Bioassay zur Überwachung der Anti-Aging-Wirkung der Behandlung mit Nabelschnurblut

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Sang-Hun Bae1*, Ala Jo1,2*, Jae Hyun Park1, Chul-Woo Lim1, Yuri Choi1, Juhyun Oh2, Ji-Min Park1, TaeHo Kong1, Ralph Weissleder2,3, Hakho Lee2, Jisook Moon1

1. Department of Biotechnology, College of Life Science, CHA University, Gyeonggi-do 13488, Republik Korea

2. Zentrum für Systembiologie, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA 02114, USA

3. Department of Systems Biology, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, USA *Diese Autoren haben zu gleichen Teilen beigetragen.

Korrespondierender Autor: Hakho Lee, PhD. Zentrum für Systembiologie, Massachusetts General Hospital, 185 Cambridge St, CPZN 5206, Boston, MA 02114, USA. 617-726-8226 hlee@mgh.harvard.edu Jisook Moon, PhD. Department of Biotechnology, College of Life Science, CHA University, Pangyo-ro 335, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do 13488, Republik Korea. 82-31-881-7210 jmoon@cha.ac.kr

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Eingegangen: 04.10.2018; Angenommen: 2018. 11. 18; Veröffentlicht: 01.01.2019

Cistanche hat eine Anti-Aging-Wirkung

Abstrakt

Hintergrund: Die Behandlung alter Tiere mit Plasma eines frühen Entwicklungsstadiums (z. B. Nabelschnurplasma) zeigte ein beeindruckendes Potenzial zur Verlangsamung des altersbedingten Abbaus neuronaler und kognitiver Funktionen. Die Übertragung solcher Ergebnisse auf die klinische Realität erfordert jedoch effektive Methoden zur Bewertung der Behandlungswirksamkeit; Ideale Methoden sollten minimalinvasiv, für serielle Assays geeignet, kostengünstig und quantitativ sein.

Methoden: Wir haben einen neuen Biosensor-Ansatz zur Überwachung entwickeltAntialterungTherapie. Wir haben zwei wichtige Sensorkomponenten weiterentwickelt: i) ein durch Blut übertragener Metabolit wurde als Surrogat-Alterungsmarker identifiziert; und ii) es wurde ein kompaktes und kostengünstiges Testsystem für Anwendungen vor Ort entwickelt. Wir behandelten gealterte Mäuse entweder mit menschlichem Nabelschnurplasma oder Kochsalzlösung; ein unvoreingenommenes Metaboliten-Profiling auf Mausplasma zeigte Arachidonsäure (AA) als einen potenten Indikator, der mit dem assoziiert istAntialterungWirkung. Als nächstes haben wir einen konkurrenzfähigen magneto-elektrochemischen Sensor (cMES) implementiert, der für den AA-Nachweis direkt aus Plasma optimiert ist. Die entwickelte Plattform konnte AA direkt aus kleinen Plasmavolumina (0,5 µl) innerhalb von 1,5 Stunden nachweisen.

Ergebnisse: cMES-Assays bestätigten eine starke Korrelation zwischen AA-Spiegeln undAnti-Aging-Effekt: Die AA-Spiegel nahmen zwar mit zunehmendem Alter ab, stiegen jedoch bei den mit Plasma behandelten gealterten Mäusen an, die auch eine verbesserte Lern- und Gedächtnisleistung zeigten.

Schlussfolgerungen: Die cMES-Plattform wird sowohl prä- als auch klinisch befähigenAntialterungForschung durch die Ermöglichung einer minimal invasiven Langzeitbehandlungsüberwachung; Diese Kapazitäten werden die Entwicklung beschleunigenAntialterungTherapien, die die Lebensqualität des Einzelnen verbessern.

Schlüsselwörter: Anti-Aging, Arachidonsäure, Metaboliten-Profilierung, magneto-elektrochemischer Sensor, Biosensor

Einführung

Das Altern wird zunehmend als klinischer Risikofaktor für kognitive Degeneration (z. B. Neurodegeneration, Demenz) und andere chronische Erkrankungen (z. B. Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Muskeldegeneration) anerkannt [1]. Mit zunehmender Lebenserwartung und wachsender älterer Bevölkerung werden erhebliche Anstrengungen unternommen, um Alterungsmechanismen aufzuklären [1–3] und therapeutische Strategien zu finden, um Alterungsprozesse zu verlangsamen oder sogar umzukehren [4]. Tatsächlich wurden vielversprechende Ergebnisse aus Tierversuchen berichtet; Erwachsene Mäuse, die eine Plasmatransfusion von jungen Mäusen erhielten, erlangten ihre kognitive Funktion, synaptische Plastizität und neuronale Aktivität zurück [5]. Rasante Entwicklung imAntialterungBehandlungen und deren Umsetzung in Studien am Menschen werden erwartet [6]. Gegenwärtige Metriken zur Überwachung von Behandlungseffekten sind jedoch nur begrenzt praktikabel, da Methoden beim Menschen oft schwierig anzuwenden sind (z. B. invasive Bildgebung des Gehirns, kontrollierte Verhaltensbeobachtung) und subjektiv sind (z. B. Fragebögen zu Patientenerfahrungen). Eine wichtige Voraussetzung für den FortschrittAntialterungTherapien liegt daher in der Entwicklung quantitativer, minimalinvasiver Assays zur Therapieüberwachung.

Wir argumentierten, dass Metaboliten eine starke Quelle für sein würdenAntialterungBiomarker. Metabolite sind ein essentieller Phänotyp in einem Organismus und werden als diagnostische Biomarker für andere Krankheiten untersucht [7]. Insbesondere das Altern ist typischerweise mit metabolischen Veränderungen oder Funktionsstörungen verbunden, die sich auf die gesamten Metabolitenprofile in Organismen auswirken. Daher ist es denkbar, dass die Rückverfolgung der Zusammensetzung und/oder der Spiegel von Metaboliten Aufschluss über die Wirksamkeit von gibtAntialterungBehandlung. Darüber hinaus könnten Metabolit-Assays, insbesondere in Form von Bluttests, quantitativ und minimal invasiv sein; diese Vorzüge würden es erleichtern, unterschiedliche Behandlungsschemata oder Patientengruppen zu erfassen und die (Anti-)Aging-Dynamik durch serielle Probennahme zu überwachen.

