Bakterielle Vesikel der äußeren Membran induzieren eine Transkriptionsverschiebung bei Arabidopsis in Richtung einer Aktivierung des Immunsystems, was zur Unterdrückung des Krankheitserregerwachstums in Planta führt

Abstrakt

Gramnegative Bakterien bilden an ihrer Zellperipherie kugelförmige Bläschen, die sich später von der Bakterienzellwand lösen und extrazelluläre Vesikel bilden. Es wurde gezeigt, dass diese nanoskaligen Strukturen, die als äußere Membranvesikel (OMVs) bekannt sind, Infektionen und Krankheiten fördern und sowohl bei Säugetieren als auch bei Pflanzenwirten typische Immunreaktionen auslösen können. Um die umfassende Transkriptionsveränderung von Pflanzen nach der Exposition gegenüber OMVs besser zu verstehen, haben wir Sämlinge von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) mit OMVs behandelt, die aus dem gramnegativen pflanzenpathogenen Bakterium Xanthomonas campestris pv gereinigt wurden. campestris und führte 2, 6 und 24 Stunden nach der Exposition eine RNA-Seq-Analyse an OMV- und scheinbehandelten Pflanzen durch. Die stärkste Transkriptionsverschiebung trat zu den ersten beiden getesteten Zeitpunkten auf, was sich in der Anzahl der unterschiedlich exprimierten Gene und der durchschnittlichen Faltungsänderung widerspiegelt. OMVs induzieren eine starke Transkriptionsverschiebung hin zur Aktivierung des Immunsystems und regulieren eine Vielzahl immunbezogener Signalwege, darunter eine Vielzahl von Immunrezeptoren, hoch. Ein Vergleich der Reaktion von Arabidopsis auf OMVs und auf gereinigte Auslöser ergab, dass OMVs eine ähnliche Reihe von Genen und Signalwegen induzieren wie einzelne Auslöser, jedoch wurden Signalwege nachgewiesen, die durch OMVs und nicht durch andere Auslöser aktiviert wurden. Die Vorbehandlung von Arabidopsis-Pflanzen mit OMVs und die anschließende Infektion mit einem bakteriellen Krankheitserreger führten zu einer deutlichen Verringerung des Krankheitserregerwachstums. Mutationen im Plant-Elongation-Factor-Rezeptor (EFR), im Flagellin-Rezeptor (FLS2) oder im Co-Rezeptor der Brassinosteroid-unempfindlichen 1–assoziierten Kinase (BAK1) hatten keinen signifikanten Einfluss auf die Immunpriming-Wirkung von OMVs. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass OMVs eine breite Transkriptionsverschiebung in Arabidopsis induzieren, die zur Hochregulierung mehrerer Immunwege führt, und dass diese Transkriptionsänderung die Resistenz gegen bakterielle Infektionen erleichtern kann.

SCHLÜSSELWÖRTER

Arabidopsis thaliana, bakterielle Infektion, extrazelluläre Vesikel, OMVs, äußere Membranvesikel, Pflanzenimmunität, RNA-seq, Xanthomonas campestris pv. campestris

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1. EINLEITUNG

Pflanzen sind ständig mit schädlichen Mikroben konfrontiert, die auf ihrem Gewebe gedeihen und das normale Wachstum behindern. Eine wirksame Abwehrreaktion hängt in hohem Maße von der schnellen und genauen Erkennung und Identifizierung der eindringenden Mikrobe ab. Zu diesem Zweck nutzen Pflanzen umfassende Überwachungssysteme, um die Invasion von Krankheitserregern zu überwachen (Cook et al., 2015). Es wird spekuliert, dass die erste Linie des Überwachungssystems der Pflanze oder die erste zelluläre Schnittstelle, an der Pflanzen und Mikroben interagieren, der Interzellularraum, der Apoplast, ist. Dort wird die Erkennung eindringender Mikroben durch membrangebundene, extrazellulär exponierte Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) vermittelt (Boutrot & Zipfel, 2017; Couto & Zipfel, 2016). PRRs erkennen mikrobielle Determinanten, die bei vielen Mikroben weit verbreitet und konserviert sind und als mikrobe- oder pathogenassoziierte molekulare Muster (MAMPs) bekannt sind (Ranf et al., 2016). Da Mikroben eine schnelle Mutagenese durchlaufen, sind evolutionär nützliche Immunrezeptoren so angepasst, dass sie hochkonservierte Regionen wichtiger mikrobieller Komponenten erkennen, die aufgrund erheblicher Fitnesskosten nicht einfach verworfen oder mutiert werden können. Beispielsweise ist bakterielles Flagellin ein entscheidendes Element in der Physiologie vieler Mikroben, einschließlich Krankheitserregern, und derzeit eines der am besten untersuchten MAMPs (Felix et al., 1999; Zipfel et al., 2004). Die Wahrnehmung von Flagellin oder dem synthetischen Epitop flg22 (bestehend aus hochkonservierten 22 Aminosäuren am N-Terminus des Flagellum-Bausteins Flagellin) durch den verwandten pflanzlichen Immunrezeptor Flagellin Sensing 2 (FLS2) führt zu einer erheblichen Transkriptionsänderung , gefolgt von einer wirksamen Immunantwort, die die Infektion stoppt (Chinchilla et al., 2007; Gómez-Gómez & Boller, 2000). Viele bekannte MAMPs sind mit der Zellwand der Mikrobe verbunden. Zum Beispiel Pilzchitin (Fesel & Zuccaro, 2016), bakterielles Peptidoglycan (PG) (Erbs et al., 2008; Gust et al., 2007), bakterielle Lipopolysaccharide (LPS) (Dow et al., 2000; Silipo et al ., 2005), Flagellin (Boutrot & Zipfel, 2017; Felix et al., 1999) und mehr. Dennoch ist nicht ganz klar, wie diese Zellwand-assoziierten Komponenten mit ihren zugehörigen Immunrezeptoren in Planta interagieren. Ob dies durch Zelltod und/oder Abbau der Zellwand oder durch die aktive Freisetzung von Komponenten wie dem Flagellum geschieht, ist ein Thema, das weiterer Untersuchung bedarf (Bahar, 2020).

Ein Beispiel für die aktive Freisetzung von Zellwandfragmenten durch gramnegative Bakterien ist die Ablösung extrazellulärer Vesikel (EVs), die aus der Außenmembran austreten und in die Umgebung gelangen (Kulp & Kuehn 2010; Théry et al., 2018). ). Diese bakteriellen EVs werden allgemein als äußere Membranvesikel (OMVs) bezeichnet, und wir werden uns künftig an diese Nomenklatur halten (Schwechheimer & Kuehn, 2015). Der Prozess der OMV-Freisetzung erfolgt kontinuierlich und unter verschiedenen Umweltbedingungen, einschließlich während der Besiedlung des Wirts (Gurung et al., 2011; Ionescu et al., 2014; Jin et al., 2011). Neben integralen Außenmembranmolekülen wie Außenmembranproteinen (OM), LPS und Lipiden verkapseln OMVs periplasmatische Flüssigkeiten, die aus einer Vielzahl von Molekülen wie Proteinen, zellwandabbauenden Enzymen, Polysacchariden und Nukleinsäuren bestehen (Kuehn & Kesty, 2005). Da OMVs während der Besiedlung des Wirts freigesetzt werden und ihre Ladung aus MAMPs besteht, ist es verlockend zu spekulieren, dass sie als Träger von Immunauslösern fungieren, die die auslösenden Moleküle in unmittelbarer Nähe ihrer zugehörigen Immunrezeptoren abgeben (Bahar, 2020; Katsir & Bahar, 2017). Tatsächlich wurde gezeigt, dass OMVs sowohl das Immunsystem von Säugetieren als auch von Pflanzen induzieren, wenn sie ihren Wirten präsentiert werden (Bahar et al., 2016; Ellis & Kuehn, 2010; Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021). Während in Säugetierzellen sowohl die LPS- als auch die Proteinkomponenten von OMVs als Immunauslöser wirken (Ellis et al., 2010), ist bei Pflanzen noch nicht klar, welche OMV-Moleküle die wichtigsten Immunauslöser sind.

