Diskussion

Wir haben eine quantitative Echtzeittechnik zur Untersuchung der Übertragung von SNCA von Zelle zu Zelle entwickeltC. elegans. Das Modell weist viele Schlüsselmerkmale der Synucleinopathie auf, einschließlich der fortschreitenden Akkumulation von SNCA-Aggregaten,Nervendegeneration,Verhaltensdefizite, Undverkürzte Lebensdauer. Sowohl die genetische als auch diepharmakologische Manipulationenvon Tieren haben starke Korrelationen zwischen gezeigtAlterungsraten, transzelluläre SNCA-Übertragung und neurodegenerative Phänotypen und ebenso verschiedene damit verbundene ManipulationenAnti-Aging-Effektekann das Fortschreiten dieser Ereignisse verlangsamen.Altersabhängige Progression der Synucleinopathiegeht mit einem Rückgang des Proteinabbaus einher.Anti-Aging-Behandlungenkann die Systeme wiederherstellen, die den Proteinabbau vermitteln. Darüber hinaus verringerte die Wiederherstellung der lysosomalen Funktion die Ausbreitung von Aggregaten und die begleitende Neurodegeneration in diesen Alterungsmodellen. BiFC ist weit verbreitetFlFluoreszenztechnik, die erfolgreich angewendet wurde, um Protein-Protein-Wechselwirkungen und Proteindimerisierung und/oder -oligomerisierung in lebenden Zellen zu bewerten.7 Das V1S-SV2 BiFC-Paar wurde gezeigtFlentstehen bei der Dimerisierung/Oligomerisierung von SNCA, wenn diese Proteine ​​in Säugerzellen coexprimiert werden.7 In einer früheren Studie17 durch Erzeugung von Neuroblastom-Zelllinien, die entweder V1S oder SV2 exprimieren, haben wir gezeigt, dass der Zell-zu-Zell-Transfer von SNCA-Proteinen und die Coaggregation der übertragenen Proteine ​​mit demendogene SNCA kann mit BiFC visualisiert werdenFlFluoreszenzwährend der Kokultur dieser Zellen.

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Eines der wichtigen technischen Probleme des BiFC-Systems besteht darin, die zelltypspezifische Expression jedes Proteins zu verifizieren.Obwohl eine quantitative Analyse der transgenen SNCA-Expression in jedem Zelltyp technisch nicht durchführbar ist, haben wir eine Reihe von Daten, die das Argument stützen, dass ausschließlich SNCA vorliegtnur in den beabsichtigten Zelltypen exprimiert. Zuerst DsRedFehlerKrebs wird nur im Umkehrschluss erkannt-21 Neuronen, überhaupt nicht in den Rachenmuskelzellen. Zweitens zeigte die Immunfluoreszenzfärbung von SNCA mit einem hochspezifischen und empfindlichen Antikörper die Expression dieses Proteins spezifisch in der beabsichtigten ZelleTypen. Drittens die Expression des gleichen BiFC-Paares in den Würmernmit demdy-1Mutationszeichenfifileicht reduziert die BiFCFlFluoreszenzsignal, das die Erzeugung des BiFC anzeigtFluorescence erfordert Endozytose. Dies deutet darauf hin, dass das BiFC-Signal nicht von der Koexpression des BiFC-Paares in den gleichen Zelltypen stammt, sondern von der interzellulären Übertragung der Proteine ​​stammt.

System zur Identifizierung neuartiger genetischer Modulatoren. Darüber hinaus würde die charakteristische Struktur des Pharynx in C. elegans die bequeme Identifizierung von Änderungen in der Übertragung von syn-Synucleinopathie in einem groß angelegten Screening auf genetische und niedermolekulare Modifikatoren ermöglichen.

