Sekundäre Stoffwechselprodukte von Cyanobakterien als biotechnologische Inhaltsstoffe in natürlicher Anti-Aging-Kosmetik 2

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2.3.Biologische Aktivitäten

2.3.1. Radikalfänger-Aktivität

Das Superoxid-Anion-Radikal ist ein physiologisches freies Radikal mit extremer Bedeutung für den menschlichen Körper. Kommt es während der aeroben Atmung zu einer Überproduktion dieser ROS oder versagen die endogenen Entgiftungsmechanismen oder sind sie unzureichend, besteht ein erhöhtes Risiko oxidativer Schäden mit schwerwiegenden schädlichen Wirkungen. In diesem Sinne ist die Suche nach Mechanismen zur Hemmung der schädlichen Wirkungen von Oz* von entscheidender Bedeutung, nicht nur auf dem Gebiet der Kosmetik, sondern auch bei der Betrachtung der Linderung und Vorbeugung einer Vielzahl von Krankheiten. Das O2-Fängerverhalten von Cyanobakterienextrakten ist in Abbildung 1 dargestellt, und die IC-Werte sind in Tabelle 6 zusammengefasst.

Die wässrigen Extrakte waren beim Oz*-Abfangen signifikant wirksamer als die Acetonextrakte (Tabelle 6) und zeigten eine dosisabhängige Aktivität (Abbildung 1), wobei sich die Süßwasserstämme von den Meeresstämmen abhoben. Cephalothorax lacustris LEGE 15493 war der effektivste Stamm und wies den niedrigsten ICso-Wert auf (65,5 ug Trockenextrakt/ml, p<0.05), followed="" by="" leptolyngbya="" boryana="" lege="" 15486="" and="" nodosilinea="" nodulosa="" lege="" 06104.="" leptolyngbya="" cf.="" ectocarpi="" lege="" 11479="" was="" the="" only="" strain="" that="" did="" not="" reach="" the="" ic5o="" for="" the="" aqueous="" extract="" (table="" 6).="" on="" the="" other="" hand,="" the="" acetone="" extract="" of="" this="" strain="" was="" the="" most="" effective="" in="" o2*-="">

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Ein Vergleich der antioxidativen Kapazitäten verschiedener Cyanobakterien ist aufgrund der unterschiedlichen angewandten Methoden eine Herausforderung. Morone und Mitarbeiter bewerteten die Radikalfängerfähigkeit von Ethanolextrakten (70 % v/v) verschiedener Cyanobakterienstämme [26], wobei der niedrigste ICso-Wert 822,70 ug/ml für Phormidium sp.LEGE 02 05292 betrug, während Nr Aktivität wurde für Nodosilinea nodulosa LEGE 06102 nachgewiesen. Lopes und Mitarbeiter berichteten über O2-Abfangaktivität für Nodosilinea (Leptolynbbya) Antarktis LEGE13457 und Cuspidothrix issatschenkoi LEGE 03282 Acetonextrakte mit IC25-Werten von 319 und 286 ug/ml und keine Aktivität für Leptolynbbya- wie sp.LEGE 13412 [27]. Die Autoren berichteten auch über eine höhere Wirksamkeit der Acetonextrakte im Vergleich zu Ethanolextrakten. Eine andere von Amaro und Mitarbeitern durchgeführte Studie ergab IC50-Werte von 1394 und 826 ug/ml für Gloeothece sp. bzw. Scenedesmus obliquus (M2-1) [37]. Die hier erhaltenen Ergebnisse für Acetonextrakte scheinen weniger vielversprechend als die zuvor berichteten, obwohl sie in der gleichen Größenordnung liegen. Andererseits zeigten die wässrigen Extrakte ein enormes Potenzial, das es wert ist, für kosmetische Anwendungen im Bereich der Hautalterung weiter ausgeschöpft zu werden.

2.3.2. Enzymhemmung

MMPs sind eine Familie von extrazellulären zinkabhängigen Enzymen, deren Hauptfunktion darin besteht, die ECM umzugestalten und abzubauen[38], ein gelartiges Material, das wesentlich ist, um Zellen zusammenzuhalten und einen Weg für Nährstoffe und Sauerstoff bereitzustellen [39]. Durch MMPs induzierte Veränderungen der ECM-Komponenten wie Kollagen und Elastin sind die Grundlage für Hautschäden und Faltenbildung [40]. Zusammen mit diesen Enzymen, die mit Hautstruktur und Faltenbildung in Verbindung stehen, übernimmt ein weiteres Enzym aufgrund seiner Aktivität bei der Melanogenese eine entscheidende Rolle im Alterungsprozess: die Tyrosinase. Neben anderen Faktoren verursacht die UVR-Exposition aufgrund der erhöhten ROS-Produktion eine Ansammlung einer abnormalen Menge an Melanin. Diese reaktiven Spezies beeinflussen die Aktivität von Melanozyten, was die Umwandlung von Tyrosin in Melanin durch Oxidation erhöht, was zu Hyperpigmentierung und unregelmäßigen Hautflecken führt [41].

