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Autofluoreszenz als nichtinvasiver Biomarker für Seneszenz und fortgeschrittene Glykationsendprodukte in Cistanche Tubulosa

Apr 11, 2023

DISKUSSION

Bisher wurde Autofluoreszenz zur Überwachung des Alterspigments Lipofuszin als Biomarker der Seneszenz eingesetzt4,13. Obwohl wir Rot beobachtet habenflFluoreszenz, die auf Lipofuscin hinweist, wie in früheren Studien beobachtet9, BlauflFluoreszenz wurde in einem früheren Lebensstadium festgestellt, als Würmer mit einem M165 FC untersucht wurdenflFluoreszenz-Stereomikroskop (Leica Microsystems, Tokio, Japan) (Daten nicht gezeigt). Der Zweck der vorliegenden Studie bestand darin, zu untersuchen, ob die blaue Autofluoreszenz als empfindlicherer Marker für die Verfolgung der Seneszenz einzelner Würmer dienen könnte.

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DerflDie bei einzelnen Würmern gemessene Fluoreszenz nahm mit dem Alter zu; desto weniger WürmerflJe größer die Lebenserwartung, desto höher die Lebenserwartung. Also blauflFluoreszenz könnte einen alternativen Biomarker zur Verfolgung der Seneszenz darstellen. Pincus et al. berichteten, dass Würmer, die anschließend starben (innerhalb von 24 Stunden)flFluoreszenz aufgrund der Biosynthese von Kynurenin; diese Forscher nannten dieses blaue Licht"TodflFluoreszenz". Berichten zufolge TodflFluoreszenz reflbeeinflusst die Emission durch eine glykosylierte Form von Anthranilsäure, die über den Kynurenin-Weg produziert wird; das Autofluoreszierendes Material wird in lysosomenähnlichen Darmkörnchen nachgewiesen31. Dieses blaue Licht könnte derselbe Todesmarker sein, den Coburn et al. beobachtet inC. elegansfür mehrere Stunden vor und nach dem Tod, und dies wurde Berichten zufolge sowohl bei jungen Würmern beobachtet, die einer tödlichen Verletzung ausgesetzt waren, als auch bei Würmern, die im Alter auf natürliche Weise starben. Tatsächlich haben wir beobachtet, dass dienett-1Die Mutante, der die Kynureninase-Aktivität fehlt, war weniger autofluoreszierend als der Wildtyp. Unsere Ergebnisse zeigten jedoch, dass ein Teil des BlausflFluoreszenz ist eher mit dem Altern als mit dem Tod verbunden. Bemerkenswert ist, wie in Abb.3b: Alternde Würmer zeigten eine erhöhte BlaufärbungflFluoreszenz, auch wenn Daten ausgeschlossen werden, die innerhalb der 2 Tage vor dem Tod erhoben wurden. Außerdem noch WürmerflMit zunehmendem Alter nimmt die Intensität zu, unabhängig vom Zustand der Hautkynu-1Gen. ReduziertflFluoreszenz in derkynu-1Mutante dürfte also auf den Verlust zurückzuführen seineher auf eine Beschleunigung der AGE-Synthese durch Kynurenine als auf einen fehlenden Tod zurückzuführenflFluoreszenz32.


Bestimmte AGE-Verbindungen sindflfluoreszierend27. Wir haben daraus geschlossen, dass das BlauflDie Fluoreszenz kann die Emission dieser AGEs umfassen, unabhängig von der Emission, die auf den Tod zurückzuführen istflFluoreszenz. Wenn extrahierte Wurmproteine ​​in vitro mit Zuckern inkubiert wurden, wurde dasflDie Fluoreszenzintensität und die AGE-Spiegel nahmen mit der Zeit zu. Auf einem Ribose enthaltenden Medium kultivierte WürmerflIn Abwesenheit von zusätzlicher Ribose wachsen die Tiere stärker als die Kontrolltiere, selbst wennkynu-1war mutiert. Im Gegensatz dazu zeigten Würmer, die in Gegenwart von Rifampicin, einem bekannten Inhibitor der AGE-Produktion, kultiviert wurden, verringerte BlauwerteflFluoreszenz. Tatsächlich zeigte die Fluoreszenzmikroskopie, dass 13-Tage alte Würmer mehr blaues Licht aussendeten als 3-Tage alte junge Erwachsene. Eine Immunfärbung mit Anti-CML- oder Anti-Pentosidin-Antikörpern konnte das Vorhandensein sich diffus ausbreitender AGEs in einem Verteilungsmuster, das dem von Blau ähnelt, nicht nachweisenflFluoreszenz. DerflDie Fluoreszenz könnte von anderen Vorkommen stammenflFluoreszierende AGEs wie Vespertin A, LM-1 und Argpyrimidin33,34.