Auswirkungen des AlternsProzesse zur "Übertragung" und nicht die Aggregation selbst ist das Schlüsselthema des Papiers. Nun möchten wir klarstellen, dass wir nicht versuchen zu argumentieren, dass Alterung und lysosomale Dysfunktion nur die Übertragung von Aggregaten beeinflussen, ohne die zellautonome Aggregation selbst zu beeinträchtigen. Unser BiFC-System ist ein hervorragendes System, um das Übertragungsereignis zu quantifizieren, aber nicht dafür ausgelegt, die verbindungsautonome Aggregation zu überwachen. Frühere Studien25-27 einschließlich unserer eigenen28 befassen sich mit den Auswirkungen der lysosomalen Dysfunktion auf die Beseitigung der zellautonomen SNCA-Aggregation. Wir möchten jedoch auch darauf hinweisen, dass es keinen endgültigen Beweis dafür gibt, dass diese Studien nur die zellautonome Aggregation beobachtet haben, ohne die Effekte der transzellulären Aggregatübertragung und -verstärkung. Wir möchten auch betonen, dass die Aggregationsinitiierung eine absolute Voraussetzung für die Aggregatsübertragung ist. Tatsächlich zeigen wir, dass die zellautonome Aggregation auf Basalniveau sogar in einzelnen transgenen Tieren spontan auftritt (Fig. 8F).

DerAnti-Aging-Effekte von GlcNAcwurde als DAF-16--unabhängig beschrieben.12 Dies weist darauf hin, dass GlcNAc den daf-16-Phänotyp rettet, nicht indem es den DAF-16-Weg direkt beeinflusst, sondern indem es über unabhängige Alterungswege wirkt. Die von uns präsentierten Daten deuten darauf hin, dass die SNCA-Übertragung nicht unter der Kontrolle eines spezifischen Alterungswegs steht, sondern eher durch die allgemeine Alterung reguliert wird.

Unsere aktuelle Studie bietet eine Grundlage, um die Verwendung allgemeiner Anti-Aging-Ansätze als therapeutische Strategien zum Stoppen oder Verlangsamen des Fortschreitens von PD und verwandten Synucleinopathien in Betracht zu ziehen. Darüber hinaus können Verstärker der lysosomalen Funktion als Kandidaten für Therapien in Betracht gezogen werden, die darauf abzielen, das Fortschreiten dieser Krankheiten zu stoppen oder zu verzögern. Derselbe Ansatz könnte theoretisch auf andere altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen angewendet werden, von denen angenommen wird, dass viele durch die Ausbreitung spezifischer Proteinaggregate fortschreiten. Unter der Annahme, dass die Vermehrung verschiedener Proteinaggregate das gleiche Grundprinzip hat, spekulieren wir vorsichtig, dass Anti-Aging- und Pro-Lysosom-Strategien zu einer allgemeinen Therapie entwickelt werden könnten, um das Fortschreiten vieler neurodegenerativer Erkrankungen zu stoppen. Diese Hypothese kann angegangen werden, indem das BiFC-basierte Tiermodell auf andere Übertragungsmodelle mit MAPT, Polyglutaminproteinen und TARDBP angewendet wird.1

Materialen und Methoden

Stämme und Kultivierung von Nematoden Alle Stämme wurden unter Verwendung von Standardverfahren gehandhabt und auf Platten mit Nematodenwachstumsmedium (NGM), die einen Rasen von Escherichia coli (E. coli)-Stamm OP50 enthielten, bei 20°C gezüchtet.29 Wildtyp Bristol N2 und die Mutantenstämme unc-119(ed3), dyn-1(ky51) und asp-4(ok2693) wurden vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC; University of Minnesota, St. Paul, MN) bezogen , USA). Der mutierte Stamm asp-1(tm666) wurde vom C. elegans National BioResource Project (NBRP; Tokyo Women's Medical University School of Medicine, Tokio, Japan) bereitgestellt. Die Mutantenstämme daf-2(e1370) und daf-16(mu86) waren großzügige Geschenke von Professor Kyuhyung Kim (DGIST, Daegu, Korea).

