Biomonitoring von Mykotoxinen im Plasma von Patienten mit Alzheimer- und Parkinson-KrankheitⅡ

2. Ergebnisse und Diskussion

2.1. LC-MS/MS-Analyse

Aufgrund ihrer unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften wurden Mykotoxine für die chromatographische Trennung in zwei Gruppen eingeteilt (siehe Abschnitt Material und Methoden). Die folgenden Abbildungen (Abbildungen 1–4) zeigen überlagerte extrahierte Chromatogramme von Mykotoxinen in Kalibratoren und einer Plasmaprobe (kodiert als Proben 1–4) vor und nach der enzymatischen Behandlung. Wie man sehen kann, erscheint OTA in Proben vor und nach der enzymatischen Behandlung (Abbildung 1; Abbildung 3); wohingegen STER erst nach enzymatischer Behandlung auftritt (Abbildung 3). Keines der anderen analysierten Mykotoxine wurde in den Plasmaproben nachgewiesen.

Jede der bei der Mykotoxinquantifizierung verwendeten Kalibrierungskurven erfüllte die zuvor bei der Methodenvalidierung definierten Kriterien. Beispiele der erhaltenen Kalibrierungskurven für jedes Mykotoxin sind in den Tabellen S1 und S2 aufgeführt. Die Identität der Verbindungen wurde ebenfalls bewertet: Qualifizierungs- (q) und Quantifizierungsübergänge (Q) für jedes nachgewiesene Mykotoxin wurden bei jedem der Individuen und positiven Proben beobachtet und der erhaltene relative Fehler (RE) zwischen den q/Q-Verhältniswerten für Jedes Mykotoxin in Kalibratoren und Proben betrug weniger als 20 Prozent [32]. Darüber hinaus unterschieden sich die Retentionszeiten bei Proben und Kalibratoren nicht um mehr als 2,5 Prozent [33] (1,3 Prozent für OTA vor und 1,6 Prozent nach der enzymatischen Behandlung; 0,3 Prozent für OTB und 1,8 Prozent für STER).

2.2. Plasmaproben

Insgesamt 93 Probanden, darunter 25 gesunde Kontrollpersonen (CNT) und 68 Patienten, wurden aus dem neurologischen Dienst des San Pedro Krankenhauses in La Rioja (Spanien) rekrutiert. Kontrollspender waren nicht verwandte Begleiter der Patienten ohne offensichtliche oder diagnostizierte neurologische Erkrankungen. Die Patienten wurden nach Pathologien eingeteilt: 44 Patienten mit PD und 24 mit AD.

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Die Diagnose und der Krankheitsverlauf der rekrutierten Patienten wurden von erfahrenen Neurologen gemäß der Hoehn- und Yahr-Skala (HY) für PD (Tabelle S3) und der Global Deterioration Scale (GDS) für AD (Tabelle S4) durchgeführt. Alle AD-Patienten zeigten bereits klinische Anzeichen eines leichten kognitiven Rückgangs oder einer Demenz (von 3 bis 7, GDS-Skala). Die PD-Patienten wurden in zwei Gruppen eingeteilt, da der Krankheitsverlauf bei den Patienten unterschiedlich war: Einzelne zeigten keine beeinträchtigten Haltungsreflexe (1 und 2, HY-Skala) und andere zeigten bereits beeinträchtigte Haltungsreflexe (von 2,5 bis 3, HY-Skala).

Aufgrund der geringen Probenanzahl wurde die statistische Analyse der Parkinson-Patienten jedoch als einzelne Gruppe durchgeführt. Die Anzahl der für jede Gruppe und Untergruppe eingeschriebenen Probanden wird zusammen mit Geschlecht, Altersgruppe und Krankheitsverlauf in Tabelle 1 angegeben. Vollständige individuelle Informationen zu den für die Studie rekrutierten Probanden finden Sie in den ergänzenden Materialien (Tabellen S5 und S5). S6).

2.3. Vorhandensein von Mykotoxinen

Von den 19 untersuchten Mykotoxinen wurden in den Proben nur OTA, OTB und STER nachgewiesen. OTA war vor und nach der Behandlung mit der Mischung aus Glucuronidase/Arylsulfatase vorhanden, während OTB nur vor und STER erst nach der enzymatischen Behandlung nachweisbar war. Es ist zu beachten, dass aufgrund des begrenzten Volumens einiger Proben die Auswertung nach enzymatischer Behandlung nur für 74 der 93 gesammelten Proben möglich war.