Es wurde gezeigt, dass OMVs nicht nur die Immunantwort des Wirts modulieren, sondern auch Virulenzfaktoren tragen und an einer Vielzahl von Prozessen beteiligt sind. Dazu gehören die Zell-Zell-Kommunikation (Deatheragea & Cooksona, 2012; Mashburn & Whiteley, 2005; Raposo & Stahl, 2019), die Abgabe von Toxinen an Zielzellen (Ellis & Kuehn, 2010; Kadurugamuwa & Beveridge, 1996) und die Bildung von Biofilmen (Schooling). & Beveridge, 2006), Löschung antimikrobieller Verbindungen (Manning & Kuehn, 2011), Reaktion auf Stress (MacDonald & Kuehn, 2013), horizontaler Gentransfer (Fulsundar et al., 2014; Velimirov & Ranftler, 2018) und Virulenz (Ellis & Kuehn, 2010; Kunsmann et al., 2015). Während die meisten dieser Beispiele aus Studien zu bakteriellen Krankheitserregern bei Säugetieren stammen, belegen neuere Studien mit pflanzenpathogenen Bakterien auch, dass OMVs die bakterielle Virulenz und Pflanzenbesiedlung fördern. Ionescu et al. (Ionescu et al., 2014) zeigten, dass die OMV-Produktion durch den Pflanzenpathogen Xylella fastidiosa während der Besiedlung der Xylemgefäße die bakterielle Anlagerung an die wasserleitenden Elemente der Pflanze (das Xylem) hemmt und so das Gleichgewicht zwischen der sessilen und der mobilen Form der Pflanze verändert Erreger in Richtung der mobilen Form. Es wird angenommen, dass diese Form die Zellverteilung im Xylem fördert, was zu einem schnelleren Niedergang der Pflanze führt (Ionescu et al., 2014). Zwei weitere Studien haben gezeigt, dass Virulenzfaktoren wie Typ-II-sekretierte Lipasen/Esterase und Xylanase sowie Typ-III-sekretierte Effektoren in Verbindung mit OMVs sezerniert werden (Chowdhury & Jagannadham, 2013; Sidhu et al., 2008; Solé et al ., 2015), was darauf hindeutet, dass OMV eine wichtige Rolle bei der bakteriellen Virulenz spielen könnte. Die molekulare Komplexität von OMVs sowie ihre doppelten und möglicherweise gegensätzlichen Funktionen im Wirt (Induktion von Immunität und Förderung der Virulenz) veranlassen uns, die umfassendere Transkriptionsreaktion von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis)-Pflanzen auf die OMV-Herausforderung zu untersuchen und zu testen, ob sich diese Transkription ändert würde eine Resistenz oder Anfälligkeit für eine nachfolgende bakterielle Infektion hervorrufen.

2. MATERIALIEN UND METHODEN

2.1 Pflanzenmaterial und Wachstumsbedingungen

In dieser Studie wurden die Wildtyp-Col-0-Linie von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) sowie die folgenden Mutantenlinien verwendet: bak- (Schlesinger et al., 2011) und Falls jemals (Nekrasov et al., 2009). Arabidopsis-Samen wurden oberflächensterilisiert und wie beschrieben auf Murashige- und Skoog-Agarplatten (MS) ausgesät (Bahar et al., 2016). Die Platten wurden 2–4 Tage lang im Dunkeln bei 4 °C aufbewahrt und dann zur Keimung 5–8 Tage lang auf 22 °C gestellt. Gekeimte Sämlinge ähnlicher Größe wurden in Platten mit 24-Vertiefungen (zwei Sämlinge pro Vertiefung) überführt, die 1 ml MS-Medium mit 1 % (w:v) Saccharose (Duchefa Biochemie) enthielten, und weitere 8–10 Tage bei wachsen gelassen die gleichen Bedingungen vor der Herausforderung mit Elicitor wie unten beschrieben. Für Priming-Assays wurden Samen der Arabidopsis-Wildtyp-Col-0-Linie und der Mutantenlinien (Falls Ever und Back-) wie oben beschrieben zum Keimen gebracht und dann in 7 × 7 × 6 cm große Töpfe (1 Sämling/Topf) mit Mischung umgepflanzt Boden Green #7611 (Evenari, Ashdod, Israel) und bei einer Photoperiode von 9,5 Stunden bei 22–24 °C angebaut. Pflanzen waren

2.2 Reinigung der Vesikel der bakteriellen Außenmembran

Glycerinbestände von Xanthomonas campestris pv. campestris(Xcc) 33913 wurden auf Nähragarplatten (Difco, NA, Becton, Dickinson und Company) ausgestrichen und 2–5 Tage bei 28 °C gezüchtet. Einzelne Kolonien wurden gesammelt und zum Beimpfen eines 3- ml YEB-Starters (Hefeextraktbrühe) mit 1 0 ug/ml Cephalexinhydrat (Cp, Sigma-Aldrich) verwendet. Die Starter wurden über Nacht bei 28◦C unter Schütteln mit 185–200 U/min gezüchtet und dann zum Animpfen von 500 ml PSB-Medium (Pepton-Saccharose-Brühe) mit Antibiotika (wie oben beschrieben) in 2-L-Kolben verwendet bei einem Verhältnis von ∼1:1000 (v:v). Die Kulturen wurden wie oben beschrieben bis zu einer OD600 von 0,6–0,8 gezüchtet und dann wurden Bakterienzellen abzentrifugiert und OMVs wie beschrieben aus dem Überstand extrahiert (Mordukhovich & Bahar, 2017). Das rohe OMV-Präparat wurde dann einer Optiprep-Gradientenzentrifugation unterzogen, um gereinigte OMVs zu erhalten, wie beschrieben (Bahar et al., 2016; Mordukhovich & Bahar, 2017). Jede OMV-Charge wurde aus 1,{23}}L Bakterienkultur gereinigt und schließlich in 1 ml PBS (pH 7,3) resuspendiert. Gereinigte OMVs wurden sofort verwendet oder bis zu 7 Tage vor der Verwendung bei 4 °C gelagert. Die Größenverteilung der OMVs wurde mit einem dynamischen Lichtstreugerät (Zetasizer Nano ZS, Malvern Panalytical, Worcestershire, UK) gemessen und hatte einen mittleren Durchmesser von 121,7 ± 55,43 nm (SD). Die Partikelkonzentration wurde auf ähnliche Weise gemessen und ist in der Beschreibung jedes Experiments unten angegeben.

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2.3 Arabidopsis-Keimlingsherausforderung mit OMVs

Um die Transkriptionsreaktion von Arabidopsis auf die OMV-Exposition zu untersuchen, wurden Col-0-Keimlinge verwendet, die wie oben beschrieben in 24--Wellplatten gezüchtet wurden. Am Tag vor der OMV-Provokation wurde das MS-Medium von den Platten abgezogen und durch 250 μl steriles dH2O ersetzt, und die Platten wurden über Nacht auf dem Labortisch belassen. Am nächsten Morgen wurden jeder Vertiefung 20 µl gereinigte OMVs (30 µg pro ml, entsprechend 1,44 × 109 Partikel pro Vertiefung) oder steriles dH2O als Scheinlösung zugesetzt. Sämlinge wurden 2, 6 und 24 Stunden nach der Belastung gesammelt, auf Papier trockengetupft und mit flüssigem Stickstoff in 2- ml Eppendorf Safe-Lock-Röhrchen (Hamburg, Deutschland) eingefroren. Zu jedem Zeitpunkt wurden vier mit OMV behandelte und vier scheinbehandelte Vertiefungen gesammelt, was vier biologische Replikate für jede Behandlung zu jedem Zeitpunkt darstellte.