Plasmidkonstruktion für C. elegans

V1S- und SV2-Matrizenplasmide waren großzügige Geschenke von Dr. Pamela McLean (Massachusetts General Hospital, Boston, MA, USA). Eins) Pmyo-2::EGFP Der myo-2-Promotor (Pmyo-2) wurde aus genomischer DNA, die aus Wildtyp-N2-Würmern erhalten wurde, PCR-amplifiziert.

Es wurden ein Sense-Primer, der eine HindIII-Stelle enthält, 50 -GACAAGCTTGGGGTTTTGTGCTGTG GACGTT-30, und ein Antisense-Primer, der eine BamHI-Stelle enthält, 50 - GACGGATCCTTCTGTGTCTGACGATCGAGG-30 verwendet. Pmyo-2::EGFP wurde durch Insertion des PCR-Produkts in die HindIII- und BamHI-Stellen des pFX_EGFPT-Vektors erzeugt.30 Zwei) Pmyo-2::SNCA(Myc) A sense Primer, der eine SalI-Stelle enthält, 50 - AGCGTCGACGC CACCATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30, und ein Antisense-Primer, der die myc-Tag-Sequenz und die BglII-Stelle enthält, 50 - AGCA GATCTCTACAGATCCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCG GCTTCAGGTCGTAGTCTTG-30, wurden verwendet, um die MYC- markierte humane SNCA, erhalten aus dem pcDNA3.1 MycHis SNCA-Vektor.28 Das EGFP-Fragment von Pmyo-2::EGFP wurde durch das PCR-amplifizierte Myc-markierte humane SNCA-Fragment ersetzt, um Pmyo-2::SNCA zu konstruieren (Mein C). Drei) Pmyo-2::V1S Ein Sense-Primer, der eine SalI-Stelle enthält, 50 - AGCGTCGACGC CACCATGGTGAGCAAGGCCGAGG-30, und ein Antisense-Primer, der eine BglII-Stelle enthält, 50 -AGCAGATCTTTAGGCTT CAGGTTCGTAGTC{{ 25}} wurden verwendet, um V1S zu amplifizieren. Außerdem wurde das EGFP-Fragment von Pmyo-2::EGFP durch das PCR-amplifizierte V1S-Fragment ersetzt, um Pmyo-2::V1S zu konstruieren. Vier) Pmyo-2::V1Q25 Ein Sense-Primer, der eine claI-Stelle enthält, 50 - TAAGCAATCGA TATGGCGACCCTGGAAAAGCTG-30, und ein Antisense-Primer, der eine claI-Stelle enthält, 50 -TGCTTAATCGATAGGTCGGTGCA GAGGCTCCTC{{ 38}} wurden verwendet, um Q25 zu amplifizieren. Dann wurde das menschliche SNCA-Fragment von Pmyo-2::V1S durch das PCR-amplifizierte Q25-Fragment ersetzt, um Pmyo-2::V1Q25 zu konstruieren. 4) Pflflp-21::SV2 Das EGFP-Fragment von pFX_EGFPT wurde durch das PCR-amplifizierte SV2-Fragment ersetzt, um einen SV2-Vektor herzustellen.