Die für OTA, OTB und STER erhaltenen Analyseergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Aufgrund der Bestätigung der Identifizierungskriterien (q und Q-Übergänge sollten vorhanden sein und mit den Kalibratoren RE für beide verglichen werden, q/Q-Verhältnis und Retentionszeit, was der Fall sein sollte < 20 Prozent bzw. 2,5 Prozent sein), wurden Proben mit Werten größer oder gleich LOD für die Datenverarbeitungsanalyse verwendet. Daher wurden die Berechnungen unter Verwendung einer Untergrenzen-Substitutionsmethode durchgeführt [34].

Only OTA (77% of the samples) and OTB (13% of the samples) were detected (>LOD) in den Proben, die vor der enzymatischen Behandlung verarbeitet wurden. Bezüglich des Vorhandenseins von OTA wurden in allen Gruppen Proben unterhalb der LOD gefunden. Der maximale OTA-Wert (8,81 ng/ml) entsprach einer 66-jährigen Frau in der Kontrollgruppe. In der Kontrollpopulation waren OTA und OTB in 92 Prozent bzw. 24 Prozent der Proben vorhanden.

Diese Ergebnisse stimmen mit einer kürzlich in Navarra, einer Nachbarregion Spaniens, durchgeführten Studie überein. In dieser Studie war OTA in 97,3 Prozent und OTB in 10 Prozent der Proben vorhanden (n=438) [35], gemessen mit der gleichen Methode wie in der aktuellen Studie [36]. In der vorliegenden Studie liegen die mittleren OTA-Werte (2,15 ng/ml) leicht unter den in Navarra gemessenen Werten (2,87 ng/ml). Die OTA-Werte lagen zwischen LOD und 8,81 ng/ml, während in den Proben aus Navarra die OTA-Konzentration zwischen LOD und 19,9 ng/ml lag (wobei eine Probe bei einer {{16}jährigen Frau 45,7 ng/ml erreichte).

Hinsichtlich des Geschlechts und auch in Übereinstimmung mit der Navarra-Studie [35] konnte beobachtet werden, dass die mittleren OTA-Werte vor der enzymatischen Behandlung in allen Gruppen bei Männern tendenziell höher waren als bei Frauen. Obwohl der Prozentsatz der OTA-positiven Proben mit früheren in Spanien durchgeführten Studien übereinstimmt, sind die mittleren und maximalen OTA-Werte in der CNT-Population der vorliegenden Studie und der aktuellen Navarra-Studie [35] höher als die früherer Studien aus Spanien .

Da diese Informationen vor 2011 erhoben wurden, untermauern unsere Daten die Notwendigkeit, die Mykotoxinspiegel in der Allgemeinbevölkerung weiterhin biologisch zu überwachen. Wie bereits beobachtet [35], war OTB in einigen wenigen Proben vorhanden und trat immer zusammen mit OTA auf (mit Ausnahme eines CNT-Mannes). Überraschenderweise wurde OTB in der AD-Gruppe nicht nachgewiesen. OTB ist das entchlorte Analogon von OTA und wurde in den bisher durchgeführten Human-Biomonitoring-Studien nicht gemessen.

OTB kann in menschlichen Proben vorhanden sein, da es bekanntermaßen in einigen Lebensmittelmatrizen wie Wein vorkommt [37], könnte aber auch ein menschlicher Metabolit von OTA sein [38]. Leider ist es in der vorliegenden Studie nicht möglich, zwischen den möglichen OTB-Quellen zu unterscheiden oder zu wissen, ob das Fehlen von OTB in der AD-Gruppe auf ein anderes Nahrungsaufnahmemuster der Patienten oder auf einen anderen Stoffwechsel zurückzuführen sein könnte Krankheit vorliegt oder auf die geringe Anzahl analysierter Proben zurückzuführen ist. Die Analyse der Daten nach der enzymatischen Behandlung ergab, dass OTA immer noch nachgewiesen wurde (89 Prozent der Proben).

Darüber hinaus trat, wie zuvor bei gesunden Spendern in Navarra beobachtet [35], in der Mehrzahl der Proben (88 Prozent) STER auf, während OTB nicht mehr nachgewiesen wurde. Beim Vergleich des Vorhandenseins von OTA vor und nach der enzymatischen Behandlung war der Prozentsatz positiver Proben vor der enzymatischen Behandlung bei CNT höher als bei Patienten; wohingegen nach der enzymatischen Behandlung das Vorhandensein von OTA bei CNT abnahm, während es bei AD- und PD-Patienten zunahm. Einige Autoren unterstützen die Hypothese, dass OTA-Konjugate während des menschlichen Stoffwechsels gebildet werden könnten [39–41].