Cistanche kann Anti-Aging

Auf der Suche nach natürlichen Alternativen zu kommerziellen Anti-Aging-Inhaltsstoffen mit Schwerpunkt auf den oben genannten Enzymen wurde die Aktivität von Cyanobakterien-Extrakten untersucht (Abbildung 2). Bezüglich der HAase waren nur drei Stämme in der Lage, dieses Enzym dosisabhängig zu hemmen: Der wässrige Extrakt von Leptolyngbya vgl. ectocarpiLEGE 11479 (IC50=863 ug/ml) und die Acetonextrakte von Cephalothrix lacustris LEGE 15493 und Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, wobei die beiden letzteren nur IC25 (832 bzw. 995 ug/ml) erreichen. Auch wenn diese Werte hoch erscheinen, war ihr Aktivitätsbereich ähnlich dem des Referenzarzneimittels Dinatriumcromoglicat (DSCG) (IC50=105 ug/mL). Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass dies für die höchste getestete Konzentration gilt (1 mg/ml), Leptolyngbya vgl. ectocarpi LEGE 11479 hemmte dieses Enzym zu 80 Prozent (Abbildung 2), was diesen Extrakt als kosmetischen Inhaltsstoff vielversprechend macht.

Nur wenige Studien haben über die potenzielle Wirkung von Cyanobakterien-Verbindungen und -Extrakten auf die Hyaluronidase-Aktivität berichtet, und jeder Vergleich zum biologischen Potenzial von Extrakten sollte berücksichtigen, dass der Stoffwechsel von Cyanobakterien je nach Kultivierungsbedingungen erheblichen Schwankungen unterliegt, die die chemische Zusammensetzung der Extrakte beeinflussen. Morone und Mitarbeiter [26] bewerteten die Wirkung von Ethanolextrakten von Tychonema sp. LEGE 07196 und Cyanobium sp. LEGE 07175 auf Hyaluronidase und fanden eine stärkere inhibitorische Aktivität mit ICso-Werten von 182,74 bzw. 208,36 ug/ml. Die Aktivität von Ethanolextrakten wurde auch für eine unlösliche Fraktion von Spirulina platensis mit einem IC5o von 150 ug/ml berichtet[42]. Eine andere Studie, durchgeführt von Yamaguchi und Koketsu [19], zeigte, dass Nostochopsis lobatus MAC0804NAN eine große Menge an Polysacchariden mit einer hohen hemmenden Wirkung (IC50=7,18 ug/mL) produzierte. Es wurde auch berichtet, dass eine Arthrospira- abgeleitetes Peptid kann an der Hyaluronidase-Hemmung beteiligt sein [4]. Zusammengenommen unterstützen diese Ergebnisse das Potenzial von Cyanobakterien-Verbindungen und -Extrakten als Anti-Aging-Inhaltsstoffe für kosmetische Anwendungen.

In Bezug auf Elastase zeigten nur Acetonextrakte eine interessante Bioaktivität. Leptolyng-bya vgl. ectocarpi LEGE 11479 war wieder am aktivsten (Abbildung 2), da er als einziger Stamm den ICso erreichte, mit einem Wert von 391 ug/ml. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, Cephalothrix lacustris LEGE 15493 und Leptolyngbya boryana LEGE 15486 erreichten nur IC25 mit Werten von 126,86 bzw. 99 ug/mL. Was die Hyaluronidase betrifft, so haben sich Meeresstämme als die vielversprechendsten erwiesen.

Nach unserem besten Wissen gibt es keine früheren Berichte über Elastase-Hemmaktivität für die hier untersuchten Stämme. Bei anderen Stämmen wurde entdeckt, dass Nostoc minutum Peptide vom Microviridin-Typ und Nostopeptine produziert, mit ICso =1,3 und 11,0 ug/ml [44,45]. Microviridine B und enthalten in Microcystis aeruginosa hemmten die Elastase ebenfalls wirksam, mit ICso-Werten von 0.044 und 0,084 ug/ml [46]. Die meisten verfügbaren Daten zur Elastase-Hemmung konzentrieren sich auf isolierte Verbindungen, Daher sind Vergleiche mit den Extrakten unserer Stämme schwierig.

Ungleichmäßige Hautpigmentierung, die sowohl mit Alterung als auch UV-Exposition verbunden ist, bleibt ein Hauptanliegen der alternden Bevölkerung und der Kosmetikindustrie. Die Mehrheit der verfügbaren Studien ist unbedeutend und verwendet Pilz-Tyrosinase als enzymatisches Modell, was es schwierig macht, die Ergebnisse auf die menschliche Umgebung zu übertragen, dennoch hat dieses Enzym eine große Ähnlichkeit und Homologie mit menschlicher Tyrosinase[47]. Daher wurde hier das gleiche enzymatische Modell verwendet, um das Potenzial von Cyanobakterien-Extrakten bei der Tyrosinase-Hemmung zu untersuchen. Was Elastase betrifft, waren nur Acetonextrakte in der Lage, Tyrosinase zu hemmen. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 war am effektivsten (Abbildung 2), da es der einzige Stamm war, der den IC#N (989,26 ± 4,3 ug/ml) erreichte. Darunter lag Leptolyngbya boryana LEGE 15486 mit IC25=784 78 ± 4,33 ug/ml. mL und schließlich Leptolyngbya cf.ectocarpi LEGE 11479, wobei die vielversprechendsten Ergebnisse für die Meeresstämme gefunden wurden.