Wir beschreiben hier eine neue Biosensor-Strategie zur ÜberwachungAntialterungBehandlung. Zwei Schlüsselelemente wurden vorangebracht: i) ein durch Blut übertragener Metabolit wurde als Surrogat-Alterungsmarker identifiziert; und ii) es wurde ein schnelles, kostengünstiges Testsystem für Anwendungen in routinemäßigen klinischen Umgebungen entwickelt. Insbesondere behandelten wir eine Kohorte alter Mäuse (etwa 2 Jahre alt) mit Plasma aus menschlichem Nabelschnurblut. Umfassende Metabolomik-Analysen von Mausblut zeigten, dass Arachidonsäure (AA), deren Spiegel mit zunehmendem Alter signifikant abnahm, in der behandelten Gruppe umgekehrt anstieg. Diese Beobachtung veranlasste uns, einen magneto-elektrochemischen Sensor für kleine molekulare Ziele zu entwickeln: Wir optimierten eine konkurrierende elektrochemische Reaktion, bei der AA auf Magnetkügelchen eingefangen und für eine höhere Empfindlichkeit konzentriert wurde. Die entwickelte Plattform konnte AA innerhalb von 1,5 Stunden direkt aus kleinen Plasmavolumina (0,5 µl) nachweisen. Mithilfe dieser Plattform konnten wir außerdem eine positive Korrelation zwischen den Blut-AA-Spiegeln und der besseren Leistung der Tiere bei der motorischen Aufgabe feststellen.

Ergebnisse

Behandlung von erwachsenen Mäusen mit Plasma aus Nabelschnurblut Abbildung 1a zeigt das gesamte Versuchsschema.

Als Wirkstoff verwendeten wir Plasma aus menschlichen Nabelschnurblutproben. Frühere Studien zeigten, dass gealterte Mäuse, denen junges Mausplasma injiziert wurde, die räumliche Gedächtnisfunktion wiedererlangten, und die systemische Verabreichung von menschlichem Nabelschnurblutplasma verbesserte die Hippocampus-abhängige Kognition bei gealterten Mäusen [5, 8]. Die Injektion von Plasma, das frei von zellulären Komponenten ist, minimierte das Risiko einer Immunabstoßung aufgrund von Spezies-Mismatch. Alte Mäuse (Anfangsalter 18 Monate alt) wurden randomisiert und erhielten entweder Plasma (eine Behandlungsgruppe) oder Kochsalzlösungspuffer (eine Scheingruppe) über Schwanz-Venen-Injektion (130 &mgr;l; Einzelheiten siehe Abb. S1). Als positive Kontrolle wurden junge Mäuse (3 Monate alt) verwendet. Aus Nabelschnurblut stammendes Plasma wurde nicht gepoolt und jede Maus wurde wiederholt mit Plasma desselben Spenders infundiert (Abb. S1). Nach einer 4--wöchigen Behandlung wurden die Mäuse einem Verhaltenstest (dh Rotarod) unterzogen, und es wurde Blut für Analysen entnommen.

Abbildung 1. Experimentelles Design. Humanes Nabelschnurblutplasma wurde den jungen (3- Monate alten), alten (20- und 23- Monate alten) und plasmabehandelten alten Gruppen (20- und 23- Monate alt). Die drei Gruppen wurden 2-Rotarod-Versuchstests unterzogen, um die motorische Koordination und das Lernen zu messen. An Blut aus den drei Gruppen und den meisten wurde ein ungezieltes Metaboliten-Profiling durchgeführtAntialterung-relevanter Signalweg wurde durch einen bioinformatischen Ansatz bestimmt. Der Biosensor wurde entwickelt, um den wichtigsten Metaboliten des Signalwegs nachzuweisen.

Abbildung 2. Bestimmung von Metaboliten-Biomarkern im Zusammenhang mit der Behandlung mit menschlichem Nabelschnurblut-Plasma. (A) Globales Profil der Metabolitenstörung. Zeilen entsprechen Merkmalen (eine eindeutige Kombination aus m/z-Wert und Retentionszeit) von LC/MS und Spalten zu Proben. Zeilen sind hierarchisch gruppiert. (B) Score-Plot von PCA für die Dimensionsreduktion. Proben wurden gegen die Hauptkomponenten (PC) 1 und 2 aufgetragen. Werte in Klammern der Achsenlegenden sind Varianzanteile, die durch diese Komponenten erklärt werden. PC1 erklärt höchstwahrscheinlich Anti-Aging-Effekte, da die mit Plasma behandelte Gruppe der jungen Gruppe viel näher stand als der Schein-Gruppe. (C) Pathway-Anreicherungsanalyse. Metaboliten wurden identifiziert, indem die gemessenen m/z-Werte mit Molekulargewichtsinformationen abgeglichen wurden. Jeder Kreis stellt einen bestimmten gefundenen Weg dar. Für einen gegebenen Signalweg entspricht die x-Position oder -Größe des Kreises der Relativ-Zwischenzentralität (ein Maß für den Einfluss des Signalwegs) von Metaboliten und die y-Position oder -Farbe (niedrigere p-Werte für Rot und höhere für Blau) bis zu dem Ausmaß welche Stoffwechselprodukte überrepräsentiert sind. Dominante Pfade haben höhere x- und y-Werte. Dementsprechend wurde der Arachidonsäure(AA)-Metabolismus als wahrscheinlichster Erklärungsweg identifiziertAnti-Aging-Effektedes Nabelschnurblutplasmas.