However, more data are needed to understand and monitor the human metabolism of OTA. In this study, and again in line with the study conducted in Navarra, STER only appeared after treating the samples with β-glucuronidase/arylsulfatase and this mycotoxin was found positive (>LOD) in 88 Prozent der analysierten Proben. Diese Daten stützen die Hypothese, dass STER-Glucuronide während des menschlichen Stoffwechsels gebildet werden [35,42].

2.4. Statistische Analyse

Den Analyseergebnissen zufolge wurden die statistischen Berechnungen nur für OTA und STER durchgeführt. OTB wurde nicht in die statistische Analyse einbezogen, da nur 12 Proben (13 Prozent) größer oder gleich dem LOD waren. Die Hypothese der Normalverteilung (Shapiro-Wilk-Test) wurde abgelehnt, daher wurden für die statistische Behandlung nichtparametrische Tests verwendet, die keine Verteilungsannahme implizieren. STER wurde erst nach enzymatischer Behandlung nachgewiesen, daher wurde die statistische Analyse für STER anhand der 74 verfügbaren Ergebnisse durchgeführt, die nach enzymatischer Verdauung erhalten wurden. Andererseits standen für OTA zwei Ergebnisdatensätze zur Verfügung, der eine, der Verarbeitungsdaten vor der enzymatischen Behandlung erhielt, und der andere, der nach der enzymatischen Behandlung (dh OTA vor und nach) erhalten wurde.

Aufgrund der Unvollständigkeit des OTA nach dem Datensatz (74 Datensätze) wurde beschlossen, statistische Berechnungen durchzuführen und dabei nur den OTA vor dem Datensatz (93 Datensätze) zu berücksichtigen. Um die Entscheidung zu bestätigen, die OTA nach dem Datensatz auszuschließen, wurde ein Wilcoxon-Matched-Pairs-Signed-Ranks-Test durchgeführt, um mögliche Unterschiede zwischen gepaarten Ergebnissen der OTA vor und nach den Datensätzen zu untersuchen.

Der Test zeigte keinen signifikanten Unterschied bei der Anwendung auf OTAbefore- und OTAafter-Werte der gesamten Bevölkerungsgruppe (n=74, z=−1,438, p-Wert=0,1503), was dies bestätigt dass der komplette OTAbefore-Datensatz zu den statistischen Auswertungen passt. Wie bereits erwähnt, liegen keine früheren Studien zur Überwachung von Mykotoxinen in Plasmaproben von PD- oder AD-Patienten vor. Um alle möglichen Unterschiede und Zusammenhänge der OTA- und STER-Konzentrationsniveaus zwischen Gruppen und Untergruppen zu erfassen, wurde daher der Wilcoxon-Rangsummentest oder der Kruskal-Wallis-Test zum Vergleich mit mehreren Variablen durchgeführt.

Darüber hinaus wurden mögliche Unterschiede mit statistischer Signifikanz untersucht, indem die Gruppen nach Geschlecht und Krankheit (Patienten mit PD und AD) unterteilt wurden, wobei auch das Krankheitsstadium (HY- oder GDS-Skala) berücksichtigt wurde. Eine Zusammenfassung aller Unterschiede, die statistisch signifikant waren (p-Wert < 0.050) beim Vergleich der OTA- oder STER-Verteilungen zwischen Gruppen, zwischen CNT und Patientengruppe (als Ganzes und als PD- und AD-Gruppe), zwischen Geschlechter und zwischen Gruppen in jedem Geschlecht und jeder Geschlechtsvariable sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Die Unterschiede zwischen den Verteilungsniveaus von OTA erwiesen sich beim Vergleich der CNT-Gruppe, PD und AD als statistisch signifikant, aber dieser Unterschied (p-Wert=0.0447) wird durch den Vergleich PD/AD (p- Wert=0.0114), wobei PD die Patientengruppe ist, die durch höhere Werte gekennzeichnet ist. Bei der Betrachtung des Krankheitsstadiums und dem Vergleich der Verteilungen der PD-Untergruppe 1 und der PD-Untergruppe 2 wurde kein Unterschied beobachtet, was darauf hindeutet, dass in der PD-Gruppe das Krankheitsstadium keinen Einfluss auf einen Unterschied in der Verteilung hat. Im Geschlechtervergleich ergaben die verglichenen OTA-Werte von Männern und Frauen statistische Unterschiede entweder bei allen Probanden oder in der Patientengruppe (PD plus AD), wobei Männer immer höhere Werte aufwiesen als Frauen.

