Antiallergische und entzündungshemmende Wirkung von Neferin auf RBL-2H3-Zellen

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Abstrakt:Mastzellen spielen eine sehr wichtige Rolle bei Hautallergien und -entzündungen, einschließlich atopischer Dermatitis und Psoriasis. In der Vergangenheit wurde festgestellt, dass Referenz entzündungshemmende und Anti-Aging-Wirkungen auf die Haut hat, aber ihre Wirkung auf Mastzellen wurde noch nicht im Detail untersucht. In dieser Studie haben wir Mastzellen (RBL-2H3-Zellen) und Mausmodelle verwendet, um die antiallergischen und entzündlichen Wirkungen der Referenz zu untersuchen. Erstens fanden wir heraus, dass Referenz die Degranulation von Mastzellen und die Expression von Zytokinen hemmt. Außerdem beobachteten wir, dass bei Stimulierung von Mastzellen durch A23187/Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) die Erhöhung des intrazellulären Calciums durch Referenz gehemmt wurde. Auch die Phosphorylierung des MAPK/NF-KB-Wegs wird durch Vorbehandlung mit Referenz reduziert. Die Ergebnisse von In-vivo-Studien zeigen, dass die Referenz das Erscheinungsbild von Dermatitis und Mastzellinfiltration verbessern kann, die durch Dinitrochlorbenzol (DNCB) verursacht werden. Darüber hinaus wird auch die Expression von Barriereproteinen in der Haut wiederhergestellt.ZistanchSchließlich wurde festgestellt, dass der Bezug das durch Verbindung 48/80 verursachte Kratzverhalten verringern kann. Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, dass Referenz ein sehr gutes antiallergisches und entzündungshemmendes Naturprodukt ist. Seine Wirkung auf Mastzellen trägt zu seinem pharmakologischen Mechanismus bei.

Schlüsselwörter:Hinweis; natürliches Produkt; Mastzelle; Dermatitis; Juckreiz

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1. Einleitung

Viele Studien haben bestätigt, dass allergische Erkrankungen nicht nur das Ergebnis einer angeborenen Immunaktivierung, sondern auch einer adaptiven Aktivierung sind. Darunter spielen Mastzellen eine sehr wichtige Rolle bei einer Vielzahl von allergischen Erkrankungen wie allergischer Rhinitis, Asthma und allergischer Dermatitis. Mastzellen exprimieren IgE-Rezeptoren (FceRI) auf ihren Zellmembranen, und FceRI-Rezeptoren haben eine hohe Affinität für IgE-Antikörper [1,2]. Wenn Antigen-spezifisches IgE an FceRI bindet, kommt es zu einer Wechselwirkung und einer allergischen Reaktion. Die Aggregation von FceRI kann Rezeptortyrosinkinasen aktivieren, Downstream-Reaktionen initiieren und die Phosphorylierung verschiedener Schlüsselproteine ​​(wie z Schlüsselereignis bei der Mastzelldegranulation [3].Cistanche AustralienDie aktivierten Mastzellen degranulieren und setzen chemische Mediatoren frei. Diese chemischen Mediatoren, die bei allergischen Reaktionen verwendet werden, können Entzündungen verursachen [4], so dass die Behandlung von allergischen Symptomen Mastzelldegranulationshemmer umfasst. Daher wird die Hemmung der IgE-vermittelten Mastzelldegranulation häufig genutzt, um neue Verbindungen zur Vorbeugung und Behandlung allergischer Erkrankungen zu identifizieren. Es wurde festgestellt, dass Anti-Dinitrophenyl (DNP) IgE-Antikörper und -Antigene passive Überempfindlichkeitsreaktionen der Haut (PCA) als ein typisches In-vivo-Modell einer unmittelbaren Überempfindlichkeit und als Forschungsarzneimittel für das Potenzial von Anti-Antigen-Allergien induzieren können [5,6 ]. Darüber hinaus kann die Degranulation von Mastzellen auch durch Nicht-Immunstimulanzien wie die Verbindungen 48/80 und A23187 verursacht werden. A23187 Calciumionophor ist seit langem dafür bekannt, dass es die Mastzellensekretion durch die Freisetzung von vorgeformten Mediatoren, wie Histamin, aus ihren Körnern stimuliert, was als Beispiel dient [4] Verbindung 48/80 ist ein gemischtes Polymer von p-Methoxy-N-methylphenethylamin vernetzt durch Formaldehyd, das weithin für die unabhängige Stimulation von Mastzellen verwendet wird [7,8] Daher wurden üblicherweise geeignete Mengen der Verbindung 48/80 und A23187 als Reagenzien verwendet, um den Mechanismus allergischer Reaktionen zu untersuchen. Statistischen Auswertungen zufolge leiden etwa 15-20 Prozent der Bevölkerung an Neurodermitis. Unabhängig davon, ob es sich um Kinder oder Erwachsene handelt, die an dieser Krankheit leiden, kann atopische Dermatitis ohne angemessene Behandlung zu psychischen Belastungen der Patienten führen und ihre familiären und sozialen Gesundheitskosten belasten [9]. Leider gibt es keine geeignete Behandlungsmethode, um allergische Dermatitis zu heilen. Gegenwärtige Behandlungsoptionen vermeiden immer noch krankheitsverursachende Allergene, und die kontinuierliche Anwendung von Steroiden ist der Goldstandard der Behandlung. Die unvermeidlichen Allergene und die Nebenwirkungen von Medikamenten haben die dringende Entwicklung neuer therapeutischer Medikamente veranlasst. Aus Heilkräutern und -pflanzen isolierte Naturstoffe sind potenzielle Quellen für Therapeutika zur Vorbeugung und Behandlung entzündlicher Erkrankungen und zur Verbesserung der Lebensqualität von Patienten mit allergischen Erkrankungen.