2.4 RNA-Reinigung

RNA wurde aus Arabidopsis-Sämlingen unter Verwendung des TRIzol-Reagenzes (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die RNA wurde unter Verwendung des Turbo DNA-free Kit (Ambion, Thermo Fisher Scientific) und des RNA Clean-Up and Concentration Kit (Norgen Biotek) gemäß den Anweisungen des Herstellers weiter gereinigt. Gereinigte RNA-Proben wurden Konzentrations- und Qualitätsanalysen mit einem TapeStation 2200-Gerät (Agilent Technologies), RNA Screen Tape und RNA Screen unterzogen

2.5 Aufbau und Sequenzierung der RNA-Bibliothek

Für jede Behandlung und jeden Zeitpunkt wurden zwei Proben mit der höchsten Reinheit für die Analyse ausgewählt. TruSeq-mRNA-Bibliotheken (Illumina) mit PolyA-Einfang wurden aus den ausgewählten RNA-Proben am Crown Institute of Genomics am Weizmann Institute of Science (Rehovot, Israel) hergestellt. Jede Probe wurde markiert und aus den Proben wurde ein Pool erstellt. Dieser Pool wurde dann in zwei NGS-Spuren geladen und in der Illumina HiSeq-Sequenzierungsmaschine im Hochleistungslaufmodus, Single Read (SR) 60 (v4), ausgeführt.

2.6 Die Sequenzierung liest die Erstverarbeitung

The raw sequence reads were cleaned with Trimmomatic software v 0.36 (Bolger et al., 2014), removing low-quality reads and remaining adapter sequences. The clean reads were mapped to the reference Arabidopsis TAIR10 reference genome (Lamesch et al., 2012) using bowtie2 (Langmead & Salzberg, 2012) and quantification of gene expression was done using RSEM (Li & Dewey 2011). Principal component analysis and sample correlation matrix were calculated with the function cor() and pre-comp (), respectively, of the R base package version 3.6.1. DEGs were determined using the DESeq2 tool (Love et al., 2014). The FDR (false discovery rate) cutoff chosen was FDR < 0.05. The LogFC (Log of the fold change) cutoff for the up-regulated and the downregulated genes, was > 

2.7 Genontologien und Genbeschreibungen 

Genontologien (GO) wurden mithilfe der GO-Annotationen von TAIR (http://www.arabidopsis.org/tools/bulk/go/index.jsp) abgerufen. Genbeschreibungen gemäß den Genmodellen wurden mithilfe der Genbeschreibungssuche von TAIR (http://www.arabidopsis.org/tools/bulk/genes/) erhalten. Die GO-Anreicherung wurde mit dem AgriGO-Webtool (http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/index.php) unter Verwendung des Arabidopsis-Genomlocus (TAIR10) als Referenz berechnet

2.8 Quantitative PCR- und RNA-seq-Validierung

Um RNA-seq-Daten zu validieren, wurden RNA-Proben von Schein- und OMV-belasteten Sämlingen für die cDNA-Synthese verwendet, gefolgt von einer quantitativen PCR (qPCR) unter Verwendung genspezifischer Primer (Supp. Table S4), wie beschrieben (Bahar et al. , 2016). Insgesamt wurden 17 DEGs aus dem RNA-seq-Datensatz getestet, wobei vier biologische Replikate der RNA von OMV- oder scheinbehandelten Sämlingen verwendet wurden. Die relative Expression der getesteten Gene wurde mit der Ubiquitin-Expression unter Verwendung eines 7500 Fast Real-Time PCR-Geräts (Applied Biosystems) wie beschrieben verglichen (Bahar et al., 2016).

2.9 Vergleich der Transkriptionsreaktion von Arabidopsis auf MAMPs und OMVs 

Unser OMV-induzierter Datensatz wurde mit verfügbaren Transkriptomen von Arabidopsis verglichen, die mit flg22, (Denoux et al., 2008), elf26 (Zipfel et al., 2006), PGN (Willmann et al., 2011), OG (Davidsson et al.) infiziert waren. , 2017) und LPS (Livaja et al., 2008). Zum Datenvergleich wurde eine Anreicherung der GO-Terme durchgeführt und die induzierten GOs wie oben beschrieben durch Venn-Diagramme visualisiert.

2.10 Arabidopsis-Priming-Experimente

Um die Priming-Wirkung von Xcc OMVs auf Arabidopsis zu testen, die mit Pseudomonas syringae pv infiziert sind. Tomate DC3000 (Pst) folgten wir dem von Zipfel et al. beschriebenen Verfahren. (2004). Kurz gesagt, wurden Blätter von 6–8 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen, die wie oben beschrieben gezüchtet wurden, mit 50–100 μl gereinigten Xcc-OMVs (30 μg/ml, entsprechend 3,6-7,2 × 109 Partikeln) infiltriert pro Blatt), 1 μM flg22 oder Wasser mit einer nadellosen Spritze. Für jede Behandlung wurden 5 Blätter/Pflanze und drei Pflanzenreplikate verwendet. Pst-Inokulum wurde durch Kultivieren des Bakteriums auf King's B-Mediumplatten (20 g/L Pepton, 1,5 g/L MgSO4 x7H2O, 10 ml/L Glycerin und 15 g/L Agar) bei 28 °C für 2–3 Tage hergestellt. und dann die Kolonien mit Wasser resuspendieren und die Inokulumkonzentration auf 105 KBE/ml einstellen. Pst-Inokulum wurde 24 Stunden nach der Grundierung mit einer nadellosen Spritze in vorbereitete Blätter infiltriert (ungefähr 100 μl wurden in jedes Blatt infiltriert). Das Bakterienwachstum wurde 0 (1 Stunde nach der Inokulation) und 2 Tage nach der Inokulation (dpi) bestimmt, indem die inokulierten Blätter gesammelt und gewogen, in 1 ml 10 mM MgCl2 mazeriert und mit {{38}fachen Reihenverdünnungen auf King's plattiert wurden B-Agarplatten. Die Anzahl der KBE auf jeder Platte wurde 2 Tage später bestimmt und pro g Blatt berechnet.

ABBILDUNG 1 Transkriptionsreaktion von Arabidopsis auf OMVs 2, 6 und 24 nach der Belastung. Hauptkomponentenanalyse (A) und Probenkorrelationsmatrix (B) der Transkriptionsreaktion von Arabidopsis-Keimlingen auf OMV oder Schein, 2, 6 und 24 Stunden nach der Belastung

2.11 In-vitro-Bakterienwachstumstests 

Um die Wirkung von gereinigten Xcc OMVs auf das Pst-Wachstum in vitro zu beurteilen, wurden Pststarter 24 Stunden lang bei 28 °C in King's B-Flüssigmedium gezüchtet und dann zur Beimpfung von drei verschiedenen Kulturen mit jeweils 12 ml King's B-Medium in {{3 verwendet }}mL Falcon-Röhrchen im Verhältnis 1:100. Bakterienkulturen wurden mit 30 μg/ml OMVs (1:50 oder 1:100, entsprechend 1,44 × 109 bzw. 7,2 × 108 Partikel pro ml) oder PBS als Kontrolle ergänzt und 20 Stunden lang bei 28 °C inkubiert. Das Bakterienwachstum wurde mit einem Spektrophotometer (Amersham Biosciences) bei einer optischen Dichte (OD) von 600 nm über 22 Stunden gemessen.

3. ERGEBNISSE

3.1 Die RNA-Seq-Analyse zeigt einen großen Satz von Arabidopsis-Genen, die als Reaktion auf die OMV-Provokation unterschiedlich exprimiert werden

Um die Transkriptionsänderung bei Arabidopsis nach einer OMV-Exposition zu untersuchen, behandelten wir Arabidopsis-Sämlinge mit OMVs, die aus dem bakteriellen Pathogen Xanthomonas campestris pv gereinigt wurden. campestris 33913 (Xcc) und sammelte Pflanzen-RNA 2, 6 und 24 Stunden nach der Belastung (hpc). Anschließend wurde die RNA aus OMV- und scheinbehandelten Proben sequenziert und analysiert, wie in Materialien und Methoden beschrieben. Hauptkorrelationsanalysen (Abbildung 1A) und Probenkorrelationsmatrixanalysen (Abbildung 1B) zeigen, dass die biologischen Replikate in jeder Behandlung eng beieinander liegen, ein Hinweis auf die allgemeine Ähnlichkeit der Transkriptionsreaktionen zwischen biologischen Replikaten. Die mit OMV behandelten Proben mit 2 und 6 HPC gruppierten sich, was darauf hinweist, dass die OMV-Behandlung einen größeren Einfluss auf die Transkriptionsreaktion hatte als die Probenahmezeit (Abbildung 1B). Andererseits häufen sich mit OMV behandelte Proben zusammen mit ihrer jeweiligen Scheinbehandlung bei 24 hpc, was darauf hindeutet, dass die durch OMVs zu diesem Zeitpunkt induzierte Transkriptionsänderung zurückgegangen war und der von scheinbehandelten Pflanzen ähnelte.