Daher unterscheiden sich die OTA-Verteilungen im Vergleich zu CNT- und Patientengruppen nicht, aber es scheint, dass das Geschlecht stärker als die Diagnose Krankheit als Treiber für die Unterschiede in der OTA-Level-Verteilung dienen könnte. Darüber hinaus zeigte der Test beim getrennten Testen der Unterschiede der OTA-Verteilungen für Männer und Frauen zwischen den Gruppen (CNT, PD, AD) keinen Unterschied.

Die statistische Analyse der STER-Werte zwischen der CNT- und der Patientengruppe zeigte statistisch unterschiedliche Verteilungen (p-Wert < 0.0001), wobei die CNT-Werte niedriger waren. Die CNT/PD/AD-Gruppe zeigte statistisch unterschiedliche Verteilungen (p-Wert=0.0001) und der Unterschied wurde auch beim Vergleich von CNT/PD und CNT/AD (p-Wert < 0,0001 in beiden Fällen) bestätigt, mit a mittlerer niedrigerer Wert in der AD-Gruppe.

Daher war die Verteilung der CNT-Gruppe bei den STER-Werten im Vergleich mit Patienten und Krankheitsgruppen immer unterschiedlich. Beim Vergleich der Geschlechterverteilungen zwischen Männern und Frauen wurde jeder statistische Unterschied hervorgehoben. Die STER-Werte in den einzelnen Gruppen von Männern und Frauen unterschieden sich in allen Vergleichen (CNT/PD/AD, CNT/Patientengruppe, CNT/PD, CNT/AD). und Männer und Frauen in der CNT-Gruppe waren immer niedriger als in Patientengruppen.

Dies deutet darauf hin, dass die Diagnose einer Krankheit die Verteilung des STER-Spiegels beeinflussen kann. Unterschiede zwischen den Konzentrationsniveaus von OTA und STER wurden auch untersucht, indem die Verteilungen der beiden Patientengruppen (PD und AD) bei jedem Geschlecht (bei Männern und Frauen) verglichen und die Krankheitsskala, GDS in der AD-Patientengruppe und die HY-Skala verglichen wurden der AD-Patientengruppe, und es ergab sich kein statistischer Unterschied. Weder die OTA- noch die STER-Verteilung zeigten einen Unterschied, auch beim Vergleich der HY-Skala als binäre Variable HY_d=0 (PD-Untergruppe 1, HY-Skala im Bereich 1–2) und HY{{6 }}d=1 (PD-Untergruppe 2, HY-Skala im Bereich 2,5–3).

Beim Vergleich des OTA- und STER-Verteilungsverhaltens wird somit deutlich, dass die OTA-Unterschiede innerhalb des Geschlechts (mit M > W) und innerhalb der Patientengruppen (PD > AD) bestehen und in allen Vergleichen ein deutlicher statistischer Unterschied festgestellt wurde. Was STER betrifft, werden Unterschiede in den Verteilungen registriert, um CNT und Patientengruppe (Patientengruppe > CNT) zu vergleichen, und alle Bewertungen testeten immer einen statistischen Unterschied. Andererseits ließen sich bei den beiden untersuchten Mykotoxinen bei der Untersuchung innerhalb der Untergruppen der Patienten und/oder im Krankheitsstadium keine Unterschiede feststellen.

Nach unserem Kenntnisstand liegen keine weiteren Studien zum Vergleich der Mykotoxinwerte bei Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen vor. Einige Autoren haben jedoch darauf hingewiesen, dass die Rolle von Mykotoxinen bei der Verschlechterung der klinischen Manifestationen von Autismus-Spektrum-Störungen weiter untersucht werden muss [43,44].

Tatsächlich hoben die Autoren statistisch signifikante Unterschiede beim Vergleich von Mykotoxinen (DON, DOM-1 im Urin und AFM1, OTA und FB1 im Plasma) zwischen der autistischen und der Kontrollgruppe von Kindern hervor. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie stehen auch im Einklang mit einer neueren Studie unserer Gruppe [45], in der festgestellt wurde, dass die OTA-Inzidenz und Plasmakonzentrationen bei Kindern der Kontrollgruppe höher waren als bei Kindern mit Autismus-Spektrum- oder Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörungen.

Was den Einfluss des Geschlechts betrifft, so waren den Ergebnissen dieser Studie zufolge in den meisten veröffentlichten Studien die Plasma-OTA-Spiegel bei Männern höher als bei Frauen [46]; obwohl Warensjö et al. (2020) bei schwedischen Jugendlichen [47] und Coronel et al. (2011) [48] fanden keine Unterschiede in den OTA-Plasmaspiegeln zwischen Männern und Frauen. Um schließlich die Beziehung zwischen OTA- und STER-Spiegeln im Plasma und der Altersvariable zu beurteilen, wurde der Rangkorrelationskoeffizient (Rho) nach Spearman berechnet.

