Beta-Glucan verstärkte die Immunantwort auf den Impfstoff gegen die Newcastle-Krankheit und veränderte die MRNA-Expression der Milz bei Hühnern

ABSTRAKT

Die vorliegende Studie wurde durchgeführt, um die Wirkung der oralen Verabreichung von b-Glucan (G70), einem aus der Zellwand von Hefe gewonnenen Produkt, auf die Hämagglutinationshemmungstiter (HI) des Newcastle-Disease-Virus (NDV), die Lymphozytenproliferation und andere zu untersuchen die Rolle von T-Lymphozyten-Subpopulationen bei Hühnern, die mit NDV-Lebendimpfstoff behandelt wurden. Darüber hinaus wurde der Einfluss von b-Glucan auf die Milz-Genexpression durch Transkriptomsequenzierung untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Ergänzung mit b-Glucan den Serum-NDV-HI-Titer steigerte, den NDV-Stimulationsindex von Lymphozyten im peripheren Blut und im Darmtrakt erhöhte und die Differenzierung von T-Lymphozyten in CD4+-T-Zellen förderte. Die RNA-Sequenzierungsanalyse (RNA-seq) zeigte, dass G70 die mRNA-Expression im Zusammenhang mit dem G-Protein-gekoppelten Rezeptor und dem MHC-Klasse-I-Polypeptid hochregulierte und die mRNA-Expression im Zusammenhang mit Cathelicidin und Betadefensin herunterregulierte. Die immunmodulatorische Wirkung von G70 könnte über den Mitogen-aktivierten Proteinkinase-Signalweg wirken. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass G70 die immunologische Wirksamkeit des NDV-Lebendimpfstoffs bei Hühnern steigern und als potenzieller Adjuvanskandidat in der Geflügelindustrie eingesetzt werden könnte.

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Schlüsselwörter: Impfstoff gegen Newcastle-Krankheit, Beta-Glucan, Adjuvans, Huhn mit schwarzen Knochen, RNA-Seq

EINFÜHRUNG

Hefezellwandpolysaccharide werden direkt aus der Zellwand von Saccharomyces cerevisiae gewonnen und werden häufig als Wachstumsförderer, antimikrobielle Wirkstoffe oder Immunmodulatoren bei Geflügel eingesetzt, um die Produktion und Gesundheit zu verbessern (Schiavone et al., 2017; Hasted et al., 2021). Zuvor wurde gezeigt, dass ein Produkt namens PW220, das Hefezellwand-Polysaccharide enthält, die durch das Newcastle-Disease-Virus (NDV) hervorgerufene Immunantwort verstärkt und die mikrobielle Gemeinschaft des Blinddarms von Hühnern durch orale Verabreichung verändert (Bi et al., 2020). ). Hefezellwand-Polysaccharide bestehen hauptsächlich aus b-Glucan und Mannan-Oligosacchariden (Wang et al., 2018). In der vorliegenden Studie wurde die Wirkung von b-Glucan auf die Immunantwort auf den NDV-Impfstoff bei Hühnern untersucht. Die Milz ist ein zentrales Organ für die Auslösung der Immunantwort. Eine aktuelle Studie zeigte, dass PW220, ein Hefezellwandprodukt, die mRNA-Expression von TGF-b, IL-6, TLR5, GATA-3 und T-bet in der Milz von Hühnern hochreguliert ( Bi et al., 2022). Der spezifische Mechanismus muss jedoch noch geklärt werden. Die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) ist eine der Hochdurchsatztechnologien, die zur Untersuchung der quantitativen Genexpression und zur Analyse verschiedener Expressionsprofile auf der Ebene des gesamten Transkriptoms eingesetzt werden kann (Zhao et al., 2018). Aufgrund der Vorteile hoher Empfindlichkeit und geringer Kosten wurde RNA-seq in großem Umfang in Nutztier- und Geflügelstudien eingesetzt (Teixeira et al., 2019; Yuan et al., 2020). Daher wurde in dieser Studie die Wirkung der Verabreichung von b-Glucan auf die NDV-spezifischen Hämagglutinationshemmtiter (HI), die Proliferation von Lymphozyten und die T-Lymphozyten-Subpopulationen bei Hühnern untersucht, die oral mit NDV-Impfstoff geimpft wurden. Darüber hinaus wurde die Transkriptomanalyse verwendet, um die Wirkung von b-Glucan auf die Genexpression und die zugrunde liegenden Signaltransduktionswege in der Milz von Hühnern zu bewerten.

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Tiere

Eintägige kommerzielle Hühner mit schwarzen Knochen (männlich) wurden von Guizhou Yushun Poultry Co., Ltd. (Anshun, China) erworben. Die Hühner wurden in Drahtkäfige eingeteilt, die freien Zugang zu Futter und Wasser ermöglichten. In den ersten 7 Tagen wurde die Raumtemperatur bei 33 °C bis 35 °C gehalten und dann alle 2 Tage schrittweise um 1 °C gesenkt, bis 27 °C erreicht wurden. Alle Hühner wurden nach den von der Southwest University Animal Care festgelegten Standards verarbeitet Nutzungsausschuss (Ethik-Zertifikatsnummer: IAC-2021-0057). Alle Versuchsvögel wurden am Ende der Studie mit CO2 eingeschläfert.