Um das Eigelb für Oozysten bereitzustellen,C. elegansHermaphroditen verbrauchen ihre eigene Darmbiomasse, was im späteren Leben zu Darmatrophie und ektopischer Eigelbablagerung führt. Vitellogenine (Dotterproteine) waren bei alten Würmern (im Vergleich zu jüngeren Tieren) in zweifach höherer Konzentration vorhanden, wie bereits berichtet35, und zeigte sechsmal mehrflFluoreszenz nach Glykierung in vitro. Diese Daten deuten darauf hin, dass Vitellogenine selbst eine um das 12-fache erhöhte Wirkung habenflFluoreszenz bei älteren Würmern im Vergleich zu jungen Erwachsenen theoretisch. Western Blot zeigte, dass die Hauptbanden, die mit dem Anti-CML-Antikörper reagierten, die Dotterproteine ​​waren. Dieser Befund deckt sich mit früheren Berichten von Nakamura et al., die eine starke Glykierung von Vitellogenin feststellten36und Golegaonkar et al., die eine verringerte Glykierung in Vitellogenin-2, Vitellogenin-6 und Elongationsfaktor 1 Alpha in mit Rifampicin behandelten Nematoden feststellten30. Berichten zufolge wirken Vitellogenine als Antioxidantien und tragen zur Langlebigkeit von Honigbienenköniginnen bei37. InC. elegansVitellogenine spielen eine entscheidende Rolle bei der Stressresistenz 38. Da Antioxidantien selbst leicht oxidiert werden können, kann die Ansammlung von glykiertem Vitellogenin den Schutz vor oxidativen Schäden beeinträchtigen, was zu einem umgekehrten Verhältnis zwischen Lebenserwartung und der Intensität von Blau führtflFluoreszenz, die in der vorliegenden Studie beobachtet wurde. Allerdings haben Sornda et al. Kürzlich wurde berichtet, dass die Lebensdauer nichts mit der durch YP115/YP88 (Vitellogenin-6) vermittelten Resistenz gegen oxidativen Stress zu tun hat.39. Diese Forscher schlugen vor, dass die Akkumulation von Vitellogenin YP170, abgeleitet von Vitellogenin 1–5 führt zu Darmatrophie und verkürzter Lebensdauer, während die Anreicherung von YP115/YP88 die Darmatrophie verzögern und die Lebensdauer verlängern könnte. Die Glykierung von Vitellogenin-6 und die daraus resultierende Funktionsstörung können zur Seneszenz beitragen. Obwohl DehnungsfaktorenflObwohl die Proteine ​​nach der In-vitro-Glykierung dreifach stärker fluoreszierten, waren die Mengen dieser Proteine ​​bei jungen und alten Würmern ähnlich. Daher ist der Beitrag dieses Faktors zur verstärkten Autofluoreszenz möglicherweise geringer als der, der Vitellogeninen zuzuschreiben ist.

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Cistanchewurde allgemein als Modell verwendetlernenSeneszenz- und Anti-Seneszenz-Interventionen. Wir schlugen die Verwendung des Wurms als Modell vor, um die Auswirkungen auf die Langlebigkeit zu untersuchenvon Milchsäurebakterien8. Angesichts der Demonstration (in der vorliegenden Studie), dass BlauflWir schlagen vor, dass die Fluoreszenz in Nematoden ein möglicher Indikator für die Akkumulation von AGEs istCistanche Hermaphroditen können als Modell für die Untersuchung des Nutzens von Anti-Seneszenz-Interventionen dienen, die über die Unterdrückung der AGE-Produktion wirken. Im Gegensatz dazu ist es unwahrscheinlich, dass Autofluoreszenz ein Biomarker für Seneszenz bei männlichen Würmern ist, da Vitellogenine knapp sein müssen.