Alle Rho mit statistischer Signifikanz (p-Werte < 0.050) sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Im Allgemeinen wurden schwache negative und positive Korrelationen gefunden: OTA und STER korrelieren schwach mit dem Alter. Insbesondere nehmen die OTA-Werte mit zunehmendem Alter ab (negative Korrelationen, Rho < 0) und der Rho-Wert steigt, wenn die PD-Gruppe oder die Männergruppe ausgewählt wird; außerdem ist der Rho-Wert sogar noch höher, wenn die Werte der Männer in der PD-Gruppe ausgewählt werden. Umgekehrt sind die STER-Korrelationen positiv und statistisch signifikant, wenn die Frauengruppe ausgewählt wird.

Um die beobachteten Korrelationen darzustellen, sind in Abbildung 5 die Streudiagramme OTA/Männer in der PD-Patientengruppe und STER/Frauen in allen Probanden dargestellt. Sie zeigen das Streudiagramm mit zwei Variablen für Toxine und Alter, und die angepasste Linie hilft bei der Visualisierung die Korrelation.

Der Mechanismus von Cistanche behandelt die Parkinson-Krankheit und die Alzheimer-Krankheit

Cistanche ist ein traditionelles chinesisches Kraut, das wegen seiner potenziellen gesundheitlichen Vorteile seit vielen Jahren verwendet wird. In jüngsten Studien wurde festgestellt, dass Cistanche neuroprotektive Wirkungen haben und bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheit (AD) und der Parkinson-Krankheit (PD) wirksam sein kann.

Der Mechanismus von Cistanche bei der wirksamen Behandlung von AD und Parkinson wird auf seine aktiven Bestandteile wie Echinacosid, Acteosid und Cistanoside zurückgeführt. Es wird angenommen, dass diese Verbindungen antioxidative und entzündungshemmende Eigenschaften haben, die oxidativen Stress und Entzündungen im Gehirn reduzieren können, die mit der Entwicklung und dem Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen verbunden sind.

Cistanche kann auch das Wachstum von Nervenzellen fördern und die kognitive Funktion verbessern, indem es den Spiegel des aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktors (BDNF) erhöht, einem Protein, das eine entscheidende Rolle beim Wachstum und der Erhaltung von Neuronen spielt. Darüber hinaus reduziert Cistanche nachweislich β-Amyloid-Plaques, die charakteristische Merkmale der Alzheimer-Krankheit sind, und verringert die Ansammlung von β-Synuclein im Gehirn, das mit der Parkinson-Krankheit verbunden ist.

Insgesamt sind die potenziellen therapeutischen Vorteile von Cistanche bei der Behandlung von AD und Parkinson vielversprechend, es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um die genauen Wirkmechanismen aufzuklären und seine Wirksamkeit und Sicherheit im klinischen Umfeld zu bestätigen.

fortgesetzt werden...

Beatriz Arce-López 1, Lydia Alvarez-Erviti 2, Barbara De Santis 3, María Izco 2, Silvia López-Calvo 4, Maria Eugenia Marzo-Sola 4, Francesca Debegnach 3, Elena Lizarraga 1, Adela López de Cerain 5,6, Elena González-Peñas 1,† und Ariane Vettorazzi 5,6,* ,†

1 Abteilung für Pharmazeutische Technologie und Chemie, Forschungsgruppe MITOX, Fakultät für Pharmazie und Ernährung, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, ​​Spanien; barce@alumni.unav.es (BA-L.); elizarraga@unav.es (EL); mgpenas@unav.es (EG-P.)

2 Labor für Molekulare Neurobiologie, Zentrum für biomedizinische Forschung von La Rioja (CIBIR), Piqueras 98, 3. Stock, 26006 Logroño, Spanien; laerviti@riojasalud.es (LA-E.); mizco@riojasalud.es (MI)

3 Nationales Referenzlabor für Mykotoxine und Pflanzentoxine, Istituto Superiore di Sanità, 00161 Roma, Italien; barbara.desantis@iss.it (BDS); francesca.debegnach@iss.it (FD)

4 Servicio de Neurología, Hospital San Pedro, Piqueras 98, 26006 Logroño, Spanien; slcalvo@riojasalud.es (SL-C.); memarzo@riojasalud.es (MEM-S.)

5 Department of Pharmacology and Toxicology, Research Group MITOX, School of Pharmacy and Nutrition, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, Spain; acerain@unav.es 6 IdiSNA, Navarra Institute for Health Research, 31008 Pamplona, Spain