Morone und Mitarbeiter [26] untersuchten zuvor die Aktivität von ethanolischen Extrakten aus Cyanobakterien in demselben Modell, fanden aber keine Aktivität. Ein interessanter Aspekt dabei ist, dass einer der untersuchten Stämme Nodosilinea nodulosa LEGE 06102 war, der hier die besten Ergebnisse zeigte, was wiederum die Bedeutung der Extraktionslösungsmittel für die Gewinnung gezielter bioaktiver Extrakte unterstreicht. Wie für die anderen untersuchten Enzyme gibt es auch für Tyrosinase nur wenige Untersuchungen, die sich auf Cyanobakterien konzentrieren. In einer von Yabuta und seinem Team durchgeführten Arbeit [48] wurde berichtet, dass der Heißwasserextrakt von Nostochopsis spp. signifikant die Tyrosinase-Aktivität (IC50=250 ug/mL) hemmte. Dies ist ein sehr interessantes Ergebnis, wenn man bedenkt, dass es aus einem wässrigen Extrakt stammt, für den in der vorliegenden Studie keine Aktivität gefunden wurde. Die Autoren führen das Ergebnis auf die Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht zurück, die aus PBPs durch Wärmebehandlung freigesetzt werden, nämlich eine Bilin-Einheit, die als potenter Peroxyl-Radikalfänger wirkt. In einer anderen Studie wurde die hemmende Aktivität von Arthrospira platensis-Ethanol- (IC50=14,000 ug/ml) und Wasserextrakten (IC50 =72,000 ug/ml) untersucht, wobei die Werte wurden dem Vorhandensein von phenolischen Verbindungen wie Ferula- und Kaffeesäure im Ethanolextrakt zugeschrieben [49].

2.3.3.UV-Schutz

Obwohl immer mehr Kosmetikunternehmen Sonnenschutzmittel in ihre Produkte integrieren, ist es immer noch schwierig, die Verbraucher von den Vorteilen ihrer täglichen Anwendung zu überzeugen, um die vorzeitige Hautalterung zu verlangsamen. Ist einerseits die tägliche Anwendung von Sonnenschutzmitteln eine wenig eingefleischte Gewohnheit, besteht andererseits eine gewisse Angst vor der Verwendung synthetischer Substanzen aufgrund der damit verbundenen unerwünschten Risiken[50]. Infolgedessen hat die Forschung zum natürlichen Lichtschutz in den letzten Jahren erheblich zugenommen, angesichts ihres Potenzials für biologische Abbaubarkeit und geringere Toxizität, was sie für Mensch und Umwelt vorteilhafter macht. Um Cyanobakterienextrakte auf diesem Gebiet zu untersuchen, wurde ihre Fähigkeit als Sonnenschutzmittel in vitro für UVR-B bewertet, da es die schädlichste Strahlung ist. Die für wässrige Cyanobakterien- und Acetonextrakte gefundenen Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt.

In Bezug auf Acetonextrakte wurde der vielversprechendste Wert (19,2) für Leptolyngbya boryana LEGE 15486 gefunden, gefolgt von Leptolyngbya cf.ectocarpi LEGE 1479 (10,7), beide bei der niedrigsten getesteten Konzentration, 200 ug/mL. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 war unter den Acetonextrakten am wenigsten vielversprechend. In wässrigen Extrakten wurden die vielversprechendsten Ergebnisse für die höchste getestete Konzentration erzielt, wobei Leptolyngbya boryana LEGE 15486 und Cephalothrix lacustris LEGE 15493 mit in-vitro-SPF-Werten von 17,1 bzw. 14,9 herausragten (Tabelle 7).cistanche lebensverlängerungBei der Diskussion früherer Studien auf diesem Gebiet berichteten Hossain und sein Team [51], dass der SPF-Wert für Cephalothrix komarekiana-Extrakt 2,37 betrug. Eine andere Gruppe fand heraus, dass der SPF eines Methanolextrakts von Aphanizomenon flos-aquae 4 betrug [52]. Allerdings waren die Informationen über die von den Autoren verwendete Konzentration des Extrakts nicht verfügbar, was mögliche Vergleiche erschwerte.

Die Anzahl der auf dem Gebiet der Kosmetik erforschten Cyanobakterienstämme, insbesondere im Hinblick auf SPF, ist angesichts der Möglichkeiten dieser Ressourcen sehr gering. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die untersuchten Arten gute Optionen als biologischer Lichtschutz darstellen und möglicherweise als Booster für andere derzeit vermarktete Sonnenschutzmittel wirken, was eine Verringerung der Konzentration synthetischer Sonnenschutzmittel in den Formeln ermöglicht. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die Forschung an diesen Organismen zu intensivieren, insbesondere an ihren bioaktiven Extrakten, die aufgrund ihrer deutlich geringeren Kosten, höheren Ausbeute und schnelleren Gewinnung als isolierte Verbindungen umweltfreundlicher und wirtschaftlich attraktiver sind.