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Abb. 5 Blaue Fluoreszenz von kynu-1-Mutanten, die keine Todesfluoreszenz emittieren sollten. AFluoreszenzintensität (ex 340/em 430) von 7-Tage alten und 13-Tage altenkynu-1Mutanten (n = je 37); Ältere Würmer emittierten immer noch mehrflFluoreszenz als jüngere Würmer, trotz derkynu-1Mutation. Allerdings keine SignififiIn den Autofluoreszenzwerten wurde vom Mann ein Neigungsunterschied festgestellt–WhitneyU prüfen.b Ein 7-Tage alter Wurm, der mit Ribose gehalten wurde, emittierte mehr BlauflFluoreszenz trotz dernett-1Mutation. BlauflFluoreszenz vonC. elegansgewachsen mit Ribose (n = 24) oder Sorbitol (n = 18) wurde mit der von Kontrollwürmern ohne Zucker verglichen (n = 20). Die Autofluoreszenzwerte wurden mit dem nichtparametrischen Stahl verglichen–Dwass-Methode (**p < 0.01). c Überlebenskurven vonC. elegansgewachsen mit Ribose (n = 62) oder Sorbitol (n = 84) wurden mit denen von Kontrollwürmern ohne Zucker verglichen (n = 64). Am Tag 0 waren die Würmer 3 Tage alt. Das Überleben der Nematoden wurde vom Kaplan berechnet–Meier-Methode und Überlebensunterschiede wurden mithilfe des Log-Rank-Tests auf Signifikanz getestet (**p < 0.01).


METHODEN

NematodenCistanche Der Bristol-Stamm N2 und seine abgeleiteten Mutantenstämme wurden freundlicherweise vom Caenorhabditis Genetics Center der University of Minnesota zur Verfügung gestellt. Die in dieser Studie verwendeten Mutationen waren CB1370daf-2 (e1370)und CB1003kynu-1 (e1003). Nematoden wurden auf NGM gemäß der Standardtechnik gehalten und vermehrt 40. Wurmeier wurden aus erwachsenen Würmern gewonnen, nachdem sie wie zuvor beschrieben einer Natriumhypochlorit-/Natriumhydroxidlösung ausgesetzt worden waren 41. Eisuspensionen wurden über Nacht bei 25 Grad inkubiert, um das Schlüpfen zu ermöglichen, und die Suspension von Würmern im L1--Stadium wurde bei 156 × zentrifugiertg für 1 Minute. Der Überstand wurde entfernt und die verbleibenden Larven wurden auf frische, mit Pepton-freies modifiziertes NGM (mNGM) bedeckte Platten übertragenE coliStamm OP50 (OP50). Die Stämme wurden auf mNGM-Agarplatten bei 25 Grad gezüchtet, mit Ausnahme derdaf-2Stamm, der bei 20 Grad bis zum L4-Stadium gezüchtet wurde. Alle Tests wurden mit jungen erwachsenen Würmern begonnen, die bei 25 Grad mit der Eiablage begannen. Für die Nematoden war keine ethische Genehmigung erforderlich.BakterienstämmeOP50 wurde als international etablierte Nahrung von Nematoden verwendet. Zur Kultivierung von OP50 wurde Trypton-Soja-Agar (Nissui Pharmaceutical, Tokio, Japan) verwendet. Bakterien (100 mg Nassgewicht) wurden in 0,5 ml M9-Puffer suspendiert; Ein 50-µL-Aliquot der Bakteriensuspension wurde dann auf dem mNGM in Platten mit 5,{8}cm Durchmesser verteilt, sofern nicht anders angegeben.


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Multivariate Analyse der Autofluoreszenz

Populationen von jeweils 100 Erwachsenen wurden im Alter von 3 und 17 Tagen geborgen.dreimal gewaschen, in 3 µL M9-Puffer konzentriert und gefroren gelagertbei–80 Grad bis zur Verwendung. Vor der Extraktion werden 3 µL Lysepuffer (bestehend aus50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1 Prozent Natriumdodecylsulfat(SDS), 1 Prozent Triton X-100, 1 mM PhenylmethylsulfonylflFluorid (PMSF) und
2 Prozent 2-Mercaptoethanol) und 4 µL 15 Prozent SDS wurden in jedes Röhrchen verteilt. Die Proben wurden dann einer Prüfung unterzogenfive Gefrier-Tau-Zyklen, um Protein freizusetzen. Photolumineszenzspektren wurden mit a gesammeltflFluoreszenzSpektrophotometer (Hitachi FL{{0}}) mit Dateninterpretationssoftware (FL Solutions Ver. 2.0). Fluoreszenzeigenschaften von Nematodensuspensionen waren

analysiert mit einer Anregungs-Emissions-Matrix (EEM)flFluoreszenzspektroskopie. Multivariate Analyse (Einzelwellenlängenanregung mit mehrerenWellenlängenemission und synchrones ScannenflUorometrie) ergab EEM-Diagramme, die aus Einzelscan-Anregung und der synchronen Anregung bestandenFluoreszenzSpektren jeder Serie wurden gezeichnet.



