MiR-103a-3p-Stummschaltung verbessert die Calciumoxalat-Ablagerung in der Niere von Ratten durch Aktivierung der UMOD/TRPV5-Achse

2.10. Bioinformatische Analyse und Luciferase-Assay.

UMOD-Das Targeting von miRNA, miR-103a-3p, wurde vorhersehbar von analysiertTargetScan-Website(http://www.targetscan.org/vert_71/)und wurde dann mittels Luciferase-Assay validiert. pGL3-SteuerungVektoren (E1741) wurden von Promega (USA) gekauftKonstruieren Sie den Wildtyp von UMOD (UMOD-WT, 5′-AGCCUGUGUCUUUAAAUGCUGCU-3′) und der Mutantentypvon UMOD (UMOD-MUT, 5′-AGCCUGUGUCUUUAAAUGAUCCU-3′). NRK-52E-Zellen wurden mit kotransfiziertmiR-103a-3p-Nachahmung und UMOD-WT oder miR-103a-3pmimic und UMOD-MUT mit Hilfe von Lipofectamine2000. Das gleiche Verfahren wurde im Mimic durchgeführtKontrolle (pRL-TK-Vektoren, VT1568, YouBio, China). NachDamit haben wir die Luciferase-Aktivität in Zellen mithilfe des bestimmtDual-Luciferase-Reporter-Assay-Kit (E1910, Promega, USA).2.11. Etablierung eines Hyperoxalurie-Modells in vivo.Für diein vivoIn dieser Studie haben wir das Hyperoxalurie-Rattenmodell etabliertdurch Zugabe von 1 % Ethylenglykol (EG) (324558, Sigma-Aldrich,USA) zu Trinkwasser. Der Tierversuch wargenehmigt vom Ausschuss für Versuchstiere desDritter Affiangeschlossenes Krankenhaus der Medizinischen Universität Xinxiang(IHRM20200510). Insgesamt 40 männliche Sprague Dawley (SD)Ratten (8 Wochen alt, 180–210 g) gekauft von Charles RiverDabei kamen Laboratorien (Peking, China) zum Einsatzin vivoStudie. AlleDie Ratten wurden in vier Kontrollgruppen eingeteilt: EG, EG + Antagomir und EG + antagomir-NC, mit zehn Ratten in jeder Gruppe.Während der Unterbringung wurden in der Kontrollgruppe die Ratten lediglich versorgtmit Leitungswasser; In der EG-Gruppe wurden die Ratten behandeltmit 1 % EG; In der EG + Antagomir-Gruppe waren es die Rattenbehandelt mit 1 % EG und intravenös injiziert mit miR-103a-3p antagomir; und in der EG + Antagomir-NC-Gruppe,Die Ratten wurden mit 1 % EG behandelt und intravenös injiziertmit miR-103a-3p antagomir-NC. Nach 4 Wochen alle Rattenwaren Opferfidurch Zervixluxation unter Narkose verursacht(Pentobarbital-Natrium, 40 mg/kg, P-010, Merck, USA) undNierengewebe wurde für histologische Untersuchungen entnommen. DerDie in diesem Experiment verwendeten miR-103a-3p-Antagomire warenerhalten von Ribobio (Guangzhou, China).

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2.12. Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung.

Formalinfixiertes Nierengewebe wurde zur Beurteilung der CaOx-Ablagerung in Paraffin eingebettet. Geschnittene Proben wurden vor der HE-Färbung entparaffiniert und hydratisiert. Anschließend wurde das HE Staining Kit (C0105S, Beyotime, China) zur Behandlung der Proben gemäß der Bedienungsanleitung verwendet. Nach dem Versiegeln des Gewebes wurde der Kristallablagerungsbereich unter einem Polarisationsmikroskop (Axio Scope.A1, Precise Instrument, China) bei 100-facher Vergrößerung beobachtet und mit ImageJ (Vision 1.8.0, National Institutes of Health, USA) quantifiziert.