Stoffwechselanalysen an Mäuseblutproben

Wir haben zuerst ein unvoreingenommenes Profil von niedermolekularen Metaboliten in Mausplasma durchgeführt. Blutproben von allen drei Mausgruppen wurden Flüssigkeitschromatographie- und Massenspektrometrie-(LC/MS)-Analysen unterzogen. Wir verarbeiteten die m/z-Daten mit MAIT (Metabolite Automatic Identification Toolkit) und identifizierten statistisch signifikante Merkmale über ANOVA (8572 eindeutige Kombinationen von m/z und Retentionszeit) (Abb. 2a). Hierarchische Clustering-Analyse (HCA) von Metaboliten zeigte zwei Schlüsselmuster: i) Metabolitenprofile unterschieden sich deutlich zwischen gealterten (nicht behandelten) und jungen Mäusen; und ii) das Profil von plasmabehandelten gealterten Mäusen war näher an dem von jungen Mäusen.

Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) zeigte inhärente Strukturen von Metabolomikdaten (Abb. 2b). Etwa 50 Prozent der Gesamtvariationen waren durch die erste (PC1) und die zweite Hauptkomponente (PC2) erklärbar. Alle drei Kohorten (dh junge, plasmabehandelte und Scheingruppen) ordneten sich an getrennten Positionen ein, was anzeigt, dass biologisch relevante Merkmale für die Unterscheidung von Gruppenklassen identifiziert wurden. Interessanterweise bewegte sich die Plasma-behandelte Altersgruppe weg von der Schein-in Richtung der jungen Gruppe. Um die Gruppentrennung zu quantifizieren, haben wir hierarchisches Clustering auf den zwei Hauptkomponenten berechnet. Im Dendrogramm waren die jungen und die mit Plasma behandelten Gruppen auf einem niedrigeren Unähnlichkeitsgrad (oder einem höheren Ähnlichkeitsgrad, 1120,9) gruppiert als die nicht behandelte Gruppe (3162,5) (Abb. S2). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass ausgewählte Merkmale (Variablen oder Zeilen in Abb. 2a) verwendet werden können, um auf Metaboliten-Biomarker zu schließen, die für Alterung und Alterung relevant sindAntialterung. Wir haben die Merkmale mit bekannten Metaboliten unter Verwendung einer öffentlich zugänglichen Datenbank annotiert [9].

Des Weiteren bewerteten wir Funktionen und Interkonnektivität der identifizierten Metaboliten unter Anwendung der KEGG-Kartierung (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) [10]. Für einen gegebenen Stoffwechselweg haben wir i) die Überrepräsentation eines Kandidaten-Metaboliten und ii) seine Bedeutung (dh Betweenness Centrality) [11] als wichtigen Zwischenknoten zwischen Paaren anderer Metaboliten gemessen (siehe Methoden für Details). Wir fanden heraus, dass der Metabolismus von Arachidonsäure (AA) der am stärksten überrepräsentierte Weg war (höchster y-Wert in Abb. 2c), und Metaboliten in diesem Weg tendierten dazu, sich an Kommunikationspfaden anzusiedeln (höhere x-Werte in Abb. 2c) und Informationsfluss regeln. Unter vielen Metaboliten im AA-Metabolismus haben wir AA selbst als Biomarker ausgewählt; als Einstieg in den Stoffwechselweg kann AA allein repräsentativ für andere gestörte Metaboliten sein.

Kompetitiver magneto-elektrochemischer Sensor (cMES) für den AA-Nachweis in Plasma

Als nächstes machten wir uns daran, ein schnelles Vor-Ort-Testsystem für den AA-Nachweis voranzutreiben. Wir entschieden uns für die magneto-elektrochemische Sensortechnologie [12–17]. Es kombiniert Target-Anreicherung und -Detektion in einer einzigen Plattform: Magnetic Beads (MBs) werden verwendet, um molekulare Targets einzufangen und zu markieren, und Bead-gebundene Targets werden durch elektrochemische Sensorik detektiert. Dieser Ansatz hat viele praktische Vorteile: i) native Proben (Plasma oder Blut) können direkt verwendet werden, ohne dass eine Probenreinigung erforderlich ist; ii) der Assay erreicht eine hohe Nachweisempfindlichkeit durch magnetische Anreicherung und enzymatische Signalverstärkung; iii) Basierend auf dem elektrischen Detektionsschema können Sensoren leicht als tragbares Gerät miniaturisiert werden (Abb. 3a).

Der Nachweis von AA durch die magneto-elektrochemische Sensorik war jedoch eine technische Herausforderung; Da AA ein kleines Molekül ist (~304,5 Da), waren Immunoassays unter Verwendung eines Paares von AA-Antikörpern schwierig anzuwenden. Wir untersuchten daher ein kompetitives Assayformat (cMES; kompetitiver magnetoelektrochemischer Sensor), das nur einen einzigen AA-Antikörper benötigte (Abb. 3b). Für die Zielerfassung haben wir MBs mit AA-Antikörpern (MBAb) beschichtet. Wir stellten auch ein konkurrierendes Mittel (AA-HRP) her, indem wir AA mit einem oxidierenden Enzym (Meerrettichperoxidase, HRP) konjugierten. Insbesondere verwendeten wir eine Haptenform; An Rinderserumalbumin (BSA) konjugiertes AA und weiter HRP an den BSA-Träger konjugiert (Fig. S3). Für den cMES-Assay wurden Blutproben mit MBAb und AA-HRP gemischt. Die Menge an AA-HRP war ausreichend, um die AA-Bindungsstellen in MBAb (Methoden) zu sättigen. Dies würde abhängig von den endogenen AA-Mengen in Proben zu einer unterschiedlichen HRP-Beladung auf MBs führen. Die sequentielle Zugabe eines chromogenen Elektronenmediators (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, TMB) erzeugte einen elektrischen Strom, der von einer planaren Elektrode ausgelesen wurde. Die Reaktionszeit für die AA-Erfassung und die TMB-Inkubation wurde optimiert, um das Signalniveau zu maximieren (Abb. S4).

Abbildung 3. Kompetitiver magneto-elektrochemischer Sensor (cMES) für AA-Assays. (A) Geräteschema. Das cMES-Gerät hat einen geringen Platzbedarf und leistet sich

Betrieb vor Ort. (B) Wir haben einen kompetitiven elektrochemischen Assay für den AA-Nachweis entwickelt. Magnetbeads (MBAb) wurden mit Antikörpern gegen AA konjugiert.

