Calreticulin-Mangel stört die Ribosomen-Biogenese und führt zu einer Verzögerung der embryonalen Nierenentwicklung

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrakt

Die Nephrogenese wird durch komplexe Signalwege angetrieben, die das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung steuern. Das Chaperon Calreticulin (Calr) des endoplasmatischen Retikulums ist bekannt für seine Funktion bei der Calciumspeicherung und bei der Faltung von Glykoproteinen. Seine Rolle beiNiereEntwicklung immer noch nicht verstanden. Wir liefern in dieser Untersuchung Beweise für die entscheidende Rolle von Calr bei der Nephrogenese. Wir zeigen, dass Calr-Mangel zu einer gestörten Bildung einer intakten nephrogenen Zone und zu einer Verzögerung der Nephrogenese führt, wie durch die Störung bei der Bildung von kommaförmigen und s-förmigen Körpern belegt wird. Unter Verwendung von Proteomik- und Transkriptomik-Ansätzen haben wir gezeigt, dass zusätzlich zu einer Veränderung der Wnt-Signalisierungsschlüsselproteine ​​embryonaleNierenvon Calr // zeigten insgesamt eine Beeinträchtigung der Expression ribosomaler Proteine, was auf Störungen in der Proteinsynthese und Nephrogenese hinweist. CRISPR/cas9-vermittelter Knockout bestätigte, dass Calr-Mangel mit einem Mangel an mehreren ribosomalen Proteinen und Schlüsselproteinen in der Ribosomen-Biogenese assoziiert ist. Unsere Daten heben eine direkte Verbindung zwischen der Calr-Expression und der Ribosomen-Biogenese hervor.

Einführung

NiereDie Organogenese ist durch eine Abfolge morphogenetischer Ereignisse gekennzeichnet, die durch Zellwachstum und -differenzierung angetrieben wird. Während der Nephrogenese sind die mesenchymal-epitheliale Transition (MET) und die Verzweigung der Ureterknospe (UB), die das Ergebnis einer reziproken Induktion zwischen dem UB und dem metanephrischen Mesenchym (MM) [1] ist, die treibenden Kräfte für die Nephronbildung. Während dieses Prozesses ist ein komplexes und wechselseitiges Zusammenspiel verschiedener Signalwege notwendig, um die epitheliale Differenzierung und die Bildung des Nephrons zu orchestrieren [1–3]. Unter den Schlüsselwegen in diesem Prozess spielt der von Glia abgeleitete neurotrophe Faktor (Gdnf), der über seinen Ret-Rezeptor signalisiert, eine zentrale Rolle während eines Prozesses, der als Ureterknospung bezeichnet wird. Eine Störung dieser Signalgebung kann zu einer Harnleiter-Ektopie oderNieren-Agenesie, wenn die Signalisierung vollständig fehlt [4]. Abgesehen von der Gdnf/Ret-Signalisierung ist die kanonische Wnt/-catenin-Signalisierung dafür bekannt, mehrere Aspekte von zu koordinierenNieren-Entwicklung sowohl innerhalb des MM als auch des UB [5] und die Hemmung der kanonischen Wnt-Signalgebung in der Ureterknospen-Linie und den Nephron-Vorläufern resultiertNieren-Agenesie [6]. Die Aufrechterhaltung der transkriptionellen Reprogrammierung während der Nephrogenese hängt von der Zugänglichkeit des Chromatins ab [7]. Wir haben gezeigt, dass Heterochromatin-Proteine, von denen bekannt ist, dass sie an der epigenetischen Regulation des Gen-Silencing beteiligt sind, unverzichtbar sind, um das Gleichgewicht zwischen Verzweigungsaktivatoren und -inhibitoren im frühen Entwicklungsstadium aufrechtzuerhalten [7].

CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/NIERENFUNKTION VERBESSERN

Calreticulin (Calr) ist ein promiskuitives Chaperon des endoplasmatischen Retikulums (ER) mit einer hohen Calciumbindungskapazität und geringer Affinität, die für die Ca2-Plus-Sequestrierung in das ER und verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich Signaltransduktion, Genexpression und Proteintransport, entscheidend sind [8,9]. Die Mechanismen, die sich mit der Rolle von Calr bei Krankheiten befassen, basieren hauptsächlich auf der Ca2 plus-Chelatbildung durch die Ca2 plus-bindende C-terminale Domäne von Calr und ihre Rolle bei der unfolded protein response (UPR) [10,11]. UPR kann während einer Herausforderung mit fehlgefalteten Proteinen eine zytoprotektive Rolle spielen oder für die Zellen schädlich sein, da eine anhaltende UPR-Signalübertragung Apoptose induzierte. Obwohl sich nur wenige Studien mit der potenziellen Rolle von Calr bei Krankheiten durch Regulation der Transkription befassten, bleibt die ER-Chaperonfunktion von Calr einer der entscheidenden Mechanismen für das Schicksal der Zelle [9,12]. Längerer ER-Stress und Proteinfehlfaltung sind in verschiedenen Fällen prominentNierenerkrankungenwie Glomerulopathien, akutNierenverletzung, diabetische Nephropathie,Nieren-Fibrose und chronischNierenerkrankung[13,14]. Die Rolle von Calr in der Embryonalentwicklung ist noch nicht klar. Calr-Knockout verursacht embryonale Letalität während des Entwicklungsstadiums E14.5 aufgrund einer beeinträchtigten Herzentwicklung [15]. Die Folgen eines Calr-Mangels auf die molekularen Mechanismen vonNiereEmbryonalentwicklung sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. In der vorliegenden Studie führten wir vergleichende transkriptomische und proteomische Analysen des Embryos durchNierevon den drei Genotypen Calr plus/plus, Calr plus// und Calr// und betonten den Einfluss von Calr-Knockout auf die Nephrogenese und auf die Expression von ribosomalen Proteinen.

Schlüsselwörter:Calreticulinmangel; Nephrogenese; ribosomale Biogenese, Niere, Renal

2. Ergebnisse

2.1. Calreticulin-Knockout führt zu morphologischen und histologischen Anomalien der Niere und zu einer beeinträchtigten Nierenverzweigung