2.4. Diskriminierung von Cyanobakterien-Extrakten durch PCA-Analyse

Die Suche nach bioaktiven Verbindungen aus natürlichen Quellen mit dem Potenzial zur Verwendung als Inhaltsstoffe im Bereich der Kosmetik hat in den letzten Jahren zugenommen. Von Cyanobakterien abgeleitete Verbindungen sind nicht nur potenziell weniger toxisch und vollständig biologisch abbaubar, sondern auch aus erneuerbaren Quellen erhältlich und können kostengünstig in einer kontrollierten Umgebung erhalten werden.cistanche nzDie Klassifizierung bioaktiver Extrakte nach ihrer chemischen Zusammensetzung und ihren biologischen Aktivitäten kann wertvoll sein, um mögliche Zusammenhänge aufzuzeigen. In diesem Zusammenhang wurde die Hauptkomponentenanalyse (PCA) angewendet, wobei die chemische Zusammensetzung der Cyanobakterienextrakte und die Bioaktivität der höchsten in jedem Assay getesteten Konzentration berücksichtigt wurden (Abbildung 3). Wie zu sehen ist, konnten 72,99 Prozent der Variabilität durch die ersten beiden Dimensionen erklärt werden: PCl machte 50,41 Prozent der Varianz aus, während PC2 für 22,58 Prozent verantwortlich war. Es wurden drei Gruppen unterschieden (Abbildung 3A ): Gl, mit Wasserextrakt von Leptolyngbya cf. exocarp LEGE 11479; G2, das die Wasserextrakte von Cephalothrix lacustris LEGE 15493, Leptolyngbya boryama LEGE 15486 und Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 umfasst; und G3, einschließlich aller Acetonextrakte. Gemäß Fig. 3B unterscheidet sich Gl aufgrund des PE-Gehalts chemisch von den anderen Proben; Die Wasserextrakte von Cephalothrix lacustris LEGE 15493, Leptolyngbya boryana LEGE 15486 und Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 werden gemäß ihrem Gehalt an PC, APC und Gesamtproteinen (G2) gruppiert, während alle Acetonextrakte in der gleichen Gruppe (G3) zu finden sind auf ihren Gehalt an Carotinoiden und Chlorophyll a und seinen Derivaten. Die Verbindungen jenseits der enzymatischen Aktivitäten werden angezeigt, wobei die Ebenen mit der positiven PCl-Achse gebildet werden (Abbildung 3B). Es ist zu beobachten, dass Proben mit höheren Gehalten an Chlorophyll a und Carotinoiden eng mit der Elastase a- und Tyrosinasehemmung zusammenhängen. Dies wird durch die starke positive Korrelation zwischen Carotinoiden und Elastase (0,725, p<0.01) and="" tyrosinase=""><0.01) inhibition,="" with="" similar="" observations="" between="" chlorophyll="" a="" and="" the="" same="" enzymes=""><0.01 and=""><0.05,respectively). on="" the="" other="" hand,="" hyaluronidase="" inhibition="" is="" more="" correlated="" vvith="" pe="" content="" (figure="" 3b),="" with="" a="" significant="" positive="" correlation="" between="" the="" values=""><0.01).the compounds="" responsible="" for="" the="" radical="" scavenging="" activity="" of="" the="" extracts="" are="" displayed,="" with="" the="" planes="" formed="" with="" the="" pcl="" negative="" axis.="" the="" closest="" correlation="" is="" observed="" for="" tpc=""><0.05); other="" compounds="" such="" as="" total="" proteins,="" pc,and="" apc="" also="" contribute="" to="" the="" activity,="" although="" to="" a="" lower="" extent="" (figure="" 3b).regarding="" the="" spf,="" there="" is="" a="" close="" correlation="" between="" the="" activity="" of="" the="" extracts="" and="" their="" pbp="" content,mainly="" apc=""><0.01)and pc="" (0.838,="" p="" <="" 0.01),="" which="" points="" to="" these="" compounds="" as="" predominantly="" responsible="" for="" blocking="" uv-b="" radiation.="" the="" total="" protein="" content="" also="" contributed="" to="" this="" biological="" activity="" (0.670,=""><0.01), with="" the="" lowest="" contribution="" being="" observed="" for="" pe="" (0.210,p="">0.05). Im Allgemeinen ermöglichte die PCA-Analyse die Gruppierung von Extrakten nach den biologischen Aktivitäten, die im Bereich der Hautalterung gezeigt wurden, was zu dem Schluss führte, dass Acetonextrakte wirksamer bei der Hemmung von Enzymen sind, die für den Abbau verantwortlich sind der Hautmatrix und Verlust der Hautstruktur, während wässrige Extrakte freie Radikale effektiver abfangen und die Haut vor den schädlichen Wirkungen der UV-Strahlung schützen.

Soweit wir wissen, ist dies das erste Mal, dass ein Zusammenhang zwischen der chemischen Zusammensetzung und den biologischen Aktivitäten von Extrakten aus diesen Cyanobakterienstämmen hergestellt wurde.

3. Materialien und Methoden

3.1. Biomasseproduktion von Cyanobakterien

Vier filamentöse Cyanobakterienstämme, Cephalothrix lacustris LEGE 15493 und Lep-tolyngbya boryana LEGE 15486, aus brasilianischen Süßwasserökosystemen und Leptolyngbya cf. ectocarpi LEGE 11479 und Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 aus portugiesischen Meeresökosystemen wurden in dieser Studie verwendet. Die Stämme wurden in der Blue Biotechnology and Ecotoxicology Culture Collection (LEGE CC) am Interdisziplinären Zentrum für Meeres- und Umweltforschung (CIIMAR) gehalten. kontrollierten Bedingungen, sequentiell auf 4 l vergrößert. Die Stämme wurden in Z8-Medium [53] gezüchtet, ergänzt mit 10 ug/l Vitamin B12 und 25 g/LNaCl für Meeresstämme. Die Kulturen wurden bei 25 Grad gehalten, mit einer Lichtintensität von 10 umol Photonen m-2 s-4 und mit einer Photoperiode von 14 h hell:10 h dunkel. Die frische Biomasse wurde nach 120 oder 150 Tagen Wachstum (je nach Stamm) durch Filtration gesammelt und eingefroren, gefriergetrocknet und bis zur Extraktherstellung bei -20 Grad gelagert.