Kontrollproben enthielten nur AA-HRP und wurden mit magnetischen Kügelchen gemischt. Testproben wurden mit Magnetkügelchen und AA-HRP gemischt. (C) Elektrische Ströme

gemessen durch den tragbaren cMES-Leser. Im cMES-Assay nimmt die Stromstärke mit zunehmender AA-Konzentration ab [AA]. Das Signal von der Steuerung

Probe legt die Grundlinie für [AA]=0 ng/mL fest. Die Stromdifferenz (∆I) zwischen der Kontroll- und der Zielplasmaprobe wurde als analytische Metrik verwendet. (D)

Bekannte Mengen an AA wurden in Serum versetzt und durch das cMES gemessen. Die Nachweisgrenze lag bei ~ 126 ng/mL. (E) cMES und ELISA wurden verglichen

Konkordanz. Die Ergebnisse beider Modalitäten zeigten eine gute Übereinstimmung (R2=0.959). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM aus Dreifachmessungen angezeigt.

Abbildung 4. AA-Messungen in Plasmaproben. (A) Zeitverlaufsanalyse des Maus-AA-Spiegels nach Plasmainjektion. Wir injizierten Mäusen (n=6) 13 {{10}} μl Plasma (AA-Konzentration=7,2 µg/ml) und sammelten Mäuseblut nach 3, 7 und 14 Tage. Die AA-Spiegel im Blut der Mäuse wurden dann überwacht. Die AA-Spiegel stiegen am Tag 3 signifikant an und kehrten nach 7 Tagen auf das normale Niveau zurück. *p < 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001.="" (b)="" plasmaproben="" von="" mäusen="" wurden="" getestet.="" in="" der="" kontrollgruppe="" (n="5)" hatten="" junge="" mäuse="" (im="" alter="" von="" 5="" und="" 8="" monaten)="" höhere="" aa-spiegel="" als="" scheinbehandelte="" alte="" mäuse="" (im="" alter="" von="" 20="" und="" 23="" monaten;="" n="8)." bei="" der="" mit="" plasma="" behandelten="" gruppe="" (n="5)" wurde="" ein="" anhaltender="" anstieg="" der="" aa="" beobachtet.="" *="" p="">< 0,05;="" **="" p="">< 0,01;="" ***="" p="">< 0,001.="" (c)="" plasmaproben="" aus="" denselben="" kohorten="" wie="" in="" (b)="" wurden="" durch="" massenspektrometrie="" analysiert.="" die="" aa-spiegel="" zeigten="" einen="" ähnlichen="" trend,="" wie="" durch="" cmes="" gemessen.="" *="" p="">< 0,05;="" **="" p="">< 0,01;="" ***="" p="">< 0,001.="" die="" daten="" werden="" als="" mittelwert="" ±="" sem="">

Als Ergebnis des kompetitiven Assays nahm die Größe des elektrischen Stroms mit höheren AA-Plasmakonzentrationen ([AA]) ab. Wir haben daher eine Kontrollprobe hergestellt, indem wir MBAb nur mit AA-HRP inkubiert haben. Die Kontrollprobe wurde verwendet, um die obere Grundlinie (dh [AA]=0 ng/ml) für die Berechnung der Signalunterschiede festzulegen; elektrische Ströme von Kontroll- und Plasmaprobe wurden gemessen und die Nettodifferenz |ΔI |=|Icontrol - Iplasma|erhalten wurde (Abb. 3c). Eine solche

Differenzmessungen kompensierten auch das gemeinsame Hintergrundsignal.

Das Titrationsexperiment (Abb. 3d) mit Proben, die mit unterschiedlichen Mengen an AA versetzt waren, ergab eine Nachweisgrenze (LOD) von ~ 125,9 ng / ml. Die LOD des Assays war ~300--mal niedriger als die typische AA-Konzentration von (38 µg/ml) im Plasma junger Mäuse (5 Monate, n=2). Basierend auf diesen Ergebnissen verdünnten wir die anfänglichen Plasmaproben (100--fach) durch Zugabe einer Pufferlösung (siehe Methoden). Das Signal von unspezifischer Bindung lag nahe an einem intrinsischen Hintergrundniveau (~43 nA), was möglicherweise von dem hohen Verdünnungsfaktor profitiert. Wir haben auch bestätigt, dass die Assay-Ergebnisse mit denen des konventionellen ELISA übereinstimmten (R2=0.961, Abb. 3e). Der cMES-Assay war jedoch schneller (1 Stunde) als ELISA (4 Stunden), hauptsächlich aufgrund der schnellen Bindungskinetik; im cMES fangen MBs AA im gesamten Probenvolumen ein (3-dimensionale Diffusion), während die AA-Erfassung im plattenbasierten ELISA auf 1-dimensionaler Diffusion beruht.

AA-Überwachung bei plasmabehandelten Mäusen

Wir haben cMES angewendet, um die AA-Spiegel in Mäusen nach einer einzigen Plasmabehandlung zu analysieren. Da AA natürlicherweise in menschlichem Nabelschnurblut vorhanden ist, würde eine Plasmainjektion die AA-Spiegel der Maus zusätzlich erhöhen. Die durchschnittliche AA-Konzentration von sechs verschiedenen Plasmaproben aus menschlichem Nabelschnurblut betrug 7,2 ± 0,5 µg/ml (Mittelwert ± SEM). Wir injizierten Mäusen (n=6) 13 0 µl menschliches Nabelschnurblutplasma und überwachten ihre AA-Spiegel (Abb. 4a). Die Plasmainjektion erhöhte sofort die AA-Spiegel im Blut (Tag 3; p < 0,01,="" verglichen="" mit="" allen="" anderen="" zeitpunkten),="" aber="" die="" wirkung="" war="" vorübergehend;="" 7="" tage="" nach="" der="" behandlung="" normalisierten="" sich="" die="" aa-spiegel="" (p="0" 0,34,="" verglichen="" mit="" dem="" zeitpunkt="" vor="" der="">