Abbildung 5: Fortsetzung.

Abbildung 5: miR-103a-3p-Stummschaltung aktivierte die UMOD/TRPV5-Achse, um NRK-52E-Zellen vor Oxalat-induzierten Verletzungen zu schützen. (a) Die Wirkung des miR-103a-3p-Inhibitors auf die Zelllebensfähigkeit in NRK-52E-Zellen, die mit Oxalat, TRPV5-überexprimierendem Plasmid und siUMOD behandelt wurden, wurde bestimmt durch MTT-Assay. (b) Der Kristallzelladhäsionstest wurde verwendet, um die CaOx-Ablagerung in bestimmten Zellen zu quantifizieren (2-fache 00-Vergrößerung, Maßstabsleiste=200 μm). (c) Das Fluo-4 AM Kit analysierte die Messung des Ca2+-Gehalts in verschiedenen Gruppen. ∗∗∗p < 0:001 vs. Oxalat; ###p < 0:001 vs. Oxalat + TRPV5 + siNC + IC; ∧∧p < 0:01 und ∧∧∧p < 0:001 vs. Oxalat + TRPV5 + siUMOD + IC. TRPV5: Mitglied der Unterfamilie V des transienten Rezeptorpotential-Kationenkanals 5; UMOD: Uromodulin; MTT: Methylthiazolyldiphenyltetrazoliumbromid; NC: Negativkontrolle; siUMOD: kleine interferierende RNA gegen UMOD; I: Inhibitor; IC: Inhibitorkontrolle.

2.13. Immunhistochemie (IHC).

Um die Verteilung von TRPV5 im Nierengewebe zu untersuchen, verwendeten wir das Super Plus™ High Sensitive and Rapid Immunohistochemical Kit (E-IR R221, Elabscience, China) zur Durchführung der IHC. Kurz gesagt, Nierenschnitte (4 μm) wurden 30 Minuten lang unter Erhitzen mit Entparaffinierungs-/Antigen-Retrieval-Puffer behandelt und anschließend 15 Minuten lang mit SP-Reagenz-B-Peroxidase-Blockierungspuffer bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Schnitte 2 Stunden lang bei 37 °C mit Anti-TRPV5-Antikörper (ab137028, 1/100, Abcam, UK) umgesetzt, gefolgt von einer sekundären Antikörperinkubation. Danach wurden die Schnitte zur Farbentwicklung in der DAB-Arbeitslösung und zur Färbung in Hämatoxylinpuffer benötigt. Nach der Nachbleichungsbehandlung wurden die Färbebilder mit einem Mikroskop (CX23, Olympus, Japan) bei 100-facher Vergrößerung aufgenommen.

2.14. Statistische Analyse.

Alle Experimente wurden dreimal einzeln wiederholt, wobei die Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung beschrieben wurden. Die zwischen mehreren Gruppen verglichenen Unterschiede wurden durch eine einseitige Varianzanalyse analysiert. Für die Datenanalyse wurde GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, USA) verwendet, und ein p-Wert < 0.05 zeigte einen statistisch signifikanten Unterschied an.