Der genetische Knockout von Calr bei Mäusen verursacht eine frühe embryonale Letalität aufgrund von Ventrikelseptumdefekten [15]. Um zu untersuchen, ob Calr Knockout Auswirkungen hatNiereEntwicklung wurden Mausembryos im Stadium E13.5 aus Calr plus // schwangeren Mäusen präpariert (Abbildung 1A). Die Calr//-Embryonen zeigten im Vergleich zu Calr plus/plus und Calr plus // eine signifikante Wachstumsveränderung und zeigten eine signifikante Beeinträchtigung der embryonalen Entwicklung. Die grobe Morphologie der Embryonen und derNierenzeigten signifikante Größenabnahmen zwischen Calr plus/plus- und Calr–//-Mäusen, wobei Calr//-Mäuse die größte Abnormalität zeigten (Abbildung 1A). Um die Auswirkungen des Calr-Knockouts zu veranschaulichenNiereEntwicklung und Struktur wurden Embryonen in drei verschiedenen Entwicklungsstadien (E13.5, E14.5, E16.5) und von den drei Genotypen (Calr plus/plus, Calr plus// und Calr//) getötet und dieNierenerhalten wurden. Die Gewebeschnitte zeigten unterschiedliche Entwicklungsstadien derNiere,die durch komplizierte morphologische Strukturen fortschreitet, wie durch PAS- und HE-Färbung von Gewebeschnitten nachgewiesen wird.Nierenaus demselben Embryonalstadium mit unterschiedlichen Genotypen zeigten unterschiedliche Entwicklungsstufen (Abbildung 1B). Außerdem erhebliche Unterschiede bzglNiereStrukturen wurden insbesondere beim Vergleich von Calr // mit Calr plus / plus und Calr plus // beobachtet. Diese Unterschiede bleiben auch in fortgeschrittenen Stadien der Nephrogenese bestehen (Abbildung 1B). Anruf//Nierenzeigen im Vergleich zu Calr plus/plus und Calr plus// (Abbildung 1B) eine starke Beeinträchtigung. Im Stadium E13.5 die Größe des Calr//Nierewar kleiner und die Anzahl der Harnleiterknospen und Harnleiterknospenäste war deutlich geringer. Ähnliche Beobachtungen wurden in den Stadien E14.5 und E16.5 gemacht. Organkultur des EmbryosNierenvon den drei Embryo-Genotypen enthüllte eine wesentliche Störung in der UB-Verzweigung undNiereWachstum. Zur Visualisierung derNieren-Strukturen wurden kultivierte Rudimente mit Laminin als Marker für die Basalmembran und mit Dolichos biflorus Agglutinin (DBA) Lektin gefärbt, um die UB sichtbar zu machen.

Die kombinierte FL-Fluoreszenzfärbung der kultiviertenNiereAnsätze zeigten eine signifikante Beeinträchtigung der Verzweigung, die mit Calr-Mangel einherging und zu einer Gesamtverzögerung in führteNiereEntwicklung (Abbildung 2A,B). Zum Zeitpunkt der Isolation ist der Calr//NiereDie Rudimente zeigten 6–10 UB-Spitzen, während die Calr plus / plus- und Calr plus //-Rudimente 20–30 UB-Spitzen aufwiesen. Die Calr plus / plus und Calr plus // kultivierten Rudimente entwickelten sich während der Kulturdauer (72 h) normal und zeigten eine gut verzweigte UB (jeweils 85 ± 9, n=6) ​​sowie verschiedene bekannte Strukturen aus in vivo sich entwickelnde Niere. Die KultivierteNieredemonstrierte prätubuläre Aggregate,Nieren-Vesikel und Kappenmesenchym (Abbildung 2A,B). Im Gegensatz dazu entwickelten sich die Calr//-Rudimente nicht normal und zeigten eine signifikante Veränderung in der UB-Verzweigung (15 ± 3 n=6) (Abbildung 2B).

Abbildung 2. Calr−/− MausNiereRudimente zeigen eine starke Veränderung im Wachstum und in der UB-Verzweigung. (EIN):NiereRudimente von Calr plus/plus Calr plus/– und Calr–/– (E13.5) wurden isoliert und für drei Tage ex vivo kultiviert. Calr−/−NiereRudimente zeigten eine allgemeine Veränderung im Wachstum und eine signifikante Veränderung in der Verzweigung der Ureterknospen. (B): Immunfluoreszenzfärbung vonNiereRudimente nach drei Tagen Kultur. Eine Co-Färbung von Laminin (rot) und DBA-Lektin (grün) wurde durchgeführt, um die unterschiedlichen Strukturen der Rudimente sichtbar zu machen. Die Quantifizierung der Verzweigung erfolgte durch Zählen der Anzahl der Verzweigungen der Ureterknospe. Die Quantifizierung wird als Balkendiagramm mit Fehlerbalken dargestellt. Jeder Balken repräsentiert die Mittelwerte der Zweigzahl ± sd von sechs kultivierten Rudimenten. Signifikante Unterschiede: (*) p < 0.05,="" (***)="" p="">< 0,001.="" 2,5×="" 2,5×="" 2,5×="" int.="" j.mol.="" wissenschaft.="" 2021,="" 22,="" 5858="" 4="" von="" 21="" abbildung="" 2.="" calr悆="" maus-nierenrudimente="" weisen="" eine="" starke="" veränderung="" des="" wachstums="" und="" der="" ub-verzweigung="" auf.="">NiereRudimente von Calr plus/plus Calr plus// und Calr/(E13.5) wurden isoliert und drei Tage lang ex vivo kultiviert. Anruf /NiereRudimente zeigten eine allgemeine Veränderung im Wachstum und eine signifikante Veränderung in der Verzweigung der Ureterknospen. (B): Immunfluoreszenzfärbung vonNiereRudimente nach drei Tagen Kultur. Eine Co-Färbung von Laminin (rot) und DBA-Lektin (grün) wurde durchgeführt, um die unterschiedlichen Strukturen der Rudimente sichtbar zu machen. Die Quantifizierung der Verzweigung erfolgte durch Zählen der Anzahl der Verzweigungen der Ureterknospe. Die Quantifizierung wird als Balkendiagramm mit Fehlerbalken dargestellt. Jeder Balken repräsentiert die Mittelwerte der Zweigzahl ± sd von sechs kultivierten Rudimenten. Signifikante Unterschiede: (*) p < 0.05,="" (***)="" p=""><>

2.2. Calr-Mangel ist mit großen und signifikanten Veränderungen des Transkriptoms verbunden

Die morphologischen und histologischen Untersuchungen zeigten eine Beeinträchtigung inNiereEntwicklung in Calr/ Maus-Embryonen im Vergleich zu Calr plus / plus und Calr plus // . Um zu untersuchen, ob der Calr-Knockout die Expression von Schlüsselproteinen und Signalwegen der Nephrogenese beeinflusst, wurden vollständige Transkriptomanalysen derNiereRudimente wurden von den drei Embryo-Genotypen durchgeführt. Um die differentiell exprimierten Gene zwischen Calr plus / plus , Calr plus // und Calr/NiereProben wurden quantitative Tests basierend auf Messwertzählungen unter Verwendung von Fishers exaktem Test mit einer Benjamini-Hochberg-Anpassung für mehrere Tests durchgeführt. Die ergänzenden Abbildungen S1 und S2 zeigen die Wärmekarte der vergleichenden Analyse zwischen den Genexpressionen in derNiereGrundlagen von Calr plus / plus , Calr plus // und Calr / . Um einen umfassenden Überblick über die Genexpressionsänderungen zwischen Calr plus/plus und Calr/Niere zu erhalten, wurde ein MA-Plot mit dem transformierten Fold Change (FC) der Expression zwischen Calr plus/plus und Calr/ zu log2 von Transformierten erstellt durchschnittliches Expressionsniveau für jedes Gen über alle Proben hinweg (Abbildung 3A, ergänzende Abbildung S1). Der MA-Plot zeigt differentiell regulierte Gene in Calr plus/plus im Vergleich zu Calr/. Die funktionelle Klassifizierung der regulierten Gene nach biologischen Prozessen ergab eine Veränderung des Entwicklungsprozesses in Calr /Nieren(Abbildung 3B, Ergänzungstabelle S1). Eine genauere Untersuchung der Pathway-Annotation der regulierten Gene ergab eine Abweichung von zwei Hauptprozessen: der Wnt-Signalübertragung und der Proteinfaltung, da festgestellt wurde, dass die Mehrheit der regulierten Proteine ​​an diesen beiden Hauptwegen beteiligt ist (Abbildung 3B). Hierarchisches Clustering und k-Means-Clustering auf Expressionsprofilen bestätigten, dass die embryonaleNiereTranskriptome von Calr plus / plus und Calr plus // sind sehr ähnlich, unterscheiden sich jedoch erheblich von den Transkriptomen von Calr / (Abbildung 3C, ergänzende Abbildungen S1 und S2).