Als nächstes überwachen wir die Plasma-AA-Spiegel nach dem vollständigen Behandlungsplan (Abb. S1). Es wurden drei verschiedene Mauskohorten verwendet: eine plasmabehandelte (n=8) und eine scheinbehandelte (n=8) Altersgruppe (20-23 Monate alt) und eine junge Kontrollgruppe (<8 months="" old,="" n="5)." we="" used="" 0.5="" µl="" of="" mouse="" plasma="" for="" each="" measurement.="" the="" sham="" group="" showed="" lower="" aa="" level="" compared="" to="" the="" young="" group="" (p="0.003," fig.="" 4b).="" the="" plasma="" treated="" group,="" however,="" showed="" increased="" aa="" levels="" even="" after="" 1="" month="" after="" the="" treatment.="" the="" effect="" was="" sustained="" up="" to="" 4="" months="" post="" treatment;="" the="" plasma-treated="" group="" had="" higher="" aa="" level="" than="" the="" sham="" group="" (p="0.0003)." we="" also="" analyzed="" aliquots="" of="" samples="" via="" lc/ms="" (fig.="" 4c).="" the="" results="" from="" both="" assays="" were="" concordant,="" corroborating="" aa's="" value="" as="" a="">

Plasmabehandlung, die zu einer kognitiven und Verhaltensverbesserung bei gealterten Mäusen führt

Wir haben ferner Verhaltensphänotypen von Tierkohorten bewertet, insbesondere ihre motorischen Lern- und Gedächtnisfunktionen bewertet. Wir führten 1 und 4 Monate nach der Plasma- oder Scheinbehandlung {{0}} Rotarod-Versuchstests durch (Abb. 5a); Die Latenz (Laufzeit) einer Maus, bevor sie auf einen rotierenden Stab fiel, wurde verwendet, um die motorische Leistung des Tieres zu beurteilen. 1 Monat nach der Behandlung (20- Monate alt) war die Latenz sowohl der Schein- als auch der Plasma-behandelten Gruppe signifikant niedriger (p < 0,0001)="" als="" die="" der="" jungen="" (5-="" monate="" alten="" )-gruppe="" (abb.="" 5b).="" die="" plasmabehandelte="" gruppe="" zeigte="" jedoch="" eine="" allmähliche="" verbesserung="" des="" motorischen="" lernens="" und="" des="" gedächtnisses,="" während="" die="" gleiche="" fähigkeit="" in="" der="" scheingruppe="" abnahm.="" veränderungen="" der="" aa-spiegel="" gingen="" mit="" verhaltensänderungen="" einher,="" die="" als="" frühindikator="" dienen="">AntialterungBehandlungseffekt (Abb. 5c).

Gehirngewebeanalysen (Fig. 5d, 5e) zeigten, dass ältere Mäuse (die Scheingruppe) eine kleinere Fläche von DCX-positiven Zellen in der subventrikulären Zone hatten als junge Mäuse. Umgekehrt nahm die Fläche der DCX-positiven Zellen in dem mit Plasma behandelten Tier zu und blieb unverändert (p=0,04), was anzeigt, dass injiziertes Nabelschnurblutplasma die Neurogenese des alten Gehirns stimulierte. Die Ergebnisse deuten auf den potenziellen Nutzen einer Plasmabehandlung für eine anhaltende Neurogenese hin, was zu einer verbesserten motorischen Funktion in der behandelten Gruppe führte.

Diskussion

Fortschritte bei Verjüngungstherapien erhöhen gleichzeitig den Bedarf an einem objektiven und quantitativen Maß, um die Wirksamkeit der Behandlung abzulesen. Wir haben unsere Studie daher darauf ausgelegt, molekulare Biomarker zu identifizieren, die die phänotypischen Merkmale des Alterns am besten erklären könnenAntialterungBehandlung. Unsere Tierexperimente führten zu folgenden Beobachtungen: i) Metabolitenprofile von jungen und erwachsenen Mauskohorten sind offensichtlich unterschiedlich; und ii) die Injektion von menschlichem Nabelschnurplasma in gealterte Mäuse verändert ihre Metabolitenmuster näher an die von jungen Mäusen. Interessanterweise fanden wir Arachidonsäure (AA) als den wirksamsten Ersatz-Biomarker fürAntialterungBehandlung; Der AA-Stoffwechsel war sowohl bei jungen als auch bei plasmabehandelten Mäusen stark unreguliert und es wurde festgestellt, dass er eine Schlüsselrolle bei der Wechselwirkung mit anderen Stoffwechselwegen wie dem Linolsäurestoffwechsel spielt [10, 18].

Wir haben ein schnelles, tragbares Sensorsystem (cMES) weiterentwickelt, um den AA-Nachweis in der Routineforschung und im klinischen Umfeld zu erleichtern. Wir haben speziell ein kompetitives Assay-Schema mit immunomagnetischer Anreicherung integriert, um kleine molekulare Ziele (dh Metaboliten) direkt aus Plasmaproben nachzuweisen. Diese Kombination bringt die folgenden Vorteile mit sich. (i) Der Assay profitiert von einer schnellen Bindungskinetik, da Magnetperlen AA im gesamten Probenvolumen einfangen (3-dimensionale Diffusion). (ii) Assay-Prozesse (z. B. Waschschritte) werden mit externen Magneten vereinfacht, die zum Sammeln der Kügelchen verwendet werden. (iii) Durch magnetische Konzentration von AA-gebundenen Kügelchen in der Nähe der Detektionselektrode kann das analytische Gesamtsignal verbessert werden (~72 Prozent) [12]. Tatsächlich haben wir gezeigt, dass der cMES-Assay verwendet<1 µl="" of="" plasma="" with="" the="" total="" assay="" time="" within="" 1.5="" hour.="" both="" cmes="" and="" mass="" spectrometry="" consistently="" showed="" that="" plasma="" aa="" levels="" decrease="" with="" aging,="" but="" that="" they="" reversely="" increase="" with="" cord-plasma="" treatment.="" importantly,="" increases="" in="" aa="" levels="" could="" be="" an="" early="" indicator="" of="" improved="" cognitive="" functions="" in="" treated="" animals.="" these="" results="" highlight="" the="" utility="" of="" aa-cmes;="" with="" minimally="" invasive="" blood="" draw,="" individual="" patients="" can="" be="" monitored="" in="" a="" serial="" fashion="" to="" better="" assess="" treatment="">