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Impfstoff

Der Lebendimpfstoff von NDV (Stamm La Sota) wurde von Qingdao YEBIO Bioengineering Co., Ltd. (Qingdao, China) bereitgestellt.

Reagenzien 

Das Hefezellwandprodukt (YP) G70 wurde aus der Hefezellwand (Saccharomyces cerevisiae) gewonnen, die b-Glucan (mehr als oder gleich 70 %) enthält (AngelG70, QB/T4572, Angel Yeast, Yichang, China). Sowohl Antigen- als auch Positivkontrollseren zur Messung NDV-spezifischer HI-Titer wurden vom Qingdao Regen Diagnostics Development Center (Qingdao, China) erworben. Anti-Huhn-CD3-APC (C2818-T9580), CD4-FITC (D0117-WA78E) und CD8-PE (L{{14 }}TH49T) bei Ratten wurden von Nanjing Zeweil Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, China) angeboten.

Experimentelles Design

48 Hühner mit schwarzen Knochen im Alter von 5 Tagen wurden zufällig in drei Gruppen eingeteilt (Tabelle 1) und erhielten entweder die Grundnahrung (Tabelle 2) oder die Grundnahrung mit 0,1 % G7{{10}. } (B-Glucan, 0,7 g/kg) Ergänzung für die Dauer der vorliegenden Forschung. Gruppe H (G70 +-Impfstoff) und C (Impfstoff) wurden am 14. bzw. 28. Tag oral mit NDV-Impfstoff immunisiert. Gruppe S (Sailne) wurde mit einem gleichen Volumen Kochsalzlösung behandelt. Im Alter von 5, 7, 14, 21, 28, 35 und 42 Tagen wurden Blutproben durch Flügelvenenpunktion entnommen, um den HI-Titer zu testen. Sieben Tage nach der Auffrischungsimpfung wurden 8 Hühner in jeder Reihe nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und durch Ersticken mit CO2 getötet. Lymphozyten wurden sowohl aus dem peripheren Blut als auch aus dem Jejunum getrennt, um eine Lymphozytenproliferations- und Durchflusszytometrieanalyse durchzuführen. Bei der Jejunalprobenahme war das Zwölffingerdarm-Fesselband der Ausgangspunkt des Jejunums und ein 5 cm langer Abschnitt wurde vom Anfangspunkt des Jejunums entnommen. Die Milz wurde schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann für RT-qPCR und Sequenzprofilierung bei -80 Grad gelagert.

Tabelle 1. Versuchsaufbau

Tabelle 2.1 Zusammensetzung und Nährstoffgehalt experimenteller Broiler-Grundfutter.

HI-Studie

Der Test auf NDV-spezifische HI-Titer im Serum wurde gemäß der vorherigen Beschreibung durchgeführt (Ball et al., 2019). Kurz gesagt, das Serum wurde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) von 1:2 auf 1:1.024 in der 96-Well-Mikrotiterplatte mit V-Boden verdünnt. Dann wurden 25 ml der NDV-Verdünnung pro Vertiefung hinzugefügt und 30 Minuten lang bei 37 Grad inkubiert. Danach wurden 25 ml einer 1 %igen Hühnererythrozytensuspension in jede Vertiefung gegeben und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Alle Proben wurden zweimal getestet und auf jeder Platte waren sowohl positive als auch negative Kontrollen enthalten. Die HI-Titer basierten auf der größten Verdünnung, die zu einer vollständigen Hemmung der Hämagglutination führte. Der durchschnittliche HI-Titer und der Standardfehler (SE) wurden pro Gruppe gemessen.

Isolierung von Lymphozyten aus peripherem Blut

Lymphozyten wurden mit dem Lymphozyten-Trennmedium-Kit (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd., Tianjin, China) aus peripheren Blutlymphozyten isoliert und gesammelt. Anschließend wurden die Lymphozyten in Suspension mit RPMI 1640-Medium (Solarbio, Peking, China) einschließlich 5 % fötalem Kälberserum und 25 mM HEPES (pH 7,0) gelagert.

Isolierung von Lymphozyten aus dem Jejunum

Der Zuweisungsprozess wurde gemäß der vorherigen Beschreibung und mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt (Yuan et al., 2020). Kurz gesagt: Verwenden Sie einen 70-mm-Zellfilter, um den Darm in 4 ml kaltes PBS aufzuteilen. Anschließend wurde die Suspension der Probenzellen 12 Minuten lang bei 4.500 U/min zentrifugiert und der Überstand entfernt. Dann resuspendieren Sie die Darmzellen auf einem Vollmedium (Solarbio Co., Peking, China), das aus 5 % fötalem Rinderserum (FBS) in RPMI 1640 (Sijiqing Co., Hangzhou, China) besteht. Am Ende dient das Hähnchen-Lymphozyten-Isolierungskit (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.) zur Trennung von Lymphozyten. Das Darmgewebe wurde unter Verwendung eines 70-mm-Zellfilters in 4 ml kaltes PBS aufgeteilt. Anschließend wurde die Suspension der Probenzellen 12 Minuten lang bei 4.500 U/min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Danach wurden die Darmzellen in RPMI 1640 (Solarbio Co.) mit 5 % FBS (Sijiqing Co.) resuspendiert. Schließlich wurden die Lymphozyten unter Verwendung des Hühnerlymphozyten-Isolierungskits (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.) abgetrennt.