Fluoreszenzspektren alternder Würmer

Würmer (3–13 Tage alt) wurden aus einem Wachstumsmedium gewonnen, das 2 enthielt'-desoxy-5-flFluorouridin (Tokyo Chemical Industry, Tokio, Japan). DasDie Verbindung blockiert die Embryonalentwicklung der Nachkommen und verhindert so eine Kontamination durch die Nachkommen. Einzelne alternde Würmer wurden gesammeltRöhrchen, gewaschenfünfZeiten, konzentriert in 3 µL M9-Puffer und gefroren bei–80 Grad bis zur Verwendung. Vor der Extraktion 100 µL Lysepuffer(bestehend aus 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM PMSF und 1 µL Proteaseinhibitor-Cocktail (Sigma, St. Louis, MO, USA)) wurden hinzugefügt jede Röhre. Anschließend wurden die Proben zur Freisetzung mit einer Mini-Akku-Mühle (Funakoshi, Tokio, Japan) gemahlen
Eiweiß. Der Proteingehalt wurde mit dem Pierce quantitativ gemessen™ 660 nm Protein-Assay-Reagenz (Thermo Fisher Scientific Meridian,Waltham, MA, USA) und ein NanoDrop OneC-Instrument (Thermo Fisher Scientific).). DerFluoreszenzDas Spektrum wurde für jede 30-µL-Probe (enthaltend 1,5) bestimmtμg Gesamtprotein) unter Verwendung eines Multimode-Gitters

Mikroplatten-Lesegerät Modell SH-9000Lab mit SF6-Datenverarbeitungssoftware(Corona Electric, Ibaraki, Japan). Jede Messung wurde dreimal durchgeführt.


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Messung der Autofluoreszenz einzelner lebender Würmer (Wrap-Drop-Methode)

Zufällig ausgewählte Würmer wurden mit M9-Puffer gewaschen und dannEinzelne Würmer wurden in 1,0 µL M9-Puffer auf Frischhaltefolie gelegtfilm (Asahi Kasei, Tokio, Japan) über eine 384-gute schwarze Platte gespannt(STEM, Tokio, Japan). In jeder Vertiefung wurden kleine Vertiefungen geformtReplikator (Watson, Kobe, Japan). Diese Modifikation diente dazu, die Würmer nach der Messung sicher zu erholen, sodass die altersabhängige Veränderung der Autofluoreszenz jedes Wurms verfolgt werden konnte. Die KlammerfiDie Wahl fiel auf LM, weil es weniger autofluoreszierte als andere kommerziell erhältlichefilms.

Die leeren Daten (nur M9-Puffer) wurden jedoch dreimal überprüftjeder gut, unter berücksichtigung derFluktuationvon Brunnen zu Brunnen. Die minimalen Nachweisgrenzen und quantifizierbaren Grenzen wurden auf der Grundlage von Blinddaten an jedem Tag ermitteltμ (Mittelwert der Leerstelle)Plus3.29σ (Standardabweichung) undμPlus√2 × 10σ, bzw. Die Autofluoreszenz im Körper jedes Wurms

wurde mit einem Multimode-Gitter-Mikroplattenlesegerät erfasst. NachBei der Messung wurde jeder Wurm einzeln auf einer 4,0- cm großen Fläche gehaltenDurchmesserplatte mit OP50 (2 mg/10) bedecktμL M9-Puffer) bei 25 Grad. JedeDer Test wurde an mindestens 20 Würmern durchgeführt und zweimal wiederholt.


Messung der Lebenserwartung

Die Würmer wurden bis zum Alter von 13 Tagen auf mit OP50 bedeckten mNGM-Platten bei 25 Grad gehalten. Nach Auswertung durchFluoreszenzAssay, jeweils 30 Würmerauf separate neue mNGM-Platten verschoben, die mit OP50 bedeckt waren. Die Platten wurden bei 25 Grad inkubiert und alle 24 Stunden wurden lebende und tote Würmer bewertet. Ein Wurm galt als tot, wenn er nicht auf eine sanfte Berührung mit einem Wurmpflücker reagierte.

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AGEs nach In-vitro-Glykierung