Der Sense-Primer, der eine SpeI-Stelle enthält, 50 -AGCACTAGTGCCACCATGGATG TATTCATGAAAGG-30, und ein Antisense-Primer, der eine BglII-Stelle enthält, 50 -AGCAGATCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC CG-30, wurden verwendet. Der Flip-21-Promotor (Pflflp-21) wurde aus genomischer N2-DNA PCR-amplifiziert und in die KpnI- und SalI-Stellen des SV2-Vektors subkloniert, um Pflflp-21::SV2 zu erzeugen. Ein Sense-Primer mit einer KpnI-Stelle 50 - AGCGGTACCAACTAGGTCCAGTGACCGAAAG-30 und ein Antisense-Primer mit einer SalI-Stelle 50 -AGCGTCGACGCCAC CATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30 wurden verwendet, um das flflp zu amplifizieren{{15} } Promoter. Fünf) Plfflp-21::SV2-ICR-DsRed Um einen SV2-Vektor herzustellen, der DsRed als pharyngealen neuronalen Marker koexprimiert, wurde Plfflp-21 in die KpnI- und SalI-Stellen des pFX{ subkloniert {21}}DsRedxT-Vektor30 und namens Pflflp-21::DsRed. Die Koexpression von SV2 und DsRed unter dem flflp-21-Promotor wurde erreicht, indem eine intercistronische Region (ICR) zwischen SV2 und DsRed platziert wurde, die von N2.31 PCR-amplifiziert wurde. Das SV2-Fragment wurde durch Fusion mit der ICR-Region fusioniert PCR32 und in Plfflp-21::DsRed subkloniert, um Plfflp-21::SV2-ICR DsRed zu konstruieren. Ein Sense-Primer, der eine SalI-Stelle enthält, 50 -AGCGTC GACGCCACCATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30, und ein Antisense-Primer, der eine überlappende Region mit einem ICR enthält, 50 -CGATCATTTTGGAGATTACTTGTACAGCTTGTCC-30, wurde in der PCR-Reaktion verwendet für SV2. Die ICR-Region wurde mit einem Sense-Primer amplifiziert, der eine überlappende Region mit SV2 enthielt, 50 -GGACGAGCTGTACAAGTAATCTCCAAAAT CATCG-30, und einem Antisense-Primer, der eine SpeI-Stelle 50 - AGCACTAGTTACCCTGTAATAATATATTAAAC-3 enthielt.

Etablierung von transgenen BiFC-Würmern

Pmyo-2::V1S- und Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed-Plasmide wurden in die Keimdrüsen von N2-Würmern im späten L4--Stadium mit einem Selektionsmarker, pRF4, koinjiziert das ein mutantes Kollagengen, rol- 6(su1006), 33 exprimiert, um eine doppelt-transgene Linie herzustellen, die das BiFC-Paar exprimiert. Als Negativkontrolle für BiFC wurde Pmyo-2::V1S allein in N2-Würmer mit pRF4 injiziert, und Pflflp-21::SV2-ICR DsRed allein wurde in unc{{18 }}(ed3) mutierte Würmer mit einem Selektionsmarker, pCFJ151, der das unc-119(C)-Gen exprimiert.34 Das Plasmid Pmyo-2::V1 wurde erzeugt, um die BiFC-Teilsequenz nur durch Einführen zu exprimieren das Stoppcodon direkt vor der SNCA-kodierenden Sequenz in Pmyo-2::V1S unter Verwendung eines Quik Change Site-Directed Mutagenese Kit (Stratagene, 200521). Die Plasmide Pmyo-2::V1 und Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed wurden dann zusammen mit pRF4 in N2 injiziert. Das Plasmid Pmyo-2::V1Q25 wurde erzeugt, um das Huntingtin-Exon 1 mit einer Glutaminstrecke von 25 zu exprimieren, indem SNCA durch das Q25-Fragment in Pmyo-2::V1S ersetzt wurde. Die Plasmide Pmyo-2::V1Q25 und Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed wurden dann zusammen mit pRF4 in N2 injiziert. Zusätzlich wurde Pflflp-21::DsRed in N2 mit pRF4 als Kontrolle für die Auswirkungen der allgemeinen Proteinüberexpression in Neuronen injiziert. Zur chromosomalen Integration der eingebrachten Plasmide wurden injizierte Linien einer UV-Bestrahlung ausgesetzt. Nach der UV-Bestrahlung wurde jede integrierte Linie 4-mal mit N2 ausgekreuzt. Doppelt transgene Linien, die Pmyo-2::V1S und Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed tragen, wurden durch Paarung einer integrierten Pmyo-2::V1S-Linie mit einer integrierten erzeugt Pflflp-21::SV2-ICR-DsRote Linie. Alle diese transgenen Würmer zeigten einen Roller-Phänotyp und eine Expression von DsRed

Fluoreszenz in den Pharynxneuronen.