Proliferation von Lymphozyten 

Die Zellen wurden in Platten mit 96-Wells ausgesät (5£105 pro Well), stimuliert durch das Antigen von inaktiviertem NDV für 4 Hämagglutinationseinheiten oder ein gleiches Volumen Kochsalzlösung. Jede Probe wurde in 3 Wiederholungen getestet. Die Zellen und das Antigen wurden 44 Stunden lang bei 37 Grad in 5 % CO2 inkubiert und dann wurden 50 ml Methylthiazolyltetrazolium (MTT) (2 mg/ml) in jede Vertiefung gegeben und weitere 4 Stunden lang inkubiert. Die Proben wurden 8 Minuten lang bei 1.200 £ g bei Innentemperatur zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand vorsichtig entfernt und 100 ml DMSO in jede Vertiefung gegeben. Die Platten wurden 8 Minuten lang geschüttelt, um die Kristalle vollständig zu lösen. Schließlich wurde die durchschnittliche optische Dichte (OD) bei 570 nm aufgezeichnet. Der Stimulationsindex (SI) wurde mithilfe der Gleichung ermittelt: OD-Werte stimulierter Wells/OD-Werte nicht stimulierter Wells (Cui et al., 2020).

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Durchflusszytometrie-Analyse von T-Lymphozyten-Subpopulationen

Lymphoidzellsuspensionen wurden isoliert und zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellkonzentration wurde auf 106/ml geändert und dann auf dem Eis gehalten. Jede Probe wurde 30 Minuten lang unter lichtdichten Bedingungen mit 2 ml Ratten-Anti-Huhn-CD3-APC, CD4--FITC und Ratten-Anti-Huhn-CD8-PE gefärbt und anschließend behandelt durch 2 Wäschen mit PBS. Die Zellen wurden durch Durchflusszytometrieanalyse auf einem Durchflusszytometer (BD Bioscience, San Jose, CA) untersucht.

RT-qPCR-Analyse

Die Gesamt-RNA wurde aus der Milz unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Takara, Shiga, Japan) gemäß den Richtlinien des Herstellers gewonnen und dann unter Verwendung von PrimeScript RT Master Mix (Takara, Dalian, China) auf einem T100-Thermocycler (Bio-Rad, Hercules, CA). Als internes Kontrollgen wurde das Hühner-Beta-Actin eingesetzt. RT-qPCR ausgewählter Gene wurde auf einem Multiple Real-Time PCR System (AB, Carlsbad, CA) mit dem SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara) durchgeführt. Zur Beurteilung der quantitativen Variation wurde die relative quantitative Methode (244CT) durchgeführt (Bi et al., 2022). Die Primersequenzen sind in Tabelle 3 aufgeführt.

RNA-Extraktion

Jede der 3 Milzproben aus Gruppe H (G70 +-Impfstoff) und Gruppe C (Impfstoff) wurde für die RNA-Sequenz mit TRIzol-Reagenz (Takara) verwendet. Danach wurde die RNA mit 1 % Agarosegel auf Kontamination und Abbau getestet und die RNA-Reinheit mit einem NanoPhotometer-Spektrophotometer (IMPLEN, Westlake Village, CA) analysiert. Die RNA-Konzentration wurde mit dem Qubit RNA Assay Kit im Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies, Carlsbad, CA) bestimmt. Die RNA-Integrität wurde mit dem RNA Nano 6000 Assay Kit des Bioanalyzer 2100-Systems (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass die RNA vollständig und ohne DNA-Kontamination war.