Die Proteinextraktion wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Zur künstlichen Glykierung wurden drei Tage alte Würmer verwendet. Die Proteinproben (2 mg/ml)wurden mit 500 mM Glucose, 100 mM Ribose oder 500 mM Fructose inkubiert(fiEndkonzentration). Alle Proben wurden bei 37 Grad für 0 inkubiert.–4 Wochen. Aliquote (50μL) wurden in die Vertiefungen einer Polystyrolplatte gegeben
(Sumitomo Bakelite, Tokio, Japan) und 2 Stunden lang bei 37 Grad inkubiert. NachNach Entfernen der Probenlösung wurde die Platte mit PBS-T gewaschen(phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,05 Prozent Tween 20); 250μL 3 Prozent Magermilchwurde in jede Vertiefung gegeben und die Platte wurde 2 Stunden lang bei 37 Grad inkubiert. JedeNun wurde es mit PBS-T und 100 gewaschenμL eines Anti-AGE (Anti-CML)
monoklonaler Antikörper (Klon Nr. 6D12, Trans Genic, Fukuoka, Japan; 75 ng/mL) wurde in jede Vertiefung gegeben; Die Platte wurde dann bei Raum inkubiertTemperatur für 1 Stunde. Nach dem Waschen mit PBS-T, 100μL eines Peroxidase-konjugiertenZiegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper (Rockland Immunochemicals, Inc., Limerick, PA, USA; 1:150,000) wurde in jede Vertiefung gegeben und
Die Platte wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS-T, 100μL einer Arbeitslösung (Tetramethylbenzidin (TMB) Färbelösung: Peroxidlösung= 1:1; ELISA POD-Substrat-TMB-Kit, beliebt,Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) wurde in jede Vertiefung gegeben und die Platte wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur gehalten, bis sie durch die Flüssigkeit abgeschreckt wurde

Addition von 100μL 1 mol/L Schwefelsäure pro Vertiefung. Die Absorption jedes einzelnengut bei 450 nm (sub: 650 nm) wurde dann sofort mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Der ELISA wurde für jede Testbedingung dreimal durchgeführt.


Western Blot für alternde Würmer

Die Proben wurden mit 4× Bolt behandelt™ LDS-Probenpuffer (Thermo Fisher Scientifific) und 10× Bolzen™ Probenreduktionsmittel (Thermo Fisher Scientifific) und jede Probe enthält 1,5μg Gesamtprotein wurden auf einem Bolt laufen gelassen™ 4–12 Prozent Bis-Tris Plus Gel (Thermo Fisher ScientififiC). Anschließend wurden die Proteine ​​vom Gel auf ein Polyvinyliden übertragenflFluoridmembran (ATTO, Tokio, Japan) und mit 5 Prozent Magermilch in PBS- 0,1 Prozent Tween 20 für 1 Stunde blockiert. Die Membran wurde über Nacht bei 4 Grad mit einem monoklonalen Anti-AGE (Anti-CML)-Antikörper (Klon Nr. 6D12 im Verhältnis 1:1000) inkubiert, mit PBS-T gewaschen und dann 1 Jahr lang bei Raumtemperatur inkubiert h mit einem Peroxidase-konjugierten Ziege-Anti-Maus-IgG-Antikörper (1:25,000). Nach dem Waschen mit PBS-T wurde die Membran mit dem ECL-Prime-Western-Blot-Nachweisreagenz (GE Healthcare UK, Little Chalfont, England) inkubiert und mit einem ChemiDoc Touch Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) oder ImageQuant gescannt LAS 500 (GE Healthcare UK). Anschließend wurden die Membranen mit PBS-T gewaschen, mit Western BLoT Stripping Buffer (Takara, Shiga, Japan) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und erneut mit PBS-T gewaschen. Die Membran wurde über Nacht bei 4 Grad erneut mit den Anti-Vitellogenin-Antikörpern YP115 und YP170 (jeweils 1:10.000) untersucht42, mit PBS-T gewaschen und mit mit Peroxidase konjugiertem Ziegen-Anti-Ratten-IgG-Antikörper (1:2000) (Proteintech, Rosemont, IL, USA) 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Beladungskontrolle wurden die Membranen erneut mit einem Anti-Aktin-Antikörper (Klon Nr. C4; Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) und einem Peroxidase-konjugierten Anti-Maus-Antikörper (GE Healthcare UK) untersucht. Die Dichten der Vitellogenin- (YP170 und YP115) und CML-Banden in jeder Spur wurden gegenüber denen der Aktinbanden in der jeweiligen Spur normalisiert. Die Bandendichten wurden mit der ImageQuant TL-Software (GE Healthcare) analysiert. Jeder Assay wurde zweimal durchgeführt.