Cistanche kann Anti-Aging

Die Referenz stammt aus dem Lotuskern (dem Embryo des Samens) der Pflanze Nelumbo nucifera und ist ein wichtiges Bisbenzylisochinolin-Alkaloid. Es gibt Hinweise darauf, dass die Referenz bei vielen Erkrankungen ein breites Spektrum an pharmakologischen Eigenschaften hat, wie z. B. krebshemmende, antioxidative, entzündungshemmende und neuroprotektive Wirkungen [10-15].Cistanche-VorteileKhanet al. fanden heraus, dass die Referenz Anti-Photoaging-Effekte hervorruft, indem sie den UV-vermittelten Anstieg der ROS- und Malondialdehyd(MDA)-Spiegel in menschlichen Keratinozyten und Fibroblasten hemmt Dermatitis oder andere entzündliche Hauterkrankungen[18]. Ob die Referenz eine Anti-Haut-Allergie-Wirkung in Mastzellen spielt, bleibt jedoch noch ungewiss. In dieser Studie wollten wir die Auswirkungen der Referenz auf Mastzell-vermittelte allergische Erkrankungen unter Verwendung menschlicher Mastzelllinien (RBL-2H3-Zellen) und einer Verbindung 48/80-- und DNCB-induzierter Anaphylaxie untersuchen Mäuse-Modell.

La referencia proviene del núcleo de loto (el embrión de la semilla) de la planta Nelumbo nucifera y es un importante alcaloide de bisbencilisoquinolina. Existe evidencia de que la referencia tiene una amplia gama de propiedades farmacológicas, como efectos anticancerígenos, antioxidantes, antiinflamatorios y neuroprotectores, en muchas enfermedades [10-15]. Beneficios de la cistanche Khan et al. encontró que la referencia production efectos anti-fotoenvejecimiento al inhibir el aumento de los niveles de ROS y malondialdehído (MDA) mediado por UV en queratinocitos y fibroblastos humanos [16,17] Recientemente, descubrimos que la referencia tiene potencial como medicina alternativa para el tratamiento de atópica Dermatitis u otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la piel[18]. Sin embargo, sigue siendo incierto si la referencia tiene un efecto contra la alergia cutánea en los mastocitos. En este estudio, nuestro objetivo fue investigar los efectos de referencia en las enfermedades aérgicas mediadas por mastocitos, utilizando líneas de mastocitos humanos (células RBL-2H3) y un modelo de ratones con anafilaxia inducida por compuesto 48/80 y DNCB .

2. Ergebnisse

2.1.Neferin-Zytotoxizitätstest an Rattenmastzellen (RBL-2H3)

Da basophile Leukämie (RBL)-2H3-Zellen der Ratte, ein Histamin-freisetzendes Mastzellanalogon, geeignete Zellen sind, um die Auswirkungen einer Mastzell-vermittelten Entzündung zu untersuchen [19], haben wir diese Zellen verwendet, um das Antiallergikum zu untersuchen Auswirkungen der Referenz. Zuerst haben wir getestet, ob die Referenz Zytotoxizität in Mastzellen hervorrufen kann. Wenn die Zellen 24 h lang mit einer Referenz von 1 bis 30 μM vorbehandelt werden, wird die Zelllebensfähigkeit der Zellen durch die Referenzbehandlung nicht beeinträchtigt (Abbildung 1).