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENINFEKTIONEN VERBESSERN

Unsere Transkriptomanalysedaten zeigten, dass der Knockout von Calr von einer Veränderung der Expression von Schlüsselproteinen in begleitet wurdeNiereEntwicklung (Abbildungen 3C und 4A, Ergänzungstabelle S2) neben den Schlüsselproteinen in der Wnt-Signalübertragung und einer großen Anzahl nephrogener Gene wurden in der Calr/NiereRudimente (Abbildung 3C, Abbildung 4A). Unter anderem wurden Transkriptionsfaktoren wie Six1 und Six2, von denen zuvor berichtet wurde, dass sie in verschiedenen Stadien der Nephrogenese funktionieren, in der Calr// embryonalen Niere signifikant herunterreguliert. Osr1 ist eines der Gene, dessen Expression für Eya1, Pax2, Six2, Sall1 und GDNF erforderlich ist, und die Expression dieses Gens war in Calr/fast nicht vorhanden. Um den Einfluss der Veränderung der Wnt-Signalgebung und der nephrogenen Schlüsselgene auf zu untersuchenNiereEntwicklung in Calr-Knockout-Mäusen wurde eine Immunfluoreszenzfärbung mit Markern der Embryonalentwicklung durchgeführtNiereSchnitte von Embryonen im Stadium E14.5. Die Färbung bestätigte eindeutig die Veränderung der untersuchten Gene in Calr/(Abbildung 4B). Außerdem ist im Vergleich zu Calr plus / plus und Calr plus // die Calr /Nierefehlt eine klare nephrogene Zone (Abbildung 4B), wie durch die Färbung belegt, und dies bestätigt eine schwere Störung inNiereEntwicklung in Calr/ Embryonen.

2.3. Vergleichende proteomische Analysen identifizierten signifikante Veränderungen im Proteom der Calr/embryonalen Niere

Morphologische und histologische Analysen zeigten, dass eine Einschränkung von Calr für die Embryonalentwicklung problematisch istNiere. Um die Rolle von Calr besser zu verstehenNiereEmbryonalentwicklung wurden umfangreiche Proteomanalysen an embryonalen durchgeführtNierenmit zwei Strategien. In den ersten Experimenten verwendeten wir die 2D-Gelelektrophorese, um die Embryonen zu vergleichenNiereProteome von Calr plus/plus und Calr plus // Mausembryos aus dem Stadium E13.5. Das 2D-Muster zeigte eine signifikante Veränderung im Proteom von Calr plus //Nieren(p <0.05) (ergänzende="" abbildung="" s3a).="" die="" identifizierung="" der="" unterschiedlich="" häufig="" vorkommenden="" proteine="" ​​ergab="" eine="" veränderung="" in="" der="" expression="" von="" proteinen,="" die="" an="" stresswegen="" und="" am="" rna-metabolismus="" in="" calr="" plus="" embryonal="" beteiligt="">Niere(Ergänzende Abbildung S3B,C). Um die Proteomveränderung in Calr plus // und Calr悆 / im Vergleich zu Calr plus / plus besser untersuchen zu könnenNierehaben wir ein massenspektrometriebasiertes Proteomprofiling durchgeführt (Abbildung 5, Ergänzungstabellen S3–S8). Eine Überlappungsanalyse zeigte eine hohe Reproduzierbarkeit des Proteinnachweises zwischen Genotypen (Abbildung 5A). Die statistische Analyse zeigte signifikante Veränderungen in der Proteinexpression zwischen Calr plus / plus vs. Calr悆 / (Abbildung 5A, ergänzende Tabellen S3 und S4, ergänzende Abbildung S4A.), Calr plus // vs. Calr/ (Abbildung 5A, ergänzende Tabellen S5 und S6, ergänzende Abbildung S4B) und Calr plus / plus vs. Calr plus // (Abbildung 5A, ergänzende Tabellen S7 und S8, ergänzende Abbildung S4C). Immunfluoreszenzfärbung bestätigte den Knockout von Calr in Calr //Nieren. Darüber hinaus haben wir die Proteomik-Ergebnisse für zwei herunterregulierte Proteine ​​in Calr / bestätigt: Calbindin 1 (Calb-1) und Superoxid-Dismutase 1 (Sod1). Im Fall von Sod1 zeigten sowohl proteomische als auch transkriptomische Daten einen Knockout von Sod1 im Calr悆 //-EmbryonalNiereund Immunfluoreszenzfärbung bestätigte den Mangel an Sod1 in der Calr/embryonalenNiere(Abbildung 5B). Sod1 ist ein antioxidatives Metalloenzym, das eine wichtige Rolle bei der Entgiftung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) spielt, indem es freie Superoxidradikale zur weiteren Entgiftung durch zelluläre Katalasen in Wasserstoffperoxid umwandelt und so eine Toxizität verhindert. Calb-1 ist das wichtigste intrazelluläre Calcium-bindende Protein im distalen Convolute Tubulus (DCT) und spielt eine Schlüsselrolle bei der transzellulären Ca2-Plus-Reabsorption. Als intrazellulärer Ca2 plus -Puffer und Ca2 plus -Transitprotein transportiert Calb-1 Ca2 plus von der apikalen zur basolateralen Seite ohne signifikante Veränderung der intrazellulären Ca2 plus -Konzentration. Der Zusammenhang zwischen dem Calr-Knockout und der Veränderung in der Expression beider Proteine ​​ist nicht klar und bedarf weiterer Untersuchungen.

Abbildung 3. Vergleichende Genexpressionsanalyse von Calreticulin-Knockout-Mäusen. (A): MA-Plot, der breit angelegte hochregulierte und herunterregulierte Gene in Calr plus/plus-Mäusen gegenüber Calr/ zeigt. Quantitative Tests der fold change (basierend auf der normalisierten log-transformierten Read-Zählung) wurden unter Verwendung des exakten Fisher-Tests mit einer Benjamini-Hochberg-Korrektur (p < 0,05)="" durchgeführt,="" und="" nicht="" signifikante="" gene="" sind="" grau="" dargestellt.="" der="" ma-plot="" wird="" zur="" darstellung="" der="" differentiell="" exprimierten="" gene="" in="" calr="" plus/plus="" vs.="" calr/="" verwendet.="" (b):="" verteilung="" der="" biologischen="" prozesse="" der="" herunterregulierten="" gene="" in="" calr/im="" vergleich="" zu="" calr="" plus="" plus="" -.="" die="" klassifizierung="" der="" identifizierten="" gene="" wurde="" mit="" einem="" david-bioinformatik-tool="" durchgeführt.="" das="" gensymbol="" wurde="" verwendet,="" um="" die="" anmerkungen="" zur="" genontologie="" zu="" kategorisieren,="" z.="" b.="" biologische="" prozesse.="" (c):="" anreicherungsanalyse="" der="" top-gene,="" von="" denen="" festgestellt="" wurde,="" dass="" sie="" zwischen="" den="" drei="" genotypen="" (calr="" plus/plus,="" calr="" plus="" und="" calr/)="" signifikant="" reguliert="" werden.="" die="" vergleichende="" analyse="" wird="" als="" heatmap="" dargestellt="" (fc=""><2 and="" fc="" >="">