Generierung von SNCA-Modellen ohne Tag Pmyo-2::SNCA- und Plfflp-21::SNCA-Plasmide wurden entwickelt, um SNCA nur zu exprimieren, indem ein Stoppcodon direkt nach der SNCA-codierenden Sequenz mithilfe einer QuikChange Site-Directed Mutagenese eingeführt wurde Bausatz. Als Negativkontrolle wurde Pmyo-2::SNCA allein in N2-Würmer mit pRF4 injiziert. Pmyo-2::SNCA- und Plfflp-21::SNCA-Plasmide wurden zusammen mit pRF4 in die Keimdrüsen von N2-Würmern im späten L4--Stadium injiziert. Alle diese Würmer zeigten einen Roller-Phänotyp und 3 repräsentative Linien jedes Genotyps wurden für Experimente verwendet. Generierung von alterungsbezogenen BiFC-Modellen Pmyo-2::V1S und Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed-Plasmide wurden in die Keimdrüsen von daf im späten L4--Stadium co-injiziert -2(e1370) und daf-16 (mu86) mutierte Würmer mit dem pRF4. Als Kontrolle für altersbedingte BiFC-Modelle wurde Pmyo-2::V1S oder Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed allein in die Keimdrüsen des späten L{{30} injiziert. }Stadium von N2- und daf-16(mu86)-Mutantenwürmern mit pRF4. Nachdem mehrere transgene Linien erhalten wurden, die die eingeführten Plasmide enthielten, wurden 3 repräsentative Linien in jedem Mutantenhintergrund für Experimente verwendet.

Erzeugung von transgenen hlh-30p::hlh-30-Linien

Ein Plasmid, das hlh-30p::hlh-30::gfp exprimiert, war ein großzügiges Geschenk von Dr. Malene Hansen (Sanford-Burnham Medical Research Institute, CA, USA). Das Plasmid hlh-30p::hlh-30 wurde entwickelt, um mithilfe eines QuikChange Site-Directed Mutagenese Kits ein Stoppcodon vor der GFP-kodierenden Sequenz einzufügen, um die GFP-Expression zu hemmen. Als Kontrolle wurden jeweils Pmyo-2::V1S oder Pflflp-21::SV2-ICRDsRed und hlh-30p::hlh-30 injiziert Keimdrüsen von N2-Würmern im späten L4--Stadium mit pRF4. Die Plasmide, die Pmyo-2::V1S, Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed und hlh-30p::hlh-30 exprimieren, wurden in die co-injiziert Keimdrüsen von daf-16(mu86)-mutierten Würmern im späten L4--Stadium mit pRF4. Zur Analyse der lysosomalen Dysfunktion wurden asp-4(ok2693)- und asp-1(tm666)-Mutantenwürmer verwendet, bei denen das lysosomale Enzym Cathepsin-Gen inaktiviert ist. Pmyo-2::V1S- und Plfflp-21::SV2-ICR-DsRed-Plasmide wurden zusammen mit pRF4 in die Keimdrüsen von mutierten Würmern im späten L4--Stadium injiziert. Nachdem transgene Linien erhalten wurden, die die eingeführten Plasmide enthielten, wurden 3 repräsentative Linien jedes Genotyps für Experimente verwendet.