Abbildung 5. Verhaltens- und molekulare Assays. (A) 2- Rotarod-Studientests wurden 1 und 4 Monate nach der Plasmainjektion durchgeführt. (B) Die plasmabehandelte Gruppe

zeigte eine fortschreitende Verbesserung der motorischen Koordination; Die Leistung war am Ende nahe der der jungen Gruppe (der zweite Versuch mit 3 Monaten). Die Laufzeit der Scheingruppe nahm mit zunehmendem Alter ab. *p < 0.05;="" **p="">< 0.01.="" (c)="" bei="" der="" mit="" plasma="" behandelten="" gruppe="" ging="" der="" anstieg="" der="" aa-spiegel="" der="" verbesserung="" der="" motorischen="" funktion="" voraus.="" *p="">< 0.05;="" **="" p="">< 0,01;="" ***="" p="">< 0,001.="" (d)="" gehirnzellen="" in="" der="" subventrikulären="" zone="" wurden="" für="" einen="" neurogenesemarker,="" doublecortin="" (dcx),="">

Maßstabsbalken ist 50 µm. Beachten Sie, dass die Scheingruppe eine signifikant kleinere Fläche von DCX-positiven Zellen in der subventrikulären Zone aufwies als junge Mäuse, wohingegen die Fläche bei dem mit Plasma behandelten Tier zunahm und unverändert blieb. (E) Die Fläche der DCX-positiven Zellen in Bild (D) wurde gemessen. *p < 0.05;="" ***="" p=""><>

Es wurde gezeigt, dass AA das Muskelwachstum und die Gehirnentwicklung fördert [19, 20]. Andere Berichte hoben auch die potenziellen Vorteile von AA hervorAntialterung[21, 22]. Die aktuelle Studie stimmt mit diesen Ergebnissen überein, ihr Umfang war jedoch darauf beschränkt, eine korrelative Beziehung zwischen AA-Niveaus und herzustellenAntialterungPhänotypen. Eine serielle AA-Überwachung zeigte jedoch, dass AA-Erhöhungen bei mit Plasma behandelten Mäusen wahrscheinlich aus endogenen Quellen stammten, nicht aus transfundiertem Plasma. Darüber hinaus nachhaltigAntialterungWirkungen wurden bei Empfängermäusen sogar 4 Monate nach dem Ende der Plasmabehandlung beobachtet. Das motorische Lernen und die Gedächtnisfunktionen verbesserten sich; und die Zahl der neuronalen Vorläuferzellen im Gehirn stieg an. Diese Beobachtungen legen stark physiologische Veränderungen bei plasmabehandelten Mäusen nahe; der genaue Mechanismus muss noch aufgeklärt werden.

Mehrere andere Einschränkungen dieser Studie sollten in zukünftigen Forschungsarbeiten angegangen werden. Zunächst muss der cMES-Assay für eine höhere Genauigkeit verfeinert werden. Insbesondere aufgrund des Mangels an echten negativen Proben (dh Blutproben ohne endogenes AA) war es schwierig, Signale von unspezifischer Bindung zu berücksichtigen. Es ist denkbar, dass die Wirkung von Blutmatrizen vernachlässigbar ist, da wir die Proben 100--fach verdünnt haben. Eine solche Annahme soll jedoch validiert werden, indem AA-deletierte Plasmaproben verwendet werden, die aus einem AA-defizienten Mausmodell [23] oder durch Immundepletion von AA hergestellt werden könnten. Zweitens konzentrierten wir uns der Einfachheit halber auf den Nachweis eines einzelnen Metaboliten im AA-Metabolismus, aber dieser Ansatz kann den biologischen Kontext wie Wechselwirkungen zwischen Metaboliten in einem bestimmten Weg ignorieren. Das Einbeziehen einer Reihe von Metaboliten würde Stoffwechselstörungen besser erfassen und auch die diagnostische Genauigkeit erhöhen. cMES kann einfach skaliert werden, um verschiedene Marker zu erkennen und dabei kleine Probenmengen zu verbrauchen. Drittens wäre es eine Herausforderung, aktuelle Erkenntnisse auf den Menschen zu übertragen. Obwohl Mäuse und Menschen ähnliche Stoffwechselwege haben, haben Mäuse eine 7--fach höhere Stoffwechselrate als Menschen [24]. Versuche am Menschen sind notwendig, um optimale Plasmadosen für die Infusion zu bestimmen und Ausgangswerte für Biomarker festzulegen; informiert durch Tierversuche, planen wir solche Studien am Menschen. Diese Bemühungen werden die Entwicklung von beschleunigenAntialterungTherapien, die Verbesserung der individuellen Lebensqualität sowie die Verringerung gesellschaftlicher Belastungen.

Methoden

Experimentelles Design

Das Plasma wurde aus menschlichem Nabelschnurblut abgetrennt, das bei der Entbindung entnommen wurde. Das Nabelschnurblutplasma wurde alten Mäusen (18- Monate alt) und Scheinkontrollmäusen (18- Monate alt) und jungen Mäusen (3- Monate alt als positiv) durch intravenöse Infusion verabreicht Kontrolle) wurde Kochsalzlösung injiziert. 1 und 4 Monate nach der Transplantation wurden 2- Versuchs-Rotarod-Tests durchgeführt, um die motorische Koordination und das Langzeitgedächtnis zu beurteilen (Abb. S1). Die Profilierung der ungezielten Metaboliten wurde am Blut der drei Gruppen durchgeführt und durch bioinformatische Analysen bestimmtAntialterungrelevanten Stoffwechselweg (Arachidonsäurestoffwechsel). Der Biosensor wurde entwickelt, um im Blut zirkulierende Arachidonsäure einfach und effizient nachzuweisen.