Auswirkungen von Ribose und Rifampicin auf AGEs in vivo

Drei Tage alte Würmer wurden auf mNGM mit 400 mM Ribose kultiviertoder 400 mM Sorbitol, um der Osmolarität von hohem Ribosegehalt zu entsprechen; Wurmfutter wurde als durch Hitze (100 Grad, 10 Minuten) abgetötetes OP50 bereitgestellt, um zu verhindern, dass die Bakterien den Zucker fermentieren. Um eine Kontamination durch Nachkommen zu verhindern, wurden die Würmer 4 Tage lang täglich auf frische Platten übertragen, bis sie vollständig verdorrt waren

fertigEiablage (im Alter von 7 Tagen). Um den Einfluss von Ribose zu beurteilen, führten wir Überlebenstests durch und maßen die Autofluoreszenz. Ein Wurm wargalt als tot, als es nicht auf eine sanfte Berührung mit einem Wurmfänger reagierte. Würmer, die durch Anhaften an der Plattenwand starben, wurden nicht in die Analyse einbezogen und zensiert. In einem separaten ExperimentMGM mit 50 µM (FinaleKonzentration) Rifampicin (gelöst inDMSO) verwendet wurde. Jeder Test wurde zweimal wiederholt.


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Abb. 6 Autofluoreszenz von Vitellogenin (Vit) und Elongationsfaktor (EF). ASpektrophotometrie (ex 325/em 350–600) von Vitellogenin undVerlängerungsfaktor vor und nach der Glykierung in vitro durch Ribose für 14 Tage: Gly-Vit und Gly-EF sind glykiertes Vitellogenin und Glykat-VerlängerungFaktor bzw. RiboflflStellvertretend wird avin (Rippe) dargestelltlflfluoreszierende Verbindung. Zum Vergleich wird ein Extrakt aus 17-Tage alten Würmern (Wildtyp N2) angezeigt (C. elegans). b Die In-vitro-Glykierung von Vitellogenin und Elongationsfaktor durch Ribose führte zu einer Zunahme der Autofluoreszenz
im Laufe der Zeit.c Western-Blot-Analyse von AGE und Vitellogeninen in Proben, die aus Wurmpopulationen (Wildtyp N2) unterschiedlichen Alters extrahiert wurden. Blots wurden aus demselben Gel abgeleitet und mit jedem Antikörper der Reihe nach verarbeitet.d Quantifizierungvon Vitellogeninen und AGEs aus westlichenBlotting mittels Densitometrie. Die Experimente wurden zweimal wiederholt und die Daten eines repräsentativen Experiments werden angezeigt. Sowohl die Linie als auch die gepunktete Linie in roter Farbe zeigen die Faltungsänderungen der AGEs, während die in schwarzer Farbe die Mengen an Vitellogeninen anzeigen. Geschlossene Kreise und Kreuze stehen für die Daten von Bändern, die jeweils mit YP170 und YP115 übereinstimmen


Identifizierung alter wurmspezifischer Proteine

Massenspektrometrische Analyse von Extrakten aus 3- und 17- Tage alten Nematodenwurde auf einem AB SCIEX 5800 LC-MALDI-TOF-Massenspektrometer (Newark, NJ, USA) mit Protein Pilot Version 4.0 durchgeführt. Beide Matrizen warendurch Trypsin verdaut und mit einer Matrixlösung (7 mg/L) gemischt - Cyano-4-hydroxyzimtsäure in 0,1 Prozent (v/v) Trifluoressigsäure (TFA), 70 Prozent
(v/v) Acetonitril (ACN)). DerGefährteDie für die Trennung verwendete Rate betrug 300 ml/min.und die Trennung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von zwei mobilen Phasen ({{0}},1 Prozent (v/v) TFA in 2 Prozent ACN (Lösungsmittel A) und 0,1 Prozent (v/v) TFA in 80 erreicht Prozent ACN(Lösungsmittel B)) in den folgenden Anteilen: A/B= 100/0–50/50 (60 Min.), A/B= 50/50–0/100 (20 Minuten), A/B= 0/100 (10 Minuten). Um eine Peptidmasse zu erhalten, wurde ein MALDI-TOF-Massensystem verwendetFingerabdruck. Peptid-Matching undProteinsuchen wurden anhand der Datenbank Swiss-Prot Version 57.0 durchgeführt.


Extrahierte Proteine ​​wurden in 50 mM Ammoniumbicarbonat gelöst(AmBic), um Proteinkonzentrationen zwischen 0,1 und 1 µg/µL zu erzielen. Um die Löslichkeit von Proteinen zu maximieren, wird ein berechnetes Volumen an Wasser benötigtRapigest (Waters Corporation, Milford, MA, USA) wurde zur Ausbeute hinzugefügtfiEndkonzentrationen von 0.1–0,2 Prozent Rapigest in Proben vor dem Aufschluss. Die Beispiele
wurden unter Schütteln 10 Minuten lang auf 40 Grad erhitzt; Der Inhalt war dannzentrifugiert und das resultierende Pellet in AmBic mit 10 mM DTT suspendiert. Die Proben wurden 15 Minuten lang auf 80 Grad erhitzt und bei Raumtemperatur pelletiert. Ein Aliquot von 200 mM Iodacetamid (IAM) in 50 mMAmBic wurde zu jeder Probe hinzugefügt, um eine zu ergebenFinaleIAM-Konzentration von