2.4. Gen-Ontologie-Klassifizierung und Protein-Protein-Interaktionsnetzwerkanalysen

Die Vulkanplots und die Tortendiagrammanalysen zeigten, dass die Veränderung der Calr-Expression zu globalen Veränderungen im Embryo führtNiereProteom (ergänzende Abbildung S4). Um mehr Informationen über die biologischen Mechanismen zu erhalten, die mit der embryonalenNiereEntwicklungsveränderung in Calr/Mäusen kombinierten wir DAVID-Bioinformatik mit Informationen über die mutmaßliche Funktion der Proteine, die in den UniProt- und GenBank-Datenbanken gefunden wurden. Die Klassifizierung der identifizierten Proteine ​​nach ihrer Beteiligung an biologischen Prozessen führte zu zwanzig Kategorien mit neun stark vertretenen Kategorien (ergänzende Abbildung S4D). Eine der Hauptkategorien war der Entwicklungsprozess, wobei mehr als 1000 der identifizierten Proteine ​​zu dieser Gruppe gehörten. Da Protein-Protein-Wechselwirkungen die Schlüsselmechanismen für fast alle biologischen Prozesse sind, einschließlich der Entwicklung, der Extraktion von Informationen über mögliche Protein-Protein-Wechselwirkungen und der Signalwegregulation, die die regulierten Proteine ​​in Calr plus // und Calr/ embryonal verbindetNierekönnte wichtige Informationen über die Prozesse liefern, die unter Calr-Mangelbedingungen beeinträchtigt sind. Dazu untersuchten wir die Interaktionsnetzwerke zwischen den regulierten Proteinen mit STRING 11.0 (http://string.embl.de, aufgerufen am 24.03.2021). Eine weitere Analyse von Proteinen, die ausschließlich in Calr plus / plus und Calr plus // exprimiert wurden, ergab zwei starke Interaktionsknoten von Proteinen, die an zwei Hauptprozessen beteiligt sind, nämlich dem RNA-Stoffwechsel und der oxidativen Phosphorylierung (ergänzende Abbildung S5A). Dies deutet darauf hin, dass die Calr / embryonalNierekann an einer Anomalie im RNA-Stoffwechsel und Energiemangel leiden. Die Untersuchung der Interaktionsnetzwerke zwischen den in Calr plus / plus überexprimierten Proteinen und Calr plus // im Vergleich zu Calr/ unterstützt unsere Annahmen stark, da die Netzwerke drei starke Interaktionsknoten aufweisen. Zwei der Knoten akkumulierten Proteine, die am RNA-Stoffwechsel und an der oxidativen Phosphorylierung beteiligt sind, während der dritte Knoten ribosomale Proteine ​​​​beinhaltet und eine Störung der Ribosomenbildung und des Proteinumsatzes aufzeigte (ergänzende Abbildung S5B). Eine genaue Untersuchung der ribosomalen Proteine, von denen festgestellt wurde, dass sie reguliert werden, zeigte eine signifikante Veränderung von Proteinen sowohl aus großen als auch aus kleinen ribosomalen Untereinheiten, und dies enthüllte die schwere Störung der ribosomalen Biogenese und Proteinsynthese (Abbildung 6A–D).

2.5. Calr Knockout führt zu einer Veränderung der ribosomalen Proteinexpression 

Die Transkriptom- und Proteomdatenanalysen zeigten eine signifikante Veränderung in der Expression von ribosomalen Proteinen in embryonalen Calr/MäusenNieren. Western-Blot-Analyse und MS-Quantifizierung von embryonalenNiereProteinextrakte aus den drei Genotypen bestätigten die signifikante Herunterregulierung von Rps10, Rps19 und Rps26Nieren(Abbildung 7A) und Rps12, Rps13, Rps14 Rps15, Rps17 und Rps19 (ergänzende Abbildung S6A, B) in Calr/. Darüber hinaus ist die Färbung von embryonalenNiereSchnitte bestätigten das Ausmaß der Veränderung in der Expression der ribosomalen Proteine; kein Rps10 oder Rps6 konnte in Calr/embryonal nachgewiesen werdenNiereAbschnitte (Abbildung 7B). Um den Zusammenhang zwischen Calr-Knockout und ribosomaler Proteinexpression zu untersuchen, etablierten wir ein In-vitro-Calr-Knockout-Modell in MDCKNieren-Tubuluszellen unter Verwendung des CRISPR/cas9-Endonukleasesystems. Die Western-Blot-Analysen bestätigten die dosisabhängige Herunterregulierung der Calr-Expression in MDCK-Zellen und zeigten eine signifikante Depletion der 40S-ribosomalen Untereinheit, die für die Proteine ​​Rps10 und Rps19 kodiert, was eine Störung der Ribosomenbiogenese aufzeigte. Darüber hinaus zeigte die Expression wesentlicher Komponenten für die Proteinsynthese, z. B. Elongation, dass der Initiationsfaktor eEIF5a in den Calr-Knockout-MDCK-Zellen signifikant abnahm (Abbildung 7C). Der Calr-Knockout wurde von signifikanten morphologischen, proteomischen und transkriptomischen Veränderungen begleitet. Unsere In-vivo- und In-vitro-Untersuchungen haben weiter hervorgehoben, dass diese Aberrationen von einem signifikanten Rückgang der Ribosomen-Biogenese begleitet wurden. Die Abnahme der ribosomalen Proteinexpression im Calr-KnockoutNierewar nicht auf embryonale Stadien beschränkt, sondern konnte auch in von Erwachsenen stammenden Zellen nachgewiesen werdenNieren, was eine potenzielle Rolle von Calr in der ribosomalen Biogenese offenbart.

Abbildung 7. Calr-Mangel ist mit einer Herunterregulierung der ribosomalen Proteinexpression verbunden. (A): Western-Blot-Analysen der ribosomalen Proteine ​​Rps10, Rps19 und Rps26 in Proteinextrakten aus Calr plus/plus, Calr plus// und Calr//embryonalNieren. Embryonale Nieren wurden von drei verschiedenen schwangeren Calr plus/–-Mäusen geerntet. Nach der Genotypisierung wurden Embryonen derselben Mutter und desselben Genotyps zusammengruppiert und ihre EmbryonenNiereProteinextrakte wurden zusammengepoolt. Nach der Proteinschätzung wurden Western-Blot-Analysen in dreifacher Ausführung für jedes untersuchte Protein durchgeführt. Für die vergleichende Analyse der Proben wurde eine Einweg-ANOVA verwendet. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung aus mindestens drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Unterschiede wurden als statistisch signifikant betrachtet, wenn p < 0.05.="" (b):="" immunfluoreszenzfärbung="" gegen="" rps10="" und="" rps6="" in="" calr="" plus="" plus="" und="" calr悆="" mbryonalen="" nierengewebeschnitten="" mit="" einer="" vergrößerung="" von="" 20×.="" (c):="" western-blot-analyse="" von="" proteinextrakt="" aus="" mdck-zellen="" (links)="" und="" mrna-quantifizierung="" nach="" dem="" knockout="" von="" calr="" in="" mdck-zellen="" (rechts).="" calr="" wurde="" unter="" verwendung="" des="" crispr/cas9-systems="" mit="" zwei="" verschiedenen="" sgrnas="" ausgeschaltet.="" western="" blots="" wurden="" mit="" calr-,="" gapdh-,="" rps10-,="" rps19-="" und="" eif5a-antikörpern="" sondiert.="" calr-="" und="" rps10-mrna-quantifizierungen="" in="" der="" sgcalr-2-probe="" wurden="" unter="" verwendung="" von="" qpcr="" durchgeführt.="" die="" herunterregulierung="" von="" calr="" mit="" dem="" crispr/cas9-system="" zeigte="" eine="" assoziation="" zwischen="" calr-mangel="" und="" einer="" veränderung="" der="" ribosomalen="" proteinexpression.="" signifikante="" unterschiede:="" (**)="" p="">< 0,01,="" (***)="" p="">< 0,001,="" (****)="" p=""><>