Immunfluoreszenzmikroskopie

Für die Immunfluoreszenzfärbung von Würmern wurden Wildtyp-N2- und transgene Würmer gesammelt, mit M9-Puffer (22 mM KH2PO4, 22 mM Na2HPO4, 85 mM NaCl, 1 mM MgSO4) gewaschen und dann mit 4 % Paraformaldehyd in MRWB ( 80 mM KCl, 20 mM NaCl, 1{{60}} mM EGTA, 5 mM Spermidin [Sigma-Aldrich, S0266], 50 Prozent Methanol). Um die Rigidität der Cuticula-Schicht für die Penetranz zu verringern, wurden die Würmer mehreren Gefrier/Tau-Zyklen unter Verwendung von flüssigem Stickstoff unterzogen und unter Schütteln bei 4°C für 2 h inkubiert. Da Reduktions- und Oxidationsschritte die Durchlässigkeit des Wurms erhöhen, wurden die Würmer mit Tris-Triton-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 Prozent Triton X-100 [Bio-Rad Laboratories Inc., 161– 0407], 1 mM EDTA) und mit 1 Prozent b-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich, M7522) in Tris-Triton-Puffer bei Raumtemperatur (RT) für 2 h inkubiert. Anschließend wurden die Würmer in Kollagenaselösung (100 Einheiten Kollagenase Typ IV [Worthington Biochemical Co., LS004188] in 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM CaCl2, 0,1 % Triton X-100) unter Rotation inkubiert für 4 h bei RT. Dann wurden die Würmer in Tris-Triton-Puffer, ergänzt mit 0,3 Prozent H 2 O 2 (Sigma-Aldrich, H1009) für 15 min bei RT inkubiert. Nach Inkubation in Blockierungspuffer (0,1 Prozent Rinderserumalbumin [BSA; Sigma-Aldrich, A7906], 0,5 Prozent Triton X-100, 1 mM EDTA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS; GenDEPOT, CAP08-050 ]) wurden die Würmer mit monoklonalem Antikörper 274 mAb10 über Nacht bei 4°C in primärer Antikörperlösung (1 % BSA, 0,5 % Triton X-100, 1 mM EDTA in PBS) inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Würmer mit Blockierungspuffer gewaschen und mit Rhodaminrot X-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:100; Jackson Immunoresearch Laboratories, 115-295-166) für 2 Stunden inkubiert. Die Würmer wurden dann mit einem Blockierungspuffer gewaschen und in einem Antifade-Reagenz (Invitrogen, P36930) montiert. Die Proben wurden unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops Olympus FV1000 (Olympus, Tokio, Japan) analysiert.

Fluoreszenzmikroskopie lebender Würmer

Würmer wurden mit 10 mM Natriumazid in M9-Puffer immobilisiert und mit einem Deckglas bedeckt. Bilder der Würmer wurden mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie Olympus FV1000 aufgenommen.

Western-Blotting

Erwachsene Würmer wurden mit M9-Puffer und anschließend mit PBS gewaschen, das 1 Prozent Triton X-100 enthielt. Das Wurmpellet wurde in PBS, enthaltend 1 Prozent Triton X-100, 1 Prozent (Vol/Vol) Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma-Aldrich, P8340) beschallt und zentrifugiert, um den Triton-löslichen (Überstand) zu erhalten ) und -unlösliche (Pellets) Fraktionen. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des BCA-Proteintests (Pierce Biotechnology, 23223 und 23224) gemessen. Proteinproben (3 mg für den SNCA-Expressionstest, 50 mg zum Nachweis von Polyubiquitinproteinen und 20 mg (V1S-, V1SCSV2-Linien) und 40 mg (SV2-Linien) für die unterschiedliche Löslichkeit von SNCA) wurden auf 12-prozentige SDS-PAGE-Gele aufgetragen. Die primären Antikörper, die für das Western Blotting verwendet wurden, waren monoklonaler Anti-SNCA-Antikörper, 274 mAb (1:1.500) und Syn{-1} (1:1.500; BD BioScience, 610787) und Anti-Ubiquitin-Antikörper (1:3,{ {35}}; Abcam, ab7254). Der Chemilumineszenznachweis wurde unter Verwendung des LAS-3000-Lumineszenzbildanalysators (Fujifilm, Tokio, Japan) und des Amersham Imager 600 (Ge Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, USA) und der Multi Gauge (v3.0)-Software (Fujifilm) durchgeführt , Tokyo, Japan).