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

Zu jedem getesteten Zeitpunkt wurden mit OMV behandelte Sämlinge mit scheinbehandelten Sämlingen verglichen und differentiell exprimierte Gene (DEGs) extrahiert. Zu allen Zeitpunkten zusammen wurde festgestellt, dass insgesamt 984 und 175 Gene signifikant (Log-Fold-Änderung > 1 oder ← 1, p-Wert und FDR < 0,05) hoch- bzw. herunterreguliert waren. als Reaktion auf die OMV-Herausforderung (Abbildung 2A; Supp. Table S1). Die logarithmische Änderung der Genexpression (LogFC) reichte von einem Maximum von 9,08 (AT1G26410, 6 hpc), was einer mehr als {{18}fachen Änderung entspricht, bis zu -5,73 (AT3G17520, 24 hpc). Die höchste Anzahl an DEGs wurde bei 2 und 6 hpc gefunden, wo insgesamt 647 bzw. 876 DEGs identifiziert wurden (hoch- und herunterreguliert zusammen). Bei 24 hpc wurden 121 DEGs gefunden. Mehr als 50 % der hochregulierten Gene 2 und 6 Stunden nach der OMV-Exposition wurden zwischen ihnen geteilt (Abbildung 2B). Um die zeitliche Veränderung der Genexpression zu untersuchen, extrahierten wir alle hochregulierten DEGs, die zu allen Zeitpunkten gefunden wurden (37 Gene), und verglichen ihre fache Veränderung über die Zeit (Abbildung 2C). Die Fold-Change-Expression dieser Gene war zu den verschiedenen Zeitpunkten signifikant unterschiedlich (einfaktorielle ANOVA; F2, 108=8.1633, p=0.0005). Ein Post-hoc-Vergleich mit dem Tukey-Kramer-HSD-Test ergab, dass der LogFC sowohl 2 (M=3.45, SD=1.72) als auch 6 hpc (M=3.87, SD beträgt=1.98) war deutlich höher als bei 24 hpc (M=2.32, SD=1.31) (p=0.0145 und p=0 .0005) (Abbildung 2D). Während der mittlere LogFC-Ausdruck bei 6 hpc höher war als bei 2 hpc, unterschied er sich statistisch nicht (p=0.5413). Wenn wir daher die Anzahl der DEGs und das gesamte Gen LogFC zu den drei getesteten Zeitpunkten berücksichtigen, können wir den Schluss ziehen, dass die signifikanteste Transkriptionsänderung 2 und 6 Stunden nach der OMV-Exposition auftrat. Um die Gültigkeit der RNA-seq-Ergebnisse zu untersuchen, wurde die Expression von 17 hochregulierten Genen mithilfe quantitativer PCR (qPCR) mit spezifischen Primern bestimmt. Vierzehn der getesteten Gene zeigten das gleiche Muster wie in der RNA-seq-Analyse und waren im Vergleich zu Scheingenen deutlich hochreguliert. Drei der getesteten Gene hatten eine höhere relative Expression, unterschieden sich jedoch nach dieser Methode nicht signifikant vom Mock-Gen (Supp. Abbildung S1).

ABBILDUNG 2 Arabidopsis exprimierte Gene unterschiedlich als Reaktion auf die OMV-Provokation. (A) Eine Gesamtzahl der differentiell exprimierten Gene (DEGs) (hoch- oder herunterreguliert, LogFC > 1 oder ← 1, p-Wert und FDR < 0.05) bei 2, 6 und 24 Stunden nach der Herausforderung. (B) Überlappung zwischen DEGs zu unterschiedlichen Zeitpunkten (links, hochreguliert; rechts, herunterreguliert). (C) Hochregulierte Gene, die zu allen drei Zeitpunkten gefunden wurden, wurden in einem LogFC-Expressionsdiagramm dargestellt, das die Genexpression über die Zeit zeigt. (D) LogFC-Durchschnitt aller DEGs zu verschiedenen Zeitpunkten. Unterschiedliche Buchstaben geben einen statistischen Unterschied bei p < 0,05 nach dem Tukey-Kramer-HSD-Test an

3.2 Arabidopsis reagiert auf OMVs mit einer Transkriptionsverschiebung hin zur Aktivierung des Immunsystems

Um Arabidopsis-Pfade zu identifizieren, die von der OMV-Herausforderung signifikant betroffen sind, haben wir das AgriGO-Webtool verwendet (Du et al., 2010; Tian et al., 2017). Als Reaktion auf die OMV-Herausforderung identifizierten wir zu allen Zeitpunkten insgesamt 333 bzw. 55 signifikant (FDR < 0,05) hoch- bzw. herunterregulierte Genontologie-Begriffe (GO). Fast 25 % der hochregulierten GOs standen im Zusammenhang mit der Reaktion der Pflanze auf einen Reiz (Abbildung 3A). Innerhalb der Kategorie „Reaktion auf Reize“ waren die dominierenden GO-Begriffe mit Stressreaktion, auf biotische Reize, Chemikalien und endogene Reize verbunden (Abbildung 3B; Supp. Table S2). Das AgriGO-Tool identifizierte außerdem 103 deutlich hochregulierte molekulare Funktionen, darunter „Transferaseaktivität“, „Kinaseaktivität“, „Transkriptionsfaktoraktivität“, „Ionen- und Metallionenbindung“, „Kohlenhydratbindung“, „Proteinbindung“ und „katalytische Aktivität“. , „Adenylnukleotidbindung“, „Transmembranrezeptoraktivität“ und weitere Bindungsfunktionen (Supp. Table S2). Der zelluläre Standort der signifikanten Begriffe befand sich in verschiedenen Kompartimenten der Zelle, einschließlich des Zellkerns, der Vakuole und des Endomembransystems, war jedoch vor allem mit der Zellperipherie verbunden und umfasste „Plasmamembran“, „extrazelluläre Region“, „Zellwand“ usw „Apoplast“-Ontologien (Supp. Tabelle S2). Zu den deutlich herunterregulierten GOs gehörten hingegen die Begriffe „Toxinkatabolischer und metabolischer Prozess“, „Reaktion auf Wasser und Wassermangel“, „Lipidtransport und -lokalisation“ und andere (Supp. Table S2). GOs im Zusammenhang mit der Reaktion auf biotische Reize waren in den herunterregulierten Genen nicht angereichert. Zu den deutlich herunterregulierten molekularen Funktionen gehörten viele Redox-Begriffe wie „Oxidoreduktase-Aktivität“, „Häm-Bindung“, „Eisen-Ionen-Bindung“, „Lipid-Bindung“, „Sauerstoff-Bindung“ und weitere sauerstoffbezogene Funktionen (Supp. Table S2). . Herunterregulierte Begriffe befanden sich auch im extrazellulären Bereich. Um zu bestimmen, zu welchen GO-Begriffen DEGs mit der höchsten Expression gehören, haben wir die ursprüngliche DEG-Liste gefiltert, indem wir Gene ausgewählt haben, deren LogFC höher als 4 oder kleiner als -4 war (entsprechend einem 16--fachen Unterschied). . Wir haben 117 Gene identifiziert, die diese Kriterien erfüllten, von denen 115 zu allen Zeitpunkten zusammen hochreguliert und 2 herunterreguliert waren. Aufgrund der geringen Anzahl herunterregulierter Gene mit einem LogFC von weniger als -4 wurden keine signifikant unterdrückten GOs identifiziert. Andererseits wurden 72 signifikant hochregulierte GOs identifiziert, von denen die signifikantesten mit „Reaktion auf externe biotische Reize“, „Reaktion auf andere Organismen“, „zelluläre Reaktion auf Sauerstoffniveaus“ und „Verteidigungsreaktion“ zusammenhängen. , „Reaktion auf Stress“ und mehr immunbezogene GOs (Abbildung 3C).