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3. Ergebnisse

3.1. Hochregulierung von TRPV5

Geschützte NRK-52E-Zellen vorOxalatinduzierte Verletzung. Basierend auf der zentralen Rolle von TRPV5 bei der Regulierung des Ca2+-Transports inrenale tubuläre Zellenhaben wir zunächst eine TRPV5-Überexpression in NRK-52E-Zellen durchgeführt. Wie in Abbildung 1(a) gezeigt, wurde durch qRT-PCR ein signifikanter Anstieg des TRPV5-mRNA-Spiegels nachgewiesen (p < 0:001). Im Western Blot wurde auch der hohe Gehalt an TRPV5-Protein in transfizierten Zellen gemessen (Abbildung 1(b), p < 0:001). Nach der Oxalatbehandlung in NRK-52E-Zellen stellten wir fest, dass die Expression von TRPV5 im Vergleich zu der der Kontrollgruppe herunterreguliert war, was durch Transfektion von TRPV5-überexprimierendem Plasmid umgekehrt wurde (Abbildung 1(c), p < 0:001). Darüber hinaus lieferte der Western-Blot-Nachweis ähnliche Ergebnisse (Abbildung 1(d), p < 0:001). Der folgende MTT-Test zeigte, dass Oxalat die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigte, was danach teilweise aufgehoben wurdeTRPV5-Überexpression(Abbildung 1(e), p < 0:05). Der Nachweis der Kristalladhäsion zeigte diesTRPV5-Überexpressionhemmte deutlich die durch Oxalat induzierte Adhäsion von CaOx in NRK-52E-Zellen (Abbildung 1(f)).

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Abbildung 6: miR-103a-3p-Stummschaltung milderte die EG-induzierte CaOx-Ablagerung in Nierengeweben in vivo durch Aktivierung der UMOD/TRPV5-Achse. (a, b) Die CaOx-Ablagerung wurde durch H&E-Färbung im Nierengewebe von Ratten gemessen, die mit EG oder EG und miR-103a-3p antagomir (×100) behandelt wurden. Vergrößerung, Maßstabsleiste=200 μm). (c) Western Blot wurde verwendet, um die Proteinspiegel von UMOD und TRPV5 in Nierengeweben von Ratten zu messen, die mit EG oder EG und miR{{10}}a-3p Antagomir behandelt wurden. -Actin diente als interne Kontrolle. (d) Die IHC-Analyse der TRPV5-Expression wurde in den Geweben verschiedener Gruppen durchgeführt (100-fache Vergrößerung, Maßstabsbalken=200 μm). ∗∗∗p < 0:001 vs. Kontrolle; #p < 0:05, ###p < 0:001 vs. EG + Antagomir-NC. HE: Hämatoxylin und Eosin EG, Ethylenglykol; TRPV5: Mitglied der Unterfamilie V des transienten Rezeptorpotential-Kationenkanals 5; UMOD: Uromodulin; NC: Negativkontrolle; IHC: Immunhistochemie

3.2. Oxalat-Induktion

Herunterregulierte UMOD-Expression, die positiv mit der Anreicherung von TRPV5 auf der Zelloberfläche verbunden war. Es wurde festgestellt, dass die mRNA-Expression von UMOD in Oxalat-induzierten NRK-52E-Zellen herunterreguliert ist (Abbildung 2(a), p < 0:001), also auch sein Proteingehalt (Abbildung 2(b), p < 0:01). Die Ergebnisse von CoIP bestätigten, dass UMOD durch Anti-Flag-markiertes TRPV5 in erheblichem Maße coimmunopräzipitiert wurde und umgekehrt TRPV5 durch Anti-UMOD coimmunopräzipitiert wurde (Abbildung 2(c)). Als nächstes regulierten wir die UMOD-Expression in NRK-52E-Zellen hoch, was durch qRT-PCR und Western Blot verifiziert wurde. Die bemerkenswerte Erhöhung der UMOD-Expression, die in mRNA (Abbildung 2(d), p < 0:001) und Proteinspiegeln (Abbildung 2(e), p < 0:001) festgestellt wurde, zeigte die erfolgreiche Transfektion an. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse des Zelloberflächen-Biotinylierungstests, dass TRPV5 im Vergleich zur Negativkontrolle in großer Menge auf der Oberfläche von NRK- 52E-Zellen vorlag, die mit UMOD und TRPV5-Überexpression kotransfiziert wurden (Abbildung 3(a)).