Dot-Blotting

Erwachsene Würmer jedes Stammes wurden mit M9-Puffer und anschließend mit PBS gewaschen, das 1 Prozent Triton X-100 enthielt. Das Wurmpellet wurde in PBS mit 1 % Triton X-100 und 1 % (Vol/Vol) Protease-Inhibitor-Cocktail beschallt. Proteinproben (500 ng) wurden auf Nitrozellulosemembranen geladen, die dann getrocknet und in einer Blockierungslösung inkubiert wurden. Die primären Antikörper, die für das Dot-Blotting verwendet wurden, waren die monoklonalen Anti-SNCA-Antikörper 274 mAb und Syn-O2,13 letzterer ist spezifisch für SNCA-Aggregate. Der Chemilumineszenznachweis wurde unter Verwendung des LAS-3000-Lumineszenzbildanalysators und des Amersham Imager 600 und der Multi Gauge (v3.0)-Software durchgeführt.

Behandlung mit Anti-Aging-Mitteln

N-Acetylglucosamin (GlcNAc) (Sigma-Aldrich, A8625) wurde in destilliertem Wasser auf 1 M als Stammlösung gelöst. Die Stammlösung wurde mit flüssigem LB-Medium (Sigma-Aldrich, L3022) verdünnt. Die Würmer im L4--Stadium jeder transgenen Linie wurden auf NGM-Platten übertragen, die eine Endkonzentration von 10 mM GlcNAc enthielten. Einzelwurm-PCR Ein trächtiger Einzelwurm aus jeder Linie wurde in Lysepuffer (5 0 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM MgCl2, 0,45 Prozent NP-40 [IGEPAL; Sigma-Aldrich, I3021], 0,45 Prozent Tween 20 [Sigma-Aldrich, P1379]) mit 0,1 mg/ml Proteinase K (Sigma Aldrich, P4850). Der einzelne Wurm im Puffer wurde mehreren Gefrier-Tau-Zyklen unter Verwendung von flüssigem Stickstoff unterzogen, 1 h bei 65 °C inkubiert, um genomische DNA freizusetzen, und dann 15 min bei 95 °C erhitzt, um Proteinase K zu inaktivieren. Einzelwurm-PCR-Analyse war durchgeführt unter Verwendung von Ex TaqTM Polymerase (Takara Biotechnology, RR001A) in einem Bio-Rad MyCycler PCR Thermal Cycler System (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA).

PCR-Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-Genotypisierung

Trächtige 5-Würmer aus jeder Linie wurden im Lysepuffer mit 0,1 mg/ml Proteinase K lysiert. Würmer im Puffer wurden mehreren Gefrier-Tau-Zyklen unter Verwendung von flüssigem Stickstoff unterzogen und 1 h bei 65°C inkubiert genomische DNA freisetzen und dann 15 min lang auf 95 °C erhitzt, um Proteinase K zu inaktivieren. Nach Durchführung der PCR wurden die PCR-Produkte mit dem NcoI-Enzym (New England Biolabs Inc., R3193S) bei 37 °C über Nacht verdaut und zum Nachweis der Restriktion einer Elektrophorese unterzogen Fragmentlängenpolymorphismus.