ABBILDUNG 3 Begriffe der Arabidopsis-Genontologie (GO), angereichert als Reaktion auf die Xcc OMV-Herausforderung. Kreisdiagrammdarstellungen der Kategorieverteilung in hochregulierten GO-Begriffen für den biologischen Prozess (A) und die Reaktion auf einen Reiz (B). (C) Liste der Arabidopsis-Gene mit einem LogFC von > 4 als Reaktion auf die OMV-Herausforderung. Gene wurden aus dem vollständigen Datensatz der DEGs gefiltert und zur Identifizierung angereicherter GO-Begriffe mithilfe des AgriGo-Webtools verwendet. FDR-Grenzwert < 0.05

3.2 Die OMV-Herausforderung führte zu einer Hochregulierung der Immunrezeptoren

Die MAMP-Erkennung und die Reaktion der Pflanzen auf MAMPs werden größtenteils durch membrangebundene PRRs vermittelt, die die Wahrnehmung von Krankheitserregern und die effiziente Eindämmung von Infektionen vermitteln. PRRs werden üblicherweise in zwei Gruppen eingeteilt: Rezeptorkinasen (RKs) und rezeptorähnliche Proteine ​​(RLPs) (Boutrot & Zipfel, 2017). Um PRRs zu identifizieren, die als Reaktion auf OMVs unterschiedlich exprimiert wurden, verglichen wir unseren DEG-Satz mit zuvor erstellten Listen von Arabidopsis-RKs (Kemmerling et al., 2011; Mott et al., 2016) und RLPs (Wang et al., 2008). Wir haben in unserem Datensatz zu allen Zeitpunkten zusammen 33 bzw. 10 hochregulierte RKs und RLPs identifiziert (Tabelle 1). In unserer Liste der 175 herunterregulierten Gene wurden keine RKs oder RLPs gefunden. Kemmerling et al. (2011) definierten eine Liste von 49 RKs, deren Expression durch MAMPs wie flg22 und NLP (nekrose- und ethyleninduzierendes Peptid 1-ähnliches Protein) oder die Behandlung mit Krankheitserregern signifikant induziert wurde. Wir haben diese Liste mit den hochregulierten RLKs aus unserem Experiment verglichen und festgestellt, dass 45 % der von Kemmerling et al. (2011) wurden ebenfalls als Reaktion auf OMVs induziert. Unter diesen sind FRK1, SOBIR1, SERK4, RLK/IKU2, PSKR1, HAESA, EFR, BIR und IOS1 hervorzuheben (Tabelle 1). In der RK-Gruppe wies FRK1 sowohl bei 2 als auch bei 6 PSC die höchste Expression mit einem LogFC von 7,11 bzw. 5,2 auf, während der durchschnittliche LogFC aller RKs bei 2 bzw. 6 PSC 2,11 und 2,13 betrug. Während membrangebundene RKs und RLPs hauptsächlich die extrazelluläre Wahrnehmung eindringender Mikroben vermitteln, sind Nukleotidbindungsstellen-Leucin-Rich-Repeat-Rezeptoren (LRR) (NLRs) intrazelluläre Immunrezeptoren. Wir fanden 7 verschiedene NLR-Gene, die als Reaktion auf die OMV-Exposition bei 2 und 6 HPC hochreguliert waren, keines wurde bei 24 HPC gefunden (NLR-Liste wurde aus TAIR extrahiert, 102 Gene) (Tabelle 1).

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3.3 OMVs induzieren die Expression mehrerer WRKY-Transkriptionsfaktoren

Es wurde festgestellt, dass WRKY-Transkriptionsfaktoren (TFs) eine Rolle bei pflanzlichen Immunantworten spielen und sowohl an der durch MAMP ausgelösten Immunität (MTI) als auch an der durch Effektoren ausgelösten Immunität (ETI) beteiligt sind (Birkenbihl et al., 2018; Rushton et al., 2010). ). Die OMV-Herausforderung führte zur Hochregulierung von 20 verschiedenen WRKY-TFs (Liste extrahiert aus TAIR, 70 Gene) nur bei 2 und 6 HPC (Tabelle 1). WRKY-TFs fehlten in unserem herunterregulierten Gensatz. Eine weitere Familie von TFs, die von der OMV-Herausforderung betroffen sind, sind MYB-Domänen enthaltende Proteine ​​(Tsuda & Somssich, 2015), von denen bekannt ist, dass sie an mehreren Prozessen beteiligt sind, einschließlich biotischer und abiotischer Belastungen (Ambawat et al., 2013). Insgesamt wurden 9 verschiedene MYB-TFs (Liste extrahiert aus TAIR, 211 Gene) als Reaktion auf die OMV-Exposition unterschiedlich exprimiert, 5 hochreguliert und 4 herunterreguliert (Tabelle 1). Weitere erkannte Klassen differenziell exprimierter TFs sind in Tabelle 1 aufgeführt.

3.4 Vergleich der Transkriptionsreaktion von Arabidopsis auf OMV mit der Reaktion auf gereinigte MAMPs

Um mehr über die Unterschiede in der Arabidopsis-Reaktion auf gereinigten Auslöser im Vergleich zu einer rohen und molekular komplexen Struktur – OMVs – zu erfahren, verglichen wir unsere RNA-seq-Daten mit vorhandenen transkriptomischen Daten der Arabidopsis-Reaktion auf bekannte MAMPs, einschließlich flg22 (Denoux et al., 2008) und elf26 (Zipfel et al., 2006), PGN (Willmann et al., 2011), OGs (Davidsson et al., 2017) und LPS (Livaja et al., 2008). Angereicherte GOs wurden aus den oben genannten Datensätzen wie oben beschrieben extrahiert (Supp. Table S3) und mit GOs verglichen, die nach der OMV-Challenge angereichert wurden. Im Allgemeinen ähnelten die durch OMVs induzierten Arabidopsis-GO-Terme denen, die durch einzelne, proteinhaltige und nicht-proteinhaltige MAMPs induziert wurden, und teilten sich 56, 51 und 47 % der OMV-induzierten GOs mit den durch flg22, elf26 bzw. PGN induzierten GOs. Andererseits wurde eine geringere Überlappung der induzierten GOs bei LPS und OGs beobachtet, die sich 24 bzw. 33 % mit den OMV-induzierten GOs teilten (Abbildung 4A). Bemerkenswerterweise fehlte das Pathogenese-assoziierte 1 (PR1)-Gen (At2g14610), ein Kennzeichen der LPS-induzierten Immunantworten (Silipo et al., 2005, 2008), zu allen getesteten Zeitpunkten in der Liste der OMV-induzierten Gene. Es wurde festgestellt, dass 41 GOs durch OMV und nicht durch eines der anderen hier getesteten MAMPs induziert wurden (Abbildung 4B). Diese Liste umfasste GOs im Zusammenhang mit „Apoptose“, „Reaktion auf Arzneimittel“, „Arzneimitteltransport und „Mehrfachdrogentransport“ sowie „Lipaseaktivität“ (Supp. Tabelle S3, gekennzeichnet durch Sternchen und Fettschrift).