3. Diskussion

DasNierenentwickeln sich durch verzweigte Morphogenese, die ein Prozess ist, der komplexe Wachstums- und Differenzierungsprozesse umfasst und von den Signalen angetrieben wird, die von den umgebenden Zellen im entstehenden mesenchymalen Kompartiment kommen [16]. In den letzten Jahren wurden mehrere Schlüsselgene und Signalwege inNiereEntwicklung festgestellt wurden. Daran sind die trophischen Faktoren, insbesondere GDNF, knochenmorphogenetische Proteine ​​(BMPs) und Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs) beteiligtNieren-Wachstum und Differenzierung. Sie steuern die Signalgebung, die an der Morphogenese der UB-Verzweigung sowie an der Aufrechterhaltung und Differenzierung des nephrogenen Mesenchyms im Embryo beteiligt istNiere[17]. Calr-Knockout verursacht embryonale Letalität aufgrund einer dysfunktionalen Herzentwicklung [15]. Erhöhungen der zytoplasmatischen Ca2+-Konzentration sind in normalen Kardiomyozyten erforderlich, um die kardiale Myofibrillogenese voranzutreiben. Diese unverzichtbare Veränderung der Ca2+-Konzentration hängt von Calr ab und fehlt unter Calr-Mangelbedingungen [18]. Die funktionelle Rolle des ER-Chaperons und des kalziumbindenden Proteins Calr bei der Nephrogenese wurde noch nicht erforscht. Um die potenzielle Rolle von Calr bei embryonalenNiereEntwicklung und den Einfluss von Calr-Mangel auf die Nephrogenese führten wir eine vergleichende transkriptomische und proteomische Analyse durch. Insgesamt führte Calr-Mangel zu einer Verzögerung der Nierenentwicklung und unbedeutenden Transkriptom- und Proteomveränderungen. Darüber hinaus zeigten unsere Daten, dass Calr-Mangel schwere Störungen in Nephrogenesewegen auslöste, da signifikante Expressionsänderungen von Wnt-Signalisierungsschlüsselproteinen (z. B. Wnt7a, Wnt11, Wnt10b, Fzd10, Fzd9, Prkcb, Prkcq und Kremen2) identifiziert wurden. Die induktive Signalübertragung zwischen dem Epithel der Ureterknospe und dem metanephrischen Mesenchym wird hauptsächlich durch die Wnt-Feedback-Signalübertragung reguliert [19,20]. Während Calr ein Hauptbestandteil der zellulären Kalziumhomöostase ist, ist es gleichzeitig ein essentielles ER-Chaperon für die Faltung und den Transport von Glykoproteinen und Proteinen, die an der Zellsignalisierung und Genexpression beteiligt sind [21]. Der Knockout von Calr könnte zu einer Störung der Proteinfaltung und ER-Stress führen, was zu einer Störung der Translationsmaschinerie führt. Dies kann die beobachtete Verzögerung der Nierenentwicklung bei homozygoten Mäusen erklären.

Einer der überraschenden und interessanten Aspekte, die durch unsere Daten hervorgehoben werden, ist die Veränderung in der Expression von ribosomalen Proteinen. Wir haben eine fast vollständige Depletion mehrerer Proteine ​​der ribosomalen 40S- und 60S-Untereinheiten nachgewiesen. Darüber hinaus bestätigten unsere In-vitro-Experimente die Korrelation zwischen der Herunterregulierung von Calr und der Beeinträchtigung der ribosomalen Proteinexpression. Die Ribosomenbiogenese ist gut organisiert und unterliegt strengen Vorschriften. Neuere Studien haben gezeigt, dass das Ribosom nicht nur in der normalen Zellphysiologie, sondern auch bei der Reaktion auf Reize und bei der Pathogenese von Krankheiten eine wichtige Rolle spielt. Darüber hinaus kontrolliert die Ribosomenbiogenese das Zellwachstum, und die Proliferation und Veränderungen in Ribosomen spiegeln sich in der Aberration der Zellproliferation, dem Stillstand des Zellzyklus, der Apoptose und der pathologischen Manifestation wider [22,23].

Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der Ribosomenbiogenese wurde festgestellt, dass ribosomale Proteine ​​verschiedene extraribosomale Funktionen ausüben, z. B. beim Zellwachstum und der Zellproliferation, bei der DNA-Reparatur und bei der zellulären Differenzierung und Entwicklung [24–31]. Eine Beeinträchtigung der ribosomalen Proteinfunktionen war mit hämatologischen und metabolischen Störungen verbunden und könnte zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs führen [32–36]. Mutationen in Genen, die für ribosomale Proteine ​​codieren, sind mit Erythropoese-Anomalien verbunden, die zu klinischen Syndromen führen, z. B. Diamond-Blackfan-Anämie (DBA) [37] und 5q-Syndrom [38]. Mutationen im RPS10 sind mit Diamond-Blackfan-Anämie assoziiert und 30 Prozent dieser Patienten haben Hufeisen- oder Sigmoid-AnämieNieren[39]. Interessanterweise haben die Diamond-Blackfan-Patienten eine höhere Wahrscheinlichkeit, ein myelodysplastisches Syndrom zu entwickeln, das mit der Exon-9-Mutation des Calr-Gens assoziiert ist [40–42]. Diese Umgestaltung der Translationsmaschinerie verursacht massive Abweichungen im Entwicklungsprozess und betrifft nicht nur das Urogenitalsystem, sondern auch das Kreislauf- und Fortpflanzungssystem, was schließlich bei Calreticulinmangel zu embryonaler Letalität führt. Unsere Daten zeigten eine störende Ribosomenbiogenese im Calr/-EmbryonalNiereund hob eine wesentliche Rolle von Calr in der Proteinbiogenese hervor. Wir glauben, dass ein besseres Verständnis der Beziehungen zwischen Calr-Mangel und Veränderung der ribosomalen Proteinexpression neue Erkenntnisse liefern würde, um zu verstehen, wie Calr die Biogenese und Embryonalentwicklung von Ribosomen beeinflusstNiereEntwicklung und ermöglichen neue Einblicke in die Prozesse der Organentwicklung.