3.3. UMOD

Reguliert die Schutzfunktion von TRPV5 in Oxalat-induzierten Zellen. (Abbildung 3(a)). Um das Zusammenspiel von UMOD und TRPV5 in Oxalat-induzierten NRK-52E-Zellen aufzuklären, führten wir eine siUMOD-Transfektion durch. QRT-PCR ergab, dass UMOD-mRNA in siUMOD-transfizierten Zellen in geringem Maße exprimiert wird (Abbildung 3(b), p < 0:001), und ein ähnliches Ergebnis sein Proteingehalt wurde durch Western Blot gemessen (Abbildung 3(c), p < 0:001). Anschließend zeigten MTT- und Kristalladhäsionstests, dass siUMOD die fördernde Wirkung von TRPV5 auf die Zelllebensfähigkeit (Abbildung 3(d), p < 0:01) und die hemmende Wirkung von TRPV5 auf die CaOx-Adhäsion (Abbildung 3(e)) deutlich ausgleicht. in NRK-52E-Zellen, induziert durch Oxalat. Außerdem haben wir den Ca2+-Gehalt nach divergenten Transfektionen gemessen. Wie in Abbildung 3(f) beschrieben, hemmte TRPV5 die durch Oxalat induzierte Reduktion der intrazellulären Ca2+-Konzentration von NRK-52E-Zellen deutlich, was durch die Zugabe von Simon teilweise wiederhergestellt wurde (p < 0: 001).

3.4. miR-103a-3p

Wirkt gezielt auf UMOD und ist an der Regulation der UMOD/TRPV5-Achse in Oxalat-induzierten Zellen beteiligt. Mithilfe der TargetScan-Website zeigte das Ergebnis der Genvorhersage, dass miR-103a-3p möglicherweise Bindungsstellen für UMOD enthält (Abbildung 4(a)). Anschließend wurde mit dem Luciferase-Assay die unterdrückte Luciferase-Aktivität in den mit miR-103a-3p-Mimetikum und UMOD WT cotransfizierten Zellen nachgewiesen (Abbildung 4(b), p < 0:{{21 }}01). Um die regulierende Wirkung von miR{{10}}a-3p auf UMOD zu ergründen, haben wir die miR- 103a-3p-Hemmung in NRK implementiert.{{14} }E-Zellen, mit qRT-PCR-Nachweis, der bestätigt, dass die Expression von miR-103a-3p nach der Transfektion des miR- 103a-3p-Inhibitors stark herunterreguliert wurde ( Abbildung 4(c), p < 0:001). Interessanterweise erwies sich die mRNA-Expression von UMOD nach der miR-103a-3p-Hemmung als erhöht, was durch die Hinzufügung der UMOD-Stummschaltung sichtbar aufgehoben wurde (Abbildung 4(d), p < 0:01 ). Durch Nachweis des Western-Blots wurde festgestellt, dass die Veränderung der UMOD-Proteinexpression die gleiche ist wie die, die bei der UMOD-mRNA-Expression auftritt (Abbildung 4(e), p < 0:01). Darüber hinaus haben wir Rettungsexperimente zu Zellfunktionen durchgeführt. Wie gezeigt, ist die regulierende Rolle der UMOD/TRPV5-Achse bei der Zelllebensfähigkeit (Abbildung 5(a), p < 0:001), der CaOx-Adhäsion (Abbildung 5(b)) und der intrazellulären Ca2+-Konzentration (Abbildung 5(c), p < 0:01) wurde durch den miR- 103a-3p-Inhibitor deutlich umgekehrt.

3.5. miR-103a-3p

Unterdrückung der durch EG induzierten CaOx-Ablagerung in Nierengeweben in vivo durch Aktivierung der UMOD/TRPV5-Achse. Um unsere Ergebnisse in vitro weiter zu untermauern, haben wir das Hyperoxalurie-Rattenmodell für die In-vivo-Studie konstruiert. Wie in den Abbildungen 6(a) und 6(b) dargestellt, wurde im Nierengewebe der EG-Gruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe eine erhebliche Ablagerung von CaOx-Kristallen beobachtet, und dieser Trend wurde durch miR-103a{{ umgekehrt. 5}}p Santiagomir (p < 0:001). Dann zeigten die Ergebnisse des Western Blots, dass EG sowohl die UMOD- als auch die TRPV5-Proteinspiegel stark herunterregulierte, was durch miR-103a- 3p antagomir deutlich wiederhergestellt wurde (Abbildung 6(c), p < 0:05 ). Durch IHC stellten wir fest, dass die TRPV5-Expression in der EG-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe herunterreguliert war und in der EG + Antagomir-Gruppe im Vergleich zur EG + Antagomir-NC-Gruppe hochreguliert war (Abbildung 6 (d)).

