederum induziert mehr ROS durch Schäden am ETC, was eine weitere ROS-Produktion induziert und letztendlich zu einem bioenergetischen Versagen führt . Neben ETC ist Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH)-Oxidase eine wichtige extramitochondriale Quelle von ROS, die für oxidativen Stress während des Alterungsprozesses verantwortlich sein und die oxidativen Schäden an Mitochondrien verschlimmern könnte. Zusätzlich zu diesen Mechanismen haben neuere Studien auch gezeigt, dass eine geringere mitochondriale ROS-Erzeugung zu einem geringen Grad an mtDNA-Steady-State-Schäden beiträgt.47 Eine höhere mitochondriale Basenexzisionsreparatur (BER) und eine geringe mitochondriale Schädigung langlebiger Säugetiere in allgemeinen trägt zu ihrer überlegenen Langlebigkeit bei. Ein kürzlich erschienener Bericht zeigt, dass der NADPH-Oxidase-Inhibitor die mitochondriale Dysfunktion im ventralen Cochlea-Kern von D-Gal-induzierten alternden Ratten unterdrückt. MDA gilt als mutmaßlicher Biomarker für die Lipidperoxidation in lebenden Organismen, und die MDA-Konzentration kann zur Bewertung des oxidativen Stressstatus in vivo verwendet werden. In dieser Studie fanden wir heraus, dass die Verabreichung von AOS die ROS-Produktion abschwächte, die Expression von NADPH-Oxidase herunterregulierte und den MDA-Spiegel bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen senkte. Unsere aktuellen Ergebnisse deuten darauf hin, dass AOS den oxidativen Stressstatus bei D-Gal-induzierten alternden Mäusen effizient senkt, was ein weiterer wichtiger Schutzfaktor für AOS sein könnte, um mitochondriale Schäden zu lindern.

In der vorliegenden Studie stellten wir zunächst klar, dass AOS die D-Gal-induzierte Herzalterung lindert, indem es die mitochondriale Biogenese verbessert, die mitochondriale Integrität aufrechterhält und die effiziente Entfernung von beeinträchtigten Mitochondrien in C57BL/6J-Mäusen verbessert. Darüber hinaus verringert AOS auch die ROS-Produktion und den oxidativen Stressstatus, was wiederum die Zerstörung der Mitochondrien des Herzens weiter hemmt. AOS kann ein wirksames therapeutisches Mittel sein, um die Herzalterung zu lindern. In dieser Studie verwendeten wir nur männliche Mäuse und untersuchten keine geschlechtsspezifischen Unterschiede auf die Auswirkungen von AOS. Es ist sehr interessant, dass das für dendritische Zellen spezifische interzelluläre Adhäsionsmolekül -3- Nicht-Integrin (DC-SIGN)-Liganden greift 1 (DSCL1, ein entzündungshemmender Wirkstoff) reduziert die Makrophagenpolarisation und die diastolische Dysfunktion im alternden weiblichen, aber nicht im männlichen Mausherz.52 Dieses Papier legt nahe, dass es von großer Bedeutung wäre, Geschlechtsunterschiede in zukünftigen Studien zu vergleichen.

Zusammenfassend legen unsere Ergebnisse nahe, dass AOS die D-Gal-induzierte Herzalterung über die Regulierung der myokardialen Mitochondrienfunktion und -integrität bei Mäusen lindert. AOS weist ein breites Spektrum vielversprechender biologischer Aktivitäten auf und könnte ein wirksames therapeutisches Mittel zur Linderung der Herzalterung sein.

Dieser Artikel ist aus J Cell Mol Med extrahiert. 2021;25:7157–7168. wileyonlinelibrary.com/journal/jcmm|7157