Transkriptomanalyse

Transkriptomsequenzierung, Sequenzassemblierung und Datenanalyse wurden von Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Peking, China) bereitgestellt. Die Hauptverfahren für das Transkriptom wurden wie folgt aufgeführt: 1) Die Reinigung der mRNA von der Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von Poly-T-Oligo-gebundenen Magnetkügelchen durchgeführt. Die Fragmentierung wurde mit zweiwertigen Kationen in NEB Next First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) bei hoher Temperatur durchgeführt. 2) Erststrang-cDNA wurde unter Verwendung eines zufälligen Hexamer-Primers und Moloney Murine Leukemia Virus (M-MuLV) Reverse synthetisiert. Die Synthese des zweiten cDNA-Strangs wurde dann unter Verwendung von DNA-Polymerase I und RNase H synthetisiert. 3) Verbleibende Überhänge wurden durch die Exonuklease-/Polymerase-Aktivitäten in stumpfe Enden umgewandelt. Anschließend wurde ein NEB Next Adapter mit Haarnadelschleifenstruktur ligiert, um die Hybridisierung nach Adenylierung des 3'-Endes der DNA-Fragmente vorzubereiten. 4) Etwa 250 bis 300 bp cDNA-Fragmente wurden erhalten und die Bibliothek wurde mit dem AMPure XP-System von Beckman Coulter (Beckman Coulter, Beverly, MA) gereinigt. Dann wurden 3 ml NEBU SER-Enzym (Thermo Fisher, Hillsboro, OR) mit größenselektierter, adaptorligierter cDNA bei 37 °C für 15 Minuten und anschließend 5 Minuten bei 95 °C aufgetragen. Die PCR-Amplifikation wurde mit Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase durchgeführt. Am Ende wurden die PCR-Produkte gereinigt (AMPure XP-System) und die Qualität der Bibliothek mithilfe des Agilent Bioanalyzer 2100-Systems geschätzt. Das Clustering der indexcodierten Proben wurde mit dem TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumina, San Diego, CA) durchgeführt. Anschließend wurde die Sequenzierung auf einer Illumina Novaseq-Plattform durchgeführt und 150-bp-Paired-End-Reads generiert. Referenzgenom- und Genmodell-Annotationsdateien wurden von der Genom-Website heruntergeladen (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release- 98/fasta/gallus_gallus/ und ftp://ftp. ensembl.org/ pub/re-lease-98/gtf/gallus_gallus/). Mit HISAT2 (v2.0.5) wurde ein Index des Referenzgenoms erstellt und Paired-End-Clean-Reads wurden mit dem Referenzgenom abgeglichen. Die Anzahl der jedem Gen zugeordneten Reads und die Fragmente pro Kilobase pro Million (FPKM) für jedes Gen basierend auf der Länge des Gens und der Anzahl der dem Gen zugeordneten Reads wurden mit Feature Counts v1.5 berechnet.{{38} }p3. Der differenzielle Ausdruck zwischen Gruppe H (G70 +-Impfstoff) und Gruppe C (Impfstoff) wurde mithilfe des DESeq2 R-Pakets (1.16.1) abgeleitet. Gene mit P < 0,05 und |log2 (fold change)| > 1 wurden als differentielle Expressionsgene (DEGs) definiert.

Tabelle 3. Sequenzen von Primern für RT-qPCR.

Quantitative PCR-Validierung in Echtzeit 

Zwei hochregulierte DEGs und vier herunterregulierte DEGs im Vergleich der Gruppe H (G70 +-Impfstoff) mit der Gruppe C (Impfstoff) wurden ausgewählt, um die Ergebnisse der Transkriptomsequenzierung durch RT-qPCR zu bestätigen. Die RNA wurde mit PrimeScript RT Master Mix (Takara) auf dem T100 Thermocycler (Bio-Rad) in cDNA umgewandelt. Die Primersequenzen sind in Tabelle 3 aufgeführt. Hühner-b-Actin wurde als internes Kontrollgen verwendet. RT-qPCR ausgewählter Gene wurde auf einem Multiple-Real-Time-PCR-System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) mit dem SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara) durchgeführt. Zur Beurteilung der Variation in der Quantifizierung wurde eine relative quantitative Methode (244CT) angewendet. Alle Proben wurden zur Analyse in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.

Statistische Analyse

Eine einfaktorielle ANOVA mit Duncan-Post-hoc-Test wurde für mehrere Vergleiche zwischen Gruppen unter Verwendung der SPSS-Software (Version 21.0, SPSS Inc., Chicago, IL) verwendet. Die Daten werden als Mittelwert § SE ausgedrückt. Ein Wert von P < 0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

ERGEBNISSE Wirkung von b-Glucan auf Serum-Antikörpertiter

Wie in Abbildung 1 dargestellt, sanken die NDV-spezifischen HI-Titer in allen Gruppen vor der Impfung und stiegen in den Gruppen H (G70+Impfstoff) und C (Impfstoff) nach der Immunisierung an. Interessanterweise wurden in Gruppe H (G70+Vaccine) höhere HI-Titer mit 21 (P > 0.05), 28 (P < 0.{{ 14}}5), 35 (P > 0,05) und 42 (P > 0,05) Tage älter als in Gruppe C (Impfstoff).

Wirkung von b-Glucan auf die Lymphozytenproliferation

Die Wirkung von G70 auf die Proliferation peripherer Blutlymphozyten ist in Abbildung 2A dargestellt. Der SI in den Blutlymphozyten war bei Vögeln, die mit G70 (G70 +-Impfstoff) ergänzt wurden, 7 Tage nach der Auffrischimpfung (P < 0,05) im Vergleich zur Impfstoffgruppe erhöht. Darüber hinaus war der SI in Jejunallymphozyten 7 Tage nach der Auffrischimpfung im Vergleich zur Impfstoffgruppe signifikant erhöht (P < 0,05) (Abbildung 2B).

Wirkung von b-Glucan auf das Verhältnis von CD4 + / CD8 + T-Zellen im peripheren Blut 

Die Abbildungen 3A und 3B zeigten das Gating von Lymphozyten und CD3 +-Zellen und die Abbildungen 3C bis 3E zeigten das Verhältnis von CD4 +/CD8 +-T-Zellen im G70. Impfstoff- bzw. Kochsalzgruppen-Gruppen. Wie in Abbildung 3F gezeigt, gab es nach der Auffrischimpfung keinen bemerkenswerten Unterschied zwischen der Impfstoffgruppe und der Kochsalzlösungsgruppe (P > 0,05), wohingegen der Anteil von CD4 + /CD{{12} } T-Zellen waren in der G70-Gruppe (G70 +-Impfstoff) offensichtlich höher als in der Impfstoffgruppe (P < 0,05).