3,5 OMVs induzieren Arabidopsis-Resistenz gegen bakterielle Infektionen

Hier und zuvor (Bahar et al., 2016) haben wir Beweise dafür vorgelegt, dass das Immunsystem von Arabidopsis durch OMV-Exposition induziert wird. Um zu untersuchen, ob diese OMV-vermittelte Immuninduktion zu einer wirksamen Immunantwort führt, verwendeten wir einen Planta-Bakterienwachstumstest (Zipfel et al., 2004), bei dem Arabidopsis-Pflanzen mit OMVs vorbehandelt und anschließend mit Bakterien inokuliert wurden. Ein deutlicher Rückgang um mehr als das 10-fache bei Pseudomonas syringae pv. Tomaten DC3000 (Pst) KBE/g Blatt wurden sowohl in OMV- als auch in flg22-vorbehandelten Pflanzen im Vergleich zur Scheinvorbehandlung zwei Tage nach der Inokulation beobachtet (Abbildung 5A). Das In-vitro-Wachstum von Pst wurde durch die Zugabe von OMVs zum Medium nicht negativ beeinflusst, was darauf hindeutet, dass das verringerte Pst-Wachstum in Planta mit der Priming-Wirkung von OMV zusammenhängt und keine direkte Wirkung von OMVs auf die Bakterien ist (Supp. Abbildung). S2). Um zu testen, ob die OMV-induzierte Resistenz gegen Pst durch FLS2, EFR oder BAK1 vermittelt wird, wiederholten wir dieses Experiment mit Col-0, Bak-Mutante, und die Doppelmutantenlinie fällt efr. Bei beiden Mutantenlinien führte die OMV-Vorbehandlung zu einer signifikanten Reduzierung der Pst-KBE/g-Blatt im Vergleich zu scheinbehandelten Pflanzen (Abbildung 5B-C). Wie erwartet hatten mit flg22 behandelte fls-efr- und bak-mutierte Linien ähnliche Pst-Titer wie die unbehandelten Pflanzen, da sie bekanntermaßen nicht auf flg22 reagieren. Um die relative Verringerung des Pathogentiters in Col-0 im Vergleich zu den Immunrezeptor-Mutantenlinien in vorbereiteten Pflanzen zu vergleichen, berechneten wir den Unterschied im Pst-Titer in OMV- und scheinbehandelten Pflanzen in drei unabhängigen Experimenten (Supp . Abbildung S3). Die durchschnittliche Verringerung des Pst-Titers in OMV-vorbehandelten Rückenpflanzen war geringer als die, die in Col-0-Pflanzen beobachtet wurde (0,89 vs. 1,14 Log KBE/g Blattreduktion für Bak und Col-0, jeweils ein- Weg-ANOVA; F2,4=4.3781, p=0.0523). Wir konnten bei der fls-efr-Mutantenlinie keine ähnliche Reduktion feststellen (1,26 vs. 1,32 Log-CFU-Reduktion für fls-efr bzw. Col-0, einfaktorielle ANOVA: F1,4=0.0352, p=0.5698) (Abbildung 5D-E).

TABELLE 1 OMV-induzierte RKs/RLPs und immunbezogene Transkriptionsfaktoren in Arabidopsis-Sämlingen

TABELLE 1 (Fortsetzung)

TABELLE 1 (Fortsetzung)

4. DISKUSSION

Bakterielle Außenmembranvesikel (OMVs) sind komplexe Nanostrukturen, die aus der bakteriellen Außenmembran stammen und aus Hunderten von Proteinen und anderen Zellwandkomponenten bestehen. Es wurde zuvor gezeigt, dass Arabidopsis-Pflanzen auf die OMV-Herausforderung reagieren, indem sie typische Immunreaktionen wie ROS-Burst, Immunmarker-Genexpression und mittlere Alkalisierung aktivieren (Bahar et al., 2016). In dieser Studie untersuchten wir die umfassendere Transkriptionsreaktion von Arabidopsis auf bakterielle OMVs und ihre Auswirkung auf nachfolgende Infektionen. Die übergeordnete Schlussfolgerung aus den in dieser Studie durchgeführten RNA-seq-Datenanalysen ist, dass das Immunsystem von Arabidopsis nach der Exposition gegenüber OMVs von Xanthomonas campestris pv.campestris (Xcc) aktiviert wird. Diese Schlussfolgerung wird durch unterschiedliche und ergänzende Analysen gestützt. Erstens zeigt die Anreicherung der Genontologie (GO) in Pflanzen, die Xcc-OMVs ausgesetzt waren, deutlich, dass OMVs von Arabidopsis als Stressoren wahrgenommen werden. Der zelluläre Ort der Pflanzenreaktion hing in erster Linie mit der Zellperipherie zusammen, was auf eine äußere zelluläre Wahrnehmung des herausfordernden Materials, der OMVs, hindeutet. Dies stützt die Annahme weiter, dass OMVs und ihre Bestandteile von extrazellulären Rezeptoren wahrgenommen werden, ähnlich wie viele bekannte MAMPs. Zweitens haben wir festgestellt, dass eine große Anzahl von RKs und RLPs als Reaktion auf die OMV-Herausforderung hochreguliert wird. Von vielen dieser Rezeptoren ist bekannt, dass sie die Wahrnehmung von Krankheitserregern vermitteln, oder es wurde zuvor gezeigt, dass sie mit der pflanzlichen Immunantwort in Zusammenhang stehen. FLG22-induzierte Rezeptor-ähnliche Kinase 1 (FRK1) war der am stärksten induzierte Rezeptor. Dies ist interessant, da wir in unserer Xcc OMV-Proteomikanalyse kein Flagellin nachweisen konnten (Daten nicht gezeigt). Es ist bekannt, dass FRK1 auch durch andere Immunauslöser induziert wird, aber es ist faszinierend, warum seine Expression so viel höher ist als die der übrigen hier hochregulierten RKs. Die Expression des Elongationsfaktorrezeptors (EFR) hingegen war zum Zeitpunkt von 2 Stunden nur signifikant hochreguliert und hatte einen LogFC von 1,12, obwohl EF-Tu in Xcc-OMVs gefunden wird (Bahar et al., 2016). ). Wir fanden auch einige NLR-Gene, die als Reaktion auf die OMV-Herausforderung hochreguliert wurden, von denen die Hälfte als Krankheitsresistenzproteine ​​bezeichnet wird, deren Funktion bei der pflanzlichen Immunität jedoch nicht beschrieben wurde. Obwohl wir nicht annehmen, dass NLRs direkt an der OMV-Wahrnehmung beteiligt sind, könnten sie stromabwärts der RK/RLPs-Erkennung von OMV-Molekülen induziert werden, wie auch als Reaktion auf gereinigte MAMPs wie flg22, elf18 und LPS beobachtet wurde (Denoux et al., 2008). ; Livaja et al., 2008; Zipfel et al., 2006). Drittens wurden viele immunbezogene Transkriptionsfaktoren, WRKY, MYB und andere, durch OMVs deutlich hochreguliert (Bjornson et al., 2021). In unserer Studie trat die wichtigste Transkriptionsänderung als Reaktion auf OMV zu den ersten beiden Zeitpunkten (2 und 6 hpc) auf. Dies wurde sowohl durch eine deutlich größere Anzahl differentiell exprimierter Gene (DEGs) als auch durch einen deutlich höheren Log Fold Change (LogFC) bei 2 und 6 HPC veranschaulicht. Dennoch wurde von insgesamt 121 DEGs, die bei 24 hpc gefunden wurden, fast die Hälfte (52) bei 2 oder 6 hpc nicht gefunden. Dies deutet darauf hin, dass die Hälfte der DEGs bei 24 hpc spätregulierte Gene sind, deren Expression nach mehr als 6 hpc hoch- oder herunterreguliert wurde. Tatsächlich wurden bereits zuvor Arabidopsis-Gene mit unterschiedlicher Expressionsdynamik nach Auslöserherausforderungen identifiziert (Bjornson et al., 2021).

ABBILDUNG 4 Vergleich der Begriffe der angereicherten Genontologie (GO) als Reaktion auf OMV und auf einzelne gereinigte MAMPs. Arabidopsis-Expressionsdatensätze als Reaktion auf die MAMP-Herausforderung (elf26, flg22, OGs, PGN und LPS; Referenzen finden Sie im Abschnitt „Materialien und Methoden“) wurden verwendet, um angereicherte GOs mithilfe des AgriGo-Webtools zu extrahieren. Angereicherte GO-Sätze jedes MAMP wurden mit der angereicherten GO-Liste als Reaktion auf OMVs unter Verwendung von Venny verglichen (A und Supp. Table S3). Nur in den OMV-Datensätzen angereicherte GO-Begriffe werden in (B) sortiert nach ihrem FDR-Wert angezeigt.