3.2. Vorbereitung der Extrakte

Aus jedem Stamm wurden nacheinander zwei verschiedene Extrakte hergestellt: Aceton und wässrig. Zunächst wurde der Acetonextrakt unter Verwendung von 2 g trockener Biomasse hergestellt. Die Biomasse wurde in Aceton suspendiert und 10 min im Ultraschallbad (Fisherbrand [FB15053, Loughborough, UK) extrahiert. Nach der Acetonextraktion wurde das resultierende Pellet in der Abzugshaube trocknen gelassen und dann mit 70 ml destilliertem Wasser nach dem gleichen Verfahren extrahiert. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 10,00×× g Gs für 5 min bei 4 Grad in einer HERAEUS MegafugeTM 16R Mikrozentrifuge (Thermo ScientificTM, Waltham, MA, USA) entfernt. Überstände von jeder Extraktion wurden unter reduziertem Druck eingedampft Druck (BUCHIR-210 Rotationsverdampfer) (Acetonextrakt) oder gefroren und lyophilisiert (wässriger Extrakt). Die Extraktion mit dem entsprechenden Überstand wurde dreimal wiederholt. Die Trockenextrakte wurden bis zur weiteren chemischen und biologischen Analyse bei -20 Grad aufbewahrt.

3.3.Zell-Assays

3.3.1.Zellkultur

Menschliche Keratinozyten HaCAT (ATCC), Maus-Fibroblasten 3L1 (ATCC) und menschliche Endothelzellen hCMEC (bereitgestellt von Dr. POCouraud (INSERM)) wurden für die Zytotoxizitätsbewertung verwendet. Zelllinien wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM GlutaMAXTM, Gibco, Glasgow, UK), ergänzt mit 10 Prozent (v) fötalem Rinderserum (Gibco), 1 Prozent Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep 100 IE /ml bzw. 10 mg/ml) (Gibco) und 0,1 Prozent Amphotericin B (Gibco). Zellerhaltung und Assays wurden bei 37 Grad in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO 2 durchgeführt, und das Kulturmedium wurde alle zwei Tage erneuert. Bei 80-90 Prozent Zellkonfluenz wurden adhärente Zellen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, Gibco) gewaschen, mit TrypLEX-Express-Enzym (1×) (Gibco) abgelöst, zur Erhaltung übergeben und für die geplanten Assays ausgesät.

3.3.2.Zytotoxizität – MTT-Assay

Die Zelllebensfähigkeit wurde durch die Reduktion des {{0}}(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromids (MTI, Sigma-Aldrich, Deutschland)-Assay, wie zuvor berichtet [26]. Alle Zelllinien (Endothelzellen, Fibroblasten und Keratinozyten) wurden in 96--Well-Platten mit einer Dichte von 1,0 × 10 Zellen/ml, 3,3 × 10 4 Zellen/ml bzw. 2,5 × 10 4 Zellen/ml ausgesät.Cistanche PenisgrößeNach 24 h Zelladhäsion wurde das Kulturmedium entfernt, und die Zellen wurden 24 und 48 h frischem Medium ausgesetzt, das die verschiedenen Cyanobakterienextrakte in fünf seriellen Konzentrationen von 12,5 bis 200 ug/ml enthielt. Für die Acetonextrakte wurden Stammlösungen in Dimethylsulfoxid (DMSO) (Gibco) hergestellt und vor der Exposition der Zellen mit DMEM verdünnt, so dass die maximale DMSO-Konzentration 1 Prozent nicht überstieg. Wässrige Extrakte wurden in PBS hergestellt und vor der Exposition der Zellen mit DMEM verdünnt. Die Negativkontrolle war PBS, und die Kontrolle für den Zelltod war DMSO 20 Prozent. Nach der Inkubation wurde der MIT-Cytotoxizitätsassay durchgeführt. Kurz gesagt, 20 &mgr;l MTT-Lösung wurden zu jeder Vertiefung gegeben und 3 h lang bei 37 Grad inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Medium vorsichtig entfernt und die purpurfarbenen Formazansalze in DMSO gelöst. Die Extinktion wurde bei 550 nm mit einem Synergy HT-Multidetektions-Mikroplattenlesegerät (Biorek, Bad Friedrichshall, Deutschland), betrieben mit GEN51M-Software, abgelesen. Der Assay wurde vierfach durchgeführt und gemittelt. Zur Reproduzierbarkeit wurde jeder Assay mindestens dreimal unabhängig voneinander wiederholt. Die Zytotoxizität wurde als Prozentsatz der Zelllebensfähigkeit ausgedrückt, wobei eine 100-prozentige Lebensfähigkeit in der Lösungsmittelkontrolle berücksichtigt wurde.