Abbildung 1. Auswirkung der oralen Verabreichung von b-Glucan auf die Serumantikörpertiter gegen den NDV-Impfstoff. Die Daten werden als Mittelwert § SE ausgedrückt.

Verwandte Genexpression

Wie in Abbildung 4 dargestellt, deutlich erhöhte mRNA-Expression von TGF-b (P < 0.05), IL-6 (P < 0.{{13} }5) und TLR5 (P < 0.05) wurde im Vergleich zur Impfstoffgruppe in der Milz von Hühnern nachgewiesen, die mit G70 (G70 +-Impfstoff) behandelt wurden. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der mRNA-Expression von IFN-g (P > 0,05), TLR4 (P > 0,05) und TLR3 (P > 0,05) in der Milz zwischen dem G70-Impfstoff (G70 +-Impfstoff) und dem Impfstoff gefunden Gruppen.

Analyse von RNA-Sequenzierungsdaten 

Die Sequenzierung von RNA aus 8 Milzbibliotheken ergab 24,1 G Rohdaten, wie in Tabelle S1 des Ergänzungsmaterials dargestellt. CN bedeutet Impfstoff der Gruppe und HN bedeutet Impfstoff der Gruppe G70 +. Die Bibliotheken C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 und H4 bestehen jeweils aus 45.591.492, 47.424.782, 46.193.492, 54.403.376, 47.118.476, 45.899.262, 45.841.884 und 45.504.43 8 Originallesungen. Nach dem Aptamer wurden mehrdeutige Sequenzen und Sequenzen mit geringer Qualität entfernt, sodass 44.050.198, 45.449.884, 44.261.112, 52.097.846, 45.542.404, 44.566.290, 44.113.172 und 44.026.960 saubere Lesevorgänge übrig blieben. Mehr als 96 % der sauberen Lesevorgänge gehörten zu den ursprünglichen Lesevorgängen, und 8 Bibliotheken wurden mithilfe von HISAT2 zur Sequenzierung von Lesevorgängen mit einer Referenzdatenbank abgeglichen, die aus dem Gallus-Genom bestand. Darüber hinaus wurden die sauberen Lesevorgänge in mehr als 95 % der Fälle dieser Datenbank zugeordnet. Spezifisch für die Bibliotheken aus C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 und H4 waren 40.921.384 (92,9 %), 41.302.100 (90,87 %), 40.771.075 (92,11 %), 46.905.784 (90,03 %), 42.444.112 (93,2 %). %), 40.213.444 (90,23 %), 40.922.895 (92,77 %) und 40.971.972 (93,06 %) Lesevorgänge wurden jeweils eindeutig der Referenzdatenbank zugeordnet.

Differenziell exprimierte Gene

Wie in Abbildung 5A angegeben, wurden insgesamt 198 unterschiedlich exprimierte Gene identifiziert, darunter 47 hochregulierte Gene und 151 herunterregulierte Gene. Die DEGs wurden ausführlich in der Zusatzmaterialtabelle S2 beschrieben. Abbildung 5B zeigt, dass DEGs eine gute Reproduzierbarkeit der Behandlungen aufweisen.

Analyse der Klassifizierung der Genontologie und der Kyoto-Enzyklopädie zur Anreicherung von Genen und Genomen

Gene, bei denen es sich um differenziell exprimierte Gene handelt, wurden auf der Grundlage des Gene Ontology (GO)-Klassifizierungssystems in drei Hauptfunktionskategorien eingeteilt: biologischer Prozess, zelluläre Komponente und molekulare Funktion. Die zehn wichtigsten GO-Begriffe in den drei Kategorien sind in Abbildung 6 dargestellt. Es gab eine Dominanz von Genen, die an der „Reaktion auf humorales Immunsystem“, „Chemokin-Reaktion“, „Reaktion auf antimikrobielles Humoral“, „Abwehrreaktion gegen das Bakterium“ beteiligt waren. „„Immunreaktion auf antimikrobiellen Humor, vermittelt durch antimikrobielle Peptide“, „Abwehrreaktion gegen gramnegative Bakterien“ und „Abwehrreaktion gegen grampositive Bakterien“ in der Kategorie der biologischen Prozesse. Darüber hinaus stand in der Kategorie der molekularen Funktion ein bemerkenswertes Verhältnis der Gene mit „CC-Motiv-Chemokin-Rezeptor (CCR)-Chemokin-Rezeptor-Bindung“, „Chemokin-Rezeptor-Bindung“ und „Lipopolysaccharid-Bindung“ in Zusammenhang. Darüber hinaus waren „Mitochondrialer Atmungskettenkomplex I“, „NADH-Dehydrogenase-Komplex“ und „Atmungskette“ die am häufigsten vorkommenden angereicherten Begriffe in der Kategorie der Zellkomponenten. Die Signalweganalyse der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes wurde auch an den unterschiedlich exprimierten Genen durchgeführt. Die Ergebnisse legen nahe, dass Gene hauptsächlich in sieben Signalwege eingeteilt wurden, darunter „Neuroaktive Liganden-Rezeptor-Interaktion“, „Gap Junction“, „Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-Signalweg“, „ABC-Transporter“, „Biosynthese von Aminosäuren“ „Arzneimittelstoffwechsel“ und „Proteinexport“.