4. Diskussion

Im Zusammenhang mit immer vielfältigeren chirurgischen Behandlungen von Nierensteinen sind hervorzuheben, dass herausragende Methoden zur Verhinderung ihres Auftretens und Wiederauftretens eingesetzt werden können [27]. Der häufigste Bestandteil von Nierensteinen sind CaOx-Kristalle. Viele Faktoren beeinflussen die Entwicklung von Ca2+--haltigen Nierensteinen, wobei Hyperkalkuliurie bei weitem der wichtigste anerkannte Risikofaktor ist [28]. Tsuruoka et al. zeigten, dass eine verringerte Ca2+-Reabsorption durch die Nierentubuli maßgeblich zur Auslösung von Hyperkalziurie beiträgt und dass die aktive Calcium-Reabsorption durch verschiedene Faktoren reguliert werden könnte [29]. Später stellten Worcester et al. schlugen vor, dass die postprandialen Ca2+-Spiegel im Urin bei Patienten mit Hyperkalziurie im Vergleich zu den Kontrollpersonen deutlich höher waren, selbst wenn die Parathormonsekretion im Blut und die Nierenbelastung auf dem gleichen Niveau lagen [30]. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass eine gestörte renale tubuläre Reabsorption der Hauptgrund für Hyperkalziurie sein kann. Diese Studie untersuchte daher den zugrunde liegenden molekularen Mechanismus, der den Ca2+-Spiegel im Urin aus der Perspektive der Ca2+-Reabsorption reguliert, um wichtige Kanäle zur Vorbeugung und Behandlung von Nierensteinen aufzuzeigen.

TRPV5 fungiert als renaler tubulärer epithelialer Ca2+-Kanal, der den Ca2+-Transport und die Reabsorption in der Niere vermittelt [31]. Jang et al. wiesen darauf hin, dass die TRPV5-Proteinexpression im Nierengewebe von Ratten mit Harnwegshyperkalzämie offensichtlich herunterreguliert war, aber durch die Verabreichung von Hydrochlorothiazid wiederhergestellt wurde, was darauf hindeutet, dass der Mechanismus der Behandlung von Hyperkalziurie mit Hydrochlorothiazid durch eine Hochregulierung der TRPV5-Proteinexpression im Nierengewebe erreicht werden könnte [32]. Studien haben bestätigt, dass eine hohe Oxalurie die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) induziert, die renalen tubulären Epithelzellen schädigt und die Struktur von Phosphatidylserin in der Zellmembran verändert, was zur Adhäsion von CaOx an der Oberfläche der renalen tubulären Epithelzellen führt [33]. In der vorherigen Forschung haben wir herausgefunden, dass nach der Auslösung einer NRK-52E-Zellschädigung durch Oxalat ein bemerkenswert herunterreguliertes TRPV5 auftrat, dessen Trend sich nach der Transfektion der TRPV5-Überexpression umkehrte. Darüber hinaus steigerte die Hochregulierung von TRPV5 die Lebensfähigkeit der Zellen und hemmte die durch Oxalsäure induzierte CaOx-Adhäsion in NRK-52E-Zellen, was darauf hindeutet, dass TRPV5 eine entscheidende präventive Wirkung auf die Oxalat-induzierte CaOx-Steinbildung in der Niere hat.