3.4. Chemisches Profiling von Cyanobakterien-Extrakten

3.4.1.Gesamtphenolgehalt (TPC)

Um die TPC der Extrakte zu bestimmen, wurde ein kolorimetrischer Assay basierend auf der Folin-Ciocalteu-Methodik [54] mit leichten Modifikationen verwendet. Die Acetonextrakte wurden in DMSO solubilisiert und die wässrigen Extrakte in Wasser. Kurz gesagt, 25 μl jedes Extrakts (10 mg/ml) wurden vollständig mit 25 μl Folin-Ciocalteu-Reagenz (Sigma-Aldrich) gemischt20{{20}} μl NagCO3-Lösung und 500 μl deionisiertes Wasser. Für den Blindwert wurde das Folin-Ciocalteu-Reagenz durch entionisiertes Wasser ersetzt. Die Extinktion des gebildeten gefärbten Produkts wurde bei 725 nm unter Verwendung eines Synergy HT Multi-Detektions-Mikroplattenlesegeräts (Biotek, Bad Friedrichshall, Deutschland), das über die GEN51M-Software betrieben wurde, gemessen. Standardkurven für die TPC-Quantifizierung wurden unter Verwendung von sieben Konzentrationen von Gallussäure (GA) (0,025 bis 0,5 mg/ml) erhalten, die im gleichen Lösungsmittel wie die zu testenden Extrakte hergestellt wurden (y=2.097x＋0,01560 R²{{ 22}}.9989 für Aceton und y=2.204x＋0.01401,R2=0.9982 für Wasser, wobei "y" sich auf die Extinktion und "x" auf die Konzentration bezieht) . Drei unabhängige Bestimmungen wurden doppelt durchgeführt. Der Gesamtphenolgehalt wurde als ug GA-Äquivalente (GAE) pro mg Trockenextrakt ausgedrückt.

3.4.2.Gesamtproteine

Die Gesamtproteinkonzentration wurde unter Verwendung des BCA-Proteinassaykits (#23227, Thermo-Scientific) bestimmt. Wässrige Extrakte wurden in Wasser hergestellt, während Acetonextrakte in DMSO hergestellt wurden. Kurz gesagt, in einer 96--Well-Platte, 25 ul jedes Extrakts (1 mg/ml) wurden mit 200 ul des Arbeitsreagens gemischt. Die Extinktion wurde bei 562 nm unter Verwendung eines Synergy HT Multi-Detektions-Mikroplattenlesegeräts (Biotek, Bad Friedrichshall, Deutschland) gemessen, das über die GEN5IM-Software betrieben wurde. Eine Standardkurve (y=-126.87x3＋547.73.353 -10.017; R2=0.999 und y=162.87x3-248.51x²＋932.13x -11.715;R2=0.99, wobei "y" sich auf die Extinktion und "x" auf die Konzentration bezieht) wurde für jeden Extrakt unter Verwendung von neun Albuminkonzentrationen (BSA) (25 to 2000 ug/mL), um die Proteine ​​zu quantifizieren. Drei unabhängige Experimente wurden dreifach durchgeführt. Der Gesamtproteingehalt wurde als ug Äquivalente von Rinderserumalbumin (BSA) pro mg Trockenextrakt ausgedrückt.

3.4.3.Pigmente

Die sowohl in wässrigen als auch in Acetonextrakten vorhandenen Pigmente wurden spektrophotometrisch quantifiziert. Chlorophyll a und seine Derivate wurden unter Verwendung einer Kalibrierungskurve quantifiziert, die mit dem kommerziellen Standard (Sigma-Aldrich) erhalten wurde: y=8.0791x-0.0{{19} }22 (R2=0.996), wobei sich "y" auf die Extinktion und "x" auf die Konzentration bezieht. Gesamtcarotinoide wurden als -Carotin (Sigma-Aldrich) durch seine Kalibrierungskurve （y=17.133x＋0.0099; R²=0.990, wobei sich "y" auf die Extinktion und "x" auf die Konzentration bezieht). Die Gesamt-Carotinoidkonzentration wurde als &mgr;g &bgr;-Carotin pro mg Trockenextrakt ausgedrückt. Kalibrierungskurven für beide Standards wurden unter Verwendung von fünf verschiedenen Konzentrationen (0,001 bis 0,025 mg/ml) erhalten. Die spektrophotometrischen Bestimmungen wurden in 96--Well-Platten bei 450 nm für -Carotin und 663 nm für Chlorophyll a unter Verwendung von durchgeführt ein Synergy HT Multidetektions-Mikroplattenlesegerät (Biotek, Bad Friedrichshall, Deutschland), das über die GEN5TM-Software betrieben wird.

Der PBP-Gehalt wurde spektrophotometrisch bestimmt, indem die Extinktionen der wässrigen Extrakte bei verschiedenen Wellenlängen (562, 615 und 645 nm) gemessen und die entsprechenden Formeln angewendet wurden, wie zuvor von Pagels et al. [34]: Wässrige Extrakte wurden auf eine Endkonzentration von 0,5 mg/ml resuspendiert. Das Experiment wurde dreifach durchgeführt, und die Ergebnisse wurden in ug/mg Trockenextrakt ausgedrückt. 3.5.Biologische Aktivitäten