In unserer Studie trat die wichtigste Transkriptionsänderung als Reaktion auf OMV zu den ersten beiden Zeitpunkten (2 und 6 hpc) auf. Dies wurde sowohl durch eine deutlich größere Anzahl differentiell exprimierter Gene (DEGs) als auch durch eine deutlich höhere Log-Fold-Change (LogFC) bei 2 und 6 HPC veranschaulicht. Dennoch wurde von insgesamt 121 DEGs, die bei 24 hpc gefunden wurden, fast die Hälfte (52) bei 2 oder 6 hpc nicht gefunden. Dies deutet darauf hin, dass die Hälfte der DEGs bei 24 hpc spätregulierte Gene sind, deren Expression nach mehr als 6 hpc hoch- oder herunterreguliert wurde. Tatsächlich wurden bereits zuvor Arabidopsis-Gene mit unterschiedlicher Expressionsdynamik nach Auslöser-Challenges identifiziert (Bjornson et al., 2021). Das schnelle und größtenteils vorübergehende Genexpressionsmuster, das wir hier gesehen haben, steht im Einklang mit anderen Studien, die die zeitliche Reaktion von Arabidopsis auf MAMPs getestet haben. Beispielsweise haben Denoux et al. (2008) und Bjornson et al. (2021) haben gezeigt, dass die Transkriptionsänderung bei Arabidopsis als Reaktion auf verschiedene MAMPs innerhalb von Minuten bis Stunden erfolgt und in den meisten Fällen die DEGs etwa 24 Stunden nach der Pflanzenexposition wieder auf das Grundniveau zurückkehren. Im Gegensatz zu Interaktionen zwischen einer Pflanze und einem Krankheitserreger, bei denen die Interaktion dynamisch und andauernd ist, wenn sie mit einer nicht lebenden Probe wie einem gereinigten MAMP oder mit OMVs in Kontakt gebracht wird, ist zu erwarten, dass die Reaktion der Pflanze, zumindest auf Transkriptionsebene, wäre vorübergehend und nicht über Tage anhaltend. Intensive Forschung in den letzten drei Jahrzehnten hat mehrere pflanzliche Immunrezeptoren entdeckt, die für die Erkennung von Mikroben verantwortlich sind. Viele dieser Rezeptoren sind in der Lage, einzelne mikrobielle Merkmale zu erkennen und werden im Detail untersucht, um die Wahrnehmung von Krankheitserregern, die Signalübertragung des Immunsystems und die Reaktion von Modell- und Nutzpflanzen besser zu verstehen. Pflanzen sind jedoch gleichzeitig mehreren mikrobiellen Merkmalen aus unterschiedlichen Quellen ausgesetzt, was die Wahrnehmung und Reaktion des Immunsystems komplexer macht. Wir waren daran interessiert, die Unterschiede in der Transkriptionsreaktion von Arabidopsis auf einzelne gereinigte MAMPs im Vergleich zu OMVs zu untersuchen, die eine natürlichere und komplexere mikrobielle Struktur darstellen, aber einen Grad an Komplexität aufweisen, der von der Mikrobe selbst entfernt ist. OMVs tragen Virulenzfaktoren, abbauende Enzyme, Toxine und andere Biomoleküle, die eine funktionelle Rolle für das Bakterienwachstum in Pflanzen spielen könnten. Daher war es interessant zu testen, ob die OMV-Herausforderung einzigartige GOs induziert, die nicht durch synthetische MAMPs induziert werden.

ABBILDUNG 5 Die Vorbehandlung von Arabidopsis-Blättern mit OMVs induziert Resistenz gegen nachfolgende bakterielle Infektionen. Col-0-Pflanzen (A) wurden mit OMVs, Wasser (Schein) oder flg22 als Kontrollen vorbehandelt und 24 Stunden später mit einer 105 KBE/ml-Suspension von Pst DC3000 unter Verwendung einer nadellosen Spritzeninfiltration inokuliert . Der Pst DC3000-Zelltiter in den inokulierten Blättern wurde 48 Stunden nach der Inokulation durch serielle Verdünnungsplattierungen bestimmt. Arabidopsis Col-0- und fls efr (B)- oder bak (C)-Pflanzen wurden in einem ähnlichen Experiment getestet, wie in (A) beschrieben. Die mittlere Log Pst DC3000 KBE/gr-Reduktion nach OMV-Vorbehandlung (im Vergleich zu unbehandelten Pflanzen) in Col-0 und fällt efr (D) sowie Col-0 und zurück (E) wurde verglichen. Jeder Balken stellt die mittlere Reduzierung von Log Pst DC3000 KBE/gr aus drei unabhängigen Experimenten dar (Daten der unabhängigen Experimente sind in Supp. Abb. S3 dargestellt). Die Unterschiede waren statistisch nicht signifikant (zweiseitiger Student-T-Test. p-Werte sind über den Diagrammbalken angegeben). Die Experimente A, B und C wurden mindestens dreimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt (3 Pflanzen/Replikate pro Behandlung in jedem Experiment). Sternchen (**) weisen auf einen signifikanten Unterschied im Vergleich zum Scheintest hin (Dunnet-Test p < 0,001).

Für unsere transkriptomischen Vergleiche haben wir Daten aus Studien mit ähnlichen Versuchsbedingungen, also in Pflanzen und zu ähnlichen Zeitpunkten, zusammengestellt. Eine signifikante Überlappung der GO-Anreicherung wurde bei der Reaktion von Arabidopsis auf OMV und auf flg22, elf26 und PGN beobachtet. Dies ist nicht unerwartet, da bekannt ist, dass viele der Abwehrwege, die bei der Erkennung von Krankheitserregern aktiviert werden, ähnlich sind, unabhängig vom spezifischen Auslöser oder seiner Quelle (Bjornson et al., 2021; Zipfel et al., 2006). Dennoch wurde festgestellt, dass einige einzigartige GOs von OMVs und nicht von den anderen von uns untersuchten MAMPs hochreguliert werden. Dazu gehören GOs, die mit dem Zellwandabbau zusammenhängen, wie etwa „Lipaseaktivität“ und „Hydrolaseaktivität, die auf Glykosylbindungen einwirkt“, was darauf hindeuten könnte, dass das pflanzliche Abwehrsystem auf den OMV-Abbau abzielt. Interessanterweise wurde auch festgestellt, dass drei GOs im Zusammenhang mit dem Drogentransport durch die OMV-Herausforderung in einzigartiger Weise hochreguliert wurden. Dies könnte darauf hindeuten, dass Pflanzen mit toxischen Verbindungen konfrontiert sind, die möglicherweise durch OMV-vermittelte Abgabe in ihre Zellen gelangen. Im Gegensatz zur Reaktion von Arabidopsis auf immunauslösende Peptide und PGN beobachteten wir eine relativ geringe Überlappung zwischen der Reaktion von Arabidopsis auf OMVs OGs und LPS. Diese kleine Überlappung, insbesondere mit LPS, ist etwas überraschend, wenn man bedenkt, dass LPS in Säugetierzellen anerkanntermaßen einen starken Beitrag zur durch OMVs induzierten Immunantwort des Wirts leisten (Ellis et al., 2010). Darüber hinaus könnte die Tatsache, dass wir keine Hochregulierung des LPS-Immunmarkers PR1 finden konnten (Silipo et al., 2005), darauf hindeuten, dass LPS kein Hauptauslöser der pflanzlichen Immuninteraktion mit bakteriellen OMVs ist. Dies muss jedoch noch genauer untersucht werden. Es wurde gezeigt, dass OMVs zur bakteriellen Besiedlung von Säugetier- und Pflanzenwirten und in einigen Fällen zur bakteriellen Virulenz beitragen. Andererseits aktivieren OMVs das Immunsystem des Wirts und fungieren somit als zweischneidiges Schwert: Sie fördern einerseits das Überleben und die Virulenz der Bakterien und versorgen andererseits das Überwachungssystem des Wirts und aktivieren die Immunität des Wirts (McMillan & Kuehn, 2021). ). Unsere Priming-Assays zeigten, dass die OMV-Exposition zu einer signifikanten Hemmung von Pseudomonas syringae pv führte. Tomaten-DC3000 (Pst)-Wachstum in Planta, ähnlich dem Priming-Effekt, der bei synthetischen MAMPs beobachtet wird (Jung et al., 2009). Daher förderte in diesem Fall die Vorverabreichung von OMVs in das inokulierte Gewebe nicht die bakterielle Besiedlung, sondern bereitete die Pflanzen vielmehr darauf vor, eine wirksame Immunantwort auszulösen, die das Wachstum von Krankheitserregern hemmte. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit unseren Transkriptionsdaten und unserer vorherigen Studie und stützt die Annahme, dass OMVs bei Arabidopsis eine robuste und wirksame Immunantwort auslösen. Zwei aktuelle Studien haben auch gezeigt, dass eine Vorbehandlung von Arabidopsis mit OMVs einer pathogenen oder kommensalen Pseudomonas-Art eine nachfolgende Pst-Infektion unterdrückt (Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021). Diese Ergebnisse weisen insgesamt darauf hin, dass die OMV-Infiltration unter den getesteten Bedingungen die Infektion mit Krankheitserregern nicht erleichtert. In einer früheren Studie haben wir gezeigt, dass mehrere Immunrezeptormutanten die WT-Reaktionsfähigkeit auf Xcc-OMVs aufrechterhalten. Zu diesen Mutanten gehörten bekannte PRRs, die entweder proteinhaltige (FLS2, EFR, RLPReMAX) oder nicht-proteinhaltige MAMPs (LYM1/LYM3) erkennen (Bahar et al., 2016). Interessanterweise haben Janda et al. (2021) berichteten, dass, wenn die FLS2-Rezeptormutantenlinie von Arabidopsis (Grippe) mit OMVs von Pst in Kontakt gebracht wurde, die FRK1-Expression unverändert blieb und scheinbehandelten Pflanzen ähnelte, was darauf hindeutet, dass FLS2 die Reaktion auf Pst-OMVs vermittelt. Es ist möglich, dass Flagellin in Pst-OMV-Präparaten häufiger vorkommt als in Xcc 33913 OMVs, und daher hatte die Entfernung des Flagellinrezeptors einen stärkeren Einfluss auf die Pflanzenreaktion auf Pst als auf Xcc OMVs.