4. Materialien und Methoden

4.1. Tiere

Calreticulin-heterozygote (Calr plus//) und Wildtyp- (Calr plus/plus) Wurfgeschwister-Mäuse mit identischem genetischem C57BL/6J-Hintergrund wurden von Professor Marek Michalak, University of Alberta, Edmonton, Alberta, Kanada, erhalten. Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien Haltungsbedingungen gezüchtet und genotypisiert, wie zuvor in Michalak et al. [fünfzehn]. Für unsere Studie wurden trächtige Calr plus //-Mäuse in verschiedenen Stadien der Embryonalentwicklung (Embryonaltage 13,5: E13,5; 14,5: E14,5; und 16,5: E16,5) getötet, die Embryonen geerntet und dieNierenwurden seziert. Für die Genotypisierung wurde ein Stück des Embryoschwanzes verwendet. DasNierenwurden weiter für entweder histochemische Färbung oder Transkriptomik- oder Proteomikanalyse vorbereitet. Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den deutschen Tierschutz- und Ethikgesetzen (NIH-Standards) durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission der Universitätsmedizin Göttingen, Deutschland (33.14-42502-04-11/0598) genehmigt.

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENSCHMERZEN VERBESSERN

4.2. Histochemische Färbung

Für die histologische Färbung des EmbryosNieren, die ausgeschnittenNierenwurden über Nacht in 4-prozentiger gepufferter Formaldehydlösung fixiert und anschließend in Paraffinblöcke eingebettet. Die in Paraffin eingebetteten Schnitte wurden entparaffiniert und rehydriert und mit Hämatoxylinlösung Gill III und Eosin Y-Lösung (Merck, Darmstadt, Deutschland) gemäß dem Protokoll des Herstellers gefärbt.

4.3. Ex-vivo-Organkultur der embryonalen Niere

Die Ex-vivo-Organkultur wurde nach Davies et.al [43] durchgeführt. Trächtige Mäuse wurden im Stadium E13.5 der Embryonalentwicklung getötet, Embryonen wurden geerntet und dieNierenwurden seziert. Nach Genotypisierung, 6NiereRudimente von jedem Genotyp (Calr plus/plus , Calr plus // und Calr/ ) wurden auf eine transparente PET-Membran mit 0,4 &mgr;M Porengröße (24 Vertiefungen, BD Falcon) plattiert. Die Membran wurde in eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen gegeben, die 400 &mgr;l enthieltNiereKulturmedium (KCM, DMEM, 10 Prozent inaktiviertes FCS). Dies ermöglichte dieNieredas Medium zu kontaktieren, ohne es zu ertränken. Unter diesen Bedingungen war es möglich, die zu haltenNierebei 37 ◦C und 5 Prozent CO2 für mindestens 144 h kultiviert.

4.4. Immunfluoreszenzfärbung der kultivierten Nieren und immunhistologische Analyse der Nierenschnitte

Das EmbryonaleNierenex vivo für 72 h kultiviert wurden, danach dieNiereRudimente wurden in kaltem Methanol bei t 20 ◦C für 30 min fixiert. Dem Fixierungsschritt folgten 3 Waschschritte für jeweils 5 min in PBS. Der primäre monoklonale Kaninchen-Anti-Laminin-Antikörper (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) wurde in PBS verdünnt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die KultivierteNiereRudimente wurden in PBS für 4 h gewaschen und der sekundäre Antikörper (Molecular Probes Alexa Fluor 555 Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (1:500)) wurde über Nacht bei 4 °C zugegeben. Das UB wurde mit Lektin Dolichos biflflorus Agglutinin (DBA) für mindestens 3 h gefärbt. Nach der Inkubation wird dieNierenwurden für 3 h in PBS gewaschen und für die mikroskopische Analyse eingebettet. Immunfärbung von entparaffinierten und rehydrierten EmbryonenNiereSchnitte wurden durchgeführt, um die Expression und Verteilung mehrerer Proteine ​​nachzuweisen. Die Schnitte wurden mit einer Antigenrückgewinnungslösung (1,8 µM Zitronensäure und 8,2 µM Natriumcitrat) behandelt, die 25 Minuten lang in einem Dampfgarer vorgewärmt wurde. Die Schnitte wurden mit 10 % Ziegenserum in PBS für 1 h blockiert und über Nacht bei 4 °C mit den Primärantikörpern inkubiert (Die folgenden Primärantikörper wurden verwendet: monoklonales Kaninchen-Anti-Calbindin-1, Anti-Wt1, Anti- Six2, Anti-Pax2, Anti-Calr (Abcam, Cambridge, UK), Kaninchen-monoklonaler Anti-Rps6, Anti-Rps10 (Invitrogen) und Kaninchen-monoklonaler Anti-Sod1-Antikörper (Abnova, Taipei, Taiwan).Die primären Antikörper wurden mit Fluoreszenz nachgewiesen markierte Sekundärantikörper (Molecular Probes Alexa Fluor 555 Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper und Alexa Fluor 555 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG) für 1 h bei Raumtemperatur. Für Negativkontrollen wurden Gewebeschnitte nur mit dem Sekundärantikörper inkubiert. Die Objektträger wurden montiert mit Deckgläsern in Vectashield-Eindeckmedium mit DAPI zur Gegenfärbung der Zellkerne (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).

4.5. Zellkultur

Madin-Darby-HundNiere(MDCK)-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten und in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % L-Glutamin bei 37 °C vermehrt in einer 5-prozentigen CO2--Atmosphäre. Die Zellen werden in T25-Kolben kultiviert und zweimal in einer Woche geteilt. Für die Zellpassage wurden MDCK-Zellen kurzzeitig trypsiniert, um eine Veränderung der Zellstruktur zu vermeiden.

4.6. Generierung von Knockout-Zellen

Die sgRNA-Sequenzen von Calr (XM8622117) für die Canis-Lupus-Spezies wurden mit dem Online-Tool BlueHeronBio (Origene, Herford, Deutschland) entworfen. Die sgRNA-Sequenz 50 GTAGATGGCGGGTTCGGCAG 30 wurde in das pLenti-Cas-Guide-Plasmid (Addgene-Plasmide Nr. 3931646) mit BamHI- und BsmBI-Restriktionsenzymen eingefügt, um das pLenti-Cas9-Calr-Konstrukt zu erzeugen, was später durch Sanger-Sequenzierung bestätigt wurde. Um Carl in MDCK-Zellen auszuschalten, wurde eine transiente pLenti-Cas9-Calr-Transfektion durchgeführt. Einen Tag vor der Transfektion wurden 200 000 Zellen/ml in Platten mit 6 Vertiefungen mit MEM-Medium ausgesät. Vor der Transfektion wurde das Kulturmedium auf FCS-freies Opti-MEM-Medium gewechselt. Zur Transfektion der Zellen wurde Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) verwendet. Lipofectamin-Plasmid-DNA-Mix wurde mit OptiMEM basierend auf dem Protokoll des Lehrers hergestellt. Für die Transfektion von Platten mit 6 Vertiefungen wurden 4 ug Plasmid-DNA separat zu 250 ul Opti-MEM-Medium gegeben und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde das DNA-Gemisch zu dem Lipofectamine 2000-Gemisch gegeben und 30 min inkubiert, bevor es zu den Zellen gegeben wurde. Der Transfektionserfolg wurde mittels Western Blot beurteilt.