Abbildung 2. Wirkung der oralen Verabreichung von b-Glucan auf den Lymphozyten-stimulierenden Index (SI). (A) Lymphozyten des peripheren Blutes; (B) Darmlymphozyten. Die Daten werden als Mittelwert § SE ausgedrückt.

Abbildung 3. Wirkung der oralen Verabreichung von b-Glucan auf das CD4+/CD8+-Zellverhältnis im peripheren Blut. (A) Gate auf Lymphozyten; (B) Gate auf CD3+ T-Zellen; (C) Häufigkeiten von CD3+ CD4 + CD8 + T-Zellen in der G70+-Impfstoffgruppe; (D) Häufigkeiten von CD3+ CD4 + CD8 + T-Zellen in der Impfstoffgruppe; (E) Häufigkeiten von CD3+ CD4 + CD8 + T-Zellen in der Kochsalzlösungsgruppe; (F) Balkendiagramm, das das CD4+/CD8+-Verhältnis darstellt. Die Daten werden als Mittelwert § SE ausgedrückt.

Abbildung 4. Wirkung der oralen Verabreichung von b-Glucan auf die mRNA-Expression in der Hühnermilz. Die Daten werden als Mittelwert § SE ausgedrückt.

Abbildung 5. Zusammenfassung der RNA-Seq-Daten. (A) Liste der unterschiedlich exprimierten Gene, (B) Clusterkarte der DEGs.

Überprüfung differenziell exprimierter Gene durch RT-qPCR

Die 6 DEGs, die hoch- oder herunterreguliert wurden, wurden durch quantitative Echtzeit-PCR bestätigt. Das Ergebnis deutete darauf hin, dass die RT-qPCR-Daten im Allgemeinen mit den RNA-seq-Daten im Allgemeinen übereinstimmten, was auf ein zuverlässiges Sequenzierungsergebnis hinweist (Abbildung 7). Expression von mRNA von MAPK-Pathway-assoziierten Genen Wie in Abbildung 8 gezeigt, war die mRNA-Expression von FAS (P < 0.05) und CACNA2 (P < 0.05) signifikant verringert in der Milz von Hühnern der G70-Gruppe (G70 +-Impfstoff) im Vergleich zur Impfstoffgruppe nachgewiesen. Darüber hinaus wurde in der G70-Gruppe (G70 +-Impfstoff) im Vergleich zur Impfstoffgruppe (P > 0,05) eine numerisch erhöhte mRNA-Expression von DUSP5 und DUSP4 sowie eine numerisch verringerte mRNA-Expression von p38, JNK und ERK festgestellt. .

DISKUSSION

Lebendimpfstoff gegen ND wird in Hühnerfarmen häufig geimpft, und dennoch kommt es immer noch zu sporadischen Ausbrüchen der Newcastle-Krankheit in immunisierten Geflügelbeständen (Zhang et al., 2022). Die optimalen Impfstoffe sollen die zelluläre und mukosale Immunität sowie eine wirksame humorale Immunität stimulieren (Shan et al., 2019). Daher wurde Adjuvanzien, die sowohl mukosale als auch zelluläre Immunantworten hervorrufen können, immer mehr Aufmerksamkeit geschenkt (Chen et al., 2014; Yu et al., 2015). Im Vergleich zum Injektionsweg ist die orale Verabreichung ein einfacherer Ansatz, der die Kosten senkt und weniger Stress für Masthühner verursacht (Boyaka et al., 2003; Zhang et al., 2008). Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass eine mit b-Glucan ergänzte Diät den Spiegel der NDV-spezifischen HI-Titer im Serum von Hühnern deutlich erhöhte, was mit früheren Berichten übereinstimmt (Horst et al., 2019). NDV-spezifische Antikörper sind für die Entwicklung einer humoralen Immunantwort essentiell, um Hühner vor einer NDV-Infektion zu schützen (Martinez et al., 2018; Li et al., 2020). B-Lymphozyten produzieren Antikörper und T-Lymphozyten expandieren als Reaktion auf Mitogene (Bohacova et al., 2021). In der vorliegenden Studie war der Stimulationsindex der peripheren Blutlymphozyten von Hühnern für NDV der G70-Gruppe offensichtlich höher als der der Impfstoffgruppe, was darauf hindeutet, dass mehr T-Lymphozyten aktiviert wurden. Die vorherrschenden Subpopulationen von T-Lymphozyten sind die CD4 +- und CD8 +-T-Zellen (Cui et al., 2020). CD4 +-T-Zellen produzieren hauptsächlich Zytokine und fördern die Reifung von B-Zellen, wohingegen CD8 +-T-Zellen mit der Abtötung der Zielzellen verbunden sind (Zhang et al., 2021b). In dieser Untersuchung stieg das Verhältnis der in der G70-Gruppe nachgewiesenen CD4 +/CD8 +-T-Zellen deutlich an, was darauf hindeutet, dass G70 mehr CD4 +-T-Zellen aus dem peripheren Blut aktivieren könnte. Darüber hinaus beobachteten wir in der G70-Gruppe einen deutlich höheren Index der intestinalen Lymphozytenstimulation als in der Impfstoffgruppe, was bestätigte, dass B-Glucan auch intestinale Lymphozyten stimulieren kann. Unsere vorherigen Experimente bestätigten, dass der Hefezellwandextrakt PW220 die darmspezifischen sIgA- und IgA+-Zellen signifikant erhöhte (Bi et al., 2020). Das heißt, sowohl B-Glucan G70 als auch PW220 fördern wirksam die Immunität der Darmschleimhaut.