Vorbereitung der Nabelschnurblutprobe

Menschliches Nabelschnurblut wurde vom Institutional Review Board des CHA General Hospital (Seoul, Korea, IRB Nr. CHAMC-2015- 08-130-009) gesammelt. Menschliches Nabelschnurblut wurde von 4 Spendern gespendet und mit Citrat-Phosphat-Dextrose mit Adenin (CPDA-1) Antikoagulans behandelt. Menschliches Nabelschnurblutplasma wurde durch 15-minütige Zentrifugation bei 2,000 g bei Raumtemperatur isoliert. Isolierte Plasmaproben wurden bei -80 Grad gelagert und mit einem einzigen Gefrier-Tau-Zyklus bei Raumtemperatur verwendet.

Tierversuche

Tierprotokolle wurden vom CHA University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Wir haben 18- Monate alte weibliche C57BL/6-Mäuse verwendet, um metabolische Störungen und Verhaltensphänotypen zu bewerten, die mit Alterung und Alterung korrelierenAntialterung. Die positiven Kontrollen waren 3- Monate alte weibliche C57BL/6-Mäuse. Alle Mäuse wurden bei Raumtemperatur in einem standardmäßigen 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus gezüchtet. Den erwachsenen Mäusen wurde Nabelschnurblutplasma oder Kochsalzlösung (130 &mgr;l) 12 Mal für 4 Wochen intravenös injiziert. Isoliertes menschliches Nabelschnurblutplasma wurde nicht gepoolt, und ein bestimmtes Tier erhielt Nabelschnurblutplasma von demselben Spender. Die Anzahl der in jedem Experiment verwendeten Tiere ist in den entsprechenden Methodenabschnitten beschrieben. Plasma wurde durch Zentrifugation gesammelt (3,000 g, 15 min bei Raumtemperatur).

Metabolitenerfassung und Datenanalyse

Für die Profilerstellung von durch Blut übertragenen Metaboliten wurde den Mäusen zu den festgelegten Zeitpunkten Blut durch Herzpunktion entnommen: die junge Gruppe (3- Monate alt, n=10), die Scheingruppe ({{ 4}} Monate alt, n=10; 23- Monate alt, n=12), die plasmabehandelte Gruppe (20- Monate alt, n {{13 }}; 23- Monate alt, n=5). Die Blutproben wurden unter Verwendung eines Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie(LC-MS)-Systems (Agilent) analysiert. Wir konvertierten LC/MS-Dateien in ein Standard-mzXML-Format (ProteoWizard) [25] und verarbeiteten sie dann mit MAIT (Metabolite Automatic Identification Toolkit) [26] zur Merkmalserkennung, statistischen Analyse und Metabolitenidentifikation. Statistisch signifikante Merkmale (dh ionisierte und/oder fragmentierte Metaboliten) wurden mittels Varianzanalyse (ANOVA) identifiziert. Diese Merkmale wurden basierend auf dem Masse/Ladungs-Verhältnis des Massenspektralions (m/z-Toleranz von 0.005) allen möglichen mutmaßlichen Metaboliten in der Metabolom-Datenbank [9] zugeordnet. Wir haben globale Metabolitenveränderungen durch hierarchische Clustering-Analyse und die inhärenten Strukturen von Metabolomikdaten durch Hauptkomponentenanalyse (PCA) charakterisiert. Zwei oder drei technische Wiederholungen (wodurch sichergestellt wird, dass die technische Variation viel kleiner als die biologische Variation ist) pro Maus wurden in das unüberwachte Lernen wie PCA und hierarchisches Clustering einbezogen. Hierarchisches Clustering auf Hauptkomponenten (HCPC) wurde von FactoMineR, einem R-Paket, durchgeführt [27]. Für eine funktionelle Analyse wurden mittels KEGG Pathway Analysis (MetaboAnalyst 3.0) die wahrscheinlichsten Stoffwechselwege ermittelt, die durch Alterung und Plasmabehandlung gestört werden [28]. Die hypergeometrische Verteilung wurde verwendet, um die Überrepräsentation der übereinstimmenden Metaboliten in spezifischen KEGG-Wegen zu messen.

Herstellung von immunomagnetischen Kügelchen

Mit Epoxygruppen beschichtete Magnetperlen (5 mg) (Dynabeads M-270 Epoxy, Invitrogen) wurden in 100 ul 0,1 M Natriumphosphatlösung suspendiert. Einhundert Mikrogramm Antikörper gegen Arachidonsäure (Biomatik) wurden zugegeben und gründlich gemischt. Einhundert Mikroliter 3 M Ammoniumsulfatlösung wurden zugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert und dann weiter bei 4 Grad über Nacht mit langsamer Kippdrehung inkubiert. Die Konjugationsreaktion wurde bei pH=7,4 durchgeführt. Diese Prozesse induzieren die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen Epoxy- (Kügelchen) und Amin- (Antikörper-) Gruppen, was wir zuvor bestätigt haben, indem wir Antikörper-Kügelchen-Konjugate pH-Herausforderungen unterzogen haben [29]. Im Durchschnitt wurden 2,4 × 104 Antikörper pro Bead immobilisiert. Antikörper-konjugierte magnetische Kügelchen wurden mit einem Permanentmagneten abgetrennt, zweimal mit PBS-Lösung gewaschen und in 200 &mgr;l PBS mit 1 Prozent BSA resuspendiert. Die Perlen wurden bei 4 Grad bis zu einem Monat gelagert.

HRP-Konjugation an Arachidonsäure

HRP wurde dann über reduktive Aminierungschemie an BSA konjugiert. Insbesondere wurden 1 00 µg BSA-konjugierte AA (RPU51089, Biomatik) in 0,5 ml 0,2 M Carbonat-Biocarbonat-Puffer (pH 9,4) gelöst und zu einem Milligramm lyophilisiertem EZ-Link gegeben Plus aktivierter Peroxidase (Thermo Scientific) und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Als nächstes wurden 10 &mgr;l Natriumcyanoborhydrid (Thermo Scientific) zugegeben und die Mischung 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurden 20 &mgr;l Quenching-Puffer (Thermo Scientific) zugegeben, gefolgt von 15-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur. Gelelektrophorese und Proteinbandanalyse bestätigten die HPR-Konjugation an BSA-AA (Abb. S3a). HRP-konjugierte AA wurden gesammelt und mit Amicon Ultra 100K Zentrifugalfilter (Millipore) konzentriert. Verbleibende Peroxidase und BSA-AA wurden viermal mit PBS ausgewaschen.