4.7. Transkriptomanalyse

Für Transkriptomuntersuchungen wurden 3 trächtige Calr plus // Mäuse verwendet. Embryonen (8–10/trächtige Mäuse) wurden geerntet und dieNierenwurden isoliert. Nach Genotypisierung,Nierenvom gleichen Genotyp und der gleichen Mutter wurden gepoolt und für die RNA-Extraktion verarbeitet. Gesamt-RNAs wurden aus Calr plus/plus, Calr plus// und Calr/embryonal isoliertNierenunter Verwendung der Trizol (Invitrogen)-Methode gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Die Proben wurden dann mit DNAse I (Sigma) behandelt, um die DNA-Kontamination zu entfernen. Die Qualität der RNA wurde mit dem mikrofluidischen Elektrophoresegerät Agilent 21{{10}}0 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) bestimmt. Für die Sequenzierung wurden die RNA-Proben mit dem "TruSeq RNA Sample Prep Kit" nach dem Protokoll des Herstellers (Illumina, San Diego, CA, USA) aufbereitet. Die Single-Read-Sequenzierung (50 bp) wurde mit einem HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA, USA) durchgeführt. Die Sequenzen wurden unter Verwendung des STAR-Alignments mit der Genom-Referenzsequenz von Mus Muscullus (Ensembl genome assembly 3.2.1; https://www.ensembl.org/info/genome/genebuild/assembly.html, abgerufen am 24. März 2021) abgeglichen Software (Cold Spring Labaro tory, Cold Spring Harbor, USA) (Version 2.3.0e, https://github.com/alexdobin/STAR, abgerufen am 24. März 2021) [44], die 2 Mismatches innerhalb von 50 Basen zulässt. Das SAMtools-Paket (Version 0.1.18) und HTSeq (Version 0.6.1p1) wurden zum Filtern eindeutiger Treffer und zum Zählen verwendet [45,46]. Kandidatengene wurden auf ein Minimum von 2--facher Änderung und FDR-korrigiertem p-Wert < 0,05="" gefiltert.="" die="" genannotation="" wurde="" mit="" mus="" muscullus="" von="" ensembl="" v78="" (www.ensembl.org,="" zugriff="" am="" 1.="" märz="" 2019)="" über="" das="" paket="" biomart="" (version="" 2.24.0)="" [47]="" durchgeführt.="" die="" go-anreicherungsanalyse="" für="" kandidatengene="" wurde="" mit="" dem="" goseq-paket="" (version="" 1.2)="" [48]="" unter="" verwendung="" von="" standardparametern="">

4.8. Nierenlyse, Proteinextraktion und zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE)

Für die 2D-Gelelektrophorese wurden Embryonen von 6 trächtigen Calr plus // Weibchen (8–10 Embryonen/Weibchen) verwendet. Für die Proteinextraktion für die 2D-Gelelektrophorese (2-DE), dieNierenvon Embryonen im gleichen Embryonalstadium und vom gleichen Genotyp und weiblich (8–10 Embryonen/trächtige Frau) wurden gepoolt, mit einem Lysepuffer (9,5 M Harnstoff, 2 Prozent CHAPS (w/v), 2 Prozent Ampholyte (w /v), 1 Prozent DTT) und verwirbelt. Nach Zugabe des Lysepuffers wurden die Proben 30 min bei 4 °C inkubiert. Zur Entfernung der Zelltrümmer wurde 30 min bei 13,000× g und 4 ◦C zentrifugiert. Der Überstand wurde für weitere 30 min bei 13,000× g und 4 ◦C erneut zentrifugiert, um maximale Reinheit zu erhalten. Die Überstände wurden gesammelt und die Pellets wurden verworfen und die resultierenden Proben wurden sofort verwendet oder bis zur Verwendung bei –80 ◦C gelagert. Um die Salzbelastung zu reduzieren und die Proteine ​​anzureichern, wurde eine Methanol-Chloroform-Fällung nach Wessel und Flügge [49] durchgeführt. Das Pellet wurde getrocknet und im Lysepuffer gelöst. Die Gesamtproteinkonzentration wurde mit dem Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) nach Bradford bestimmt. Als Standard wurde BSA (Sigma, Steinheim, Deutschland) verwendet. Um die experimentelle Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, haben wir dreifache Gele von jedem erzeugtNiereSchwimmbad. Die 2D-Proteintrennung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [50]. Die 2-DE-Gele wurden mit Flamingo-Fluoreszenz-Gelfarbstoff (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt. Nach dem Färben wurden die Gele mit einer Auflösung von 50 &mgr;m auf einem Fuji FLA-5100-Scanner gescannt. Die digitalisierten Bilder wurden mit Delta 2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Deutschland) analysiert. Zur Proteinvisualisierung wurden die 2-DE-Gele zusätzlich über Nacht mit kolloidalem Coomassie-Blau, Roti-Blue (Roth, Karlsruhe, Deutschland) gefärbt.

4.9. Massenspektrometrische Analyse und Proteinidentifizierung

Signifikant regulierte Spots wurden aus den Gelen ausgeschnitten und ein tryptischer In-Gel-Verdau und eine Peptidextraktion wurden durchgeführt, wie zuvor von Dihazi et al. beschrieben. [51]. Kurzzeitig wurden Gelflecken zweimal in 25 mM Ammoniumbicarbonat (amBic) und einmal in Wasser gespült, mit 100 % Acetonitril (ACN) für 15 Minuten geschrumpft und in einem SpeedVac (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) für 20–30 min. Alle ausgeschnittenen Spots wurden mit 12,5 ng/µL Trypsin in Sequenzqualität (Roche Molecular Biochemicals, Basel, CH) in 25 mM amBic über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Peptidextraktion wurde zweimal durchgeführt, indem zuerst 50 Prozent ACN/1 Prozent Trifluoressigsäure (TFA) und dann 100 Prozent ACN verwendet wurden. Alle Extrakte wurden gepoolt und das Volumen wurde unter Verwendung von SpeedVac reduziert. Tryptische Peptide wurden einer massenspektrometrischen Sequenzierung unter Verwendung eines Massenspektrometers Q-TOF Ultima Global (Micromass, Manchester, UK) unterzogen, das mit einem Nanoflflow-ESI-Z-Spray ausgestattet war. Die Proteinidentifizierung wurde mit der Mascot-Suchmaschine gegen MSDB- und Swissprot-Datenbanken unter Verwendung einer Peptidmassentoleranz und Fragmenttoleranz von 0,5 Da durchgeführt.