CISTANCHE ZUR VERBESSERUNG VON CALCIUMOXALAT

Als primärer Kanal für die Ca2+-Reabsorption könnten die Aktivität und Expression von TRPV5 durch mehrere Faktoren reguliert werden [34]. Beispielsweise bestätigte eine aktuelle Studie, dass UMOD die Bildung von Nierensteinen verhindert, indem es die Ca2+-Reabsorption über TRPV5 stimuliert [35]. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass 87,5 % der Mäuse mit UMOD-Knockout im Alter von 15 Monaten Calciumoxalat- und Calciumphosphatsteine ​​im CNT, im Nierenmark und in den Papillen bildeten. Alle diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass UMOD mit TRPV5 bei der Bildung von Nierensteinen interagieren könnte, was bisher nicht bestätigt wurde. Unsere Studie identifizierte jedoch zum ersten Mal die Existenz der Wechselwirkung, dass UMOD die TRPV5-Expressionsfunktion in verletzten NRK-52E-Zellen positiv regulierte, indem es die Lebensfähigkeit der Zellen stärkte, die CaOx-Adhäsion reduzierte und die Reabsorption von Ca{{12} verstärkte. }.

miRNAs sind durch ihre gezielte Regulation von mRNAs an der Entstehung und dem Fortschreiten von Nierenerkrankungen beteiligt. Es wurde festgestellt, dass miR-21 durch Hochregulierung von PPARA zur Oxalat-induzierten Schädigung der Nierentubuluszellen beiträgt [36]. Darüber hinaus haben Jiang et al. berichteten, dass die Hemmung von miR-155-5p zur Hochregulierung der MGP-Expression die durch Oxalat verursachte Schädigung durch oxidativen Stress in der Niere nachweisbar abschwächen könnte [37]. Es gibt jedoch nur wenige Studien, die sich mit der Aufklärung des Mechanismus der miRNA-Regulierung von UMOD befassen, der die Nierensteinbildung beeinflusst. Um weitere Einblicke in die Pathogenese dieser Krankheit zu gewinnen, wurden in dieser Studie bioinformatische Analysen und ein Luciferase-Assay eingesetzt, um die miRNA miR-103a-3p zu finden, die möglicherweise UMOD reguliert. In der Forschung zu Nierenerkrankungen wurde bestätigt, dass der miR-103a-3p-Zyklus einen tiefgreifenden Einfluss auf Nierenentzündungen und -fibrosen hat [38]. Peters et al. schlugen außerdem vor, dass miR-103a-3p als potenzieller Biomarker bei chronischen Nierenerkrankungen angesehen werden könnte [39]. Interessanterweise haben wir in unserer Studie den molekularen Mechanismus von miR-103a-3p in Nierensteinen bestätigt, sodass die Stummschaltung von miR- 103a-3p Oxalat-induzierte Verletzungen lindern könnte NRK-52E-Zellen durch Aktivierung der UMOD/TRPV5-Achse. Darüber hinaus haben wir diesen Regulationsmechanismus durch In-vivo-Experimente in EG-induzierten Rattenmodellen noch stärker nachgewiesen. Allerdings mangelt es in dieser Studie an Berücksichtigung, da es sich bei den In-vitro-Experimenten um einen einzigen Zelltyp und eine relativ kleine Anzahl von Studienvariablen handelt.

CISTANCHE ZUR VERBESSERUNG VON CALCIUMOXALAT

5. Schlussfolgerungen

Insgesamt ergab unsere aktuelle Studie, dass miR-103a-3p-Stummschaltung die CaOx-Ablagerung in der Rattenniere durch Aktivierung der UMOD/TRPV5-Achse verbessert, was eine neue theoretische Grundlage für Präventions-, Diagnose- und Behandlungsstrategien legt in Richtung Nierensteinen aus der Sicht der Ca2+-Reabsorption.

Datenverfügbarkeit Die während der Studie generierten analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Interessenkonflikte Die Autoren erklären, dass hinsichtlich der Veröffentlichung dieses Artikels kein Interessenkonflikt besteht.

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