Elektrochemischer Nachweis von AA in Plasmaproben

Für den elektrochemischen Nachweis von AA wurde den jungen (n {0}}), scheinbehandelten (n=8) und plasmabehandelten Gruppen (n=5 für 1 Monat) Blut entnommen und n=5 für 3 Monate). Maus-Plasmaproben (0,5 µl) wurden in 50 µl 1 % BSA in PBS (×100--fache Verdünnung) verdünnt und mit immunomagnetischer Bead-Lösung (50 µl) und HRP-konjugierter AA-Lösung gemischt (50 ul). Die Menge an AA-HRP war groß genug, um die Bindungsstellen in Magnetkügelchen zu sättigen. Wir verwendeten etwa 8,4 × 10 7 Kügelchen pro Test, was 2,0 × 10 12 AA-Bindungsstellen verfügbar machte. Die Menge an AA-HRP betrug ~1,7 × 1013; das Verhältnis zwischen AA-HRP und Bindungsstellen war ~8:1. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang unter langsamer Tilt-Rotation inkubiert. Die Kontrollperle wurde durch Mischen von 1 Prozent BSA in PBS (50 &mgr;l) mit immunomagnetischer Perlenlösung (50 &mgr;l) und HRP-konjugierter AA-Lösung (50 &mgr;l) hergestellt. Alle reagierten Kügelchen wurden mit einem Permanentmagneten getrennt und zweimal mit 80 &mgr;l PBS (1 Prozent BSA) gewaschen. Schließlich wurden die Kügelchen in 7 &mgr;l PBS resuspendiert. Die vorbereitete Kügelchenlösung und 20 &mgr;l TMB-Lösung (Biomatik) wurden oben auf die Elektrode geladen. Nach 6 min wurde die Chronoamperometrie-Messung gestartet. Wir verwendeten einen miniaturisierten elektrochemischen Sensor (ein von AcurreHealth Inc. entwickeltes Prototypsystem). Die Strompegel im Bereich von 40-45 s wurden gemittelt. Wir verwendeten den Umrechnungsfaktor (×100), um die geschätzten ursprünglichen AA-Konzentrationen im Plasma anzugeben.

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

ELISA-Experimente wurden unter Verwendung des ELISA-Kits für Maus-Arachidonsäure (AA) (Biomatik) gemäß den Herstellungsrichtlinien durchgeführt. Reihenverdünnte AA wurden in jede Vertiefung gegeben und mit HRP-konjugierter AA bei 37 Grad für 40 min inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit Waschpuffer wurde TMB-Lösung zugegeben und 20 min inkubiert. Die Farbentwicklung wurde durch Zugabe von Stopplösung gestoppt. Die Extinktion wurde bei 450 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (Tecan) abgelesen.

Rotarod-Test

Wir modifizierten den Rotarod-Test von Kong et al. [30] zur Beurteilung der Bewegungskoordination. Das Rotarod mit einer Stange mit einem Durchmesser von 3- cm startete mit 4 U/min und beschleunigte 5 min lang um 4 U/min pro 30 Sekunden. Die Mäuse wurden auf den Stab gesetzt und die Zeit, die die Mäuse brauchten, um vom Stab zu fallen, wurde gemessen. Jede Maus erhielt 3 Versuche pro Tag, und die Laufzeiten jedes Tages wurden als Durchschnitt der Trainingszeiten berechnet. Der erste Rotarod-Test wurde 1- Monat nach der Plasmabehandlung durchgeführt: die junge Gruppe (n=29), die Scheingruppe (n=17), die mit Plasma behandelte Gruppe (n {{ 11}}). Eine Umschulungssitzung wurde 4- Monate nach der Plasmabehandlung begonnen. Um ein Übertraining zu vermeiden, wurde ein Nachtraining für 2 Tage durchgeführt. Das andere Verfahren war das gleiche wie in der ersten Sitzung.

Bildgebung des Gehirngewebes

1 Monat (n=4) und 4 Monate (n=3) nach der Injektion von menschlichem Nabelschnurblutplasma oder Kochsalzinjektion wurden die Tiere eingeschläfert und dann mit 4 Prozent Paraformaldehyd (PFA) und PBS perfundiert linke Ventrikel. Als Kontrollen dienten die Jung- (n=5) und Scheingruppen (n=4). Ihre Gehirne waren

extrahiert und kryogeschützt. Jedes Gehirn wurde auf einem Kryotom mit einer Dicke von 30 &mgr;m geschnitten. Zu

Durchführen der Immunhistochemie, unspezifische Bindung wurde mit 5 % normalem Ziegenserum in 0,3 % Triton X-100 für 40 min blockiert. Primärer Antikörper gegen Doublecortin (DCX; 1:400, Cell Signaling, #4604S) wurde über Nacht bei 4 Grad aufgetragen, und dann wurde PBS zum Waschen verwendet [31]. Sekundärantikörper Alexa Fluor 488 (1:2000, Invitrogen, #A11008) wurde zum Nachweis von DCX verwendet. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon Eclipse 80i) aufgenommen und mit Image J [32] analysiert.

statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde unter Verwendung von R-Basisfunktionen und lme4, einem R-Paket für Linear, durchgeführt

Modelle mit gemischten Effekten oder verallgemeinertes lineares Modell

(GLM) gefolgt von einem LSD-Post-hoc-Test [33]. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt und ein p-Wert von < 0,05="" wurde="" als="" signifikant="">

Ergänzungsmaterial

Ergänzende Zahlen.

http://www.thno.org/v09p0001s1.pdf

Danksagungen

Wir danken AccureHealth Inc. für die Bereitstellung des miniaturisierten elektrochemischen Sensors. Diese Studie wurde teilweise durch ein Stipendium des Institute for Information and Communications Technology Promotion (IITP) unterstützt, das von der koreanischen Regierung (MSIT) finanziert wurde (2017M3A9B4025699).

Konkurrierende Interessen

Die Autoren haben erklärt, dass kein Interessenkonflikt besteht.