Quantitative PCR (qPCR)

Adulte transgene Würmer wurden gesammelt und in M9-Puffer gewaschen. Die Würmer im Puffer wurden beschallt und die Proben mehreren Gefrier-Tau-Zyklen unter Verwendung von flüssigem Stickstoff unterzogen. RNA wurde mit Trizol-Reagenz (Invitrogen, 15596-026) extrahiert und unter Verwendung des RNeasy-Minikits (Qiagen, 74106) gereinigt. Jede cDNA wurde aus 500 ng Gesamt-RNA unter Verwendung des iScript-cDNA-Synthesekits (Bio-Rad Laboratories Inc., 170–8891) synthetisiert. Für die Echtzeit-PCR wurden Zielgene und spezifische Primer mit SYBR Premix Ex Taq II (Takara Biotechnology, RR081A) in 96--Well-Platten gemischt. Es wurden zuvor von anderen Gruppen entworfene spezifische Primer verwendet.14 Die DNA-Produkte wurden mit dem 7500 Real-Time PCR-System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) analysiert. Relative mRNA-Spiegel von Zielgenen wurden normalisiert, um -1 zu wirken.

Hitzeschockbehandlung der dyn-1-Mutante

Die doppelt-transgenen Würmer (Pmyo-2::V1S C Pflflp-21::SV2-ICR DsRed) wurden mit dyn-1(ky51) mutierten Würmern gepaart.20 Erwachsene Mutterwürmer der doppelt-transgenen Linie, mit oder ohne die dyn-1(ky51)-Mutation, wurden auf NGM-Platten, die E. coli OP50 enthielten, für 4 h bei 20°C kultiviert, um Eier zu legen, und wurden dann entfernt. Synchronisierte Nachkommenwürmer jedes Stamms im L4--Stadium wurden zur Beobachtung bei 30 °C kultiviert.

Pharyngeale Pumpanalyse

Das pharyngeale Pumpen wurde 1 min lang bei RT unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops gezählt. Wildtyp N2, Mutanten und transgene Würmer wurden analysiert. Die Daten wurden als PPM (Pumpen pro Minute) ausgedrückt.

Lebensdauer-Assay

Von erwachsenen Mutterwürmern gelegte Eier wurden synchron bis zum L4-Larvenstadium auf NGM-Platten gezüchtet, die mit E. coli OP50 bei 20 °C ausgesät waren. Die Würmer im L4--Stadium wurden auf NGM-Platten übertragen, die 100 mM 5- enthielten. Flfluoro-20 -desoxyuridin (Sigma-Aldrich, F0503), um zu verhindern, dass sie Nachkommen produzieren. Die Anzahl der lebenden oder toten Würmer wurde alle ein bis zwei Tage aufgezeichnet. Würmer, die aufbrachen, sich eingruben oder von den Platten krochen, wurden zensiert, aber als zensierte Tiere in die Lebensdaueranalyse aufgenommen. Die Überlebensdaten wurden mithilfe von OASIS (einer Online-Anwendung für die Überlebensanalyse von Lebensspannen-Assays) analysiert.

statistische Analyse

Alle Experimente wurden blindkodiert durchgeführt und mindestens dreimal wiederholt. Die Werte in den Figuren sind als Mittelwerte ausgedrückt. Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn die P-Werte < SEM waren. 0.05. Die Diagramme wurden unter Verwendung der Software Prism 5 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA) gezeichnet. Die Werte wurden durch einfache ANOVA mit dem Tukey-Posthoc-Test unter Verwendung der Software InStat (Version 3.05) (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA) verglichen.

Abkürzungen

ACTB-Aktin, b

AD Alzheimer-Krankheit

Ab-Amyloid b

ALS Amyotrophe Lateralsklerose

Bimolekulare Fluoreszenzkomplementierung durch BiFC

GlcNAc-N-Acetylglucosamin

PD Parkinson-Krankheit

Offenlegung möglicher Interessenkonflikte

Es wurden keine potenziellen Interessenkonflikte offengelegt.

Finanzierung

Diese Arbeit wurde von der National Research Foundation (NRF) gefördert, die von der koreanischen Regierung (MEST) (NRF-2015R1A2A1A10052540, NRF-2015R1A2A1A15053661) und dem Korea Health Technology R&D Project des Gesundheitsministeriums finanziert wurde & Welfare, Republic of Korea (HI14C0093), sowie das 2014 KU Brain Pool Program der Konkuk University.

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