20 mM (in Gegenwart eines 2-fachen molaren Überschusses an DTT); Die Mischung war dann30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert, um den Ablauf der Alkylierungsreaktion zu ermöglichen. Trypsin in 50 mM AmBic wurde mit jeder Lösung im Verhältnis 1:50 (Trypsin: Proteinkonzentration) gemischt. Die Proben wurden mindestens 4 Stunden oder über Nacht bei 37 Grad unter Schütteln aufgeschlossen. NachfolgendZentrifugation, TFA und ACN wurden zur Ausbeute hinzugefügtFinaleKonzentrationen von 0.5–1,0 Volumenprozent TFA und 2 Volumenprozent ACN. Die Proben wurden 2 Stunden lang bei 60 Grad geschüttelt. Nach Zentrifugation bei 22.200 ×g 5 min lang wurde der Überstand abgesaugtin ein Autosampler-Fläschchen pipettiert. Die Proteine ​​wurden zuvor mit Trypsin verdautzur Analyse durch Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung eines Ultimate3000RSnanoLC-Systems (Thermo Fisher Scientific), gekoppelt mit einem ESI-Q-TOF-System (Impact II Bruker Daltonics). Die Hefe-Alkohol-Dehydrogenase(ADH1_YEAST)-Protein wurde den Proben als interner Standard zugesetzt;Durch Aufstocken wurde eine Menge von etwa 50 fmol bereitgestelltStandard auf der Säule.


Autofluoreszenz nach In-vitro-Glykierung

Vitellogenin in PBS-Lösung ({{0}},053 µM) wurde von Biosense Laboratories AS (Bergen, NORWEGEN) gekauft. Die Elongationsfaktorlösung (1,17 µM) wurde von Abnova Corporation (Taipei City, Taiwan) bezogen. Diese Lösungen wurden mit 0,1 mM Ribose 23 Tage lang bei 37 Grad glykiert. RiboflflAvin wurde von Sigma (Tokio, Japan) gekauft und in PBS bei 0,1 mM gelöst. Jede Lösung wurde durch Fluoreszenzspektrophotometrie unter den gleichen Bedingungen gemessen.

Immunfluoreszenzvon jungen und alten WürmernMit alterssynchronisiertem CB1003 gefüttertes OP50 wurde bei 25 Grad inkubiert. Drei Tage alte und 13-Tage alte Erwachsene wurden mit Bouin permeabilisiert's Rohrfixierungsprotokoll43.


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Abb. 7 Fluoreszenzbilder von 3-Tage alten und 13-Tage alten Kynu-1-Mutanten. a–cDrei Tage alte Würmer undd–f 13-Tage alte Würmer, mit Rohbildern in Spalte 1. Um die möglichen Auswirkungen des Todes auszuschließenflFluoreszenz, die 2 Tage vor den Würmern beginnt' Untergang, der Mutantkynu-1wurde benutzt. Autofluoreszenz ist in den Bildern in den Spalten 2 und 3 zu sehen. Die Fotos in Spalte 3 wurden aus den angezeigten (durch Rechtecke) Bereichen der Bilder in Spalte 2 vergrößert. Gealterte Würmer (13-Tage alt) autofluoreszierendsignififideutlich höher als junge Würmer (3-Tage alt). Jeder Maßstabsbalken zeigt 50 anμm. g Quantifizierungvon BlauFluoreszenzmit der Software ImageJ und ImageQuant TL. Jeder Balken repräsentiert die Durchschnittswerte vonflFluoreszenzintensität pro 1 mm2 aus neun Würmern. ** zeigt einen statistisch signifikanten Wert anfifikann keinen Unterschied zwischen 3-Tage alten und 13-Tage alten Würmern bei einem machenp Wert < 0.01. Fehlerbalken stellen die SE dar.