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENVERSAGEN VERBESSERN

4.10. Proteinextraktion, SDS-PAGE, geltryptischer Verdau und massenspektrometrische Analysen

Zur massenspektrometrischen Quantifizierung der Proteinveränderung im Calr/Nierewurden die Proben desselben Genotyps und derselben Mutter zusammengepoolt. Um genügend Pools zu generieren und eine biologische und experimentelle Replikation sicherzustellen, verwendeten wir 6 verschiedene schwangere Cal plus // mit 8–10 Embryonen/Mäusen. Das EmbryonaleNierenvon den drei Genotypen wurden aus den Embryonen geerntet und die Proteinextraktion wurde unter Verwendung des Lysepuffers wie oben beschrieben durchgeführt. Proteinextrakte wurden durch SDS-PAGE getrennt, die Gele wurden mit Coomassie-Blau gefärbt, jede Spur ausgeschnitten und in 2 0-Scheiben gleicher Größe geschnitten und die Scheiben einem In-Gel-Verdau mit Trypsin unterzogen. Für die massenspektrometrische Analyse wurden die Proben auf einer selbstgepackten Umkehrphasen-C18-Vorsäule (0,15 mm ID × 20 mm, Reprosil-Pur120 C{{11}) angereichert }AQ 5 µm, Dr. Maisch, Ammerbuch-Entringen, Deutschland) und auf einer analytischen Umkehrphasen-C18-Säule (0.075 mm ID × 200 mm, Reprosil-Pur 120 C{ {21}}AQ, 3 µm, Dr. Maisch) unter Verwendung eines 30-minütigen linearen Gradienten von 5–35 % Acetonitril/0,1 % Ameisensäure (v:v) bei 300 nl min-1). Der Eluent wurde auf einem Q Exactive-Hybrid-Quadrupol/Orbitrap-Massenspektrometer (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Deutschland) analysiert, das mit einer FlexIon-nanoSpray-Quelle ausgestattet war und unter der Excalibur 2.4-Software unter Verwendung eines datenabhängigen Erfassungsverfahrens betrieben wurde. Jeder Versuchszyklus hatte die folgende Form: Ein vollständiger MS-Scan über den Bereich von 350–1600 m/z wurde mit einer Auflösungseinstellung von 70, 000 FWHM und einem AGC-Ziel von 106 und einer maximalen Füllzeit von 60 ms erfasst . Bis zu den 12 häufigsten Peptidvorläufern mit Ladungszuständen von 2 bis 5 über einer Intensitätsschwelle von 2 × 104 wurden dann nacheinander mit einer Isolationsbreite von 2,0 FWHM isoliert, mit Stickstoff bei einer normalisierten Stoßenergieeinstellung von 25 Prozent fragmentiert und die resultierenden Produkt-Ionenspektren erstellt wurde mit einer Auflösungseinstellung von 17.500 FWHM aufgezeichnet und es gab ein AGC-Ziel von 2 × 105 und eine maximale Füllzeit von 60 ms. Die ausgewählten Vorläufer-m/z-Werte wurden dann für die folgenden 15 s ausgeschlossen. Es wurden zwei technische Replikate pro Probe erworben. Peaklisten wurden aus den Rohdaten mit der Software Raw2MSMS v1.17 (Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried, Deutschland) extrahiert. Die Proteinidentifizierung wurde unter Verwendung der Software MASCOT 2.5.1 (Matrixscience, London, UK) erreicht. Proteine ​​wurden gegen das UniProtKB-Maus-Referenzproteom v2017.09 (16930 Proteineinträge) zusammen mit einer Reihe von 51 Kontaminanten identifiziert, die üblicherweise in unserem Labor identifiziert wurden. Die Suche wurde mit Trypsin als Enzym und Jodacetamid als Cysteinblocker durchgeführt. Bis zu zwei verpasste tryptische Spaltungen und Methioninoxidation als variable Modifikation waren erlaubt. Suchtoleranzen wurden auf 10 ppm für die Precursormasse und 0,05 Da für die Fragmentmassen festgelegt und als Instrumententyp wurde ESI-QUAD-TOF angegeben. Scaffold Software Version 4.8.9 (Proteome Software Inc., Portland, OR, USA) wurde verwendet, um MS/MS-basierte Peptid- und Proteinidentifizierungen zu validieren. Peptididentifikationen wurden akzeptiert, wenn sie mit einer Wahrscheinlichkeit von mehr als 95,0 Prozent durch den Percolator-Algorithmus festgestellt werden konnten. Proteinidentifikationen wurden bei mindestens 2 sicher identifizierten Peptiden auf eine Falschentdeckungsrate von 1 Prozent gekürzt. Proteintreffer, die ähnliche Peptide enthielten und darüber hinaus nicht allein auf der Grundlage der MS/MS-Analyse unterschieden werden konnten, wurden gruppiert, um die Prinzipien der Sparsamkeit zu erfüllen. Proteine, die signifikante Peptidnachweise teilen, wurden in Cluster gruppiert. Die Proteinhäufigkeiten wurden anhand ihrer Spektralzahlen nach Normalisierung der Gesamtsummen zwischen allen Wiederholungen geschätzt.

4.11. Western-Blot-Analyse

Western-Blot-Analysen wurden nach Towbin et al. [52]. Gleiche Proteinmengen (50–75 µg) wurden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt und auf Nitrozellulosemembranen (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK) übertragen. Die Membranen wurden in 5 % fettfreier Trockenmilch in einem TBST-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7, 4 150 mM NaCl 0,1 % Tween 20) blockiert und mit Primärantikörpern (anti-Calr, anti -Rps10, Anti-Rps19, Anti-Rps26 und Anti-eIF5A) über Nacht bei 4 °C. Um die Proteinbanden sichtbar zu machen, wurden fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper verwendet. Um eine gleiche Proteinbeladung zu bestätigen, wurden die Blots mit Anti-Actb- oder Anti-GAPDH-Antikörpern (Sigma, Taufkirchen, Deutschland) behandelt.

4.12. Bioinformatik

Die Klassifizierung der identifizierten Proteine ​​nach ihren hauptsächlich bekannten und postulierten Funktionen erfolgte mit Hilfe von DAVID Bioinformatics (http://david.abcc. ncifcrf.gov, abgerufen am 21. Februar 2019) [53,54]. Gensymbole wurden verwendet, um die Annotationen der Genontologie (GO) (biologische Prozesse und molekulare Funktionen) zu untersuchen und zu kategorisieren. Die Netzwerkanalyse bekannter und vorhergesagter Protein-Protein-Wechselwirkungen der identifizierten Proteine ​​wurde mit STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins) [55] durchgeführt.

4.13. Statistische Analyse

Für {{0}}DE wurden die digitalisierten Bilder analysiert und ein Spot-Matching über Gele und eine Normalisierung mit Delta2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Deutschland) durchgeführt. Delta2D berechnet für jeden erkannten Punkt einen „Punktqualitäts“-Wert. Dieser Wert zeigt, wie genau ein Punkt die "ideale" 3D-Gauß-Glockenform darstellt. Basierend auf dem durchschnittlichen Spotvolumenverhältnis wurden Spots, deren relative Expression sich mindestens 2--fach (Zunahme oder Abnahme) in dreifacher Ausführung zwischen den verglichenen Proben verändert hatte, als signifikant angesehen. Um die Signifikanz der Proteinregulation zu analysieren, wurde der Student's t-Test durchgeführt und statistische Signifikanz wurde für P-Werte kleiner als 0,05 angenommen. Alle Blots wurden unter Verwendung der ImageJ-Software quantifiziert. Die Daten wurden mit dem Softwarepaket GraphPad Prism, Version 8 (San Diego, CA, USA) zusammengestellt. Die Software wurde zur graphischen Darstellung und Analyse entweder durch Student's t-Verteilung oder Einweg-ANOVA verwendet. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung aus mindestens drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Unterschiede wurden als statistisch signifikant betrachtet, wenn p < 0,05.="" harnleiterknospenspitzen="" und="" nephrone="" wurden="" manuell="" gezählt="" und="" die="" daten="" wurden="" mit="" dem="" softwarepaket="" graphpad="" prism,="" version="" 8,="">