Vorteile von Cistanche für Männer: Stärkung des Immunsystems

Über eine verbesserte Immunität von Tieren durch die Verabreichung von B-Glucan wurde bereits berichtet. Guo et al. (2003) bestätigten, dass die Verabreichung von b-Glucan den Index von Schleimbeutel- und NDV-spezifischen Antikörpern bei Hühnern verbesserte. Levine et al. (2018) schlugen vor, dass eine B-Glucan-Supplementierung den intestinalen MHC Ⅱ hochregulieren und die Anzahl der CD45 +-Zellen erhöhen kann, um Darmschäden zu lindern.

Li et al. (2005) zeigten, dass b-Glucan aus der Nahrung die mRNA-Expressionsniveaus von IL-8 und TGF-b im Darmtrakt von Schweinen hochregulieren kann. Der Mechanismus der immunmodulatorischen Wirkung von B-Glucan ist nicht klar. Kim et al. (2010) zeigten, dass b-Glucan die Reifung dendritischer Zellen fördert, indem es die Expression von CD40, CD80 und CD86 hochreguliert. Darüber hinaus haben Lee und Kim (2014) und Su et al. (2020) berichteten, dass b-Glucan Mustererkennungsrezeptoren wie den Dectin-1-Rezeptor, den Toll-like-Rezeptor und CR3 aktiviert (Baert et al., 2015). Die Milz ist ein entscheidendes Organ für die Auslösung einer Immunantwort und spielt eine wesentliche Rolle sowohl bei der angeborenen als auch bei der erworbenen Immunität (Bronte und Pittet, 2013). Es gibt jedoch nur wenig Forschung, die auf einer RNA-seq-Analyse der mRNA-Expression in der Milz nach oraler Verabreichung von Hefepolysacchariden basiert. In der vorliegenden Studie legte die Signalweganalyse der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes nahe, dass diese Gene hauptsächlich in zwei Signalwege eingeteilt wurden, darunter „Neuroaktive Liganden-Rezeptor-Interaktion“ und „MAPK-Signalweg“. Die Rezeptoren zur Mustererkennung, die auf B-Glucan abzielen, wurden auf der Oberfläche von Immunzellen angereichert (Goodridge et al., 2009). Nach der b-Glucan-Erkennung wurden die Tyrosinkinase und der Kernfaktor kappaB (NF-kappaB) durch diese Rezeptoren stimuliert, was zur Induktion der proinflammatorischen Zytokinsekretion und Aktivierung von Immunantworten führte (Kankkunen et al., 2010; Masuda et al ., 2012; Xu et al., 2016; Bode et al., 2019). Die MAPK spielt als Familie der Serin-Threonin-Proteinkinasen eine entscheidende Rolle bei Entzündungen und Zytokinproduktion bei Hühnern. Byun et al. (2016) zeigten, dass b-Glucan die Produktion von Interferon-g und Interleukin-2 erhöhte und deutlich höhere Phosphorylierungsgrade von MAPK p38 in Peritonealmakrophagen auslöste. Wang et al. (2014) berichteten, dass b-Glucan Entzündungsreaktionen in THP-1-Zellen abschwächt, indem es die p38-MAPK-Aktivierung hemmt. In dieser Studie wurden 13 DEGs, darunter DUSP4, CACNA2D1, PDGFD, PTPRR, ENSGALG00000006351, FAS, MAP2K3, MYC, DUSP5, MAX, SRF, PRKCB und EGFR, im MAPK-Signalweg identifiziert, was darauf hindeutet, dass b-Glucan die Immunantwort regulieren könnte der Milz über MAPK bei Hühnern. Die MAPK ist eine konservierte Klasse von Ser/Thr-Kinasen in Zellen, die hauptsächlich an zellulären Reaktionen wie Immunantwort, Apoptose und Proliferation beteiligt sind. Die MAPK-Familie umfasst mindestens 3 Unterfamilien: c-Jun N-terminale Kinase (JNK), p38 MAPK und extrazelluläre signalregulierte Kinase (ERK) (Hong et al., 2020; Zhang et al., 2021a). DUSP4 und DUSP5 sind Phosphatasen mit doppelter Spezifität, die spezifisch die Aktivität von Mitgliedern der MAPK-Familie wie p38, JNK und ERK hemmen und eine wichtige regulatorische Rolle bei der Verhinderung entzündlicher Überreaktionen und der Förderung der Rückbildung von Entzündungen im Körper spielen (Imasato et al ., 2002; Talreja et al., 2021). Darüber hinaus wurde berichtet, dass eine kleine nichtkodierende RNA namens gga-miR-200a-3p die Expression entzündungsfördernder Faktoren unterdrückt und so die Autoimmunreaktion des Wirts reguliert, indem sie den MAPK-Signalweg negativ reguliert und seine nachgeschalteten Signalmoleküle (Pham et al., 2017). In der vorliegenden Studie zeigte die RT-qPCR-Analyse, dass die mRNA-Expression von P38, JNK und ERK abnahm und die mRNA-Expression von DUSP4 und DUSP5 bei Hühnern, die mit b-Glucan (G70) gefüttert wurden, zunahm. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die immunstärkende Wirkung von b-Glucan (G70) auf den Impfstoff gegen die Newcastle-Krankheit mit der durch MAPK vermittelten negativen Rückkopplungsregulation entzündungsfördernder Faktoren zusammenhängt. Darüber hinaus ist FAS eine essentielle Substanz, die Apoptose vermittelt und für die Immunhomöostase von entscheidender Bedeutung ist (Krueger et al., 2003; Guegan und Legembre, 2018). Mittlerweile ist CACNA2 eine spannungsabhängige Kalziumkanal-Untereinheit, die eine fördernde Wirkung auf die Zellproliferation, -migration und -invasion hat (Sun et al., 2020). In dieser Studie waren FAS und CACNA2 bei Hühnern, die mit B-Glucan (G70) ergänzt wurden, signifikant verringert, was darauf hindeutet, dass B-Glucan (G70) immunstärkende Wirkungen ausübt, hauptsächlich durch Hemmung der Apoptose von Immunzellen und Ausgleich der Autoimmunität. Diese Ergebnisse liefern eine theoretische Referenz für die Verwendung von B-Glucan (G70) als Immunverstärker im klinischen Umfeld. Allerdings bedarf der Mechanismus der Verstärkung der Immunantwort durch B-Glucan durch den negativen Rückkopplungseffekt des MAPK-Signalwegs weiterer Beweise. Es ist interessant festzustellen, dass Gene, die für Cathelicidin kodieren, einschließlich CATH3, CATH1, CATH2, und Gene, die für B-Defensin kodieren, einschließlich AvBD6, AvBD7, AvBD1 und AvBD4, im Vergleich H (Gruppe G70 +-Impfstoff) deutlich herunterreguliert wurden. vs. Kontrolle (Gruppenimpfstoff). Host Defense Peptides (HDPs) sind Effektormoleküle, die eine entscheidende Rolle im angeborenen Immunsystem spielen (Cuperus et al., 2013). Diese Peptide wurden in einer Vielzahl von Tierarten entdeckt, von Säugetieren bis hin zu Vögeln. Es gibt 4 Cathelicidine bei Küken, bestehend aus CATH1, CATH2, CATH3 und CATHB1, die verschiedene Bakterien wirksam abtöten (Hamad et al., 2017). Aviäre Beta-Defensine (AvBDs), auch Gallinaceen genannt, sind kleine kationische Peptide mit 3 Cysteindisulfidbindungen zwischen ihren Cysteinresten und spielen eine wichtige Rolle im angeborenen Immunsystem (Yoshimura, 2015). Die Verringerung der Expression von Cathelicidinen und Beta-Defensin wurde möglicherweise durch eine Rückkopplungsregulation erklärt, bei der Bakterien- und Parabakterienpopulationen durch Hefezellwand-Polysaccharide reduziert wurden (Bi et al., 2020). Ähnliche Ergebnisse wurden in anderen Studien festgestellt. Shao et al. (2016) zeigten mittels quantitativer Echtzeit-PCR-Analyse, dass die Ergänzung von Hefe-b-Glucan bei Masthühnern die Salmonelleninfektion unterdrückte und die Expression von HDPs verringerte. In dieser Studie erhöhte ein Produkt G70, das hauptsächlich aus b-Glucan besteht, den Spiegel an NDV-spezifischen Antikörpern im Serum, erhöhte den NDV-Stimulationsindex von peripheren Blutlymphozyten und intestinalen Lymphozyten und förderte die Differenzierung von peripheren Blut-T-Lymphozyten in CD{{ 123}} T-Zellen. Darüber hinaus zeigte die RNA-seq-Analyse, dass G70 die mRNA-Expression im Zusammenhang mit dem G-Protein-gekoppelten Serotoninrezeptor und dem MHC-Klasse-I-Polypeptid hochregulierte und die mRNA-Expression im Zusammenhang mit Cathelicidin und Beta-Defensin herunterregulierte. Angesichts der verstärkten Wirkung von G70 auf den ND-Impfstoff bei Hühnern kann die Wirkung von G70 auf andere Geflügelimpfstoffe wie den Vogelgrippeimpfstoff weiter untersucht werden.

Abbildung 6. KEGG-Signalweganalyse.

Abbildung 7. RT-qPCR-Bestätigung ausgewählter DEG-Kandidaten. Die Daten werden als Mittelwert § SE ausgedrückt.

Abbildung 8. Relative mRNA-Expression in der Milz. Gesamt-RNA wurde aus der Milz extrahiert. Als internes Kontrollgen diente das Hühner-b-Actin. Die Daten werden als Mittelwert § SE ausgedrückt.

VERWEISE

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