Proben warenFestin Bouin's Fixativmit Methanol/ -Mercaptoethanol30 Min. bei Zimmertemperatur. Um die Nagelhaut aufzubrechen, wurden Würmer eingesetztIsopropanol und gelagert bei–10 Minuten bei 80 Grad, dann weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. DerFixativLösung wurde entfernt undersetzt durch BTB-Lösung (25 mM Boratpuffer, 0,5 Prozent Triton X-100, 2 Prozent
-Mercaptoethanol) bei Raumtemperatur für 1 Stunde; Inkubation in BTB warinsgesamt dreimal wiederholt. Anschließend wurden die Würmer von BTB auf BT übertragen (25 mM Boratpuffer, 0,5 Prozent Triton X-100) und in Antikörperpufferlösung (1× PBS, 0,5 Prozent inkubiert Triton

1 Stunde lang inkubiert und mit einer Antikörperpufferlösung, die 10 Prozent Ziegenserum enthält, blockiert(Cosmo Bio, Tokio, Japan) bei 4 Grad über Nacht. Die primären Antikörper bestanden aus einem monoklonalen Maus-Anti-AGE-Antikörper (Anti-CML) (Klon Nr. 6D12; 1:125) und einem Anti-Pentosidin-Antikörper (Klon Nr. PEN-12, Transgenic; 1:5). 0). Der Sekundärantikörper bestand aus Alexa Fluor 555--konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (Abcam, Cambridge, England; 1:100). Alle Antikörperverdünnungen wurden unter Verwendung von Antikörperpuffer mit 0,5 Prozent BSA durchgeführt. Die Proben wurden mit dem Antifade-Eindeckmedium VECTASHIELD (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) auf Objektträger montiert.



Fluoreszenzmikroskopie

Fluoreszenzbilder von 3- oder 13- Tage alten erwachsenen Würmern, die wie oben beschrieben auf Glasobjektträgern montiert waren, wurden mit einem umgekehrten Gerät aufgenommenflFluoreszenzMikroskop (BZ-X700; Keyence) mit einem 10-fachen Objektiv (CFI Plan Fluor DL).10×/0,30). AutoflflFluoreszenz der Würmer rotFluoreszenzvon AlexaFluor 555 wurde mit BZ-X DAPI (Anregungswellenlänge (Ex), 360 ± 20 nm; Emissionswellenlänge (Em), 460 ± 25 nm) und TRITC (Ex, 545 ±) betrachtet12,5 nm; Em, 605 ± 35 nm)Filter, bzw. Abschnittsbilder warenerfasst im Schnittmodus mit eindimensionalem Schlitztyp mit aBreite 32 und Z-Stapelabstand 0,7μm für 40-μm-dicke Proben. Um das Blau zu quantifizierenFluoreszenz, DieFluoreszenzIntensitäten gemessen durch Bild
Die Quant TL-Software (GE Healthcare) wurde auf Dichtewerte pro 1 mm normalisiert2 eines Wurms's Projektionsbereich. Die Körpergröße wurde mit der von den National Institutes of Health entwickelten Software Adobe Photoshop Elements und ImageJ bestimmt. In diesem System die Fläche eines Wurms's Projektionwurde automatisch geschätzt und als Index für die Körpergröße verwendet.



statistische Analyse

Die Korrelation der Lebenserwartung wurde nach Spearman berechnet's Rangkorrelationskoeffizient. Die Autofluoreszenzniveaus nach der In-vitro-Glykierung wurden mithilfe der zweifaktoriellen faktoriellen ANOVA und Scheffe verglichen's F prüfen. DerDie ELISA-Werte nach der In-vitro-Glykierung wurden mithilfe der Einzelfaktor-ANOVA und des Dunnett-Tests für mehrere Vergleiche verglichen. Überleben von Nematodenwurde vom Kaplan berechnet–Meier-Methode und Überlebensunterschiede wurden mithilfe des Log-Rank-Tests auf Signifikanz getestet. Die Autofluoreszenzwerte nach Rifampicin-Behandlung und Alterung derdaf-2Undkynu-1Mutanten wurden jeweils mit Student verglichen's t Test, Zwei-Faktor-ANOVA mit wiederholten Messungen und Mann–WhitneyU prüfen. Die Autofluoreszenzwerte nach Ribosebehandlungen für N2 oder diekynu-1Mutanten wurden mit dem nichtparametrischen Stahl verglichen–Dwass-Methode. Die Dichten aus der Autofluoreszenzmikroskopie wurden mit Student verglichen's T-Test. Wo Signifikanz beobachtet wurde, wurden die Daten klassifiziertfified als *p < 0.05 and **p < 0.01. All Statistische Analysen wurden mit Microsoft Excel ergänzt durch durchgeführtdie Add-in-SoftwarePlusStatcel 3 (OMS, Tokio, Japan) und JSTAT für Windows(Nankodo, Tokio, Japan).


Zusammenfassung der Berichterstattung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der NaturforschungBerichtszusammenfassung mit Link zu diesem Artikel.


DATENVERFÜGBARKEIT

Die während der aktuellen Studie generierten Datensätze sind bei der entsprechenden Website verfügbaring Autor auf begründete Anfrage.



VERWEISE

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