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Es hat sich gezeigt, dass verschiedene Pflanzenimmuntests zu unterschiedlichen Ergebnissen führen können, was zu angeblich widersprüchlichen Schlussfolgerungen führt. Beispielsweise haben wir gezeigt, dass in einem Blattscheiben-ROS-Burst-Assay die Reaktion von Arabidopsis auf OMVs vom EFR-Rezeptor abhängig war. Im Immunmarker-Genexpressionsassay mit Arabidopsis-Sämlingen reagierte jedoch jede Mutantenlinie genauso auf OMVs wie die Wachtturm-Gesellschaft. McMillan et al. (2021) zeigten, dass verschiedene physikalische Behandlungen, die auf OMVs angewendet wurden, bestimmte Aktivitäten wie die Hemmung des Keimlingswachstums aufhoben. Es veränderte jedoch keine anderen Immunfunktionen, wie z. B. das Pflanzen-Priming. Daher ist es wichtig, verschiedene Tests zu kombinieren, um unterschiedliche Immunausgänge zu testen und einen möglichst umfassenden Überblick über die pflanzliche Immunantwort auf einen bestimmten Auslöser zu erhalten. Um die Beteiligung einiger der bekannten PRRs und Co-Rezeptoren weiter zu untersuchen, haben wir die Falls Ever und die Bak-Mutantenlinien mithilfe des Pflanzen-Priming-Assays getestet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Arabidopsis-Doppelmutantenlinienabfälle in ähnlicher Weise durch Xcc OMV vorbereitet wurden wie WT-Pflanzen, was die Annahme stützt, dass andere MAMPs als Flagellin und EF-Tu auch in Xcc 33913 OMVs vorhanden sind. Basierend auf Immunmarker-Genexpressionstests haben wir zuvor vorgeschlagen, dass der BAK1-Co-Rezeptor an der Wahrnehmung und/oder Reaktion von OMV beteiligt ist (Bahar et al., 2016). In dieser Studie haben wir diesen Vorschlag mithilfe des Priming-Assays erneut aufgegriffen. Hier wurde die Bak-Mutantenlinie durch OMV-Vorbehandlung geprimt, jedoch in etwas geringerem Maße als WT-Col-0-Pflanzen. Dieser Spielraum war zwar statistisch nicht signifikant, aber größer als der, der bei der jemals mutierten Doppel-FLS-Linie beobachtet wurde. Dieses Ergebnis steht auch im Einklang mit einer aktuellen Studie, die zeigte, dass die Bak-Mutantenlinie in Immunpriming-Experimenten als WT-Pflanzen auf OMV reagierte (Tran et al., 2021). Insgesamt könnte dies darauf hindeuten, dass BAK1 zwar an der OMV-Wahrnehmung beteiligt ist, andere Immunwahrnehmungs- und Signalwege jedoch durch OMV aktiviert werden, was zu einer wirksamen Immunantwort und Unterdrückung des Krankheitserregerwachstums führt. Die Beteiligung der Co-Rezeptoren BAK1 und SOBIR1 als Reaktion auf OMVs (Bahar et al., 2016) ließ uns annehmen, dass mehrere Immunrezeptoren, wahrscheinlich PRRs, an der OMV-Wahrnehmung beteiligt sind. Eine aktuelle Studie legt jedoch nahe, dass die Aktivierung des pflanzlichen Immunsystems durch OMVs MAMP-unabhängig sein könnte und auf physiochemische Veränderungen in der pflanzlichen Plasmamembran zurückzuführen ist, die durch die OMV-Integration induziert werden (Tran et al., 2021). Dies ist eine faszinierende Hypothese, die noch weiter untersucht werden muss. Interessanterweise haben McMillan et al. (2021) berichteten, dass mit Proteinase K behandelte OMVs ihre Immunpriming-Fähigkeit beibehielten, was darauf hindeutet, dass diese Aktivität möglicherweise unabhängig von der proteinhaltigen Ladung des OMV ist. Dieses Ergebnis könnte zwar die MAMP-unabhängige Immunaktivierungshypothese von Tran et al. stützen. (2021) können andere, nicht-proteinische MAMPs, die in OMVs vorhanden sind, wie LPS und PGN, MTI aktivieren (Bahar et al., 2016; McMillan et al., 2021). Darüber hinaus behielten mit Proteinase K behandelte OMVs ihre Fähigkeit, eine Hemmung des Keimlingswachstums zu induzieren, was darauf hindeutet, dass die Wachstumshemmung von der Proteinladung der OMVs abhängt (McMillan et al., 2021). Insgesamt unterstreichen diese Ergebnisse die Komplexität der Pflanzenreaktion auf OMVs und die Bedeutung der Verwendung verschiedener Ergebnisse, um die Beteiligung eines bestimmten Auslösers an bestimmten Signalwegen zu testen.

Im Jahr 2021 berichteten vier unabhängige Studien, darunter diese (die wahrscheinlich gleichzeitig stattfanden), dass bakterielle OMVs das pflanzliche Immunsystem modulieren und eine wirksame Reaktion gegen Pathogeninfektionen auslösen (Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021; Tran et al., 2021). Diese aufregenden Ergebnisse positionieren OMVs als neuen und wichtigen Akteur bei der Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben, wo es noch viel zu lernen gibt. In dieser Studie bieten wir einen umfassenderen Überblick über die Transkriptionsreaktion von Arabidopsis auf Xcc OMV. Ergänzende Forschungsansätze sind erforderlich, um die Komponenten und Mechanismen, die an der Wahrnehmung von OMVs durch Pflanzen beteiligt sind, besser zu verstehen.

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