2.2.Neferin reduziert die Degranulationswirkung von RBL-2H3, stimuliert durch verschiedene Aktivatoren

RBL-2H3-Zellen werden üblicherweise für In-vitro-Studien zur Degranulations-[20-22]Stimulation der RBL-2H3-Zellen mit Anti-Dinitrophenol (DNP)-IgE und DNP-konjugiertem Humanserumalbumin verwendet (HSA) löst Degranulation aus. Darüber hinaus ist bekannt, dass Mastzellen als Reaktion auf synthetische Verbindungen wie Verbindung 48/80 und das Calciumionophor A23187 degranulieren, und diese Verbindungen wurden als bequeme Reagenzien für direkte Studien der Mechanismen von In-vitro-Allergiereaktionen verwendet [23, 24]. Die Ergebnisse zeigten, dass das Zytoplasma von RBL-2H3, das nicht durch den Aktivator aktiviert wurde, begrenzte sekretorische Granula enthielt.Cistanche-CholesterinDie alleinige Behandlung der Referenz (10 μM) hatte keinen Einfluss auf die Aktivität von RBL-2H3 (Abbildung 2A, B). Die Zugabe verschiedener Aktivatoren, einschließlich Verbindung 48/80, A23187 und Anti-DNP/IgE plus DNP/HSA, füllte das Cytoplasma jedoch deutlich mit sekretorischen Granula. Unter dem Elektronenmikroskop ist zu sehen, dass sich im Zytoplasma eine große Anzahl sekretorischer Granula befindet, und einige sekretorische Granula verschmelzen sogar mit der Zellmembran, was zu einer Degranulation führt (Abbildung 2C-E). Nach Vorbehandlung mit Referenz 10 uM waren die sekretorischen Granula im Zytoplasma signifikant reduziert (Abbildung 2F-H). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Referenz die Aktivierung und Degranulation von RBL-2H3, die durch den Aktivator stimuliert wird, wirksam hemmen kann.

2.3. Neferin hemmt die PMA/A23187--induzierte intrazelluläre Kalziumerhöhung in RBL-2H3

Calciumionen spielen die Rolle des sekundären Botenstoffs im Prozess der Zellaktivierung. A23187 ist der effektivste Weg, um das Eindringen von Calciumionen durch Zellmembranen zu erhöhen und die Aktivierung von Mastzellen zu stimulieren. Phorbolmyristatacetat (PMA) kann die Proteinkinase Cand aktivieren und die intrazellulären Calciumionen erhöhen, um die Wirkung von A23187 zu verstärken. Der Anstieg von Calciumionen in Mastzellen wurde auch als wichtiger Faktor bei der Induktion der Mastzellaktivierung angesehen, so dass er die Degranulation von Mastzellen beeinflusst und mehr entzündliche Zytokine und Chemokine freisetzt.Cistanche Deserticola Nebenwirkungen,Daher versuchte diese Studie zu untersuchen, ob die Referenz die Calciumionenkonzentration in RBL-2H3 hemmen kann, wenn sie Entzündungen hemmt. Die experimentelle Gruppe wurde in mit oder ohne Referenzvorbehandlung für 20 min unterteilt, und 1 mM CaClz und PMA/A23187 wurden hinzugefügt, um RBL-2H3 zu stimulieren und zu aktivieren. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung von RBL-2H3 mit unterschiedlichen Referenzkonzentrationen allein den Anstieg der intrazellulären Calciumionenkonzentration nicht beeinflusste. In der PMA/A23187--induzierten Ca2t-Einstromgruppe stieg die intrazelluläre Calciumionenkonzentration signifikant an. RBL-2H3-Zellen wurden 20 Minuten lang mit der Referenz (3 μM und 10 μM) vorbehandelt, und die Calciumionenkonzentration wurde signifikant reduziert (Abbildung 3).

2.4.Neferin reduzierte die mRNA-Expression entzündungsfördernder Zytokine in PMA/A23187, stimuliert durch RBL-2H3

Die Immunantwort der Haut erhöht die Anzahl der Mastzellen im Körper, und die Mastzellen produzieren dann entzündungsfördernde Zytokine und beschleunigen das Fortschreiten der Krankheit. Entzündungsfördernde Zytokine, insbesondere TNF-a, IL-6, IL-1 und IL-8, induzieren nicht nur Entzündungen, sondern verursachen auch Leukozyteninfiltration, Granulombildung und Gewebefibrose. PMA/A23187 wirkt auf Mastzellen und veranlasst sie, IL-16, IL-6, TSLP und TNF- zu produzieren, was eine allergiebedingte Entzündung verursacht. Daher haben wir RBL-2H3 mit Referenz für 20 min vorbehandelt und mit PMA/A23187 für 6 h stimuliert, um festzustellen, ob die Referenz die mRNA-Expression von IL-1 , IL{{ 19}}, TSLP und TNF-a. Die Ergebnisse zeigten, dass in der Gruppe, die nur mit Referenz behandelt wurde, die Expression von Zytokin-mRNA nicht beeinflusst wurde und die Expression von mRNA in der Gruppe, die eine Entzündung durch PMA/A23187 induzierte, signifikant zunahm. In der mit Referenz behandelten Gruppe wurde beobachtet, dass die mRNA-Expressionsniveaus von IL-1, IL-6, TSLP und TNF-a signifikant unterdrückt waren (Abbildung 4).

2.5.Neferin hemmt die PMA/A23187--induzierte Phosphorylierung des MAPK-Signalwegs in RBL-2H3

Frühere Studien haben darauf hingewiesen, dass Mastzellen intrazelluläre Calciumionen freisetzen müssen, um MAPK zu aktivieren. Darüber hinaus reguliert der MAPK-Signalweg die Expression von Monozyten, T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Zytokinen und Chemokinen und induziert Autoimmunität. Dieser Mechanismus ähnelt dem Aktivierungsweg von PMA/A23187. In dieser Studie untersuchten wir, ob die Referenz an der Regulierung von MAPK-Wegen teilnehmen kann. Wir behandelten RBL-2H3 20 Minuten lang mit verschiedenen Referenzkonzentrationen (1, 3 und 10 µM) und stimulierten dann 30 Minuten lang mit PMA/A23187, um eine Entzündung zu induzieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die Aktivierung von p38-, JNK- und ERK-Proteinen nicht beeinträchtigt wurde, wenn RBL-2H3 nur mit unterschiedlichen Referenzkonzentrationen behandelt wurde. In der mit PMA/A23187 allein behandelten Gruppe stellten wir fest, dass p38-, JNK- und ERK-Proteine ​​aktiviert wurden und eine signifikante Phosphorylierung aufwiesen. In der mit Referenz vorbehandelten Gruppe wurde beobachtet, dass bei höheren Referenzkonzentrationen die Phosphorylierung von p38-, JNK- und ERK-Proteinen signifikant reduziert war (Abbildung 5A-C).

2.6.Neferin hemmt die PMA/A23187--induzierte Phosphorylierung des NF-B-Signalwegs in RBL-2H3

Die Expression entzündungsfördernder Zytokine hängt von der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB in Mastzellen ab. Wenn das IKB-Protein phosphoryliert und abgebaut wurde, wurde NF-kB freigesetzt und in den Zellkern migriert, wo es sich an die entsprechenden DNA-responsiven Elemente bindet und die Transkription proinflammatorischer Mediatoren fördert. Viele Zytokine und Chemokine wurden produziert, die die Immunantwort, Differenzierung und Entzündung regulieren. Daher untersuchten wir, ob die Vorbehandlung mit der Referenz die durch PMA/A23187 induzierte Proteinphosphorylierung beeinflusst. Wir behandelten RBL-2H3 mit unterschiedlichen Referenzkonzentrationen (1, 3 und 10 μM). Nach 20 min stimulierte PMA/A23187 RBL-2H3 für 1 h oder 2 h, um eine Entzündung zu induzieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung von RBL-2H3 mit unterschiedlichen Referenzkonzentrationen allein die Phosphorylierung von IKBa und NF-KB nicht beeinflusste. Wenn PMA/A23187 zur Stimulation verwendet wurde, wurde ein signifikanter Anstieg der Phosphorylierung von IkBo und NF-KB beobachtet. In der mit Referenz vorbehandelten Gruppe wurde festgestellt, dass die Phosphorylierung von IkBa (Abbildung 6A) und NF-KB (Abbildung 6B) signifikant reduziert war.

2.7.Die Wirkung von Neferin auf 2,4-Dinitrochlorbenzol (DNCB)-induzierte atopische Dermatitis

Als Tiermodell für die Krankheitsforschung ist DNCB ein repräsentativer Reizstoff, der atopische Dermatitis verursacht[25]. Unser Experiment verwendet 1 Prozent Dinitrochlorbenzol (DNCB), gelöst in 75 Prozent Alkohol, um die erste Stufe der Sensibilisierungsreaktion zu induzieren. Referenz (3 mg/kg und 1 0 mg/kg) und Dexamethason (Dexa, {{10}},2 mg/kg), gelöst in DMSO, wurden am fünften Tag zehn Tage lang intraperitoneal verabreicht . Am 8., 1. und 14. Tag wurden 0,5 % DNCB als zweite Stufe der Entzündungsauslösung appliziert. Die Mäuse wurden in vier Gruppen eingeteilt – Kontrollgruppe, DNCB-Gruppe, mit Referenz behandelte Gruppe und mit Dexamethason behandelte Gruppe – und dann wurden nach Vergleich zwischen den Gruppen die Unterschiede notiert. Wir haben beobachtet, dass DNCB auf der Haut von Mäusen eine atopische Hautentzündungsreaktion auslöst. Nach dem Auftragen von DNCB wurde festgestellt, dass die Haut der Mäuse vermehrt gerötet und schuppig wurde. Diese sind alle auf eine abnormale Keratinozytenproliferation, Infiltration und Aggregation von Immunzellen zurückzuführen. Die Gruppe, die vier Tage lang mit Referenz 3 mg/kg und Dexamethason 0,2 mg/kg behandelt wurde, hatte eine Linderung der Rötung. Wir beobachteten weiterhin den Zustand der Rückenhaut der Mäuse bis zum 15. Tag. Im Vergleich zur Kontrollgruppe hatte die DNCB-Gruppe stark gerötete und geschwollene Hautzustände, und es gab Hautschuppen und Wunden, die anscheinend durch Juckreiz und Schmerzen verursacht wurden . Wir können einen Trend mit abnehmendem Grad nach Behandlungen mit Referenz und Dexamethason feststellen (Abbildung 7A). Toluidinblau-Färbung wurde verwendet, um die Anzahl der aggregierten Mastzellen zu beobachten. Die Mastzellen erschienen violett, wenn sie unter einem Mikroskop beobachtet wurden. Es kann quantitativ gezeigt werden, dass viele Mastzellen in der DNCB-Experimentalgruppe infiltriert und in der Dermis angereichert sind, signifikant erhöht im Vergleich zur Kontrollgruppe. In der mit Referenz und Dexamethason behandelten Gruppe waren die Infiltration, Aggregation und die Anzahl der Mastzellen verringert (Abbildung 7B, C).

2.8.Neferin verbessert die mRNA-Expression von Barriere-verwandten Molekülen nach der Behandlung mit DNCB

Die durch AD verursachte hautbedingte Entzündung kann eine abnormale Hautbarrierefunktion verursachen. Wenn die Hautbarriere defekt ist, können Antigene oder Reizstoffe leichter in die Epidermis der Haut eindringen und in den Körper eindringen, um immunbezogene Reaktionen auszulösen. Gleichzeitig wird die Produktion von Differenzierungsproteinen, einschließlich Filaggrin, Loricrin und Involucrin, unterdrückt. Daher ist die Wiederherstellung der geschädigten Hautbarriere sehr wichtig für die Prävention und Behandlung von AD [26]. In unserer Studie haben wir Referenzen verwendet, um in das Tiermodell der DNCB-induzierten atopischen Dermatitis einzugreifen. Nach dem Töten von Mäusen wurde das Rückenhautgewebe für eine RI-qPCR-Analyse geerdet, um zu bewerten, ob die Referenz die Verringerung der mRNA-Expression in Filaggrin, Loricrin und Involucrin nach der Behandlung mit DNCB verbessern kann. Die Ergebnisse zeigten, dass die experimentelle DNCB-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe eine signifikant reduzierte mRNA-Expression von Filaggrin, Loricrin und Involucrin aufwies. Die mRNA-Expression von Filaggrin, Loricrin und Involucrin war in der mit Referenz und Dexamethason behandelten Gruppe im Vergleich zur DNCB-Gruppe signifikant erhöht (Abbildung 8).

Wir haben weiterhin bewiesen, dass Referenz eine antiallergische Kratzwirkung hat. Wir verwendeten ein Mastzell-Degranulationsmittel, Verbindung 48/80, um Kratzverhalten in BALB/c-Mäusen zu induzieren. Wie in Abbildung 9 gezeigt, haben wir festgestellt, dass die Behandlung der Referenz das durch Verbindung 48/80 (50 ug/Stelle) verursachte Kratzverhalten hemmt. Die wiederholte Verabreichung von niedrigeren und höheren Referenzdosen (3 und 10 mg/kg) an 5 aufeinanderfolgenden Tagen verringerte die Anzahl der durch die Verbindung 48/80 verursachten Kratzer signifikant.