3.5.1.Superoxid-Anion-Radikal (O2*-)-Abfangen

Der Radikalfänger-Assay von Oz*- wurde durchgeführt, um das antioxidative Potenzial der Cyanobakterien-Extrakte nach Barbosa und Mitarbeitern [55] mit geringfügigen Modifikationen zu bewerten. Die wässrigen Extrakte wurden in Wasser hergestellt, während Acetonextrakte in DMSO hergestellt wurden. Für jeden Extrakt wurden fünf Reihenverdünnungen hergestellt und getestet, um das Verhalten und die IC-Werte der Extrakte zu bewerten. Alle Reagenzien wurden in Phosphatpuffer (19 uM, pH 7,4) gelöst. Ein Volumen von 50 μl jeder Verdünnung wurde mit 50 μl 166 μM-Nicotinamidadenindinukleotid-reduzierter Form (NADH)-Lösung und 150 μl 43 μM Nitrotetrazoliumblauchlorid(NBT) in einer 96--Well-Platte gemischt. Nach Zugabe von 50 μl 2,7 μM Phenazinmethosulfat (PMS) wurde die Radikalfängeraktivität der Proben mit einem Synergy HT Multi-detection Microplate Reader (Biotek, Bad Friedrichshall, Deutschland) überwacht, der über die GEN51M-Software in kinetischer Funktion betrieben wurde, bei Raumtemperatur für 2 min bei 562 nm. Drei unabhängige Assays wurden dreifach durchgeführt. GA wurde als positive Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der Radikalfänger im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle ausgedrückt. Die Ergebnisse für die berechneten IC-Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (ug/ml) von mindestens drei unabhängigen Assays ausgedrückt, die doppelt durchgeführt wurden. Die IC-Werte und die entsprechenden Dosis-Wirkungs-Kurven wurden mit der Software Graphpad Prism® (San Diego, CA, USA; Version 9, für MacOS) berechnet.

3.5.2. Hyaluronidase-Hemmung

Der Hyaluronidase-Inhibitionsassay wurde gegenüber dem von Ferreres et al. [56] leicht modifiziert. Kurz gesagt, 25 μl jedes Extrakts (9 mg/ml), 175 μl Hyaluronsäure (HA) (0,7 mg/ml) und 25 μl Hyaluronidase (HAase) (90{{ 14}} U/mL in NaCl0,9 Prozent ）wurden in einem Reaktionsröhrchen gemischt. Wässrige Extrakte wurden in Wasser hergestellt und Acetonextrakte wurden in DMSO hergestellt. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37 Grad wurde die Reaktion durch die Zugabe von 25 μl Dinatriumtetraborat (0,8 M in Wasser) gestoppt, gefolgt von einer 3-minütigen Inkubation bei 90 Grad in einem Wasserbad. Die Reaktionsröhrchen wurden auf Raumtemperatur gekühlt, bevor 375 &mgr;l DMAB[4-(Dimethylamino)benzaldehyd]-Lösung zugegeben wurden. Nach 20-minütiger Inkubation bei 37 Grad wurde die Extinktion des gebildeten gefärbten Produkts bei 560 nm in einem Synergy, HT Multi-Detektions-Mikroplattenlesegerät (Biotek, Bad Friedrichshall, Deutschland), das über die GEN5IM-Software betrieben wurde, gemessen. Die Negativkontrolle wurde ohne Extrakt durchgeführt. Als positive Kontrolle wurde Dinatriumcromoglycat (DSCG) verwendet.

Drei unabhängige Assays wurden dreifach durchgeführt, und die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der Enzymhemmung im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle ausgedrückt.

3.5.3.Elastase-Hemmung

Der Schweine-Pankreas-Elastase-Inhibitionsassay wurde nach Mota und Mitarbeitern[57] mit leichten Modifikationen durchgeführt. Wässrige Extrakte wurden in Wasser hergestellt, während Acetonextrakte in DMSO hergestellt wurden. In einer 96-Well-Platte wurden kurz 50 μl des Extrakts mit 90 ul HEPES-Puffer (0,1 M) gemischt, 10 ul N-Succinyl-Ala-Ala-Ala p-Nitroanilid-Substrat (100 uM), 70 ul Acetatpuffer (200 mM) und 30 ul Elastase (1 U/ml) Die Platte wurde bei 37 Grad inkubiert 10 min, und die Extinktion des Reaktionsprodukts wurde bei 405 nm in einem Synergy HT Multidetection-Mikroplattenlesegerät (Biotek, Bad Friedrichshall, Deutschland), betrieben über GEN51M, gemessen. Die Negativkontrolle wurde in Abwesenheit von Extrakt durchgeführt, und Ascorbinsäure wurde als Positivkontrolle verwendet.Cistanche-PulverDrei unabhängige Assays wurden dreifach durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der Enzymhemmung im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle ausgedrückt.

3.5.4.Tyrosinase-Hemmung

Der Tyrosinase-Hemmtest wurde nach Adhikari et al.[58] durchgeführt. mit leichten Modifikationen. Kurz gesagt, in einer 96-Well-Platte wurden 20 μl jedes Extrakts mit 100 μl Tyrosinase (30 U/ml in Phosphatpuffer) gemischt. Wässrige Extrakte wurden in Wasser hergestellt, während Acetonextrakte in DMSO hergestellt wurden. Die Mischung wurde 8 min bei 30 Grad inkubiert. Dann wurden 80 μl L-DOPA (L-3,4-Dihydroxyphenylalanin)-Lösung (2,5 mM in Phosphatpuffer) zugegeben, und die Absorption (T0, Absorption zu einem Zeitpunkt "Null") war sofort gemessen mit einem Synergy HT Multi-detection microplate reader (Biotek, Bad Friedrichshall, Deutschland), betrieben über die GEN5TM-Software, bei 475 nm. Die Bestimmung der Extinktion bei T0 (bevor das Reaktionsprodukt gebildet wurde) ermöglichte die Eliminierung möglicher Interferenzen aufgrund der natürlichen Farbe der untersuchten Extrakte. Nach 8-minütiger Inkubation bei 30 Grad wurde die Extinktion erneut gemessen (T8). Der Prozentsatz der Tyrosinasehemmung in Gegenwart von Cyanobakterienextrakten wurde im Vergleich zur unbehandelten (negativen) Kontrolle berechnet, wobei die Differenz zwischen den Extinktionen (T{ {21}}T0) entspricht 100 Prozent Enzymaktivität. Die Negativkontrolle wurde ohne Extrakt durchgeführt, und Kojisäure wurde als Positivkontrolle verwendet. Drei unabhängige Assays wurden dreifach durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der Enzymhemmung im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle ausgedrückt.

3.5.5.Sonnenschutzfaktor (SPF)

Der In-vitro-Lichtschutzfaktor wurde nach Rohr und Mitarbeitern[59]mit leichten Modifikationen bestimmt. Wässrige Extrakte wurden in Wasser hergestellt, während Acetonextrakte in Aceton hergestellt wurden. Kurz gesagt wurde die Extinktion von 2 ml jedes Extrakts (20 und 1000 ug/ml) in einem Spektrophotometer (von 290 bis 320 nm, 5 in 5 nm) gemessen. Der SPF wurde nach der von Mansur [60] vorgeschlagenen Formel berechnet: wobei EE (A) das Erythem-Effekt-Spektrum, I (A) das Sonnenintensitätsspektrum, Abs (λ) die Extinktion des Extrakts und CF die Korrektur ist Faktor (28) bestimmt mit einem handelsüblichen Sonnenschutzmittel mit einem bekannten SFP-Wert von 30.

3.6.Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit der Statistiksoftware IBM SPSS (Version 23.0 für macOS, IBM Corporation, New York, NY, USA, 2015) durchgeführt. Die Daten wurden von Kolmogorov-Smirnov und Leven auf Normalität und Homogenität der Varianzen analysiert Tests, dann einer einfachen ANOVA unter Verwendung eines Tukey-HSD (ehrlich signifikanter Unterschied) als Post-Doc-Test oder einem ungepaarten t-Test unterzogen. Ein Pearson-Korrelationstest wurde verwendet, um die normalisierten Expressionsdaten zwischen den chemischen Profilen und den biologischen Aktivitäten von Cyanobakterienextrakten zu vergleichen.

3.7. Hauptkomponentenanalyse (PCA)

PCA wurde verwendet, um eine Reihe potenziell korrelierter Variablen in eine Reihe relativ unabhängiger Variablen umzuwandeln, die basierend auf ihrem Beitrag zur Erklärung der Variation des gesamten Datensatzes in eine Rangfolge gebracht werden konnten[61]. Die relativ wichtigen Komponenten hochdimensionaler Muster können erfolgreich identifiziert werden. Die ursprünglichen hochdimensionalen Daten können auf einen niedrigerdimensionalen Raum abgebildet werden, und daher wird die Komplexität eines hochdimensionalen Musterklassifizierungsproblems stark reduziert [62]. Für die vorliegende Studie wurde eine Mustererkennung basierend auf PCA unter Verwendung der Statistiksoftware IBM SPSS (Version 23.0 für macOS, IBM Corporation, New York, NY, USA, 2015) durchgeführt. Die Datenmatrix bestand aus den Metaboliten, die in den wässrigen und Acetonextrakten der vier Cyanobakterienstämme vorhanden waren, und ihrer Aktivität bei der höchsten getesteten Konzentration.

4. Schlussfolgerung

Die biologische Aktivität der hier analysierten Cyanobakterienextrakte erwies sich als eindeutig korreliert. Gemäß dem Vorhandensein von bioaktiven PBPs waren die wässrigen Extrakte für den UV-Schutz am wirksamsten, was sie zusammen mit ihrer Radikalfängerkapazität als vielversprechende Inhaltsstoffe für die Verwendung in Anti-Aging-Formulierungen nahelegt, die darauf abzielen, durch äußere Faktoren verschlimmerte Hautalterung zu verhindern. Andererseits erwiesen sich die Acetonextrakte als wirksamer bei der Hemmung der Aktivität von Enzymen, die für den Abbau der dermalen Matrix und den Verlust der Hautstruktur verantwortlich sind, und eignen sich daher besser für die altersbedingte Hautalterung.Cistanche-Salsa-ExtraktDas von uns vorgeschlagene sequentielle Extraktionsschema könnte sich als vorteilhaft erweisen, da es die Gewinnung chemisch unterschiedlicher bioaktiver Extrakte durch die Monetarisierung von Cyanobakterien-Biomasse ermöglicht, wodurch das Verfahren nachhaltiger und wirtschaftlich attraktiver wird. Insgesamt erwiesen sich Cyanobakterien-Extrakte als würdig für die weitere Nutzung im Bereich der Hautalterung, die auf die Suche nach natürlichen, sicheren und nachhaltigen Inhaltsstoffen für kosmetische Formulierungen abzielt.

Dieser Artikel stammt aus Mar. Drugs 2022, 20, 183. https://doi.org/10.3390/md20030183 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs